ONDAS ELECTROMAGNETICAS TRABAJO PRÁCTICO Nº 17 MICROSCOPIA

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1 ONDAS ELECTROMAGNETICAS TRABAJO PRÁCTICO Nº 17 MICROSCOPIA CONTENIDOS Microscopio compuesto : Marcha de rayos. Aumento del microscopio. Elementos Ópticos de un microscopio. Partes de un Microscopio. Tipos de microscopios. Microscopio Electrónico. Cuidados y mantenimiento. OBJETIVOS Describir los elementos ópticos y mecánicos de un microscopio compuesto. Explicar el funcionamiento óptico de un microscopio compuesto. Determinar, gráfica y analíticamente, las posiciones de las imágenes que producen el objetivo y el ocular. Caracterizar las imágenes de un microscopio compuesto. Diferenciar los distintos tipos de microscopios.. Describir los cuidados y mantenimiento de un microscopio compuesto. Realizar observaciones enfocando e iluminando convenientemente XVII.1 FUNDAMENTOS TEORICOS XVII.1.1 Introducción El microscopio es un instrumento que se utiliza para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos. Los portentosos avances técnicos han permitido ir descifrando poco a poco los mas intrincados problemas biológicos, hasta llegar a facilitar en nuestros dias una visión precisa de los organismos vivos. Si retrocedemos unos trescientos años para tratar de adquirir conciencia de lo que fue la organización de los conocimientos requeridos para estructurar toda la teoría de la célula, personajes como Robert Hooke y Leeuwenhoek, con sus microscopios rudimentarios, ponían al alcance del hombre valiosos medios de observación que al ser perfeccionados, servirían para dar pasos gigantescos en el conocimiento de la célula. Hooke, Robert ( ), científico inglés, conocido por su estudio de la elasticidad aportó conocimientos en varios campos de la ciencia, fue pionero en realizar 172

2 investigaciones microscópicas (1665), observó finísimos cortes de corcho. De su observación, dedujo que las celdillas correspondían a células. Leeuwenhoek, Antoni van ( ),fabricante holandés de microscopios, construyó como entretenimiento diminutas lentes biconvexas montadas sobre platinas de latón, que se sostenían muy cerca del ojo. A través de ellos podía observar objetos, que montaba sobre la cabeza de un alfiler, ampliándolos hasta trescientas veces (potencia que excedía con mucho la de los primeros microscopios de lentes múltiples). En 1674 realizó la primera descripción precisa de los glóbulos rojos de la sangre. Más tarde observó en el agua de un estanque, el agua de lluvia y la saliva humana, lo que él llamaría animáculos, conocidos en la actualidad como protozoos y bacterias. Microscopio óptico El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especímenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra. La fotomicrografía, que consiste en fotografiar objetos a través de un microscopio, utiliza una cámara montada por encima del ocular del microscopio. La cámara suele carecer de objetivo, ya que el microscopio actúa como tal. El término microfotografía, utilizado a veces en lugar de fotomicrografía, se refiere a una técnica de duplicación y reducción de fotografías y documentos a un tamaño minúsculo para guardarlos en un archivo. Los microscopios que se utilizan en entornos científicos cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del espécimen. Dado que la imagen de la muestra está ampliada muchas veces e invertida, es difícil moverla de forma manual. Por ello los soportes de los microscopios científicos de alta potencia están montados en una plataforma que puede moverse con tornillos micrométricos. Algunos microscopios cuentan con soportes giratorios. Todos los microscopios de investigación cuentan con tres o más objetivos montados en un cabezal móvil que permite variar la potencia de aumento 173

3 . XVII.1.2 Microscopio compuesto : Marcha de rayos L 2 L 1 d O 1 f 01 f i1 f 02 f i2 p 2 p 1 q 1 I 1 =O 2 Figura 1 I 2 q 2 El microscopio compuesto está formado esencialmente por dos lentes convergentes llamadas objetivo y ocular. La distancia focal del objetivo (f) es mucho menor que la distancia focal del ocular (f ). El objeto (O1) se coloca a una distancia ligeramente mayor que el foco del objetivo. El objetivo forma una imagen real e invertida (O 2 ) que hace de objeto para el ocular y se sitúa entre el foco f y el ocular, este da una imagen virtual y mucho mayor que el objeto fig. (1). El objeto debe situarse a una distancia del objetivo tal que todo el sistema otorgue una distancia aproximadamente igual a la del punto próximo. El objeto debe colocarse a una distancia del objetivo tal que todo sistema otorgue una distancia aproximadamente igual a la del punto próximo (25 cm), operación que se realiza mediante el enfoque y consiste en mover todo el sistema óptico (ocular + objetivo respecto al objeto; o bien mover el objeto en microscopios con platina móvil. Se define como aumento lateral de un sistema óptica a la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto. El aumento propio del objetivo está definido por la relación entre el tamaño de la imagen intermedia y el tamaño del objeto sujeto a examen. M ob d f o1 174

4 El aumento propio del ocular está definido por la relación del tamaño de la imagen total obtenida y el tamaño de la imagen intermedia de la construcción total. M oc q f 2 o2 El aumento total será el producto entre los aumentos propios del objetivo y el ocular. M = M M = d t ob oc. q2 fo 1. fo2 Aumento del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el tamaño aparente de la imagen y el tamaño del objeto, o sea: Aumento (A) = tamaño aparente de la imagen tamaño del objeto Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 veces un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor que el tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si estamos utilizando un ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que estamos viendo la preparación será: 1OX x 45X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces. Campo del Microscopio Se denomina "campo del microscopio" al círculo visible que se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro. XVII.1.3 XVII Elementos Ópticos de un microscopio Angulo de abertura Es el limitado por los rayos más periféricos que partiendo de un punto cualquiera del objeto que se observa penetra en la lente y contribuye a la formación de la imagen. 175

5 XVII Apertura Numérica Se define como el producto del índice de refracción del medio (n) por el seno del semiángulo de abertura. a= n. sen α La razón de utilizar un medio de mayor índice de refracción con un objetivo de inmersión en aceite es aumentar su apertura numérica. Los objetivos tienen grabados en la montura el valor de su apertura numérica. XVII Límite de resolución y poder separador de un sistema óptico Dos objetos puntuales situados uno muy cerca del otro se verán independientes y a la vez nítidos si los centros de sus correspondientes discos de difracción se encuentran lo suficientemente separados como para no producir una sola imagen, de allí que se define: Limite de resolución: Es la menor distancia que puede existir entre dichos puntos para que el sistema óptico aún los muestre separados. Está directamente relacionado con la longitud de onda utilizada y con la apertura numérica del objetivo. Se expresa en micrones y en los microscopios comunes varía entre 0,5 y 0,25 según el sistema óptico usado. d= 0,61λ/ n. sen α El poder separador es la capacidad de un sistema óptico para mostrar en forma nítida y separados a dos puntos situados a muy pequeña distancia entre sí, por ello se define: Poder de Resolución: Es la inversa del Límite de Resolución, ello significa que mayor será el poder de resolución de un microscopio cuanto más pequeña sea la distancia entre dos puntos, los cuales puedan verse nítidos y separados. P.R.= n. sen α /0,61λ O sea: P.R= 1/d La tabla siguiente, muestra una comparación de los valores de onda y del poder de resolución del microscopio óptico y del microscopio electrónico. Vemos que el poder resolutivo 176

6 del M.E. es unas cien veces superior al M.O., con lo que abre un campo completamente nuevo en el estudio de las estructuras biológicas. LONGITUD DE ONDA APERTURA PODER DE RESOLUCION Microscopio óptico m (rojo) m (azul) 1,00 1,00 1, m 2, m Microscopio electrónico 0, m 0, m 0, m m m m XVII.1.4 Aberraciones Las discrepancias entre la imagen observada a través de un sistema óptico y la predicha por la teoría, reciben el nombre de aberraciones. Las aberraciones más frecuentes son: Las aberraciones de esfericidad que se produce por la imposibilidad de una lente de reunir a los rayos de incidencia paralela en un foco puntiforme después de la refracción. Se produce porque los rayos periféricos no dan la misma imagen que los rayos centrales. El resultado es una visión borrosa del preparado. Se corrigen mediante el diafragma iris y por medio de los oculares. Las aberraciones cromáticas se deben a que la luz blanca está compuesta por diversas longitudes de onda correspondientes a los diferentes colores. Como la distancia focal de una lente depende del índice de refracción si la luz que procede de un objeto no es monocromática el sistema óptico no formará una imagen única de dicho objeto, sino un cierto número de imágenes coloreadas (imágenes de arco iris) alrededor de los bordes de los elementos observados en un preparado. Los oculares modernos también compensan las diferencias en las longitudes de onda y corrigen este tipo de aberración. XVII.1.5 Partes del Microscopio Compuesto El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: a. El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes que permiten el movimiento para el enfoque. b. El sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas 177

7 c. El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio. En los siguientes puntos describiremos cada uno de los sistemas nombrados, a fin de tener un conocimiento completo del microscopio. XVII La parte mecánica del Microscopio La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, la columna, la platina, el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto. El pie. Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular El tubo. Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares. El revólver. Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, la cual se nota por el ruido de un piñón que lo fija. La columna, llamada también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. La platina. Es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. En los microscopios modernos es la platina la que está articulada a los tornillos macro y micrométricos que permiten el enfoque alzando o bajando la misma. De esa manera tanto la ubicación del campo de observación como el enfoque grueso y fino son consecuencia del movimiento de la platina. Carro. Es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación con movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda. El tornillo macrométrico. Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo o la platina del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación. El tornillo micrométrico. Mediante el movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. 178

8 XVII Sistema Óptico El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos. o Los oculares. Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto. Es un sistema óptico más simple que el objetivo, y sirve para magnificar y corregir la imagen real formada por el objetivo. La construcción de los oculares se diseñan para corregir las aberraciones. Los oculares generalmente más utilizados son los de: 8X, 1OX, 12.5X, 15X. La X se utiliza para expresar en forma abreviada los aumentos o Los objetivos. Los objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente se clasifican como: Secos De inmersión Especiales Objetivos secos: En ellos se interpone directamente el aire entre el objeto y la lente frontal. Según su aumento se distinguen en seco débil (5, 10 X) y seco fuerte (20 y 45 X). En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. Objetivos de inmersión: Entre la lente frontal y el objeto se interpone un líquido de índice de refracción superior al aire por ejemplo agua, aceite de cedro, yoduro de metilo. La razón de ello es aumentar la apertura numérica. Especiales: Se refieren a los objetivos de los diferentes tipos de microscopios como ser de campo oscuro, contraste de fases, interferencia, fluorescencia, ultravioleta, etc. XVII Sistema de Iluminación Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los siguientes elementos: o El espejo. Tiene dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación natural (luz solar). Modernamente se prescinde del espejo en la fabricación de microscopios, ya que éstos traen incorporada una lámpara colocada en el eje del microscopio. 179

9 o o Condensador. El condensador está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El condensador se halla debajo de la platina. El condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo que determina su movimiento ascendente o descendente. Diafragma. Generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a través del condensador. Sirve además, para corregir la aberración de esfericidad. Trayectoria del Rayo de Luz a través del Microscopio El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar el ocular, donde es captado por el ojo del observador. (Figura 2) 180

10 XVII.1.6 Tipos de Microscopios Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes. El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. Microscopio estereoscópico. El microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio. Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio. Microscopio de campo oscuro. En vez del condensador del microscopio óptico va a tener un condensador parabólico. Los rayos que vienen de la fuente luminosa, se desvían y atraviesan el objeto de estudio en forma tangencial. Nos permite ver partículas o sustancias sin colorantes. Nos da un brillo y por el brillo denotamos la forma, el tejido Microscopio de polarización. Diferencia: en lugar del condensador está el prisma de Nicol. Detrás del objetivo está el analizador, por este tipo de prisma la luz se vuelve en luz polarizada. Este microscopio tiene dos componentes uno polarizador y otro analizador, están colocados de manera tal que sus ejes principales sean perpendiculares. Microscopio de contraste de fases. Exagera la diferencia de fases, lo que es normal y atenuado (variación de tonalidades). No necesitamos darle color a la célula. Se puede estudiar al natural. Tiene otro tipo de condensador (condensador de hendidura). Los cuerpos no teñidos son difíciles de observar, si son transparentes toda su superficie tiene la misma densidad óptica. Para observar en vivo imágenes de cuerpos transparentes se usa este microscopio. La luz pasa por un cuerpo transparente con diferentes índices de refracción, disminuye la velocidad y cambia de dirección. El sistema óptico permite encontrar estas fases. Microscopio de interferencia. El manejo es similar al anterior (juega con contraste de fases). Diferencias: nos da imágenes de alto relieve y de tono naranja y verde. Se usa más para estudiar partículas. Microscopio de rayos ultravioletas. La lente que es de vidrio es sustituido por lentes de cuarzo y la iluminación se produce por unas lámparas de mercurio. Este microscopio generalmente se lo usa para estudiar tejidos, donde por lo general se busca anticuerpos (los tejidos analizados por este sistema no se pueden guardar porque van perdiendo fluorescencia). 181

11 EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Utilizado por primera vez en 1932, se basa en un haz de electrones de alta velocidad y campos electromagnéticos en vez de lentes; utiliza electrones para iluminar un objeto, dado que estos tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz, pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. Como los electrones no pueden estimular el ojo, la imagen final es estudiada en una pantalla fluorescente o en una placa fotográfica, sensible a los electrones. Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos: Un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Lentes magnéticas, que se utilizan para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones El sistema de vacío, los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones. Tipos de Microscopios Electrónicos Existen varios tipos de microscopios electrónicos, que cada día se perfeccionan más. El microscopio electrónico de transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra, sean tejidos, células u otro material. El microscopio electrónico de Figura 3: Microscopio Electrónico barrido se utiliza para el estudio de la morfología y la topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analíticos que detectan señales características de los elementos que constituyen la muestra. Con estos poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología celular. 182

12 XVII.2 PROCEDIMIENTOS Observación de un Preparado La cátedra proveerá un preparado que será observado con un Microscopio Compuesto. Cómo combinaría el objetivo y el ocular de un microscopio compuesto para obtener el mayor aumento posible?. Prediga el tamaño de la imagen. Verifique sus conclusiones realizando la experiencia. Describa la secuencia empleada en la experiencia. Si dispusiera de objetivos secos y de inmersión, con cuál de ellos iniciaría el proceso de observación? por qué? Cómo puede obtener una imagen con mayor nitidez? Justifique. Qué distancia del sistema óptico se modifica en la operación de enfoque? Con qué elementos del sistema mecánico lo hace? Con qué elementos recorre el preparado? Con que corregiría las aberraciones de la imagen? cómo? por qué? con qué técnicas? Seleccione un sistema óptico tal que la imagen observada sea de mayor tamaño y de mayor nitidez. Describa el objetivo y el ocular utilizados, el aumento logrado, el (los) dispositivo(s) corrector(es) y la técnica de iluminación escogida. Cómo haría para que otra persona identifique el mismo elemento que usted ha observado? 183

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