UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TERMO-TOLERANCIA Y EFICACIA IN VITRO DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Metarhizium anisopliae (Ma14) SOBREL EL CONTROL DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus. TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE: TESIS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: JOSÉ ANTONIO AGUILAR BARRADAS ASESORES: DR. MIGUEL ÁNGEL ALONSO DÍAZ DRA. MA. REBECA ACOSTA RODRÍGUEZ VERACRUZ, VER. FEBRERO 2010

2 ÍNDICE GENERAL I. INTRODUCCIÓN... 1 Pag. II. ANTECEDENTES La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus y su ciclo biológico Métodos de control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus Metarhizium anisopliae 10 III. JUSTIFICACIÓN IV. HIPÓTESIS.. 14 V. OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos VI. MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio Cepa de Metarhizium anisopliae y condiciones de cultivo Cepa de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus Experimento 1. Termo-tolerancia y porcentaje de germinación in vitro de M. anisopiae. 17 i

3 6.5. Experimento 2. Termo-tolerancia y crecimiento de colonias in vitro de M.anisopliae Experimento 3. Termo-tolerancia y eficacia in vitro de Metarhizium anisopliae (Ma14) sobre el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus Diseño experimental y análisis estadístico. 19 VII. RESULTADOS Termo-tolerancia y porcentaje de germinación in vitro de M. anisopliae Termo-tolerancia y crecimiento de colonias in vitro de M. anisopliae Termo-tolerancia y eficacia in vitro del hongo entomopatógeno M. anisopliae sobre el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 24 VIII. DISCUSIÓN Termo-tolerancia y porcentaje de germinación in vitro de M. anisopliae Termo-tolerancia y crecimiento de colonias in vitro de M. anisopliae Termo-tolerancia y eficacia in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae sobre el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 28 ii

4 IX. CONCLUSIONES X. REFERENCIAS iii

5 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Efecto del hongo M. anisopliae sometidos a diferentes tratamientos de temperatura y tiempo sobre la mortalidad de larvas de R. microplus. 24 Pag. iv

6 ÍNDICE DE FIGURAS Pag. Figura 1. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 28 C.. 20 Figura 2. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 37 C.. 20 Figura 3. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 47 C Figura 4. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae, sometido a tres tratamientos de tempertura Figura 5. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 28 C. 22 Figura 6. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 37 C Figura 7. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 47 C 23 Figura 8. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a tres tratamientos de temperatura. 23 Figura 9. Comparación del efecto del hongo M. anisopliae sometido a diferentes temperaturas durante 90 minutos sobre el porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus. 25 Figura 10. Comparación del efecto del hongo M. anisopliae sometido a diferentes temperaturas durante 180 minutos sobre el porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus.. 25 v

7 DEDICATORIA A mis padres, el Sr. Antonio Aguilar Palacios y la Sra. Rosa Barradas Barradas por todo el cariño, y por el esfuerzo que realizaron día a día para que yo me forje como un profesionista, con todo mi amor les dedico este trabajo como fruto de su sacrificio; los amo. A mis hermanos, Iván, Rosario y Berenice, por el apoyo incondicional para que yo terminara mi carrera. vi

8 AGRADECIMIENTOS Al Macroproyecto UNAM Línea 7, Productividad sostenible de los hatos de cría en pastoreo del proyecto: USO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE LA GARRAPATA R. microplus. Al Dr. Carlos Gutiérrez Aguilar, por su apoyo para la realización de este trabajo. A mis asesores: Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz Dra. Ma. Rebeca Acosta Rodríguez A la MVZ. Ma. Esther Muñoz Pérez por su apoyo incondicional durante toda mi carrera y su disponibilidad en cada momento. A mis amigos que durante toda mi carrera estuvieron conmigo compartiendo momentos que jamás se olvidaran. Al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT) por haberme permitido realizar el presente trabajo, así como también por la estancia tan agradable que me ofrecieron vii

9 RESUMEN Aguilar Barradas José Antonio Termo-tolerancia y eficacia in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Ma14) sobre el control de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Tesis. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. Veracruz, Veracruz. México. Directores: Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz y Dra. Ma. Rebeca Acosta Rodríguez. Los objetivos de este estudio fueron: 1) evaluar la termo-tolerancia y el porcentaje de germinación de esporas in vitro del hongo entomopatógeno M. anisopliae (Ma14) en un medio de agar Sabouraud dextrosa (ASD), 2) evaluar la termo-tolerancia y el crecimiento de colonias de M. anisopliae (Ma14) en un medio de ASD, y 3) evaluar la termo-tolerancia y la eficacia del mismo hongo sobre el control de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Se realizaron tres experimentos donde en cada uno se expuso el hongo a tres tratamientos de temperatura (28 C, 37 C y 47 C) durante 180 minutos. En cada experimento se realizaron tres réplicas por tratamiento. En el experimento 1, se sembraron 30 µl de una solución del hongo 1 x 10 6 en ASD y se realizaron conteos mediante observación directa a 40X cada tres horas durante 48 h continuas. Para el experimento 2, se sembraron 15 µl del hongo a la misma concentración y se realizaron mediciones de las colonias cada 6 horas durante 156 horas continuas. Para el experimento 3, se utilizó la Prueba de Inmersión de Larvas para evaluar el efecto del hongo sobre la mortalidad larvaria. Para el análisis estadístico se utilizaron las pruebas de U Mann Withney, Kruskal Wallis y t de Studen. No hubo efecto del tratamiento (T ) sobre el porcentaje de germinación de esporas y sobre el crecimiento de colonias después de 48 h y 156 h de incubación, respectivamente (P>0.05). El porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus de la cepa Ma14 fue similar después de la exposición a 28, 37 y 47 C durante 180 minutos (P>0.05). Se concluye que la cepa Ma14 del hongo M. anisopliae fue capaz de tolerar temperaturas de hasta 47 C sin afectar su patogenicidad contra larvas de R. microplus, sin embargo, es necesario corroborar esta eficacia en campo en diferentes épocas del año. viii

10 I. INTRODUCCIÓN. Las garrapatas y las enfermedades que transmiten, representan uno de los principales problemas que afectan a la ganadería bovina a nivel mundial (Polar et al., 2005). Dentro de éstas, la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es el ectoparásito que causa las mayores pérdidas económicas en los hatos bovinos del trópico mexicano (Rodríguez-Vivas y Domínguez-Alpizar, 1998). El principal método de control de las garrapatas es la aplicación de acaricidas químicos; sin embargo, el uso frecuente e indiscriminado de estos productos puede favorecer el desarrollo de cepas de garrapatas resistentes a los acaricidas y tener efectos secundarios sobre el medio ambiente así como influir en la presencia de residuos químicos en los alimentos de origen animal (Fernandes y Bittencourt, 2008; George et al., 2004). En México se han diagnosticado cepas de garrapatas resistentes a las principales familias químicas de ixodicidas: Organofosforados, Piretroides (Rodriguez-Vivas et al, 2006a), Amidinas (Rosado-Aguilar et al., 2008a; Rodríguez-Vivas et al., 2006b) y Lactonas macrocíclicas (Perez-Cogollo et al., 2009). Por lo tanto, existe la necesidad de investigar nuevas alternativas de control de las poblaciones de R. microplus (Alonso-Díaz et al., 2006). El control biológico, mediante el uso de hongos entomopatógenos, ha sido sugerido por diversos investigadores como una de las alternativas con mayor futuro para el control de las garrapatas en los bovinos (Fernandes y Bittencourt, 2008; Alonso-Díaz et al., 2007; Polar et al., 2005; Samish et al., 2004). Dentro de estos, Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana son los hongos que han mostrado mayor patogenicidad contra R. microplus bajo condiciones de laboratorio 1

11 y de campo. Metarhizium anisopliae ha demostrado alta patogenicidad in vitro contra diferentes estadios de R. microplus (Ojeda, 2007). Sin embargo, bajo condiciones de campo se han reportado inconsistencias en el efecto ixodicida del hongo, probablemente debido a factores relacionados con el medioambiente tales como temperatura (T ), rayos ultravioleta (UV), y factores relacionados al hospedero como la Tº, que afectan el crecimiento de M. anisopliae (Samish et al., 2004). Uno de los principales factores que pueden afectar la persistencia y la eficacia en campo de M. anisopliae es la termo-tolerancia que posean las cepas. El rango optimo de Tº para el crecimiento de M. anisopliae es de 25 35º C (Cooney y Emerson, 1964) y el límite de Tº máxima para la germinación de las conidias de M. anisopliae es de 37º C (Walstad et al., 1970) y para el crecimiento de las hifas de 37 40º C (Fargues et al., 1997, 1996). Estudios recientes han identificado algunas cepas de M. anisopliae que pueden tolerar temperaturas de hasta 48º C sin afectar su actividad biológica (Li y Feng, 2009; Rangel et al., 2005). Es deseable encontrar hongos que muestren tolerancia a las altas temperaturas (similares a aquellas alcanzables en verano), sin afectar la patogenicidad contra R. microplus. En un estudio previo, Alonso-Díaz et al. (2007) reportaron que la aplicación directa de M. anisopliae sobre bovinos infestados en forma natural con R. microplus, redujo significativamente las poblaciones de garrapatas. No obstante, en este estudio la aplicación del hongo se realizó a las siete de la noche con la finalidad de evitar las altas temperaturas y los rayos UV. Es necesario evaluar la termo-tolerancia de diversas cepas de M. anisopliae bajo condiciones de temperatura (Tº) y humedad relativa similares a las que se tienen en condiciones naturales con la finalidad de disponer de cepas que se puedan 2

12 aplicar durante el transcurso del día sin que se afecte su viabilidad. Ya que no existen estudios sobre la termo-tolerancia de la cepa Ma14 de M. anisopliae en condiciones de laboratorio y de campo. 3

13 II. ANTECEDENTES 2.1. LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus Y SU CICLO BIOLÓGICO. Las garrapatas son ácaros artrópodos que se clasifican en dos familias: 1) la ixodidae o garrapatas duras y 2) la argasidae o garrapatas blandas. La garrapata R. microplus (Ixodidae) se considera el parásito de mayor importancia económica para la ganadería de las regiones tropicales y subtropicales (Solís, 1991; Cen et al., 1998). Esta garrapata presenta un ciclo de vida de un solo hospedero, que preferentemente son los bovinos, pero también puede llegar a infestar a equinos (Labruna et al., 2001) ovinos, caprinos y venados (George, 1990). Solís (1993), Popham y Garris (1991) y Núñes et al. (1982) dividen el ciclo biológico de R. (Boophilus) microplus en dos fases: 1) fase no parásita o de vida libre, que inicia desde el desprendimiento de la teleogina (garrapata adulta engurgitada) hasta la aparición de las larvas en la vegetación; y 2) fase parásita o de vida parasitaria, que comienza una vez que las larvas infestan al hospedero y termina con el desprendimiento de las teleoginas. El ciclo de vida libre o fase no parasita, se clasifica en (Núnez et al., 1982): i). Prootoquia o preoviposición, es el periodo que comprende desde el desprendimiento de la teleogina hasta la oviposición, el cual tiene una duración en verano de 2-4 días mientras que en invierno se amplía hasta 90 y 97 días. 4

14 ii). Ootoquia u oviposición, es el tiempo que transcurre desde el desove del primer huevo hasta el último (Núñes et al., 1982). Esta fase se desarrolla durante un periodo de días (Solís, 1993). iii). Metatoquia, es la fase que ocurre entre el cese de la oviposición y la muerte de la teleogina, este periodo varía de 2-5 días siendo muy raros los especímenes que rebasan los ocho días (Núñes et al., 1982). iv). Incubación, es el periodo desde que inicia la oviposición hasta la emergencia de las larvas, este es el estado del ciclo biológico más susceptible a los factores ambientales debido a que condiciones de temperatura y humedad pueden acortarlo o alargarlo. Núñes et al. (1982) mencionan un promedio de incubación de 15 días en verano y un máximo de 51 días en invierno. Cen et al. (1998), bajo condiciones de laboratorio, menciona un promedio de 24 días. v). Eclosión, es la etapa en donde la larva emerge del huevo. Bajo condiciones controladas de laboratorio, el porcentaje de eclosión es superior al 80% (Núñes et al, 1982). vi). La vida larvaria libre, es el tiempo que ocurre desde la eclosión larval hasta el encuentro del hospedero; poco después de eclosionar las larvas suben al pasto ascendiendo hasta el extremo de las hojas, donde se ubican preferentemente en la cara sombreada, para evitar la luz solar (Castellanos, 1993). Se ha observado que en los meses húmedos ocurre una mayor viabilidad larvaria comparado a los meses secos, varía desde 22 días hasta 5

15 240 días (Solís, 1993) en estudios realizados in vitro el tiempo fluctua entre 10 y 70 días en verano y hasta 250 días en invierno y otoño (Núñes et al., 1982). El proceso que completa el ciclo de desarrollo de la garrapata lo constituye la fase parásita que corresponde a una serie de eventos que ocurren en el hospedero, y dura en promedio 21 días. Es la fase donde las garrapatas se alimentan de sangre del hospedero, realizándose también los procesos de muda o cambio de estadio de larva a ninfa y de ninfa a adulta. Se ha determinado que la transición de ninfas a adultos se presenta a partir del día 5 al 14 y del 13 al 25 respectivamente, después del establecimiento larvario al hospedero. Esta fase finaliza con el desprendimiento de la teleogina para iniciar la oviposición. Núñes et al. (1982), mencionan que la fase parásita es poco variable y se divide en tres etapas: i). Etapa larval, la principal característica morfológica son tres pares de patas y en el hipostoma doble hilera dentaria. Una vez sobre el hospedero, las larvas se mueven rápidamente a través de la piel del hospedero, buscando los lugares más apropiados para fijarse, que generalmente son: la zona de piel laxa y con rica vascularización, tales como la entrepierna, papada, cuello y borde anterior de las orejas, donde en conjunto se localiza normalmente el 95% de la población parasitaria de R. (Boophilus) microplus. La mayoría de las larvas se fijan en minutos y más del 90% comienzan a alimentarse en las primeras 24 h. ii). Etapa ninfal, con visibles diferencias morfológicas, cuatro pares de patas y triple hilera dentaria en el hipostoma. Al final de esta etapa el dimorfismo 6

16 sexual es evidente. Las ninfas después de alimentarse permanecen en el hospedero y emergen como adultos. iii). Etapa adulta, presentan cuatro pares de patas y cuatro hileras dentarias en el hipostoma. Al abrirse longitudinalmente, de las metaninfas de menor tamaño y color más oscuro, emergen los machos. Cada macho puede fertilizar 18 hembras y permanecer en el hospedoro hasta 48 días posterior a la muda (Davey, 1986). De las metaninfas de mayor tamaño y peso (50% de la población), y posterior a la fecundación (4-6 mm) ocurre el desprendimiento después de alcanzar un tamaño de 7-13 mm de largo por 4-8 mm de ancho MÉTODOS DE CONTROL DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El control de R. microplus consta de dos estrategias principales: la primera estrategia es el método de control químico que esta basado en el uso de sustancias químicas o ixodicidas y ha sido, a través de los años, la estrategia de control más utilizada (López, 2005). Las familias de ixodicidas que más se han empleado han sido los organoclorados (OC), organofosforados (OF), piretroides (PS), amidinas (A), fenilpirazolonas (F) y lactonas macrocíclicas (LM) (Rosario y Hernández, 2001). La segunda estrategia son alternativas de control no químico dentro de las cuales las más estudiadas son las siguientes: i) Uso de razas de bovinos resistentes. Se ha demostrado que las razas Bos indicus presentan mayor resistencia en comparación con las razas Bos taurus (Norval et al., 1996). La cruza de ganado puede reducir la cantidad de 7

17 garrapatas lo cual permite que exista un mejor control de las mismas (Solomon y Kaaya, 1996). ii) Manejo de pastizales. Este tipo de control consiste en la rotación de potreros y/o la introducción de especies forrajeras que disminuyen la carga de larvas en el pastizal (Benavides et al., 2000). Con relación al uso de variedades de pastos con efecto antigarrapata o efecto repelente se han investigado, entre otros, Brachiaria brizantha, Melinis minutiflora y Stylosanthes sp (Sutherst, 1978). iii) Uso de plantas con efecto ixodicida (De Freitas y Souza, 2007; Tedonkeng et al., 2005). El uso de extractos de plantas es una alternativa potencial para el control de garrapatas ya que produce altos niveles de mortalidad y reduce la eficiencia repructiva de las hembras adultas, además de que no se desarrollla resistencia por parte de las garrapatas. (Rosado-Aguilar et al., 2009, 2008b). iv) Uso de vacunas. Este método de control se basa en la inoculación de antígenos ocultos del intestino de las garrapatas, que al inyectarlos en el bovino, produce anticuerpos que lo protege de infestaciones posteriores en contra del intestino de las garrapatas que funcionan sobre él cuando la garrapata los ingiere al alimentarse de la sangre del hospedero. Actualmente se conocen dos vacuna comerciales: Gavac (Cuba) y TickGard (Australia) (Jonsson y Matschoss, 1998). v) Hongos entomopatógenos (Alonso-Díaz et al., 2007; Bittencourt, 1997; Bittencourt et al., 1989;). Los hongos entomopatógenos se usan 8

18 frecuentemente para el control de plagas en los cultivos agrícolas (Roddam y Rath, 1997; Kaaya et al, 1993; Anderson et al 1988; Ferron, 1981). No obstante varios estudios han demostrado que los hongos entomopatógenos, no solo causan la mortalidad de muchas especies de garrapatas, sino que también reducen las siguientes generaciones, esto debido a los efectos que tienen sobre la eficacia reproductiva (Fernandes y Bittencourt, 2008). Beauveria bassiana y Metarhiziun anisopliae, poseen mayores ventajas para el control biológico de insectos (Fuxa, 1997).Estos hongos poseen ciertas propiedades que se derivan de las características de los organismos entomopatógenos en general (Vilcinskas et al., 1997). i). ii). Poseen un alto poder residual Conservan su virulencia en la preparación y antes de la dispersión del inocuo en el campo. iii). La especificidad, se define como el conjunto de adaptaciones recíprocas entre microorganismos patógenos y sus hospederos en relación con las condiciones del medio en las cuales se encuentren. iv). Tienen posibilidades de multiplicación y conservación en condiciones económicas rentables. v). Su alto poder patógeno es suficientemente estable Metarhizium anisopliae. Metarhizium anisopliae es un hongo entomopatógeno que fue aislado por primera vez en 1879 del escarabajo Anisoplia austriaca Herbst, por Metchnikoff quien sugirió 9

19 su uso como agente microbiano contra el parásito del insecto (Ferron, 1978). Es un hongo cosmopolita que no infecta animales de sangre caliente y tampoco existen reportes de sensibilidad humana al mismo (Kaaya y Munyinyi, 1995). Se emplea para el control de plagas agrícolas (Zimmerman, 1993); pero para el control de parásitos de los animales su uso ha sido menos frecuente (Zhioua et al., 1997). Dentro de las poblaciones de parásitos que afectan a los animales domésticos, se ha evaluado el efecto acaricida de M. anisopliae en contra de las garrapatas donde demostró ser altamente patógeno sobre diversos estadios como larvas y adultas repletas (Ojeda et al., 2009; Alonso et al. 2007). La patogenia de M. anisopliae sobre la garrapata R. microplus inicia con la adhesión de las conidias al integumento de la garrapata (Arruda et al., 2005). Posteriormente, la conidia germina y el tubo germinativo penetra a la cutícula. Esta penetración de la hifa a través de la epicutícula se realiza por medio de un doble proceso simultáneo: uno enzimático y el otro mecánico (Pinto et al., 1997). La presión mecánica ocurre debido a la formación del apressorium y la invasión enzimática ocurre por degradación debido a la acción de enzimas hidrolíticas como proteasas, quitinasas y lipasas (Frazzon et al., 2000; Bittencourt et al., 1999; Pinto et al., 1997; St. Leger et al., 1986). Después de invadir la epicutícula, las estructuras penetrantes del hongo invaden órganos internos y segregan micotoxinas las cuales son responsables de disminuir la fecundidad y viabilidad de huevos incubados (Pinto et al., 1997). La aplicación directa de M. anisopliae sobre el ganado causa una mortalidad del 100%, reduce la fecundidad en un 99 % y la eclosión larvaria en un 100% de garrapatas R. appendiculatus y Amblyoma variegatum (Kaaya et al., 1996). En 10

20 cuanto al efecto de M. anisopliae sobre la garrapata R. microplus, (Kaaya et al. (1996) encontraron un 92% de infectividad de garrapatas 24 h después de la aplicación del hongo; además, reportaron una elevada mortalidad de hembras confinadas en las orejas al ser protegidas con bolsas en ganado cebú. En otro trabajo, Kaaya y Hassan (2000) reportaron que M. anisopliae reduce la incubación de huevos de 40-50% e induce la mortalidad de hembras pletóricas en un 48%; sin embargo, también resalta que los trabajos en campo son todavía discutibles y contrastantes. Por ejemplo, en México se evaluó el efecto de M. anisopliae sobre el control de R. microplus en condiciones de campo (García y Ávila, 2005). En este estudio la aplicación del hongo se realizó a una concentración de 1 X 10 8 conidias/ml en ganado F1 y se reportó una eficacia de hasta el 80% sobre el control de garrapatas. No obstante, Lezama et al. (1995), al evaluar otra cepa de M. anisopliae en condiciones de estabulación no encontraron efecto del hongo sobre las garrapatas de ganado criollo. En general, los estudios in vitro han demostrado altos niveles de eficacia de los biopesticidas fúngicos contra las garrapatas (Polar et al., 2005; Onofre et al., 2001; Frazzon et al., 2000) lo cual no ha sido consistente cuando se aplica al ganado in vivo (Polar et al., 2005; Benjamin et al., 2002; Kaaya, 2000). Al respecto, se han identificado algunos factores relacionados con el ambiente como la temperatura y la humedad así como otros relacionados con los animales como la temperatura superficial (Leemon et al., 2008) y la composición química de las secreciones de la piel y la microflora de la misma (Polar et al., 2005). Leemon et al. (2008) informan que algunos aislamientos de M. anisopliae no crecen a 40 C y que incluso pocos aislamientos fueron capaces de crecer a 35 C. 11

21 Por su parte, Li y Feng, (2008) notifican que algunas cepas de M. anisopliae pueden tolerar temperaturas de hasta 48 C y que algunas cepas sólo fueron capaces de crecer a una temperatura de entre C. Por otra parte Rangel et al., (2005) menciona que las cepas aisladas de regiones con latitud alta presentan mayor susceptibilidad a la temperatura que las cepas provenientes de regiones cercanas al ecuador. De esta forma, es evidente que cuando se evalúan cepas de M. anisopliae como una herramienta de control biológico contra R. microplus un pasó básico es evaluar la termo-tolerancia de las cepas del hongo para identificar aquellas capaces de crecer bajo condiciones de campo. 12

22 III. JUSTIFICACIÓN Es necesario evaluar la termo-tolerancia de diversas cepas de M. anisopliae bajo condiciones de temperatura (Tº) y humedad relativa similares a las que se tienen en condiciones naturales con la finalidad de disponer de cepas que se puedan aplicar durante el transcurso del día sin que se afecte su viabilidad. No existen estudios sobre la termo-tolerancia de la cepa Ma14 de M. anisopliae en condiciones de laboratorio y de campo. 13

23 IV. HIPÓTESIS El hongo Metarhizium anisopliae (Ma14) mostrará la capacidad de tolerar altas temperaturas sin que se afecte su actividad biológica in Vitro sobre R. microplus. 14

24 V. OBJETIVOS 5.1. OBJETIVO GENERAL Evaluar el comportamiento del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae in vitro sometido a diferentes temperaturas para el control de R. microplus y determinar el punto optimo para su desarrollo y mejor eficacia OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Evaluar la termo-tolerancia y el porcentaje de germinación de esporas in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Ma14) en un medio de agar Sabouraud dextrosa. 2. Evaluar la termo-tolerancia y el crecimiento de colonias in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Ma14) en un medio de agar Sabouraud dextrosa. 3. Evaluar la termo-tolerancia y la eficacia in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Ma14) sobre el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 15

25 VI. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1. ÁREA DE ESTUDIO El estudio se realizó en el Laboratorio de Sanidad Animal del Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT) perteneciente a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, situado en el Km. 5.5 de la carretera Federal Martínez de la Torre Tlapacoyan, Municipio de Tlapacoyan, Ver. De septiembre hasta diciembre del CEPA DE Metarhizium anisopliae Y CONDICIONES DE CULTIVO Se utilizó la cepa Ma 14 del hongo entomopatógeno M. anisopliae originario de Sucumbo, Michoacán, México. El hongo fue aislado y depositado en la colección micológica de la Universidad de Colima. El crecimiento y reproducción del hongo se realizó en agar Sabouraud dextrosa, enriquecido con 1% de extracto de levaduras y 500 ppm de cloranfenicol. Después se incubó a 25º C y 70% de humedad durante tres semanas. La cosecha de conidias se realizó por raspado y se suspendió en agua destilada estéril con Tween 80 al 1% (v/v). La concentración de conidias (1 x 10 8 ) se determinó de forma directa utilizando una cámara de Neubauer CEPA DE GARRAPATAS Rhipicephalus (Boophilus) microplus Se utilizaron garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus adultas que se obtuvieron de un rancho bovino de la región. Las garrapatas se incubaron en una estufa bacteriológica a 28 C de Tº y 80% de humedad relativa durante 14 días para permitir la oviposición. Después los huevos fueron colocados, en las mismas condiciones de incubación, durante 14 días en tubos vacutainer con un tapón de 16

26 algodón para permitir el paso del aire y que ocurriera la eclosión larvaria. En los bioensayos se utilizaron larvas de 7 14 días de edad EXPERIMENTO 1. TERMO-TOLERANCIA Y PORCENTAJE DE GERMINACIÓN IN VITRO. Para evaluar la termo-tolerancia del hongo M. anisopliae, se prepararon 10 ml de una solución a una concentración del hongo de 1 x 10 6 que fue sometido a las siguientes temperaturas (tratamientos): 28º C, 37º C y 47º C durante 180 minutos. Posteriormente, para cada tratamiento se determinó la viabilidad y la germinación de esporas mediante la siembra de 30 μl de una suspensión de esporas a una concentración de 1 x 10 6 en cajas de Petri con un medio de cultivo realizado con agar Sabouraud dextrosa de acuerdo con lo descrito por Lacey et al. (1994). Para cada tratamiento se utilizó un control que fueron cajas de Petri con el mismo medio de cultivo al cual se adicionó 30 μl de una suspensión de esporas a la misma concentración mencionada la cual no fue sometida a las temperaturas (tratamientos). Se realizaron tres réplicas para cada tratamiento y para cada grupo control. Las cajas fueron incubadas a 28ºC y 80 % de humedad durante 48 h (en oscuridad). Para calcular el porcentaje de germinación de esporas se determinó el número de colonias mediante la observación directa en un microscopio a 40x con lecturas a la hora 0 (al momento de la siembra), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36 y 48 h EXPERIMENTO 2. TERMO-TOLERANCIA Y CRECIMIENTO DE COLONIAS IN VITRO. Para evaluar el crecimiento de las colonias, se realizó un segundo experimento para lo cual se utilizó la misma dilución del hongo y los mismos tratamientos de 17

27 temperatura y tiempo mencionados para el experimento 1. La siembra del hongo de cada tratamiento se realizó en cajas de Petri con agar Sabouraud dextrosa. Se colocó una gota de 15 µl de la dilución y se incubo a 28ºC y 80 % de humedad durante 156 hs (en oscuridad). Se realizaron tres réplicas para cada tratamiento y grupo control. El grupo control no se sometió a ningún tratamiento de temperatura. Para evaluar el crecimiento del hongo se realizaron mediciones del diámetro de las colonias, de acuerdo a lo descrito por Polar et al (2005), cada 6 horas durante 48 horas. A partir de la hora 48, las mediciones se realizaron cada 12 horas hasta la hora EXPERIMENTO 3. TERMO-TOLERANCIA Y EFICACIA IN VITRO DE Metarhizium anisopliae (MA14) SOBRE EL CONTROL DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Se prepararon 10 ml de una solución a una concentración del hongo de 1 x 10 6 que fue sometido a los mismos tratamientos de temperatura y tiempo mencionados en la sección 6.4. Para evaluar la eficacia in vitro del hongo sobre el control de garrapatas se realizó la técnica de inmersión de larvas descrita por Shaw (1966). Brevemente, aproximadamente 100 larvas fueron expuestas al hongo por inmersión en viales durante 10 minutos. Después, las larvas se colocaron en paquetes de papel filtro (Whatman # 1) para incubar a 28 C de temperatura y de 80 a 90% de humedad relativa. Después de siete días de incubación se determinó el porcentaje de mortalidad de larvas mediante el conteo directo de larvas vivas y muertas en cada tratamiento. Para cada tratamiento se utilizó un grupo control negativo, el cual 18

28 consistió en la inmersión de larvas en agua destilada durante el mismo periodo de tiempo. Se realizaron tres réplicas para cada tratamiento DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO. En cada experimento se utilizó un diseño experimental completamente al azar. El efecto del tratamiento sobre la eficacia del hongo entomopatógeno in vitro (medido mediante el porcentaje de germinación de esporas y el efecto ixodicida) se analizó mediante la prueba de U Mann Withney y/o Kruskal Wallis. El efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las colonias del hongo se analizó mediante la prueba de t de Student. Se utilizó un valor de significancia de P<

29 % DE % DE GERMINACION VII. RESULTADOS 7.1. TERMO-TOLERANCIA Y PORCENTAJE DE GERMINACIÓN IN VITRO de M. anisopliae. En cuanto al efecto del tratamiento (T ) sobre el porcentaje de germinación de esporas, no hubo diferencias de los tratamientos con sus respectivos grupos testigo (P<0.05) (Figuras 1, 2 y 3). No obstante, cuando se compararon los tres tratamientos entre sí, hubo diferencias estadísticamente significativas en la germinación de esporas a las 6, 9, 12 y 15 h post-inoculación (P<0.05) (Figura 4) HORAS TRATADO CONTROL Figura 1. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 28 C TRATADO CONTROL Figura 2. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 37 C. 20

30 % DE GERMINACIONO % DE GERMINACION HORAS TRATADO CONTROL Figura 3. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a 47 C HORAS TX28 TX37 TX47 Figura 4. Germinación de esporas del hongo M. anisopliae sometido a tres tratamientos de temperatura. 21

31 7.2. TERMO-TOLERANCIA Y CRECIMIENTO DE COLONIAS IN VITRO de M. anisopliae. En cuanto al efecto de tratamiento (T ) sobre el crecimiento de colonias no hubo diferencias estadísticamente significativas cuando se analizaron los tratamiento con su respectivo grupo control (P<0.05) (Figuras 5, 6 y 7). Sin embargo, cuando se realizó el análisis entre los tres tratamientos hubo diferencias en las horas 84, 96 y 108 (P<0.05). El hongo sometido a 47 C tuvo un menor crecimiento de colonias (Figura 8). Figura 5. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 28 C. Figura 6. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 37 C. 22

32 CRECIMIENTO (mm) CRECIMIENTO (mm) TRATADO CONTROL HOR A Figura 7. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a 47 C C 37 C 47 C HOR A Figura 8. Crecimiento de colonias de M. anisopliae sometido a tres tratamientos de temperatura. 23

33 7.3. TERMO-TOLERANCIA Y EFICACIA IN VITRO DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Metarhizium anisopliae (Ma14) SOBRE EL CONTROL DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El efecto ixodicida del hongo M. anisopliae sobre la mortalidad de larvas de R. microplus se muestra en el cuadro 1. Hubo un efecto ixodicida del hongo sometido a diferentes temperaturas y tiempos en comparación con sus respectivos grupos controles (P<0.05). Cuando se comparó la eficacia del hongo sometido a diferentes temperaturas durante 90 minutos sobre la mortalidad larvaria de R. microplus, el tratamiento a 37 C tuvo un mayor porcentaje de mortalidad con 74.86% (P<0.05; Figura 9). Sin embargo, a 180 minutos no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (P>0.05; Figura 10). Cuadro 1. Efecto del hongo Metarhizium anisopliae sometidos a diferentes tratamientos de temperatura y tiempo sobre la mortalidad de larvas de Rhipicephalus microplus. TRATAMIENTOS TIEMPO 28 C 37 C 47 C (minutos) TX CX TX CX TX CX 44.2 ± a 3.8 ± 0.6 b 74.8 ± 9.3 ± 5.1ª 4.3 b 27.7 ± 4.8ª 4.3 ± 1.1 b ª 3.1 ± 1.2 b 61.2 ± 30.7± ± b 9.6ª 20.6 a 5.9 ± 1.3 b Dentro de cada tratamiento, distinta literal entre columnas indica diferencia estadísticamente significativa (P<0.05). TX = grupo tratado con M. anisopliae, CX= grupo control. 24

34 c a b Figura 9. Comparación del efecto del hongo M. anisopliae, sometido a diferentes temperaturas durante 90 minutos, sobre el porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus. a a a Figura 10. Comparación del efecto del hongo M. anisopliae, sometido a diferentes temperaturas durante 180 minutos, sobre el porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus. 25

35 VIII. DISCUSIÓN 8.1. TERMO-TOLERANCIA Y PORCENTAJE DE GERMINACIÓN IN VITRO. El primer objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del tratamiento (T ) sobre el porcentaje de germinación de esporas de la cepa Ma14 del hongo M. anisopliae. En este estudio se observó un efecto significativo del tratamiento sobre la germinación de esporas durante las primeras 15 h post-inoculación. El tratamiento del hongo a 37 C mostró una mejor germinación a partir de las 6 h alcanzando el 91% de germinación a las 36 h post-incoulación. Mientras que los tratamientos a 28 C y 47 C la germinación de esporas inició más tarde y alcanzaron el 85% y 79% de germinación a las 36 h, respectivamente. Rangel et al, (2005) reportaron resultados similares al presente estudio al someter 17 cepas de M. anisopliae a 40 C durante 2, 4, 8 y 12 h. No obstante, cuando estos mismos autores sometieron las mismas cepas a 45 C durante 12 hs el 88.3% de las cepas tuvo porcentajes de germinación inferiores al 40% y sólo el 11.7% de las cepas tuvieron porcentajes de germinación superiores al 80%. Los factores que inducen la formación de esporas y clamidosporas difieren entre especies de hongos (Ment et al., 2009). Estos factores incluyen cambios nutricionales que inducen estrés, temperatura, radiación UV, humedad, el tiempo que es sometido al estrés térmico y el origen del hongo (Li y Feng, 2009; Inglis et al., 2001). Debido a que las clamidosporas sirven principalmente como una estructura de supervivencia del hongo bajo condiciones desfavorables (Ment et al., 2009), los resultados de este estudio señalan a la cepa Ma14 como una herramienta promisoria para el control biológico de R. microplus en campo debido a la capacidad de tolerar una T de hasta 47 C durante 180 minutos, 26

36 sin embargo, es necesario realizar evaluaciones en campo y en diferentes épocas del año TERMO-TOLERANCIA Y CRECIMIENTO DE COLONIAS DE M. anisopliae IN VITRO. El segundo objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del tratamiento (T ) sobre el crecimiento de colonias del hongo entomopatógeno M. anisopliae (Ma 14). Estudios previos señalaron que la temperatura óptima para el crecimiento de colonias de diversas cepas de M. anisopliae fluctuó entre los 25 y los 30 C (; Li y Feng et al., 2009; Leemon y Jonsson, 2008; Polar et al., 2005). No obstante, Li y Feng (2009) sugirieron evaluar la termo-tolerancia de los hongos entomopatógenos sometiéndolos a temperaturas estresantes de entre 45 y 48 C con la finalidad de obtener cepas termo-tolerante capaz de ser utilizadas bajo condiciones de campo. En este estudio y para conocer la termo-tolerancia de la cepa Ma 14, se sometió al hongo a temperatura estresante de hasta 47 C. La cepa Ma14 del hongo M. anisopliae mostró crecimiento de colonias (termo-tolerancia) a temperaturas de 28 C, 37 C y 47 C. Las adaptaciones fisiológicas de los hongos entomopatógenos a las condiciones climatológicas extremas pueden deberse al origen de las cepas. Vidal et al. (1997) señalaron que los hongos originarios del ecuador resisten más el calor en comparación a otras poblaciones de hongos originarios de otras latitudes. Por el contrario, Vänninen (1995) y McCammon y Rath (1994) señalaron que hongos originarios del hemisferio norte y sur exhibieron mayor tolerancia al frio que aquellos originarios del ecuador. La cepa Ma14 se aisló de un lugar donde existen 27

37 condiciones de T adversas a las cuales el hongo tuvo que adaptarse para sobrevivir y por tal motivo fue capaz de soportar la temperatura estresante a la cual fue sometido TERMO-TOLERANCIA Y LA EFICACIA IN VITRO DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Metarhizium anisopliae (Ma14) SOBRE EL CONTROL DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El control biológico, mediante el uso de hongos entomopatógenos, ha sido sugerido por diversos investigadores como una de las alternativas con mayor futuro para el control de las garrapatas en los bovinos (Fernandes y Bittencourt, 2008; Alonso-Díaz et al., 2007; Polar et al., 2005; Samish et al., 2004). Sin embargo, debido a las inconsistencias que existen entre los resultados generados en condiciones de laboratorio y de campo, la evaluación de la termo-tolerancia de la cepas de M. anisopliae es un paso necesario cuando se evalúan diferentes cepas (Li y Feng, 2009). Hasta nuestro conocimiento, este es el primer reporte donde se evaluó el efecto de la temperatura sobre la patogenicidad de M. anisopliae en larvas de R. microplus. El porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus de la cepa Ma14 no fue afectada por la exposición a 28, 37 y 47 C durante 180 minutos y fue superior al 62% en todos los tratamientos. Estos resultados son superiores a lo reportado por Ojeda et al., (2009) quienes encontraron un 45% de mortalidad de larvas de R. microplus al utilizar la cepa Ma14 de M. anisopliae a una concentración de 1 x 10 6 conidias/g. Por su parte, Bahiense et al. (2006) reportaron una eficacia del 96% de M. anisopliae a una concentración de 1 x 10 8 sobre larvas de R. microplus. Existen 28

38 diferentes factores que pueden afectar la patogenicidad M. anisopliae sobre R. microplus. La dosis de hongos utilizada, diferente patogenicidad de cepas de M. anisopliae, la susceptibilidad de la cepa de garrapata, entre otros (Ojeda et al. 2009). 29

39 IX. CONCLUSIONES Se concluye que la cepa Ma14 del hongo M. anisopliae es capaz de tolerar temperaturas de hasta 47 C sin afectar su patogenicidad contra larvas de R. microplus, sin embargo, es necesario corroborar esta eficacia en campo en diferentes épocas del año. 30

40 X. REFERENCIAS 1. Alonso-Díaz, M.A., Rodríguez-Vivas, R.I., Fragoso-Sánchez, H., Rosario-Cruz, R., Resistencia de la garrapata Boophilus microplus a los ixodicidas. Arch. Med. Vet. 68 (2), Alonso-Diaz, M.,A., García, L., Galindo-Velasco, E., Lezama-Gutierrez, R., Angel-Sahagún, C.A., Rodríguez-Vivas, R.I., Fragoso-Sánchez, H Evaluation of Metarhizium anisopliae (Hyphomycetes) for the control of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on naturally infested cattle in the Mexican tropics. Vet. Parasitol. 147, Anderson, T.E., Roberts, D.W., Soper, R.S Use of Beauveria bassiana for suppression of Colorado potato beetle in New York State (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomol.17, Arruda, w., Lubeck, I., Schrank, A., Vainstein, H.M Morphological alterations of Metarhizium anisopliae during penetration in Boophilus microplus ticks. Exp. Appld Acarol. 37, Bahiense, T.C., Fernandes, É.K.K., Bittencourt, V.R.E.P Compatibility of the fungus Metarhizium anisopliae and deltamethrin to control a resistant strain of Boophilus microplus tick. Vet. Parasitol. 114, Benavides, O.E. Romero, N.A. Rodríguez, B.J Situación actual de la resistencia de la garrapata Boophilus microplus a acaricidas en Colombia. Recomendaciones en Manejo Integrado. Carta Fedegan. 61, Benjamín, M.A., Zhioua, E., Ostfeld, R.S Laboratry and field evaluation of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Deuteromyces) for controlling questing adult Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 39, Bittencourt, V.R.E.P., Mássard, C.L., Lima, A.F Uso del hongo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, en el control de la garrapata Boophilus microplus (Canestrini). Memorias del Instituto Osvaldo Cruz. 84 (supl. 3), Bittencourt, V.R.E.P Análisis de la eficacia in vitro de dos aislados del hongo entomopatógenico Beauveria bassiana (Bals) Vuil, en hembras ingurgitadas de Boophilus microplus (Canestrini, 1987) (Acari: Ixodidae). Rev. Bras. Parasitol. 6,

41 10. Bittencourt, V.E.R.P., Mascaranhas, A.G., Faccini, J.L.H Mecanismo de infecao do fungo Metarhizium anisopliae no carrapato Boophilus microplus em condicoes experimentais. Ciencia Rural. 29, Castellanos, J.L.H El género Boophilus. En: Campaña contra la garrapata. Instructivo técnico. SAGAR-CNMVZ. México, D.F. pp Cen, A.J., Rodíguez-Vivas, R.I., Domínguez-Alpizar, J.L., Wagner, G Studies on the effect on infection by Babesia spp on oviposition of Boophilus microplus engorded females naturally infected in the Mexican tropics. Vet. Parasitol. 78, Cooney, D.G., Emerson, R., Thermophilic Fungi, An account of Their Biologi, Activities and Classification. W.H. Freeman, Davey, R.B Mating competitiveness of hybrid Boophilus male ticks compared to pure-strain B. annulatus and B. microplus males (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 23: De Freitas, F.F., Souza, E.P.F Acaricidal activity of an oleoresinus extract from Copaifera reticulata (Leguminosae: Caesalpinioideae) against larvae of the southern cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Vet. Parasitol. 147, Fargues, J., Goettel, M.S., Smits, N., Ouedraogo, A., Rougier, M., Effect of temperature on vegetative growth of Beauveria bassiana stains from different origins. Mycologia. 89, Fargues, J., Goettel, M.S., Smits, N., Ouedraogo, A., Vidal, C., Lacey, L.L., Lomer, G.J., Rougier, M., Variability in susceptibility to simulated sunlight of conidia among strains of entomopathogenic hyphomycetes. Micopatol. 135, Fernandes, E.K.K., Bittencourt, V.R.E.P., Entomopatogenic fungi against South american tick species. J. Exp. Appl. Acarol. 46, Ferron, P Biological control of insects pests by entomogenous fungi. Ann. Rev. Entomol. 23, Ferron, P Pest control by the fungi Beauveria and Metarhizium. In: Microbial control of Pests and Plants disease Academic Press London Frazzon, A.P.G., Vaz, I.D., Masuda, A., Schrank, A., Vainstein, M.H In vitro assessment of Metarhizium anisopliae isolates to control the cattle tick Boophilus microplus. Vet. Parasitol. 94(1-2),

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