Estudio de la estabilidad del sistema Paratest usado para diagnóstico de las parasitosis intestinales Rev /01/2011

Transcripción

1 1 Estudio de la estabilidad del sistema Paratest usado para diagnóstico de las parasitosis intestinales Rev /01/ Introducción Las parasitosis intestinales representan un serio problema de salud pública, en países subdesarrollados y en desarrollo, afectan a adultos y a niños. Los últimos pueden sufrir perjuicios en el desarrollo físico e intelectual, resultantes de la acción de los parásitos sobre el hospedero, como expoliación nutricional y sanguínea, procesos inflamatorios, lesiones de tejidos, disturbios digestivos y gastrointestinales entre otros. Aunque la mortalidad no sea demasiado elevada en las afecciones humanas por parásitos intestinales, aún hay relatos de muerte por hiperparasitismo en el país, lo que muestra la negligencia a que estos agravios de la salud han sido sometidos. El diagnóstico preciso de las parasitosis, con posterior encaminamiento para la terapia adecuada, representa una importante acción en la salud individual y colectiva que conduce a la mejoría de la calidad de vida de la población. Con este objetivo, el sistema Paratest es evaluado en el presente estudio, como un abordaje alternativo para el diagnóstico parasitológico que ofrezca menor riesgo biológico y mayor practicidad de ejecución de los exámenes, manteniendo la norma de calidad de los resultados. 2. Objetivos Este trabajo tiene por objetivo evaluar la estabilidad del sistema Paratest con relación: diagnóstico a) A la temperatura de almacenaje del Kit en las condiciones originales de producción, o sea, antes de la adición y dilución de la muestra (heces) en el líquido diluyente / conservante. b) A la temperatura de almacenaje del Kit, después de la adición y dilución de las heces en el líquido diluyente / conservante. c) Al tiempo de almacenaje del Kit, específicamente a temperatura ambiente (22ºC 30ºC), en las condiciones originales de producción, o sea, antes de la adición y dilución de la muestra biológica (heces) en el líquido diluyente / conservante. d) Al tiempo de almacenaje del Kit, específicamente a temperatura ambiente (22ºC 30ºC), después de la dilución de las heces en el líquido diluyente / conservante. 3. Método 3.1. Sistema (kit) Paratest El Sistema (Kit) Paratest producido por la empresa Diagnostek está constituido de un frasco plástico cuya tapa posee una membrana filtrante con poros de aproximadamente 266 µm, que, retienen gran parte de los detritos y residuos de la

2 2 materia fecal dejando pasar formas parasitarias que pueden ser identificadas por microscopia. El frasco del Kit Paratest posee como líquido diluente / conservante un volumen de 7 ml de solución de Formalina a 5%, tamponada con compresa fosfato de sodio en ph 7,0. Para el examen coproparasitológico son diluidos en esta solución cerca de dos gramos de heces recién emitidas por el paciente, siendo que, de la suspensión así lograda, una pequeña fracción es goteada en lámina de microscopia y examinada microscópicamente por un especialista en parasitología. El diagnóstico es hecho por la identificación morfológica de las formas parasitarias observadas al examen microscópico. Todos los frascos del Kit poseen la identificación del lote, con informaciones sobre la semana, mes y año de fabricación lo que aporta para la precisión de los análisis de estabilidad Selección de los lotes del Kit Paratest para estudios de estabilidad Para el análisis de la estabilidad con relación a la temperatura se mantuvo fija la variable relacionada al lote, utilizando frascos ejemplares del mismo lote, en diferentes temperaturas. Para el análisis de la estabilidad con relación al tiempo de almacenaje, antes de la adición de la muestra fecal, fueron utilizados frascos de diferentes lotes, producidos en fechas distintas. Para el análisis de la estabilidad con relación al tiempo, después de adición de la muestra fecal, fueron utilizados frascos del mismo lote, con misma fecha de fabricación Concepto de estabilidad para Kit Paratest y criterio de análisis Con relación al tiempo o temperatura, con y / o sin muestra biológica diluida, la estabilidad de los lotes del Kit Paratest es definida como la capacidad de preservación (fijación) y mantenimiento de la integridad de las formas parasitarias, en las diferentes condiciones testadas. Esa estabilidad fue contrastada con base en la morfología parasitaria analizada después del mantenimiento en diferentes temperaturas y en diferentes tiempos. Por tanto, el criterio de análisis de las muestras para verificación de la estabilidad del Kit tuvo como base la morfología de las formas parasitarias descrita por los microscopistas conforme convención abajo: a) Formas parasitarias íntegras y bien : cuando el analista observó formas parasitarias con morfología idéntica o muy próxima de la morfología original descrita en la literatura y observada en muestras fecales frescas y no conservadas (muestra control), apenas diluidas en el líquido conservante del Paratest (modelo oro morfológico), en el momento del análisis. b) Formas parasitarias alteradas y no : cuando el analista observó formas parasitarias con morfología diferente y distorsionada con relación a la morfología original descrita en la literatura y con relación a la observada en muestras fecales frescas y no conservadas (muestra control), apenas diluidas en el líquido conservante del Paratest (modelo oro morfológico), en el momento del análisis.

3 Muestras control Los controles de los análisis en tiempos distintos y temperaturas diferentes fueron hechos por comparación con formas parasitarias íntegras / bien (modelo oro morfológico) examinadas simultáneamente, en tiempo real, a las muestras prueba. Ese control era proveniente de muestras fecales frescas consabidamente positivas que fueron diluidas en la solución conservante del Paratest en el exacto momento (tiempo cero) de los análisis microscópicos, en temperatura ambiente, y acompañadas microscópicamente a lo largo del tiempo Descripción de los ensayos Evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest en la condición original de producción en relación a la temperatura de almacenaje. Para ese ensayo, se utilizaron tres frascos del Kit Paratest del mismo ateste de fabricación, con fecha de fabricación inferior a una semana, quiénes, fueron mantenidos en temperaturas distintas antes de la adición de la muestra fecal (Frasco X - temperatura ambiente, entre 22ºC y 30ºC; Frasco Y - refrigeración a 4ºC y Frasco Z - estufa a 37ºC), por 7 días, antes del inicio del estudio. El propósito fue verificar si la variación de la temperatura afectaría la estabilidad de la solución diluente / conservante. En el momento del ensayo, a estos tres frascos fueron agregados dos gramos de la misma muestra fecal fresca, poliparasitada, y consabidamente positiva para cistos de protozoarios y huevos y larvas de helmintos. Inmediatamente después de la homogenización de las heces una alícuota de la suspensión de cada frasco fue goteada en lámina de microscopia y examinada en microscopio óptico por un especialista en parasitología, visando a la descripción de la morfología. El análisis morfológico fue hecho en comparación con el modelo oro del control predefinido en ese estudio y la morfología fue descrita conforme convención de norma morfológica, también antepasadamente definida en el presente estudio, conforme apartado Después del primer examen, inmediatamente después de la dilución de las heces (tiempo cero), los frascos fueron incubados en las temperaturas iniciales y sus contenidos fueron reexaminados después de 24 horas (tiempo 1) y 48 horas (tiempo 2). Los resultados de esos análisis están descritos en el apartado 4.1, Cuadro 1. La opción por el uso de frascos pertenecientes a lotes fabricados a menos de una semana representó apenas un margen de seguridad para eliminar posible variable relacionada al tiempo de almacenaje Evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación a la variación de temperatura, después de la adición de la muestra fecal.

4 4 Para ese ensayo, se utilizaron tres frascos del Kit Paratest del mismo lote de fabricación, con fecha de fabricación inferior a una semana, que fueron mantenidos a temperatura ambiente hasta el momento del ensayo (frasco M, frasco N y Frasco O). En cada frasco fueron agregados dos gramos de la misma muestra fecal fresca, poliparasitada y consabidamente positiva para cistos de protozoarios y huevos y larvas de helmintos. Inmediatamente después de la homogenización en el líquido diluyente/conservante del Kit Paratest, una alícuota de la suspensión de cada uno de los tres frascos fue goteada en lámina y examinada al microscopio óptico, estableciendo por estos primeros análisis (tiempo cero, a temperatura ambiente) el modelo oro morfológico de las formas parasitarias observadas. Los resultados cualitativos de estos análisis inmediatos representaron los controles para los análisis subsiguientes de los contenidos de los mismos frascos sometidos a diferentes temperaturas. En la secuencia, uno de estos frascos fue incubado a temperatura ambiente (Frasco M), el segundo fue incubado bajo refrigeración, a 4ºC (frasco N), y el tercero fue incubado en estufa a 37ºC (frasco O). A lo largo de siete días, los exámenes fueron hechos después de 24 horas, 72 horas, 120 horas y 168 horas, cuando una nueva alícuota de cada uno de los tres frascos fue goteada en lámina de microscopia para análisis. Estos exámenes microscópicos subsiguientes fueron realizados siempre por el mismo analista, visando a la descripción de la morfología. Ésta fue hecha en comparación con la modelo oro, predefinido en ese estudio y en consonancia con la convención de descripción de la norma morfológica, también antepasadamente definida en el presente estudio (conforme apartado 3.1.2). Los resultados de estos exámenes están descritos en el apartado 4.2, Cuadro 2. La opción por el uso de frascos pertenecientes a lotes fabricados a menos de una semana representó apenas un margen de seguridad para eliminar posible variable relacionada al tiempo de almacenaje Evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación al tiempo de almacenaje a temperatura ambiente (22 o C 30 o C) antes de la adición de la muestra biológica fecal. Para ese ensayo fueron usados siete frascos del Kit Paratest, de lotes distintos producidos en fechas distintas, a lo largo de un período de tres años, a saber: Frasco k, con una semana de producción; Frasco P, con un mes de producción; frasco Q con tres meses de producción; frasco R, con seis meses de producción; frasco S, con un año de producción; frasco T, con 2 años de producción y frasco U, con 3 años de producción. En cada frasco fueron agregados dos gramos de la misma muestra fecal fresca, poliparasitada y consabidamente positiva para cistos de protozoarios y huevos y larvas de helmintos. Inmediatamente después de la homogenización en el líquido diluyente/conservante del Kit Paratest (tiempo cero), una alícuota de la suspensión de cada uno de los tres frascos fue goteada en lámina y examinada al microscopio óptico. El análisis morfológico de las formas parasitarias fue afrontada con el modelo oro de la muestra control, preparada en tiempo real, examinada en el tiempo cero y después de una semana. El ensayo fue conducido en temperatura ambiente. Como en el control, fueron hechos dos análisis para cada frasco: en tiempo cero y después

5 5 de una semana (tiempo 1). Los resultados de estos análisis están presentados en el apartado 4.3, Cuadro Evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación al tiempo de almacenaje, a temperatura ambiente (22 o C 30 o C), después de la adición de la muestra biológica fecal. Para ese ensayo fueron usados tres frascos (frasco G, frasco H y frasco I) del Kit Paratest, pertenecientes al mismo lote, fabricado con menos de una semana de antecedencia al ensayo. Ese tiempo de fabricación del lote fue aleatorio, objetivando apenas eliminar la variable tiempo de ensayo. Fue adoptada la temperatura ambiente para la realización del ensayo durante todo el período de análisis, estandarizado para un mes. A cada frasco fueron agregados dos gramos de la misma muestra fecal fresca, poliparasitada y consabidamente positiva para cistos de protozoarios y huevos y larvas de helmintos. Inmediatamente después de la homogenización en el líquido diluyente/conservante del Kit Paratest, una alícuota de la suspensión de cada uno de los tres frascos fue goteada en lámina y examinada al microscopio óptico (tiempo cero). El análisis morfológico de las formas parasitarias, en el tiempo cero, representó el modelo oro morfológico, con el que fueron afrontadas las formas parasitarias de los frascos a lo largo del mes. Los resultados de estos análisis están presentados en el apartado 4.4, Cuadro Resultados 4.1. Estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest a condición original de producción, en relación a la variación de temperatura. Según muestra la descripción de las formas parasitarias, en el Cuadro 1, se constató que, en las tres temperaturas de almacenaje del Kit Paratest testadas la estabilidad no fue afectada, garantizando la conservación de la muestra y preservación de la morfología de las formas parasitarias, en condiciones óptimas, en la comparación con el modelo oro del control. Después del análisis en el tiempo cero, los frascos fueron mantenidos por más 48 horas en las temperaturas originales de almacenaje sin que la morfología de las formas parasitarias fuesen afectadas. Se observó, sin embargo que a la temperatura de 37ºC hay aceleración de la evaporación del líquido conservante / diluyente del Kit Paratest. Cuadro 1: Influencia de la temperatura de almacenaje del Kit Paratest sobre la morfología de las formas parasitarias. Temperatura inicial del líquido diluyente /conservante Descripción de las formas parasitarias a lo largo del tiempo Tiempo Cero (examen inmediato) Tiempo 1 (después de 24 horas) Tiempo 2 (después de 48 horas) Nota

6 6 T ambiente (22 o C-30 o C) (Frasco X) T 4 o C (Frasco Y) T 37 o C (Frasco Z) Control* * Modelo oro Similar al modelo oro Similar al modelo oro Similar al modelo oro Representa Modelo oro 4.2. Resultado de la evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación a la variación de temperatura, después de la adición de la muestra fecal. Según muestra el Cuadro 2, abajo, la variación de la temperatura de incubación del Kit Paratest, después de la adición de la muestra fecal no ejerció ningún efecto deletéreo sobre la conservación de las formas parasitarias por período de hasta siete días (168 horas) a contar de la data de la dilución. Sin embargo, fue observada una evaporación aumentada del líquido conservante en la temperatura de 37ºC. Cuadro 2 Influencia de la variación de temperatura seguida a la adición de la muestra biológica sobre las formas parasitarias. Frasco/ (temperatura) Frasco M T ambiente (22 o C-30 o C) Frasco N (T 4 o C) Frasco O (T 37 o C) Controle* (modelo oro) Tiempo Cero (examen inmediato) Descripción de las formas parasitarias a lo largo del tiempo Tiempo 1 24 horas Tiempo 2 72 horas Tiempo horas Tiempo horas 4.3. Resultado de la evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación al tiempo de almacenaje, en temperatura ambiente (22 o C 30 o C) antes de la adición de la muestra biológica fecal. Según muestra el Cuadro 3, abajo, el ensayo realizado como descrito en el apartado mostró que el Kit es estable antes de la adición de la muestra biológica, por un período de hasta tres años, cuando mantenido en temperatura ambiente. Reveló también que después de la dilución de la muestra fecal las formas parasitarias se mantienen íntegras y por un período de hasta cuatro semanas.

7 7 Cuadro 3. Evaluación de la estabilidad del Kit con relación al tiempo de almacenaje antes de la dilución de la muestra. Frasco / (tiempo de producción) Frasco K (1 semana) Frasco P (1 mes) Frasco Q (3 meses) Frasco R (6 meses) Frasco S (1 ano) Frasco T (2 anos) Frasco U (3 anos) Control* * Modelo oro Descripción de las formas parasitarias a lo largo del tiempo Tiempo Cero (examen inmediato) Tiempo 1 (1 semana) Tiempo 2 (2 semanas) Estudio en andamiento Tiempo 3 (3 semanas) Estudio en andamiento Tiempo 4 (4 semanas) Estudio en andamiento 4.4. Resultado de la evaluación de la estabilidad de la solución diluyente / conservante del Kit Paratest, en relación al tiempo de almacenaje, en temperatura ambiente (22 o C 30 o C), después de la adición de la muestra biológica fecal. Según muestra el Cuadro 4, abajo, las formas parasitarias se mantienen íntegras y por hasta cuatro semanas después de la dilución en el líquido diluyente / conservante del Kit Paratest. Esos resultados confirman los presentados en el apartado 4.3. Cuadro 4. Influencia del tiempo de permanencia de la muestra fecal en el líquido diluyente / conservante sobre la morfología de las formas parasitarias. Frasco T ambiente (22 o C-30 o C) Frasco G Frasco H Frasco I Tiempo Cero (examen inmediato) * Descripción de las formas parasitarias a lo largo del tiempo Tiempo 1 (1 semana) Tiempo 2 (2 semanas) Tiempo 3 (3 semanas) Tiempo 4 (4 semanas)

8 8 Control* * Modelo oro 5. Conclusiones Con base en los estudios de estabilidad descritos arriba se concluyó que Con relación a la variable Temperatura : - El sistema Paratest, sin la adición de la muestra biológica (heces) mantiene la estabilidad cuando almacenado en temperatura ambiente o bajo refrigeración o a 37ºC, por un período de tres años garantizando la integridad y conservación de las formas parasitarias cuando agregadas al líquido diluyente / conservante. Diagnostek recomienda el almacenaje a temperatura ambiente (23ºC 30ºC). - El sistema Paratest después de la adición de la muestra biológica (heces) mantiene las formas parasitarias íntegras y bien, en temperatura ambiente o bajo refrigeración, así como a temperatura de hasta 37ºC, por un período de hasta una semana. Diagnostek recomienda el almacenaje, después de la dilución de la muestra biológica, a temperatura ambiente y destaca que temperaturas próximas a 37ºC podrán acelerar la evaporación del líquido diluyente / conservante. Con relación a la variable Tiempo : - El sistema Paratest, sin la adición de la muestra biológica (heces) es estable por un período de tres años, en temperatura ambiente, manteniendo íntegras y bien conservadas las formas parasitarias, cuando la muestra fecal es agregada al líquido diluyente / conservante. - El sistema Paratest, después de la adición de la muestra biológica (heces) mantiene las formas parasitarias íntegras y bien, a temperatura ambiente por, por lo menos, treinta días (4 semanas). Diagnostek recomienda que el examen sea hecho en hasta 10 días después de la adición de la muestra fecal en el líquido diluyente / conservante.