Red latinoamericana de dosimetría biológica (documento base). Programa de ensayo interlaboratorio (intercomparación internacional )
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- María Ángeles Vidal Poblete
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1 Red latinoamericana de dosimetría biológica (documento base). Programa de ensayo interlaboratorio (intercomparación internacional ) Di Giorgio, M.; Vallerga, M.B.; Radl, A. y Taja, M.R. Presentado en: Taller Regional sobre la serie de informes Técnicos 260 y 405, ISO19238:2004 y el método EPR-2003 del OIEA en el marco del Proyecto IAEA Nº RLA/9/054. La Habana, Cuba, 29 octubre al 11 noviembre 2007
2 RED LATINOAMERICANA DE DOSIMETRÍA BIOLÓGICA (DOCUMENTO BASE). PROGRAMA DE ENSAYO INTERLABORATORIO (INTERCOMPARACIÓN INTERNACIONAL ) Di Giorgio, M.; Vallerga, M.B.; Radl, A. y Taja, M.R. Autoridad Regulatoria Nuclear Argentina INVITACIÓN En el marco del Proyecto Regional OIEA - RLA/9/054 Fortalecimiento de los Sistemas Nacionales para la Preparación y Respuesta en Emergencias Radiológicas y Nucleares, el laboratorio de Dosimetría Biológica (LDB) de la AUTORIDAD REGULATORIA NUCLEAR (ARN) de la República Argentina, con la colaboración del Centro Regional de Referencia para Dosimetría de la COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA, se complace en invitar a los laboratorios responsables de la Dosimetría Biológica de: 1. Brasil - Instituto de Radioprotección y Dosimetría (IRD) 2. Chile - Comisión Chilena de Energía Nuclear (CCHEN) 3. Cuba - Centro de Protección e Higiene de las Radiaciones (CPHR) 4. Méjico - Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ) 5. Perú - Instituto Peruano de Energía Nuclear (IPEN) 6. Uruguay - Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable 7. España (Universidad Autónoma de Barcelona - Facultad de Biociencias) 8. La Plata, Argentina (Universidad Nacional de La Plata - CIGEBA,) 1 a participar en un ejercicio de intercomparación para el análisis de algunos de los parámetros relevantes que intervienen en la determinación biológica de la dosis, a fin de fortalecer la capacidad de respuesta en situaciones accidentales que requieran la activación de mecanismos de asistencia mutua y que constituyen el fundamento de la organización de la Red Latinoamericana de Dosimetría Biológica. 1. INTRODUCCIÓN Los ensayos de aptitud de laboratorios son un elemento esencial para el aseguramiento de la calidad de los laboratorios ya que constituyen una evaluación objetiva del desempeño de los laboratorios, tanto desde el punto de vista humano como material. Debido a la necesidad de fortalecer las capacidades de servicio de los laboratorios Latinoamericanos de Dosimetría Biológica participantes del proyecto, mediante la implementación de buenas prácticas de laboratorio, se requieren acciones tendientes a mejorar la calidad y competencia técnica de los laboratorios en forma sostenida en el tiempo, constituyendo un soporte técnico de la Red Latinoamericana de Dosimetría Biológica (en proceso de organización) con fines de asistencia mutua. En este contexto, y tomando en cuenta la necesidad de cooperación mutua para la mejora de los métodos de recuento de aberraciones cromosómicas y de conversión de frecuencia a dosis considerando el escenario de sobreexposición, hemos querido ofrecer un ejercicio de comparación interlaboratorio para el análisis de algunos de los parámetros relevantes que intervienen en la determinación biológica de la dosis. 1 laboratorio de apoyo al LDB de la ARN, Argentina, en caso de una emergencia radiológica que supere la capacidad operativa del laboratorio de la ARN (acorde a los requisitos de las Normas ISO y 19238). 55
3 El propósito de este primer ejercicio de intercomparación es que todos los participantes que lo deseen puedan participar en el nivel que cada laboratorio decida y explicite anticipadamente en su respuesta a esta convocatoria. Esto significa que podrán participar: laboratorios que informen sólo las lecturas de los datos crudos (sin procesar, raw data) y la determinación de la frecuencia. laboratorios que informen adicionalmente dosis. En este caso, podrán utilizar curvas de calibración realizadas en sus laboratorios o curvas de calibración de consenso internacional. Cualquiera sea el caso, deberán informar los coeficiente de las curvas de calibración aplicadas y las incertidumbres asociadas a los mismos. El laboratorio organizador realizará los análisis estadísticos tendientes a valorar el grado de consenso existente en la región y a evaluar el desempeño de los participantes. No es objetivo de esta intercomparación obtener una calificación de los laboratorios participantes sino conocer el grado de consenso, identificar las dificultades y propiciar las modificaciones necesarias para el trabajo colaborativo de los laboratorios, lo cual mejorará la capacidad de respuesta de la Red. 2. OBJETIVOS GENERALES DEL PROGRAMA DE ENSAYO INTERLABORATORIOS: 1. Evaluar la reproducibilidad interlaboratorio de las determinaciones realizadas. 2. A partir de las dificultades identificadas, propiciar las modificaciones necesarias para el trabajo colaborativo de los laboratorios. 3. LABORATORIOS PARTICIPANTES: Los laboratorios invitados a este ejercicio de intercomparación son los laboratorios de Dosimetría Biológica ya existentes en la Región: Argentina (LDB de la ARN y laboratorio de apoyo), Brasil, Chile, Cuba, Méjico, Perú y Uruguay) y el Laboratorio de la Universidad Autónoma de Barcelona- España (Joan Francesc Barquinero y equipo de colaboradores). 4. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: A partir de un mismo donante sano, se obtendrán dos muestras de sangre periférica (día I y día II). Las muestras serán obtenidas por venopunción con heparina de Litio. Se realizarán dos ciclos de irradiaciones in vitro con dos dosis de radiación diferentes: Dosis I (día I): Las irradiaciones se harán el mismo día con la dosis I, en las mismas condiciones de irradiación. Dosis II (día II): Las irradiaciones se harán el mismo día con la dosis II, en las mismas condiciones de irradiación del día I. Las irradiaciones se realizarán en el Centro Regional de Referencia para Dosimetría de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA), en el Centro Atómico Ezeiza. Se realizarán con una fuente de 60 Co, en aire, en condiciones de equilibrio electrónico. Las dosis administradas serán informadas en un documento emitido por el Centro Regional de Referencia, guardadas en sobre sellado y entregadas a un representante del proyecto (Dr. Omar García Lima) durante la reunión a realizarse en Cuba en octubre-noviembre de 2007, en el mismo momento en que se distribuyan las muestras (láminas portaobjetos) a cada uno de los participantes, a fin de dar transparencia a la metodología. Dicho sobre será abierto en la reunión a realizarse en octubre de 2008 en Argentina. 5. CULTIVOS CELULARES A partir de muestras de sangre irradiada (dos puntos de dosis) y sin irradiar se desarrollan cultivos de linfocitos estimulados, in vitro, a proliferación mitótica con fitohemaglutinina M (al 3%) durante un tiempo de cultivo de alrededor de 48 horas. A las 45 a 46 horas de cultivo se agrega colchicina Sigma (0,15 0,20 μg/ml, concentración final a partir de una solución 100 μg/ml) a 56
4 fin de detener las células en división en metafase. A las 48 horas de incubación, las células son colectadas por centrifugación y tratadas con solución hipotónica. La fijación se realiza con metanol:acético (3:1). Se preparan los extendidos. Se utiliza la técnica de Fluorescencia plus Giemsa (FPG), agregando a los cultivos 5- bromodeoxiuridina (6 μg/ml [19,4 μm] concentración final, a partir de una solución 2 mg/ml), a fin de discriminar entre las metafases en el primer y posteriores ciclos de división. 6. DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras se distribuirán simultáneamente a los laboratorios participantes: serán entregadas a cada uno de los participantes durante la reunión a realizarse en octubre-noviembre de 2007 en La Habana, Cuba. Argentina preparará 9 cajas conteniendo 6 láminas portaobjetos (slides) para cada punto de dosis y tres láminas portaobjetos para la muestra sin irradiar (un total de 15 láminas por participante), seleccionados al azar. Las cajas se sortearán entre los participantes quienes recibirán su caja sorteada y una nota conteniendo las instrucciones específicas, planillas para volcar los datos, etc. Adicionalmente, cada participante firmará una nota indicando el número de caja recibido, país, persona responsable y compromiso de acuerdo para entregar los resultados, vía , antes de la fecha de cierre del ejercicio. 7. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS Los participantes analizarán las muestras en sus respectivos laboratorios e informarán los resultados y los datos solicitados vía al laboratorio de Dosimetría Biológica de la Argentina dosibiol@cae.arn.gov.ar, antes del 31 de marzo de 2008 (fecha de cierre del ejercicio), con copia a un laboratorio de Dosimetría Biológica que los países participantes designen en la reunión de La Habana, Cuba. Los laboratorios deberán 1. Determinar, para cada punto de dosis, el número de dicéntricos y anillos observados en 500 células evaluadas, expresando los datos crudos, la frecuencia y la incertidumbre asociada a la observación. Analizar la distribución intercelular de las aberraciones cromosómicas inestables observadas en el total de metafases evaluadas y su conformidad con la distribución de Poisson utilizando el test μ de Papworth y la relación varianza-media (σ 2 /y). (Tabla I). 2. Estimar la dosis a partir de la curva de calibración apropiada (propia o de consenso internacional), expresada como dosis media con intervalo de confianza del 95%. Deberán consignarse los coeficientes de la curva de calibración aplicada y las incertidumbres consideradas para el cálculo de la dosis a partir de la frecuencia (Tabla II). Si se aplica otro método, se deberá describir. 3. Realizar los análisis y enviar los resultados en el plazo establecido, y de acuerdo a la manera de informar que se acuerde en la reunión de Cuba. 8. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS El laboratorio de Argentina asignará un código anónimo a cada uno de los laboratorios participantes. Realizará el análisis estadístico de los resultados con la colaboración del laboratorio designado por consenso de las partes. Los procedimientos estadísticos incluyen el cálculo de valores de consenso, estimaciones de la reproducibilidad, e indicadores de desempeño. Los procedimientos estadísticos a utilizar se detallarán en un protocolo específico que será enviado a los participantes el 15 de agosto de 2007 y discutido durante la reunión en La Habana, Cuba, en noviembre de
5 9. INFORME Un mes después de la fecha de cierre se enviará, por separado, un informe confidencial a cada uno de los participantes en los que se hubieran identificado inconsistencias, a fin de que los laboratorios puedan realizar las correcciones necesarias antes de que se realice el informe preliminar, que será enviado a todos los participantes el 15 de julio de Este informe contendrá el análisis de los datos de los laboratorios participantes en forma anónima. El informe final se discutirá en la reunión a realizarse en Buenos Aires, Argentina en octubre de En esta reunión se abrirá el sobre sellado conteniendo la documentación que garantiza las dosis físicas administradas a las muestras evaluadas. Asimismo, durante esta reunión se realizará una valoración de los resultados obtenidos y se propiciará el desarrollo de medidas correctivas. Se prevé realizar una publicación a partir de este ejercicio de intercomparación. 10. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES AÑO 2007 FECHA ACTIVIDADES junio - julio Preparación de la muestra: - irradiaciones y cultivos celulares. - armado de cajas con láminas portaobjetos a distribuir. agosto Envío del protocolo conteniendo (Fecha límite: 15/08/07): - procedimientos estadísticos a utilizar. - puntos a ser discutidos durante la reunión en Cuba. octubre - noviembre (Reunión en Cuba) - Discusión entre los participantes de los procedimientos estadísticos y criterios de desempeño a aplicar. - Entrega a Cuba del documento sellado con informe de las dosis físicas administradas. - Firma del compromiso de acuerdo para el ensayo interlaboratorio, por parte de los participantes. - Sorteo entre los participantes de las cajas con las láminas portaobjetos. - Entrega a los participantes de instrucciones y planillas. AÑO 2008 FECHA ACTIVIDADES marzo abril Envío de los resultados obtenidos por los participantes a la Argentina y a otro país a designar (Fecha límite: 31/03/08). Envío a los participantes del informe confidencial con inconsistencias observadas. julio - agosto Circulación del informe preliminar (Fecha límite: 15/07/08) octubre (Reunión en Argentina) - Presentación y discusión del informe final - Apertura del sobre sellado con el informe de dosis administradas. - Valoración de los resultados obtenidos. - Desarrollo de medidas correctivas. 58
6 Tabla I. Resultados citogenéticos a partir de una muestra de sangre venosa irradiada in vitro con una fuente de Co-60 con dos dosis diferentes y muestra control. Código de laboratorio Código de muestra Nº de células evaluadas Nº de dicéntricos Nº de anillos céntricos Exceso de acéntricos Frecuencia DS Distribución de células conteniendo dicéntricos + anillos 0 dic 1 dic 2 dic 3 dic 4 dic 5 dic 6 dic σ 2 /y μ 59 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 I I I I I I I I I 59
7 Tabla II. Determinación de la dosis media y su intervalo de confianza del 95%. Código de laboratorio Frecuencia observada dicéntricos (+anillos) Frecuencia espontánea Coef. α Coef. β Error en α Error en β Error Poisson Intervalo de confianza del 95% (en frecuencia) Dosis media [Gy] Intervalo de confianza del 95% (en dosis) [Gy] L1 L2 L3 L4 60 L5 L6 L7 L8 L9 60
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