Guía del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

Transcripción

1 Guía del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Revisión A Copyright Waters Corporation 2010 Todos los derechos reservados

2 Información sobre los derechos de autor (copyright) 2010 WATERS CORPORATION. IMPRESO EN LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA Y EN IRLANDA. RESERVADOS TODOS LOS DERECHOS. QUEDA TERMINANTEMENTE PROHIBIDA LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL DE ESTE DOCUMENTO POR PROCEDIMIENTO ALGUNO SIN EL CONSENTIMIENTO EXPRESO DEL EDITOR. La información que aparece en este documento está sujeta a modificaciones sin previo aviso y no debe interpretarse como un compromiso contractual por parte de Waters Corporation. Waters Corporation no asume responsabilidad alguna por ningún error que pudiera aparecer en este documento. En el momento de su publicación, se considera que este manual es exacto y está completo. Waters Corporation no será en ningún caso responsable de los daños accidentales o indirectos relacionados con el uso de este documento o derivados de éste. Marcas comerciales ACQUITY, ACQUITY UPLC, UPLC y Waters son marcas registradas de Waters Corporation. Auto Blend Plus, ecord, Empower, i 2 Valve, LAC/E, MassLynx y THE SCIENCE OF WHAT S POSSIBLE. son marcas comerciales de Waters Corporation. MP35N es una marca registrada de Hamilton Precision Metals. PEEK es una marca comercial de Victrex Corporation. TRITON es una marca comercial de Union Carbide Corporation. TWEEN es una marca comercial de ICI Americas, Inc. Otras marcas registradas o comerciales pertenecen exclusivamente a sus respectivos propietarios. ii

3 Comentarios del cliente El departamento de Comunicaciones del Servicio Técnico de Waters agradece la comunicación de cualquier error que se detecte en este documento, así como las sugerencias para mejorarlo. Su ayuda para conocer mejor lo que se espera encontrar en la documentación nos permite mejorar de manera continua su exactitud y utilidad. Tenemos muy en cuenta los comentarios enviados por nuestros clientes. Para ponerse en contacto con nosotros, enviar un mensaje a tech_comm@waters.com. Contacto con Waters Contactar con Waters para presentar solicitudes de mejora o preguntas técnicas relativas al uso, el transporte, la retirada o la eliminación de cualquier producto de Waters. El contacto puede hacerse a través de Internet, teléfono o correo convencional. Información de contacto de Waters: Medio de contacto Información Internet El sitio web de Waters incluye información de contacto de las filiales internacionales de Waters. Visitar Teléfono y fax Desde EE. UU. o Canadá, llamar al HPLC o enviar un fax al Desde otros países, consultar los números de teléfono y fax de las filiales internacionales en el sitio web de Waters. Correo convencional Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA EE.UU. iii

4 Consideraciones de seguridad Algunos de los reactivos y las muestras que se utilizan con los instrumentos y dispositivos de Waters pueden suponer un peligro radiológico, biológico o químico. Se deben conocer los efectos potencialmente peligrosos de todas las sustancias con las que se trabaja. Hay que seguir siempre las buenas prácticas de laboratorio y consultar las recomendaciones del responsable de seguridad de la organización. Consideraciones específicas para el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Peligro de alto voltaje Advertencia: Para evitar descargas eléctricas, se recomienda no retirar los paneles protectores del espectrómetro de masas. Estos paneles no cubren ningún componente que el usuario deba manipular. Para evitar una descarga eléctrica no mortal cuando el instrumento se encuentra en modo Operate (Funcionamiento), no tocar las áreas marcadas con el símbolo de advertencia de alto voltaje. Para tocar dichas áreas hay que pasar antes al modo Standby (En espera) del instrumento. Consejos de seguridad Consultar el Apéndice A para ver una lista completa de advertencias y precauciones. iv

5 Funcionamiento de este Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Al utilizar este Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class, se deben seguir los procedimientos de control de calidad (QC) estándar y las directrices que se indican en esta sección. Símbolos aplicables Símbolo Definición Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea Garantiza que un producto fabricado cumple con todas las directivas aplicables de la Comunidad Europea. Marca C de cumplimiento de CEM de Australia. Confirma que un producto fabricado cumple con todos los requisitos de seguridad estadounidenses y canadienses. Consultar las instrucciones de uso. Destinatarios y finalidad La presente guía está dirigida al personal encargado de la instalación, funcionamiento y mantenimiento de los instrumentos del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Ofrece una descripción general de la tecnología y el funcionamiento del sistema. v

6 Uso previsto del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class El Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class de Waters es para uso exclusivo en investigación y no está concebido para utilizarse en aplicaciones de diagnóstico. Calibración Para calibrar los sistemas de cromatografía líquida (LC), se deben seguir métodos de calibración adecuados y utilizar por lo menos cinco estándares para generar una curva estándar. El intervalo de concentraciones de los estándares debe incluir la gama completa de muestras de control de calidad, muestras habituales y muestras atípicas. Para calibrar los espectrómetros de masas, se debe consultar la sección de calibración de la guía de funcionamiento del instrumento que se desea calibrar. En los casos en los que el módulo no vaya acompañado de una guía de funcionamiento, sino de una guía de mantenimiento y descripción general, consultar las instrucciones de calibración en la Ayuda en línea del módulo. Control de calidad Se recomienda analizar de forma sistemática tres muestras de QC que representen los niveles por debajo de lo normal, normal y por encima de lo normal de un compuesto. Los resultados del análisis de estas muestras deben encontrarse dentro de unos límites aceptables y se debe evaluar la precisión entre un día y otro, y entre un análisis y otro. Es posible que los datos obtenidos cuando las muestras de QC estén fuera de los límites no sean válidos. Dichos datos no se deben incluir en un informe hasta asegurarse de que el instrumento funciona satisfactoriamente. Clasificación ISM Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase B Esta clasificación se asigna según la CISPR 11, que contiene los requisitos de los instrumentos industriales científicos y médicos (ISM). Los productos del Grupo 1 contienen energía de radiofrecuencia acoplada conductivamente, generada o utilizada de forma intencionada, necesaria para el funcionamiento interno del propio equipo. Los productos de Clase B se pueden utilizar tanto en instalaciones comerciales como residenciales, y se pueden conectar directamente a la red de suministro eléctrico de bajo voltaje. vi

7 Representante autorizado en la CE Waters Corporation (Micromass UK Ltd.) Floats Road Wythenshawe Manchester M23 9LZ Reino Unido Teléfono: Fax: Contacto: Gerente de calidad vii

8 viii

9 Contenido Información sobre los derechos de autor (copyright)... ii Marcas comerciales... ii Comentarios del cliente... iii Contacto con Waters... iii Consideraciones de seguridad... iv Consideraciones específicas para el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class... iv Consejos de seguridad... iv Funcionamiento de este Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class... v Símbolos aplicables... v Destinatarios y finalidad... v Uso previsto del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class... vi Calibración... vi Control de calidad... vi Clasificación ISM... vi Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase B... vi Representante autorizado en la CE... vii 1 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Cromatografía líquida UltraPerformance Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Inyector de flujo a través de aguja Eluyente de lavado Eluyente de purga Acondicionamiento del eluyente activo Mejoras de software Contenido ix

10 Componentes del sistema Tecnología de la columna Para obtener más información Optimizar el funcionamiento Directrices generales Calculadora de columnas ACQUITY UPLC Dispersión Arrastre Precisión y exactitud Tiempo de los ciclos (entre inyecciones) Evitar fugas Preparación de las muestras Partículas Diluyentes de muestras compatibles Preparar el sistema Preparar el hardware del sistema Encender el sistema Supervisión de las pruebas iniciales Supervisar los indicadores LED de los módulos del sistema Indicador LED de encendido Indicadores LED de estado Activar los sensores de fugas Puesta en marcha del sistema Configurar el software de datos cromatográficos Paneles de control ACQUITY Panel de control del bioqsm Panel de control del biosm-ftn Panel de control del Detector de absorbancia programable (UV variable) Puesta en marcha de la Consola ACQUITY UPLC x Contenido

11 A Consejos de seguridad... A-1 Símbolos de advertencia... A-2 Advertencias de peligro asociadas con tareas específicas... A-2 Advertencias específicas... A-3 Símbolo de precaución... A-6 Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters... A-6 Símbolos eléctricos y de manejo... A-7 Símbolos eléctricos... A-7 Símbolos de manejo... A-8 B Conexiones externas... B-1 Conexiones de los tubos del sistema... B-1 Conexiones de los cables externos del instrumento... B-3 Conexiones de los cables externos del instrumento del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class... B-3 Conexiones Ethernet... B-4 Conexiones del horno de columnas... B-4 Conexiones de la trayectoria del flujo para los compartimentos de columnas... B-5 Conexiones de señales... B-7 Realizar las conexiones de señales... B-7 Conectar a la fuente de alimentación... B-12 C Consideraciones generales sobre los eluyentes... C-1 Introducción... C-2 Prevenir la contaminación... C-2 Eluyentes limpios... C-2 Calidad de los eluyentes... C-2 Preparación de los eluyentes... C-2 Agua... C-2 Contenido xi

12 Recomendaciones sobre los eluyentes... C-3 Directrices generales sobre los eluyentes... C-4 Eluyentes no permitidos... C-6 Recomendaciones para el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class... C-7 Recomendaciones para el bioqsm... C-8 Recomendaciones para el biosm-ftn... C-8 Recomendaciones sobre el detector... C-9 Propiedades comunes de los eluyentes... C-9 Miscibilidad de los eluyentes... C-11 Utilización de los valores de miscibilidad (números-m)... C-12 Estabilizadores de eluyentes... C-13 Viscosidad de los eluyentes... C-13 Selección de la longitud de onda... C-14 Valores de corte de UV para eluyentes comunes... C-14 Fases móviles mezcladas... C-14 Absorbancia de la fase móvil... C-15 Index... Index-1 xii Contenido

13 1 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class Contenido: Tema Página Cromatografía líquida UltraPerformance 1-1 Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class 1-3 Componentes del sistema 1-9 Cromatografía líquida UltraPerformance En 2004, Waters realizó avances significativos en el diseño de instrumentos y columnas con el fin de introducir la tecnología UPLC en el campo de la ciencia de separaciones. Gracias al uso de esta tecnología, los Sistemas ACQUITY UPLC de Waters logran aumentar notablemente la resolución, la velocidad y la sensibilidad en aplicaciones de cromatografía líquida, en comparación con los sistemas convencionales. La cromatografía líquida UltraPerformance emplea columnas con rellenos de partículas redondeadas de 1.7 μm de diámetro y presiones de funcionamiento máximas de kpa (1 034 bar, psi). La ecuación de van Deemter, una fórmula empírica que describe la relación entre la velocidad lineal y la eficacia de la columna, considera el tamaño de las partículas como una de las variables. Así, la ecuación se puede utilizar para caracterizar el rendimiento teórico a lo largo de un rango de tamaños de partícula. Cromatografía líquida UltraPerformance 1-1

14 Historia del tamaño de las partículas en la cromatografía líquida: Tecnología HPLC existente Intervalo de funcionamiento de la tecnología UPLC H E T P [µm] Partículas de 10 µm (1970) Partículas de 5 µm (1980) Mejor combinación de eficacia y velocidad Partículas de 2.5 µm (2000) Partículas de 1.7 µm (2004) Velocidad lineal [U, mm/s] Resulta evidente, a partir de la figura anterior, que la utilización de partículas de 1.7 μm proporciona una mayor eficacia que conduce a incrementos de caudal (un HEPT menor indica una mayor eficacia). Cuando se trabaja en este área del gráfico, la capacidad del pico y la velocidad de una separación puede establecer límites por encima de los de la tecnología HPLC convencional. Waters ha definido este nuevo nivel de rendimiento como cromatografía UltraPerformance. 1-2 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

15 Comparación de separaciones cromatográficas utilizando partículas de 5.0 μm y 1.7 μm: µm, columna UPLC AU min µm, columna UPLC AU , min Cada separación se llevó a cabo con una columna de mm. Las condiciones cromatográficas de las separaciones son idénticas, a excepción del caudal, que ha sido escalado en función del tamaño de las partículas. Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class El Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class se diseñó para las investigaciones biológicas y biofarmacéuticas. Está optimizado para el análisis de péptidos, proteínas, oligonucleótidos y carbohidratos. El sistema central incluye el Sistema biológico de gestión de muestras de flujo a través de aguja (biosm-ftn) y el Sistema biológico de gestión de eluyentes cuaternario (bioqsm). La función Auto Blend Plus del software proporciona capacidades mejoradas para el desarrollo de métodos. Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class 1-3

16 La trayectoria humectada del sistema contiene únicamente materiales biocompatibles que No interactúan significativamente ni adsorben o modifican a las biomoléculas como las proteínas. No filtran iones en los eluyentes cromatográficos recomendados (consultar el Apéndice C). No son atacados ni dañados significativamente por las fases móviles que se describen en el Apéndice C, incluidas las siguientes: Fases móviles ácidas que contienen haluros, como HCl (6 mm) y NaCl (hasta 1 M) en tampón fosfato (de 20 a 100 mm). Tampón fosfato a ph entre 2 y 12 en presencia de NaCl 1M. Los materiales de la trayectoria humectada son principalmente aleaciones de titanio y la aleación MP35N, que es una aleación de níquel-cobalto-cromo-molibdeno no magnética. El sistema admite varios tipos de módulos de compartimento de columnas. El Horno de precalentamiento activo de todos los módulos de compartimento de columnas tiene superficies humectadas hechas de materiales biocompatibles. Los módulos de compartimento de columnas pueden ser: un horno de columnas con un horno de precalentamiento activo; un compartimento de columnas con un horno de precalentamiento activo y capacidades de cambio de columnas; un compartimento de columnas auxiliar con un horno de precalentamiento activo; un termostatizador para columnas de 30 cm; o un horno de columnas de 30 cm con un horno de precalentamiento activo. El Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class combina la velocidad y el rendimiento de la UPLC con la capacidad de las separaciones HPLC. Esta combinación proporciona muchas ventajas, entre las que se incluyen: Cromatografía de partículas pequeñas y alta presión que permite realizar análisis más rápidamente y con mayor resolución que con la HPLC tradicional. Consumo reducido de eluyente (significativamente menos que la HPLC tradicional) Flexibilidad en la mezcla de eluyentes con un bioqsm Un biosm-ftn que facilita la transferencia de métodos de HPLC a UPLC. Mejoras en el diseño del bioqsm y el biosm-ftn para minimizar la dispersión y reducir la duración de los ciclos 1-4 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

17 Inyector de flujo a través de aguja El biosm-ftn del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class utiliza un mecanismo de flujo a través de aguja totalmente diferente de los inyectores basados en bucles que se utilizan en el Sistema ACQUITY UPLC. El mecanismo de flujo a través de aguja aspira una muestra y la retiene en la aguja de muestras para preparar la inyección de la muestra en la columna. La aguja forma parte de la trayectoria del flujo de inyección cuando se inyecta la muestra en la columna. Gracias al mecanismo de flujo a través de aguja, el sistema funciona de manera similar a la mayoría de los sistemas HPLC tradicionales, lo que facilita la transferencia de métodos HPLC. El mecanismo de flujo a través de aguja tampoco requiere el aprendizaje de nuevos modos de inyección. Además, mejora la exactitud de la inyección y reduce la duración del ciclo para inyecciones de volúmenes pequeños. Los gradientes pasan a través de la aguja durante el proceso de inyección, con lo que se garantiza una completa recuperación de la muestra. Eluyente de lavado El sistema de lavado utiliza un solo eluyente para limpiar la parte exterior de la aguja de muestras y cebar el sistema de lavado. El eluyente no entra en la trayectoria del flujo de inyección. Precaución: No dejar las soluciones tampón almacenadas en el sistema. Lavar todas las trayectorias del flujo, incluido el lavado de la aguja, con una cantidad suficiente de eluyente no tamponado antes de apagar el sistema. Si el sistema va a apagarse durante un periodo prolongado (de más de 24 horas), utilizar metanol al 10% - 20% en agua. Si se utiliza un eluyente de lavado tamponado, cebarlo durante 30 segundos como mínimo. El uso de soluciones tampón puede ocasionar la acumulación de sales en la aguja y el puerto de lavado, y hacer necesaria una limpieza periódica. Restricción: evitar el uso de eluyentes de lavado tamponados. Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class 1-5

18 Eluyente de purga La función principal del eluyente de purga es transportar la muestra a lo largo de la trayectoria de inyección. El eluyente de purga ceba también la jeringa de muestras y la trayectoria de inyección. La inyección de eluyente en la columna solo se produce durante la dilución automática, cuando se utiliza como eluyente de dilución. Acondicionamiento del eluyente activo Las aplicaciones HPLC y UPLC se benefician de un calentamiento adicional de la precolumna y la fase móvil con el fin de mejorar las separaciones cromatográficas. El Horno de columnas biológico ACQUITY UPLC H-Class utiliza un Horno de precalentamiento activo para acondicionar el eluyente a medida que entra en la columna. El Horno de precalentamiento activo aumenta la temperatura de la fase móvil entrante (y de la muestra inyectada) hasta la temperatura programada del compartimento de columnas. Indicación: el precalentamiento activo es la configuración predeterminada del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Mejoras de software Auto Blend Plus Auto Blend Plus permite crear gradientes basados en el ph o en la concentración de sales de los eluyentes. Los eluyentes que se utilizan con Auto Blend Plus se instalan habitualmente en las botellas de eluyente de la siguientes forma: El eluyente A es ácido. El eluyente B es básico. El eluyente C es un tampón salino. El eluyente D es acuoso. Si el bioqsm dispone de una válvula de selección de eluyentes opcional, es posible seleccionar uno de seis eluyentes (D1 a D6). Se especifica (o se selecciona de un catálogo) un valor de pka o una curva de calibración de ph, que se utilizan para calcular el ph. El catálogo editable incluye soluciones de ph conocido, soluciones salinas, valores de pka y curvas de calibración de ph. 1-6 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

19 El cociente ph/sales de cada inyección se mantiene constante. Se especifica la concentración de ph, la curva de ph, la concentración de sales, la curva de sales, el caudal y uno de los siguientes parámetros para los segmentos del gradiente: Time (Tiempo) Column volume (Volumen de la columna) Total volume (Volumen total) Quantum Synchronization (Sincronización cuántica) La introducción de una muestra de baja presión en el caudal de fluido de alta presión durante una inyección ocasiona un pulso de presión que puede afectar a los resultados cromatográficos. La función Quantum Synchronization (Sincronización cuántica) reduce el impacto de este pulso de presión. El biosm-ftn y el bioqsm se comunican para coordinar de manera automática la secuencia de inyección, permitiendo así que el bioqsm proporcione más presión en el momento exacto en que el biosm-ftn cambia la posición de la válvula de inyección a Inject (Inyección) para introducir la muestra a baja presión. Gradient Smart Start (Inicio inteligente de gradiente) Antes de cada inyección de muestra, el biosm-ftn normalmente ejecuta secuencias de lavado y aspira el volumen de muestra adecuado. Cuando se finalizan estas tareas, el bioqsm inicia la distribución de gradiente hacia la válvula de inyección. El volumen de permanencia del sistema afecta a la cantidad de tiempo que el gradiente tarda en llegar hasta la columna y puede ser un componente significativo del tiempo de ciclos total. La función Gradient Smart Start (Inicio inteligente de gradiente) coordina las operaciones previas a la inyección y reduce el efecto del volumen de residencia del bioqsm sobre la duración de los ciclos. El gradiente se inicia antes o durante las tareas previas a la inyección del biosm-ftn, lo que permite un ahorro de tiempo considerable. Wash Plungers (Lavar émbolos) El material precipitado que permanece en los émbolos de la bomba del bioqsm puede ocasionar daños en las juntas de alta presión. La función Wash Plungers (Lavar émbolos) lava las juntas con eluyente para eliminar cualquier precipitado. Se puede utilizar la función Wash Plungers (Lavar émbolos) Características del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class 1-7

20 según sea necesario o bien utilizarla como parte de la función No-Flow Shutdown (Apagado sin flujo). No-Flow Shutdown (Apagado sin flujo) La función No-Flow Shutdown (Apagado sin flujo) ejecuta la función Wash Plungers (Lavar émbolos) después de que el bioqsm haya permanecido inactivo durante un intervalo de tiempo especificado. Esta función evita que se depositen precipitados en los émbolos del bioqsm mientras el sistema esté inactivo. Automatic Prime (Cebado automático) Cuando se habilita esta función del bioqsm, el sistema ceba los tubos cada vez que se selecciona un eluyente nuevo. Ejemplo: si una primera inyección utiliza el conducto D1 y una segunda inyección utiliza el conducto D2, el sistema de gestión de eluyentes ceba el conducto D2 entre la primera y la segunda inyección. Elevación del flujo Esta función permite especificar la velocidad a la que el bioqsm incrementa o disminuye el flujo. 1-8 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

21 Componentes del sistema Módulos del instrumento: FRONTAL POSTERIOR Bandeja de botellas Detector Horno de columnas biosm-ftn bioqsm El Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class puede incluir un bioqsm equipado con una válvula de selección de eluyentes opcional de 6 puertos, un biosm-ftn, un módulo de compartimento de columnas, detectores (de UV variable, red de fotodiodos o espectrómetro de masas) y una columna ACQUITY UPLC. Todos los materiales que entran en contacto con la muestra son biocompatibles. El software para cromatografía Empower o el software para espectrometría de masas MassLynx de Waters controlan el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Componentes del sistema 1-9

22 bioqsm El bioqsm es una bomba de alta presión con mezclador a baja presión. El Sistema de gestión de eluyentes cuaternario suministra un flujo constante (sin pulsos) de eluyente a caudales analíticos máximos de 1 ml/min a kpa (1 034 bar, psi) y hasta 2 ml/min a presiones reducidas máximas de kpa (621 bar, psi). El bioqsm puede bombear cuatro eluyentes desgasificados simultáneamente mediante una válvula generadora de gradientes (GPV) para crear de forma dinámica la composición especificada. biosm-ftn El biosm-ftn utiliza un mecanismo de inyección directa para inyectar muestras extraídas de placas y viales en una columna cromatográfica. Los bucles de extensión opcionales (que se instalan entre la aguja de muestras y la válvula de inyección) aumentan el volumen de las inyecciones más allá de la capacidad de la aguja de muestras. El biosm-ftn también puede diluir las muestras con la opción Auto-dilution (Dilución automática). Horno de columnas Las variaciones en la temperatura de la columna pueden cambiar los tiempos de retención de los picos y modificar la forma de los picos, con lo que se incrementa la dificultad a la hora de lograr resultados precisos. Los compartimentos de columnas ayudan a la hora de garantizar separaciones precisas y reproducibles mediante el control de la temperatura de la columna. El compartimento de columnas se calienta a cualquier temperatura entre 20 ºC (o al menos 5 ºC por encima de la temperatura ambiente) y 90 ºC. Un dispositivo de precalentamiento activo calienta el eluyente entrante antes de que llegue a la columna. El horno de columnas admite columnas hasta 4 6 mm de diámetro interno y hasta 150 mm de longitud. Indicación: el precalentamiento activo es la configuración predeterminada del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Controlador de la consola local (opcional) El controlador de la Consola local ACQUITY UPLC (LCC) complementa el software del sistema de datos cromatográficos (CDS), lo que permite controlar los sistemas localmente. La funcionalidad mínima del LCC, diseñado para que simule un teclado sencillo, le impide funcionar como un controlador independiente. Su instalación en un sistema no sustituye al control del CDS Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

23 Waters ha diseñado el LCC para preparar los módulos del sistema para el funcionamiento, definir las condiciones iniciales y realizar pruebas diagnósticas del sistema. Estas funciones básicas se llevan a cabo rápidamente, incluso cuando un sistema está físicamente alejado de la estación de trabajo de adquisición y control del software, o del módulo LAC/E 32, o cuando el control en red no está disponible. FlexCart El elemento opcional FlexCart proporciona una plataforma móvil al Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Puede contener los módulos del sistema, así como el PC y el monitor, y proporciona salidas eléctricas para los módulos del sistema y una gestión de desechos integrada. Cuando se utiliza con un espectrómetro de masas, la altura ajustable del carro permite colocar la salida de la columna cerca de la sonda de entrada, con lo que se minimiza el volumen muerto del sistema. Tecnología de la columna Las columnas ACQUITY UPLC se rellenan de partículas híbridas de alta resistencia con puente de etilsiloxano de 1.7 μm o partículas de sílice de alta resistencia de 1.8 μm que pueden soportar mecánicamente condiciones de alta presión. El hardware de la columna y los tubos de salida correspondientes pueden soportar hasta kpa (1 034 bar, psi). Las dimensiones de la columna permiten caudales óptimos compatibles con MS y los tubos de salida correspondientes minimizan el efecto del volumen extra-columna. Aunque el sistema trabaja con cualquier columna para análisis HPLC, las especialmente diseñadas para ACQUITY UPLC maximizan su capacidad a alta presión. Si se comparan con las columnas de HPLC tradicionales, las columnas ACQUITY UPLC proporcionan una resolución y una sensibilidad mayores en el mismo tiempo de análisis o una resolución equivalente y una sensibilidad mayor en tiempos de análisis menores. Tecnología ecord Las columnas ACQUITY UPLC incluyen un chip ecord de la columna que registra el historial de uso de la columna. El chip ecord de la columna interactúa con el software del sistema y registra información de un máximo de 50 colas de muestras analizadas en la columna. En entornos regulados, el chip ecord de la columna documenta la columna utilizada en el método de validación. Componentes del sistema 1-11

24 Además de los datos variables sobre el uso de la columna, el chip ecord de la columna también almacena datos fijos sobre el proceso de fabricación de la columna, como: Identificación única de la columna; Certificado de análisis; Datos de las pruebas de control de calidad. Cuando se conecta el chip ecord de la columna al receptáculo correspondiente en el compartimento de columnas, el chip registra y almacena automáticamente la información del sistema. No es necesario realizar ninguna otra acción. Detectores La composición química de las partículas pequeñas utilizadas en la cromatografía del sistema UPLC genera picos muy estrechos. Los Detectores TUV, PDA, ELS y FLR para UPLC y los espectrómetros de masas SQ y TQ obtienen datos a velocidades lo suficientemente rápidas como para definir estos picos sin afectar a la sensibilidad o la exactitud de la medición de los picos. Estos detectores utilizan un volumen de cubeta de flujo menor, volúmenes de tubos minimizados y conectores especializados para controlar el ensanchamiento y mantener estos picos estrechos. Hay cubetas de flujo hechas de materiales biocompatibles, como titanio, disponibles para los Detectores TUV y PDA para UPLC. Para obtener más información La siguiente información adicional sobre el Sistema biológico ACQUITY H-Class se puede encontrar en el CD de documentación del sistema: Para el sistema ACQUITY UPLC H-Class ACQUITY UPLC H-Class Información de mantenimiento y descripción general del funcionamiento del compartimento de columnas Especificaciones del sistema 1-12 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

25 Visitar waters.com para obtener más información y formar parte de la comunidad en línea de ACQUITY UPLC, en la que se puede: Compartir información o hacer preguntas a los expertos y científicos de ACQUITY UPLC Acceder a las publicaciones de ACQUITY UPLC y a las experiencias de usuarios de todo el mundo. Consultar preguntas frecuentes exclusivas, trucos, consejos y tutoriales. Conocer las aplicaciones ACQUITY UPLC más recientes y obtener información. Componentes del sistema 1-13

26 1-14 Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class

27 2 Optimizar el funcionamiento Seguir los consejos y directrices incluidos en este capítulo para garantizar el funcionamiento óptimo del Sistema ACQUITY. Contenido: Tema Página Directrices generales 2-1 Calculadora de columnas ACQUITY UPLC 2-4 Dispersión 2-5 Arrastre 2-5 Precisión y exactitud 2-6 Tiempo de los ciclos (entre inyecciones) 2-6 Evitar fugas 2-7 Preparación de las muestras 2-7 Directrices generales Las directrices del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class difieren de las prácticas estándar de HPLC, principalmente debido a las limitaciones del sistema para la cromatografía de partículas pequeñas (de menos de 2 μm). La cromatografía en un sistema UPLC produce una separación de mayor resolución a una escala mucho menor que la de la HPLC. Además, la duración del análisis es menor con la UPLC, y el consumo de eluyente y muestra se ve sustancialmente reducido. El Sistema biológico de cromatografía ACQUITY UPLC H-Class requiere el funcionamiento óptimo del Sistema biológico de gestión de muestras (biosm-ftn) puesto que la dispersión de las muestras es más evidente cuando se utilizan columnas más pequeñas. La reducción del tiempo de análisis cromatográfico también hace necesaria una gestión eficaz del tiempo de los ciclos. Directrices generales 2-1

28 Durante los análisis UPLC rápidos, se debe tener en cuenta que un pico de interés puede ser muy estrecho, de menos de 0.5 segundos. Se recomienda una velocidad de adquisición de 25 a 50 puntos a lo largo del pico, lo que proporciona una buena cuantificación y representación de los picos. Las velocidades de adquisición superiores a 20 puntos por segundo producen un aumento del ruido en la línea base y, en consecuencia, hacen necesario ajustar las constantes de tiempo del filtro. El caudal óptimo de ACQUITY UPLC es diferente al de una columna de HPLC convencional. La siguiente tabla muestra las directrices de funcionamiento para columnas de ACQUITY UPLC en condiciones isocráticas y de gradiente. Los valores mostrados son aproximaciones, y la eficacia óptima para una molécula o separación puede obtenerse con un caudal o presión diferentes. Caudales óptimos por intervalo de peso molecular: Tamaño de la columna Peso molecular Caudal mm < μl/min mm μl/min mm μl/min mm μl/min Precaución: No dejar las soluciones tampón almacenadas en el sistema. Lavar todas las trayectorias del flujo, incluido el lavado de la aguja, con una cantidad suficiente de eluyente no tamponado antes de apagar el sistema. Si el sistema va a apagarse durante un periodo prolongado (de más de 24 horas), utilizar metanol al 10% - 20% en agua. Si se utiliza un eluyente de lavado tamponado, cebarlo durante 30 segundos como mínimo. El uso de soluciones tampón puede ocasionar la acumulación de sales en la aguja y el puerto de lavado, y hacer necesaria una limpieza periódica. Se deben seguir estas recomendaciones generales a la hora de realizar un análisis UPLC: 2-2 Optimizar el funcionamiento

29 Utilizar eluyentes, soluciones tampón y aditivos de alta calidad (específicos para HPLC o MS). Utilizar agua de alta calidad (específica para HPLC o MS). Se deben utilizar siempre filtros de eluyentes en los tubos de las botellas de eluyentes. Filtrar las soluciones tampón con un filtro de membrana de 0.2 μm. Almacenar las soluciones concentradas y utilizarlas para preparar las soluciones de trabajo. No superar la cantidad de solución tampón, lo que puede producir crecimiento microbiológico. No bloquear la línea de purga del desgasificador; recortar el tubo si es necesario. No se deben sumergir en líquidos los conductos de evacuación de desechos y del desgasificador. (Consultar la Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de eluyentes cuaternario ACQUITY UPLC H-Class para obtener información detallada sobre cómo dirigir los tubos). Mantener cebados los conductos de eluyentes. Lavar las soluciones tampón del sistema con un eluyente acuoso si se va a dejar el sistema inactivo durante un periodo prolongado (de más de 24 horas). Utilizar un eluyente orgánico al 10% - 20% en agua como eluyente de almacenamiento. Cebar el biosm-ftn con eluyente de purga durante 10 ciclos como mínimo. El uso de soluciones tampón en los eluyentes de lavado de la aguja puede ocasionar la acumulación de sales y hacer necesaria una limpieza periódica. Cebar el eluyente de lavado durante 30 segundos como mínimo y el eluyente de purga durante al menos 10 ciclos. Mantener el conducto del lavado de juntas cebado. El funcionamiento continuo con concentraciones de sales superiores a 1 M puede hacer que las juntas de la bomba deban cambiarse con más frecuencia que la indicada en el mantenimiento periódico programado. Para prolongar la duración de las juntas y evitar la acumulación de cristales de sales en las juntas de la bomba, se recomienda lavar periódicamente la bomba, los tubos con altas concentraciones de sales y el depósito. La concentración de sales, el caudal y otros factores pueden afectar a la frecuencia de los procedimientos de lavado. Algunas aplicaciones pueden requerir un lavado semanal. Directrices generales 2-3

30 Cebar los conductos de eluyente durante la puesta en marcha del sistema. Supervisar el nivel de desechos para garantizar que nunca llegue a niveles demasiado altos. Iniciar los gradientes con algo de contenido orgánico (0.1%, por ejemplo) para lograr la formación de un gradiente más homogéneo y predecible que cuando se inicia sin contenido orgánico. Utilizar la opción Load Ahead (Carga en cabeza) si se desea utilizar un tiempo de ciclos más corto. No utilizar la opción Load Ahead (Carga en cabeza) p Loop offline (Desconexión del bucle) cuando se solucionan problemas de arrastre. Cuando se instala o se extrae una columna, se debe mantener en su sitio, en todo momento, el conector de compresión reutilizable del precalentador activo. Rotar la columna o el filtro en línea opcional para instalarlo o extraerlo. Calculadora de columnas ACQUITY UPLC La calculadora de columnas ACQUITY UPLC es una herramienta de software que ayuda en la transferencia de métodos de un sistema HPLC a un sistema UPLC, o de un sistema UPLC a un sistema HPLC. La calculadora distingue entre los sistemas con bombas binarias y cuaternarias. Al introducir los valores de los parámetros para la separación en curso, elegir una columna objetivo que tenga un poder de resolución (L/dp) similar. (Los valores de L/dp se calculan y se muestran automáticamente). Especificar los volúmenes de residencia para los sistemas en uso y de destino (la calculadora recomienda las condiciones cromatográficas para el sistema de destino). Estas condiciones se pueden optimizar posteriormente según los requisitos particulares. Consultar también: la documentación de la calculadora de columnas ACQUITY UPLC y la Ayuda en línea de la Consola ACQUITY para obtener más información y métodos. Indicación: la calculadora puede instalarse desde el CD de controladores del Sistema ACQUITY UPLC o desde el CD del Kit de asistencia para métodos. Después de la instalación, el icono de la calculadora de columnas ACQUITY UPLC aparece en el escritorio del ordenador. 2-4 Optimizar el funcionamiento

31 Dispersión Arrastre Los sistemas UPLC y los inyectores automáticos muestran una dispersión baja (una característica fija del instrumento que se mide observando la magnitud del ensanchamiento de picos debida al diseño del sistema). La cromatografía de partículas pequeñas utiliza columnas de alta eficacia pequeñas. Una columna UPLC típica de mm tiene un volumen aproximado de 174 μl, comparado con el volumen de 2.5 ml de una columna HPLC convencional de mm. Un tamaño de columna y partículas menor requiere un sistema cuya baja dispersión reduzca la dilución y el ensanchamiento de la banda, con lo que se conserva la forma, la altura y la sensibilidad de los picos producidos por la columna de alta eficacia. El Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class muestra normalmente un ensanchamiento de banda de 20 μl (el valor depende de la configuración del sistema). Las concentraciones máximas para UPLC son más altas que las concentraciones para HPLC. Como los efectos de la solubilidad son más evidentes en los sistemas de baja dispersión y alta presión, es importante ajustar la carga de la columna adecuadamente. Se puede observar arrastre en los sistemas cromatográficos cuando un analito anteriormente inyectado aparece como un pico en el cromatrograma de las siguientes muestras. El arrastre se suele producir cuando una pequeña cantidad de analito permanece en el sistema después de inyectar una muestra. El arrastre se puede medir mediante la observación de los picos de analito que aparecen cuando se analiza una muestra en blanco justo después de una muestra analítica. Consultar también: Especificaciones del Sistema ACQUITY UPLC H-Class para obtener información sobre el arrastre en el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class. Una causa frecuente del arrastre es el lavado inadecuado del sistema. La selección de un eluyente de lavado adecuado puede reducir el arrastre en un análisis particular. El eluyente de lavado debe ser lo suficientemente fuerte como para disolver cualquier resto de muestra y la duración del lavado debe ser la suficiente como para eliminar los residuos del sistema. Las condiciones de los métodos también pueden afectar en el arrastre. Un tiempo de retención demasiado corto en las condiciones finales de un Dispersión 2-5

32 gradiente puede producir un fallo a la hora de eliminar todos los analitos del sistema, en particular si el gradiente es brusco. Es importante lavar por completo el sistema y volver a equilibrar la columna antes de proceder a un siguiente análisis. Se debe tener cuidado a la hora de seleccionar las opciones Load Ahead (Carga en cabeza) y Loop Offline (Desconexión del bucle). La inicialización de estas opciones antes de que la parte más orgánica del gradiente llegue hasta la aguja puede hacer que queden residuos de muestras en el sistema. A veces, un ahorro de tiempo puede dar lugar a una limpieza inadecuada del sistema. La hidrofobicidad y la solubilidad de las muestras, así como la limpieza durante la preparación de la muestra y la contaminación causada por las herramientas de preparación de la muestra, son factores adicionales a tener en cuenta a la hora de intentar minimizar el arrastre. Precisión y exactitud La precisión del volumen de inyección cuando se utiliza el Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class es inferior al 1% de RSD para volúmenes de inyección entre 0.2 y 10.0 μl. La exactitud del volumen de inyección del sistema es de 100 ± 2%. (Consultar las Especificaciones del Sistema ACQUITY UPLC H-Class para obtener más información). Tiempo de los ciclos (entre inyecciones) El tiempo de análisis corto de una separación UPLC requiere un uso eficaz del tiempo entre análisis. El biosm-ftn cuenta con una opción de carga en cabeza que puede ayudar a reducir la duración de los ciclos. Esta opción indica al biosm-ftn que aspire la siguiente muestra mientras se analiza otra. La opción Loop Offline (Desconexión del bucle) del Sistema biológico de gestión de muestras de flujo a través de aguja reduce el impacto del volumen de retardo sobre la duración de los ciclos mediante la desconexión de la aguja y el bucle de extensión antes de que el gradiente llegue a la válvula de inyección y después de que la muestra se transfiera hasta el puerto de inyección. Una configuración adecuada de la velocidad de aspiración de la jeringa también puede ayudar a reducir el tiempo de los ciclos. De forma predeterminada, el sistema utiliza la información que recibe de un transductor de presión para optimizar la velocidad de aspiración de la jeringa para obtener un funcionamiento óptimo y el máximo rendimiento. 2-6 Optimizar el funcionamiento

33 Evitar fugas La prevención de fugas garantiza que el sistema mantenga una presión adecuada y una integridad de muestras a lo largo del análisis. Las fugas se pueden producir en cualquier conexión de los tubos, en la junta térmica de estanqueidad o en las juntas, pero son más frecuentes en las conexiones de los tubos. Las fugas de baja presión (en el lado de entrada de la bomba del bioqsm) producen pérdida de eluyente e introducción de aire durante el ciclo de entrada. Las fugas en las conexiones de alta presión (situadas después de la válvula i 2 ) pueden hacer que salga eluyente, pero no que entre aire. Para evitar fugas se deben seguir las recomendaciones de Waters para apretar correctamente las conexiones del sistema. Debe tenerse en cuenta que la técnica que se utiliza para volver a apretar las conexiones es distinta a la que se emplea para instalarlas. Preparación de las muestras El análisis UPLC impone algunas restricciones adicionales en la preparación de las muestras. Partículas El reducido tamaño del fritado de la columna (0.2 μm) se puede obstruir más fácilmente que en el caso de los fritados mayores de las columnas HPLC (2.0 μm). Como resultado, es fundamental que los eluyentes de fase móvil y las soluciones de muestras estén libres de partículas para el análisis UPLC. Consultar la sección Directrices generales en la página 2-1 para obtener recomendaciones sobre cómo seleccionar y manipular eluyentes. Diluyentes de muestras compatibles Cuando se utiliza la opción de dilución automática en el biosm-ftn, el eluyente de purga se utiliza como diluyente de muestras. Se debe comprobar que la solución de muestra es soluble y miscible con el eluyente de purga seleccionado. Evitar fugas 2-7

34 2-8 Optimizar el funcionamiento

35 3 Preparar el sistema Contenido: Tema Página Preparar el hardware del sistema 3-1 Configurar el software de datos cromatográficos 3-8 Paneles de control ACQUITY 3-8 Puesta en marcha de la Consola ACQUITY UPLC 3-15 Preparar el hardware del sistema Encender el sistema El encendido del sistema conlleva la puesta en marcha de la estación de trabajo del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class, los módulos del sistema y el software del sistema de datos cromatográficos. Cada dispositivo o instrumento emite tres pitidos y realiza una serie de pruebas de inicialización. Indicación: si el sistema incluye un módulo de compartimento de columnas, éste se encenderá automáticamente al encender el biosm-ftn. Para encender el sistema: 1. Encender el bioqsm y el biosm-ftn pulsando el interruptor de encendido situado en la parte superior izquierda de la puerta de cada dispositivo. Consultar también: las secciones Indicador LED de encendido en la página 3-2 y Indicadores LED de estado en la página 3-3 para obtener información sobre cómo interpretar los modos del indicador LED del estado de flujo en el dispositivo o el instrumento, o bien para comprobar que las unidades están encendidas. Preparar el hardware del sistema 3-1

36 2. Cuando los indicadores LED del bioqsm y el biosm-ftn se enciendan de color verde fijo, pulsar el interruptor de encendido situado en la parte superior izquierda del detector (o detectores). Indicación: para evitar errores de inicialización, solamente se deben encender los detectores cuando la cubeta de flujo esté mojada. 3. Iniciar el software cromatográfico. Indicación: se puede observar si en la Consola ACQUITY UPLC aparecen mensajes e indicaciones de LED. Supervisión de las pruebas iniciales Estas pruebas comienzan al encender la estación de trabajo del Sistema biológico ACQUITY UPLC H-Class: Tarjeta CPU Memoria (RAM y ROM) Sistema de comunicaciones externo (Ethernet) Reloj Si las pruebas de puesta en marcha indican un funcionamiento erróneo, consultar la Ayuda en línea de la Consola. Supervisar los indicadores LED de los módulos del sistema Los diodos luminosos (LED) de que dispone cada módulo del sistema indican cuál es su estado de funcionamiento. Los indicadores LED son específicos para cada módulo, por lo que el significado de sus distintos colores y modos de funcionamiento puede variar de un módulo a otro. Indicador LED de encendido El indicador LED de encendido, situado del lado izquierdo en el panel frontal de un dispositivo o instrumento, indica si el módulo está encendido o apagado. El indicador LED es de color verde cuando la unidad recibe corriente y se apaga cuando no la recibe. Indicación: con el fin de procurar una ventilación adecuada, los ventiladores del biosm-ftn funcionan de manera continuo, incluso cuando el interruptor de encendido se encuentra en la posición off ( desconectado ). Los ventiladores solamente se apagan cuando el cable de alimentación se desconecta de la parte trasera del instrumento. 3-2 Preparar el sistema

37 Indicadores LED de estado Indicador LED de flujo (bioqsm) El indicador LED de flujo, situado a la derecha del indicador LED de encendido en el panel frontal del bioqsm, indica el estado del flujo. Un indicador LED de flujo de color verde continuo indica que circula flujo a través del Sistema de gestión de eluyentes cuaternario. Indicador LED de análisis (biosm-ftn) El indicador LED de análisis, situado a la derecha del indicador LED de encendido en el panel frontal del biosm-ftn, indica el estado del análisis. Un indicador LED de análisis de color verde continuo indica que se están analizando inyecciones. Indicador LED de la lámpara (detector) El indicador LED de la lámpara, situado a la derecha del indicador LED de encendido en el panel frontal del detector, indica el estado de la lámpara. Un indicador LED de la lámpara de color verde continuo indica que la lámpara está encendida. Indicaciones del LED de estado: Modo y color del indicador LED Apagado Verde continuo Descripción bioqsm y biosm-ftn: indica que el dispositivo se encuentra inactivo. Detector: indica que la lámpara del detector está apagada. bioqsm: indica que está fluyendo eluyente. biosm-ftn: indica que el biosm-ftn está funcionando normalmente, intentando analizar las muestras pendientes o realizar las funciones de diagnóstico solicitadas. Cuando finalicen las funciones de diagnóstico y de análisis de muestras solicitadas, el indicador LED volverá a apagarse. Detector: indica que la lámpara del detector está encendida. Preparar el hardware del sistema 3-3

38 Indicaciones del LED de estado: (continuación) Modo y color del indicador LED Verde intermitente Rojo intermitente Rojo continuo Descripción bioqsm y biosm-ftn: indica que el dispositivo se está inicializando. Detector: indica que el detector se está inicializando o calibrando. Indica que un error ha detenido el instrumento o dispositivo. Consultar la consola para obtener información sobre el error. Indica que se ha producido un fallo en un instrumento o dispositivo que impide seguir utilizándolo. Apagar la unidad y después volver a encenderla. Si el indicador LED continúa de color rojo continuo, ponerse en contacto con un representante del Servicio Técnico de Waters. Activar los sensores de fugas Regla: al encender el sistema, los sensores de fugas estarán desactivados por defecto a menos que se hayan activado previamente. Para activar los sensores de fugas: 1. En la consola, seleccionar Control > Leak Sensors (Control > Sensores de fugas). 3-4 Preparar el sistema

39 Cuadro de diálogo Leak Sensors: Hacer clic para activar o desactivar todos los sensores de fugas del instrumento. 2. Para activar el sensor de fugas para un módulo concreto, hacer clic en el estado, a la izquierda de la descripción del módulo. Indicación: para activar todos los sensores de fugas, hacer clic en Enable All (Activar todos). Puesta en marcha del sistema Utilizar la función Start up (Puesta en marcha) para cebar el bioqsm tras cambiar la fase móvil, la aguja de muestras o bien después de que el sistema haya estado inactivo durante un largo periodo de tiempo (por ejemplo, durante toda la noche). Se debe comprobar que el sistema se encuentra correctamente configurado para su utilización antes de realizar este procedimiento. Recomendación: cebar el bioqsm durante 5 minutos como mínimo si se va a realizar un cambio de eluyentes por otros que tengan una composición diferente a la de los que ya se encuentran en el sistema. Para poner en marcha el sistema: Hacer clic para activar o desactivar cada uno de los sensores de fugas del instrumento. 1. En la consola, hacer clic en Control > Start up system (Control > Puesta en marcha del sistema). 2. Comprobar los ajustes de A/B/C/D Solvents (Eluyentes A/B/C/D) (fase móvil) en la pestaña Prime Solvents (Cebar eluyentes) del cuadro de diálogo System Startup (Puesta en marcha del sistema). Preparar el hardware del sistema 3-5

40 Indicaciones: En el área A/B/C/D Solvents (Eluyentes A/B/C/D), se pueden seleccionar o desactivar algunos o todos los eluyentes: A, B, C, D. Se puede modificar la duración del proceso de cebado de los eluyentes A a D introduciendo un valor diferente en el campo Duration of Prime (Duración del cebado). Todos los eluyentes seleccionados se cebarán durante el mismo tiempo. Para volver a establecer los valores originales en cualquier ficha, hacer clic en Set Defaults (Establecer valores predeterminados). Valor predeterminado: todos los eluyentes se ceban durante 2.0 minutos cada uno. (Intervalo: de 0.1 a 60.0 minutos). Recomendación: cebar durante 3 minuto durante 7 minutos después de cambiar de eluyentes. Precaución: No dejar las soluciones tampón almacenadas en el sistema. Lavar todas las trayectorias del flujo, incluido el lavado de la aguja, con una cantidad suficiente de eluyente no tamponado antes de apagar el sistema. Si el sistema va a apagarse durante un periodo prolongado (de más de 24 horas), utilizar metanol al 10% - 20% en agua. Si se utiliza un eluyente de lavado tamponado, cebarlo durante 30 segundos como mínimo. El uso de soluciones tampón puede ocasionar la acumulación de sales en la aguja y el puerto de lavado, y hacer necesaria una limpieza periódica. 3. Seleccionar o limpiar el cebado del lavado de juntas, el eluyente de lavado y el eluyente de purga. Si es necesario, se debe modificar la duración especificada para cebar el lavado de juntas y el eluyente de lavado, así como el número de ciclos especificado para cebar el eluyente de purga. Valor predeterminado: el lavado de juntas se ceba durante 2.0 minutos, el eluyente de lavado durante 15 segundos y el eluyente de purga durante 5 ciclos. 3-6 Preparar el sistema

41 4. Seleccionar la ficha Equilibrate to Method (Equilibrar según método) para comprobar los ajustes del caudal, la fase móvil, la composición, las temperaturas y el estado de la lámpara en estado de equilibrio. Valores de la ficha Equilibrate to Method: Parámetros de la puesta en marcha del sistema Valores predeterminados Valores permitidos Caudal inicial del método Composición de A, B, C y D (la suma debe ser 100%) Temperatura de la columna Temperatura de la muestra Lámpara ml/min De 0.1 a 2.0 ml/min A: 100% B,C,D: 0% Off (Desconectado) Off (Desconectado) A: de 0 a 100% B: de 0 a 100% C: de 0 a 100% D: de 0 a 100% Depende del tipo de módulo de compartimento de columna Off (Desactivada), o de 4.0 a 40.0 C On (Conectado) Encendida o apagada Nota: para las cubetas de flujo con paso de luz, no se debe conectar la lámpara del detector, ni trabajar con ella o encenderla si no existe flujo a través de la cubeta o si la cubeta de flujo está seca. 5. Hacer clic en Start (Iniciar). Resultado: se enciende la lámpara en el detector óptico, el sistema establece la temperatura de la muestra y de la columna, y comienzan todos los cebados. Al finalizar el cebado, el sistema de gestión de muestras caracteriza la junta y la aguja, si se ha seleccionado esta opción, y luego registra los resultados de la caracterización en la base de datos. Por último, el sistema establece el caudal del método, las selecciones de eluyente y la composición. Preparar el hardware del sistema 3-7

42 Configurar el software de datos cromatográficos Configurar el software del sistema de datos cromatográficos para utilizarlo con ACQUITY: Iniciar el software del sistema de datos cromatográficos e iniciar una sesión. Seleccionar los instrumentos del sistema y darle un nombre al sistema (consultar la Ayuda de Empower o MassLynx para obtener información detallada). Abrir la consola ACQUITY y los paneles de control. Paneles de control ACQUITY Se pueden supervisar los paneles de control del bioqsm, el biosm-ftn y el detector desde el sistema de datos cromatográficos. Paneles de control: Si el sistema está controlado por el software Empower, los paneles de control aparecen en la parte inferior de la ventana Run Samples (Analizar muestras). Si el software MassLynx controla el sistema, los paneles de control aparecen en la ficha Additional Status (Estado adicional) de la ventana Inlet Editor (Editor de entrada). Panel de control del bioqsm El panel de control del bioqsm muestra los parámetros de estado del flujo, presión del sistema, caudal total y composición del eluyente. Regla: estos parámetros se pueden modificar cuando el sistema está inactivo, haciendo clic en el valor subrayado. Los parámetros del sistema de gestión de eluyentes cuaternario no se pueden modificar durante el análisis de muestras. 3-8 Preparar el sistema

43 Panel de control del bioqsm: Estado Presión del sistema Composición de eluyentes Indicador LED de caudal Caudal Detener flujo Elementos del panel de control del bioqsm: Elemento del panel de control Indicador LED de caudal Estado Presión del sistema Caudal Composición de eluyentes (Detener flujo) Descripción Muestra el LED de flujo real situado en el panel frontal del bioqsm, a menos que se haya perdido la comunicación con el bioqsm. Muestra el estado de funcionamiento actual. Muestra la presión del sistema en kpa, bar o psi. Las unidades de presión se pueden personalizar a través de la consola. Muestra el caudal de eluyente que pasa por todos los tubos del bioqsm: de a ml/min en condiciones de funcionamiento normales y de a ml/min cuando se realiza el cebado. Muestra el porcentaje de eluyente que se va a extraer de los conductos de eluyentes (A a D). Los valores de la composición oscilan entre 0.0% y 100.0%. Detiene por completo el flujo procedente del bioqsm. Paneles de control ACQUITY 3-9

44 Se puede acceder a estas funciones adicionales haciendo clic con el botón derecho del ratón en cualquier lugar del panel de control del bioqsm: Funciones adicionales del panel de control del bioqsm: Función del panel de control Start up system (Poner en marcha el sistema) Prime solvents (Cebar eluyentes) Prime seal wash (Cebar el lavado de las juntas) Wash plungers (Lavar émbolos) Launch ACQUITY UPLC Console (Ejecutar la Consola ACQUITY UPLC) Descripción Pone el sistema en funcionamiento después de un período de inactividad prolongado o cuando se cambia a un eluyente distinto. Consultar la sección Puesta en marcha del sistema del documento Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de eluyentes cuaternario. Muestra el cuadro de diálogo Prime Solvents (Cebar eluyentes). Consultar la sección Cebar el sistema de gestión de eluyentes cuaternario del documento Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de eluyentes cuaternario. Inicia el cebado del lavado de juntas. Consultar la sección Cebar el sistema de lavado de juntas del documento Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de eluyentes cuaternario. Inicia la secuencia de lavado del émbolo, que llena y luego vacía lentamente las cámaras primaria y del acumulador (con la composición de eluyente utilizada) mientras se realiza el lavado de juntas de alta velocidad/volumen elevado. De esta manera se evita la acumulación de precipitados en los émbolos de la bomba, los cuales pueden dañar las juntas de alta presión. Inicia la consola Preparar el sistema

45 Funciones adicionales del panel de control del bioqsm: (continuación) Función del panel de control Reset QGM (Reiniciar el QGM) Ayuda Descripción Restablece el bioqsm tras un error. Muestra la Ayuda en línea de la consola. Panel de control del biosm-ftn El panel de control del biosm-ftn indica las temperaturas programadas y reales del compartimento de muestras y del módulo de compartimento de columnas. Estos valores se pueden modificar cuando el sistema está inactivo, haciendo clic en el valor subrayado. En cambio, los valores programados del sistema de gestión de muestras no se pueden modificar durante el análisis de muestras. Indicaciones: Para mantener el compartimento de muestras a una temperatura constante, abrir la puerta sólo cuando sea necesario. Los ventiladores del biosm-ftn dejan de proyectar aire cuando se abre la puerta del compartimento de muestras. Panel de control del biosm-ftn: Estado Indicador LED de análisis Temperatura actual del compartimento de muestras Valor programado del compartimento de muestras Valor programado del horno de columnas Temperatura actual del horno de columnas Visualización de la Consola ACQUITY UPLC Elementos del panel de control del biosm-ftn: Elemento del panel de control Descripción Indicador LED de análisis Muestra el indicador LED de análisis real en el panel frontal, a menos que se produzca una pérdida de comunicaciones. Estado Muestra el estado de funcionamiento actual. Paneles de control ACQUITY 3-11

46 Elementos del panel de control del biosm-ftn: (continuación) Elemento del panel de control Descripción Temperatura actual del compartimento de muestras Valor programado del compartimento de muestras Temperatura actual del horno de columnas Valor programado del horno de columnas (Visualización de la consola) Muestra la temperatura actual del compartimento de muestras con una resolución de 0.1 C, aunque esté deshabilitado el control de temperatura activo. Muestra el valor programado actual del compartimento de muestras con una resolución de 0.1 C. Cuando el control de temperatura activo está deshabilitado, este campo muestra Off (Desactivado). Muestra la temperatura actual del horno de columnas con una resolución de 0.1 C, aunque esté deshabilitado el control de temperatura activo. Muestra el valor programado actual del horno de columnas con una resolución de 0.1 C. Cuando el control de temperatura activo está deshabilitado, este campo muestra Off (Desactivado). Muestra la Consola ACQUITY UPLC. Se puede acceder a funciones adicionales haciendo clic con el botón derecho del ratón en cualquier lugar del panel de control del biosm-ftn. Funciones adicionales del panel de control del biosm-ftn: Función del panel de control Prime (Cebar) Descripción Muestra el cuadro de diálogo Prime (Cebar). Consultar la sección Cebar la SM-FTN del documento Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de muestras con flujo a través de aguja Preparar el sistema

47 Funciones adicionales del panel de control del biosm-ftn: (continuación) Función del panel de control Wash needle (Lavar aguja) Reset SM (Reiniciar el sistema de gestión de muestras) Ayuda Descripción Muestra el cuadro de diálogo Wash Needle (Lavar aguja). Consultar la sección Lavar la aguja del SM-FTN del documento Información de mantenimiento y descripción general de funcionamiento del sistema de gestión de muestras con flujo a través de aguja. Restablece el sistema de gestión de muestras tras un error. Muestra la Ayuda en línea de la consola. Panel de control del Detector de absorbancia programable (UV variable) El panel de control del Detector TUV muestra las unidades de absorbancia y los valores de longitud de onda, parámetros que se pueden modificar cuando el sistema se encuentra en inactivo haciendo clic en el valor subrayado. No obstante, los parámetros del detector no se pueden modificar durante el análisis de muestras. Los paneles de control de otros detectores funcionan de manera similar. Si el sistema incluye un detector PDA, se recomienda consultar la Guía de iniciación al Detector de red de fotodiodos UPLC para ACQUITY. Panel de control del Detector TUV: Estado Unidades de absorbancia Valor de longitud de onda A Indicador LED de la lámpara (encendida/apagada) Encender/apagar la lámpara del detector Paneles de control ACQUITY 3-13