Figura 1. En efecto, como V m = V B - V A, al aplicarse una corriente de salida de intensidad constante I en los nodos

Transcripción

1 1. ELECTROFISIOLOGÍA Una de las propiedades fundamentales de las células nerviosas y musculares, es la capacidad de generar potenciales de acción. Estos consisten en un cambio rápido y transitorio del potencial de membrana, el cual se propaga por toda la fibra o célula con la misma forma y tamaño. Los conocimientos actuales sobre los mecanismos de generación y propagación del potencial de acción, se deben a los trabajos de Bernstein, Cole & Curtis, Katz, y sobre todo Hodgkin y Huxley. Potencial de reposo y repuesta subumbral. La mayoría de las células animales mantienen una diferencia de potencial a través de sus membranas plasmáticas entre el compartimento extracelular y el intracelular, que se conoce con el nombre de potencial de membrana. Los mecanismos posibles de generación de dicho potencial involucran los gradientes iónicos y las diferencias de permeabilidad, como factores más importantes. Si se introduce un microelectrodo (diámetro aproximado 0,5 µm), dejando otro en el medio extracelular, pueden medirse las variaciones del potencial de membrana en diversas situaciones. Una experiencia frecuente es la de hacer pasar a través de la membrana un pulso de corriente y observar la respuesta. Para valores "pequeños" corriente, se observa en el potencial de membrana el siguiente efecto: V m (mv) t (ms) Figura 1 En la figura 1 se observa el curso temporal del potencial de membrana durante un pulso de corriente rectangular (tener en cuenta que V m = V int - V ext ). La curva recuerda el comportamiento de un circuito eléctrico, formado por un generador y una resistencia en paralelo con un condensador cuando se le aplica externamente una corriente constante. Este tipo de respuesta, que no modifica las propiedades eléctricas de la membrana, se denomina respuesta pasiva. Es además una respuesta subumbral pues no genera un potencial de acción. Este último se produce frente a estímulos mayores, observándose un cambio brusco y autorregenerativo de las propiedades eléctricas de la membrana. Se puede modelar la respuesta pasiva mediante un circuito equivalente como el que sigue: Figura 2 En efecto, como V m = V B - V A, al aplicarse una corriente de salida de intensidad constante I en los nodos 1

2 A y B, el cambio de potencial sigue un curso temporal exponencial según la ecuación: t /τ V ( t) = IR (1 e ) m m en la que cuando t = τ, el cambio de potencial ( V m ) es del 63 %, representando τ, el valor de la constante de tiempo de la membrana y pudiéndose calcular su valor como τ = R m C m. Ambas ecuaciones explican el curso temporal del cambio de voltaje observado en la figura 1. A este circuito RC se lo conoce como análogo eléctrico de la membrana. Este análogo es suficiente si toda la membrana está uniformemente polarizada, por ejemplo en el caso de una célula esférica. Corrientes iónicas y potencial de acción. Al aumentar la intensidad de corriente aplicada en el experimento de la figura 2, el potencial de membrana es llevado por encima de un cierto valor (umbral), desencadenándose un potencial de acción. Figura 5 t (ms) Bernstein propuso en 1902 que el potencial de acción es el resultado de un aumento de la permeabilidad de membrana a todos los iones (tomado de J. Rinzel, 1990). Si bien esta hipótesis explicó satisfactoriamente los resultados de medidas extracelulares de potencial de acción, una vez que se desarrollaron técnicas que permiten medir la diferencia de potencial transmembrana, se hizo necesario modificar la hipótesis de Bernstein. El hecho de que el potencial de membrana llega a valores positivos (por ejemplo +30 mv), no es explicable en términos de aumento indiscriminado de la permeabilidad. Hodgkin, Huxley y Katz, propusieron una explicación basada en la misma idea: como el ion sodio (Na + ) en condiciones fisiológicas se encuentra alejado del equilibrio electroquímico (en una fibra típica V m = -90 mv, mientras que E Na = +67 mv), un aumento en la permeabilidad al Na +, que en reposo es muy baja, hace tender el potencial de membrana al valor del potencial de equilibrio E Na, como resultado de la entrada del ion en la célula. Esto provoca un aumento en la permeabilidad al potasio (K + ), que alejado de su condición de equilibrio experimenta un flujo neto hacia afuera, restableciendo el potencial de reposo. La diferencia en el comportamiento de las permeabilidades al Na + y al K +, radica en que la permeabilidad por el Na + experimenta un gran aumento rápido pero transitorio al ocurrir una despolarización, mientras que la permeabilidad por el K + experimenta un aumento lento pero sostenido. Por medio de la técnica de fijación de voltaje, Hodgkin, Huxley y Katz, lograron estudiar el comportamiento de las corrientes iónicas para diferentes valores de potencial de membrana en el axón gigante de calamar. Además, modificaron el baño en el que se sumerge el axón para obtener un medio de la composición deseada. De esta forma, pueden estudiarse separadamente las corrientes originadas por cada ion. Luego, Hodgkin y Huxley obtuvieron la dependencia de las distintas corrientes y conductancias iónicas con respecto al potencial de membrana. Podemos expresar el comportamiento de la membrana en el potencial de acción, de acuerdo a la terminología de circuitos eléctricos, si ampliamos el análogo eléctrico que ya habíamos utilizado, agregando una fuente y una resistencia para cada uno de los iones relevantes. 2

3 Figura 6 En estos casos V ion representa el potencial de equilibrio del ion y C m la capacitancia de la membrana. En el circuito, la conductancia g (1/R), se relaciona con la permeabilidad de la membrana para cada ion. La flecha sobre cada resistencia indica su variabilidad. Nótese que el modelado de las respuestas pasivas se realiza por medio de un circuito cuyas resistencias son fijas, en tanto que en las respuestas activas se introduce una variación debida a que la relación entre las corrientes iónicas y el potencial de membrana no es lineal (porque la conductancia depende del potencial). A partir de las concentraciones de cada uno de los iones (que determinan el potencial de las baterías), y de las conductancias, puede calcularse el potencial de membrana. Como ejemplo, en condiciones de reposo, la corriente iónica total es nula (porque de lo contrario se debería cargar o descargar el condensador), y de esa forma sabemos que I Na + I K + I Cl = 0. Utilizando las siguientes relaciones: I Na = (V m - E Na ) g Na ; I K = (V m - E K ) g K ; I Cl = (V m - E Cl ) g Cl obtenemos (V m - E Na ) g Na + (V m - E K ) g K + (V m - E Cl ) g Cl = 0 y despejando E Na g Na + EK g K + E Vm = g + g + g Na K Cl Cl g Cl Si bien esta ecuación es válida cuando el potencial de membrana en el punto considerado es constante (donde la corriente capacitativa es nula), utilizando la misma idea puede reproducirse la respuesta activa. En ese caso debemos considerar, además de las corrientes iónicas, las corrientes capacitativas. Para estudiar la generación y propagación del potencial de acción, se considerará que las conductancias iónicas tienen la misma relación con el voltaje, tanto en un potencial de acción propagado, como cuando el potencial cambia al mismo tiempo en toda la membrana (potencial de acción de membrana ). Utilizando los parámetros extraídos de las condiciones de control de voltaje, puede resolverse numéricamente el sistema de ecuaciones diferenciales que modelan el comportamiento eléctrico de la membrana del axón. Al hacer esto se obtienen las curvas V = F( t ) y V = f ( x ), así como otros parámetros como la velocidad de conducción, que se ajustan de muy buena forma a lo observado en los experimentos. Canales iónicos y conductancia. Es necesario el estudio de la conductancia de cada ion para comprender y explicar el potencial de acción. El paso de iones en forma pasiva a través de las membranas biológicas se debe a la presencia de ciertas proteínas canal. La conductancia a un ion particular depende de la dinámica de apertura y cierre de un gran número de éstos, cuya probabilidad de encontrarse abierto está gobernada por el voltaje y el tiempo. Ciertos sectores del canal actúan como compuertas. Para abrirse el canal de K + deben activarse cuatro compuertas 1. Si la probabilidad de activación (equivalente a la fracción de compuertas abiertas) de cada una 3

4 de ellas es n, y las compuertas son independientes entre si, la probabilidad de que un canal se encuentre abierto (la fracción de canales abiertos) va a ser igual a n 4. El canal de Na + presenta 3 compuertas que se activan, y una cuarta que se inactiva al despolarizar la membrana. Si la probabilidad de que éstas permitan el pasaje es m y h respectivamente, la probabilidad de que el canal se encuentre abierto será a m 3 h. Las probabilidades m, n, y h, varían con el tiempo y con el potencial de membrana. Las conductancia macroscópica G ion de toda la membrana se relaciona con la conductancia del canal individual cuando se encuentra abierto (g ion), el número de canales en la membrana (N) y la probabilidad de encontrarse en el estado abierto (P o ) mediante la ecuación: G ion (V m,t)= g ion N P o (V m,t) Note que g ion N es la máxima conductancia de membrana para esa especie iónica, puede medirse como el cociente de G ion (V m,t) / G ion,max. Bloqueo específico de canales Los canales iónicos pueden ser bloqueados por numerosos agentes naturales o sintéticos. Algunos bloquean específicamente un tipo de canal determinado y otros pueden bloquear una familia mas grande de canales iónicos. En el modelo de las practicas se pueden cambiar las concentraciones de dos bloqueantes de canales iónicos, los cuales se describen a continuación: TEA: tetraetilamonio. Bloquea parcialmente los canales de K + de fuga, I K(fuga). Puede bloquear totalmente los canales de K + activados por voltaje, I K(V). STX: saxitoxina. Puede bloquear totalmente los canales de Na + dependientes de voltaje. EJERCICIOS PROPUESTOS EN LA PRACTICA 1. Ejercicios de electrofisiología Ejercicio 1.1 Simulación básica del potencial de acción. Seleccionar la opción 1 (Basic Simulation) en el modo Current Clamp a) Obtener un potencial de acción a partir de los parámetros iniciales del programa. b) Manteniendo constante la duración del estímulo eléctrico en 0.1 ms, cuál es el valor de menor intensidad eléctrica que se puede aplicar para obtener un potencial de acción? c) Qué sucede si manteniendo los mismos parámetros anteriores se retrasa la aplicación del estímulo 1 ms? d) Solapar la gráfica del potencial de acción obtenido en el apartado b, donde el potencial de membrana era de -60 mv, con el potencial de acción que se obtiene al iniciar el proceso con un potencial de membrana de -90 mv. Explicar los resultados. Ejercicio 1.2. Características del potencial de acción (I). El potencial de acción es una respuesta eléctrica todo o nada cuyas características son estereotipadas con independencia de la magnitud y duración del estímulo. No obstante, su amplitud y forma dependen de la amplitud y dirección de las corrientes iónicas que lo generan. A su vez, estas corrientes fluyen a través de canales iónicos cuyo estado es función tanto del voltaje como del tiempo. Variaciones en estos parámetros pueden determinar cambios en la amplitud o curso temporal del potencial de acción. Seleccionar la opción 1 (Basic Simulation) en el modo Current Clamp a) Utilizando un pulso de estimulación de 100 ma de intensidad y 0.1 ms de duración aplicado a los 0 ms, generar una secuencia de potenciales de acción superpuestos partiendo de potenciales de membrana de -90, -70, -60, -50 y -40 mv. 4

5 b) Explicar a qué se deben las diferencias en: 1) la amplitud del potencial de acción, 2) el retraso en la ocurrencia del potencial de acción, 3) el fallo en la generación del potencial de acción a los -50 mv y 4) las diferencias en el máximo alcanzado por las conductancias. Ejercicio 1.3. Características del potencial de acción (II). Seleccionar la opción 3 (Adaptación) en el modo Current Clamp. a) Partiendo de un potencial de membrana de -60 mv, obtener la superposición de las respuestas tras aplicar un estímulo de 45 ms de duración a los 5 ms del inicio, a intensidades de 10, 50, 100 y 200 ma. b) Qué ocurre con la amplitud de los potenciales de acción sucesivos a lo largo del estímulo? a qué es debido? c) Cómo se modifica la frecuencia de potenciales de acción en relación a la intensidad del estímulo? d) Qué factor limita el disparo repetitivo a altas frecuencias? Ejercicio 1.4. Umbrales y periodo refractario. El periodo refractario es el periodo que sucede a un potencial de acción durante el cual es imposible (periodo refractario absoluto) o difícil (periodo refractario relativo) inducir un segundo potencial de acción. Seleccionar la opción 3 (Adaptación) en el modo Current Clamp. a) Cuál es la duración mínima que debe tener un estímulo eléctrico en las condiciones por defecto del programa para que se produzca un potencial de acción? b) Si se aplica un segundo estímulo eléctrico de 100 ma de intensidad y 0.1 ms de duración, 12 ms después del obtenido en el apartado a, qué resultados se observan? c) Qué intensidad debería tener el segundo estímulo eléctrico para que se produjera un segundo potencial de acción? d) Representar y explicar detalladamente los resultados obtenidos en los apartado b) y c). Ejercicio 1.5. Cálculo del periodo refractario absoluto (PRA) y relativo (PRR). Seleccionar la opción 3 (Adaptación) en el modo Current Clamp. a) Generar un único potencial de acción utilizando las condiciones iniciales del programa (Vm = -60 mv; First Estim. Intensidad 100 ma, Duración 0.1 ms, Inicio 0 ms b) Obtener la intensidad mínima que debe tener un segundo estímulo eléctrico de 0.1 ms de duración aplicado a los 10 ms para evocar un nuevo potencial de acción. c) Calcular el periodo refractario para una neurona en las condiciones por defecto del programa. d) Cuál es la intensidad necesaria para generar un segundo potencial de acción 4 ms después del primero? por qué? e) Discutir los resultados obtenidos en b) y c). Ejercicio 1.6. Bloqueo específico de canales de Na + y K +. La saxitoxina (STX) es un bloqueante de la conductancia de Na + y el tetraetilamonio (TEA) es un bloqueante de los canales de K +. Seleccionar la opción 4 (Pharmacology) en el modo Current Clamp Si partimos de un potencial de membrana inicial de -60 mv, sin dar ningún estímulo y con la base de tiempo en 50ms. a) Qué ocurre cuando [STX]=0 y [TEA]=0 mm? y cuando [STX]=50 nm y [TEA]=0 mm? Explicar los resultados. b) Qué ocurre cuando [STX]=0 nm y [TEA]=50 mm? Explicar los resultados. Ejercicio 1.7 Bloqueo específico de canales de Na + y K +. La saxitoxina (STX) es un bloqueante de la conductancia de Na + bloqueante de los canales de K +. Seleccionar la opción 4 (Pharmacology) en el modo Current Clamp. y el tetraetilamonio es un 5

6 a. Partiendo de un potencial de membrana de -60 mv y con la base de tiempo en 50 ms, se aplica un estimulo de 100 ma y 0.1 msec en el momento 30 ms de haber iniciado la representación. Suponer que no se aplica ningún bloqueante de canales. Qué ocurre? b. Qué ocurre cuando [STX]=2 nm y [TEA]=0 mm? Explicar los resultados. c. En las condiciones del apartado b., qué intensidad mínima debería tener el estimulo eléctrico aplicado para obtener un potencial de acción? Ejercicio 1.8 Bloqueo específico de canales de Na + y K +. La saxitoxina (STX) es un bloqueante de la conductancia de Na + y el tetraetilamonio es un bloqueante de los canales de K +. Seleccionar la opción 4 (Pharmacology) en el modo Current Clamp. Partiendo de un potencial de membrana de -60 mv y con la base de tiempo en 50 ms, representa gráficamente qué ocurre cuando no se aplica ningún estimulo y [STX]=0 nm y [TEA]=3 mm. Explicar detalladamente los resultados obtenidos. Ejercicio 1.9. Cinética de las corrientes de Na + y de K + durante la fijación de voltaje. Potencial de Nernst para un ion. Las corrientes de sodio y de potasio voltaje dependientes determinan el curso temporal del potencial de acción. Sus propiedades pueden estudiarse si el voltaje se mantiene controlado. Seleccionar la opción 9 (Corrientes) en el modo Voltage Clamp. a) Obtener una superposición con los perfiles de las corrientes de Na + y de K +, partiendo de un potencial de membrana de -60 mv, y sostenido a -80, -30, -72, -30, 0, 30, 55 y 80 mv durante el intervalo 2-8 ms, tras los que vuelve a -60 mv. b) Qué diferencias se observan en la cinética de cada una de las corrientes? c) Cuál es el potencial de inversión del Na +? Se puede conocer el del K +? d) Diseñar un paradigma de fijación de voltaje que permita calcular el potencial de inversión del K +. Ejercicio 1.10 Dependencia de voltaje y tiempo en las conductancias de Na + y de K + Las membranas excitables poseen conductancias de Na + y de K + voltaje y tiempo dependientes, activadas por despolarización. El valor a un determinado potencial de membrana (V m ) que adoptan tanto la conductancia (g i ) como de la fuerza electromotriz (V m E i ) determinan la magnitud y dirección de la corriente iónica según la Ley de Ohm, I i = g i (V m E i ). Seleccionar la opción 8 (Conductancias) en el modo Voltage Clamp. a) Obtener una superposición con los perfiles de las conductancias de Na + y de K +, partiendo de un potencial de membrana de -60 mv, y sostenido a -100, -40, -20, 0, 30, 55 y 80 mv durante el intervalo 2-8 ms, tras los que vuelve a -60 mv. b) En qué dirección de polarización se activan las conductancias de Na + y de K + voltajedependientes y cuál es su umbral? c) Es posible determinar el potencial de inversión para ambos iones?. Por qué teniendo valores positivos los valores de ambas conductancias, el potencial de acción muestra una fase de despolarización y otra de repolarización? d) Fijar el potencial de membrana inicialmente en -30 mv durante el primer ms, cambiarlo posteriormente a 0 mv en el intervalo 1-6 ms, y finalmente a -60 mv en el tramo 6-10 ms. Qué le ocurre a las conductancias de Na + y de K +? Por qué? e) Utilizar el mismo procedimiento que en d, pero fijando los potenciales a -30 mv, -80 mv y - 30 mv. Explicar los resultados. 6