Dade Behring Marburg GmbH / IBEX Technologies, Inc. Dade Hepzyme *

Transcripción

1 /, Inc. For use as a heparin neutralizer in plasma, to rule out heparin contamination in coagulation testing Summary and Principle Heparin is a potent and widely used anticoagulant that catalyzes the inactivation of thrombin and other serine proteases by antithrombin III (ATIII). 1,2 It is used therapeutically to reduce thrombotic disease and prophylactically for patients undergoing major surgical procedures or during dialysis to prevent clotting in indwelling catheters and extracorporeal devices. 3 The presence of heparin in a specimen may interfere with the interpretation of various coagulation tests. Heparinase I, the active component of Dade Hepzyme, is specific for heparin. Heparinase cleaves heparin at multiple sites per molecule, including the ATIII binding site, producing oligosaccharides with average molecular weights of 1000 daltons, that have lost their antithrombotic activity. 4 The successful use of heparinase to digest heparin in plasma samples prior to prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aptt) assays has been previously reported. 5 Cartridges coated with heparinase have been used in conjunction with ACT assays to monitor by-pass surgery and obtain accurate baseline clotting information on heparinized whole blood. 6 Dade Hepzyme is a stable, lyophilized preparation of purified bacterial heparinase I (E.C ) produced in Flavobacterium heparinum. The availability of this enzyme in large quantities was made possible by purification and fermentation methods developed at. 7 Dade Hepzyme is designed to specifically neutralize up to 2 USP units of unfractionated heparin in 1 ml of citrated plasma. Dade Hepzyme is easy to use, requiring minimal plasma handling. Other available methods to remove heparin contamination have limitations. Use of protamine to neutralize heparin requires careful titration to prevent the effects of incomplete neutralization or of protamine's own anticoagulant properties. 8 Heparin adsorbents and filters that remove heparin from plasma have been shown to bind Factors IX and X and frequently prolong coagulation tests. 8,9,10 Dade Hepzyme may be used to: (a) Rule out heparin contamination as responsible for abnormal coagulation results of activated Partial Thromboplastin Time (aptt), Prothrombin Time (PT) and Thrombin Clotting Time (TCT) Assays. (b) Compare the aptt results for heparinized samples when monitoring heparin therapy. (c) Evaluate patients on combined heparin and coumadin therapy. Reagent For In Vitro Diagnostic Use Dade Hepzyme : Dried preparation of purified bacterial heparinase I with added stabilizers. Store at 2-8 C. Reagent is stable at 2-8 C until the expiration date printed on the label. Reconstitute each vial with 1 ml of citrated patient plasma. Allow to sit at room temperature for 15 minutes prior to testing. Neutralized plasmas should be kept at room temperature and tested as soon as possible, not to exceed the time requirements for the test procedure to be employed. Indication of deterioration: no evidence of vacuum in vial upon opening, inappropriate neutralization of control as specified in Quality Control Section. Specimen Collection and Preparation Use citrated plasma. To prepare, mix nine parts of freshly collected patient blood with one part 0.11 or 0.13 mol/l (3.2% or 3.8%) sodium citrate. Evacuated tubes containing the desired anticoagulant are commercially available and may be used with caution in blood coagulation studies. Centrifuge the blood specimen for a minimum of 10 minutes at 1500 rcf as soon as possible after collection and within 60 minutes. Transfer plasma using a plastic pipette to a plastic centrifuge tube and centrifuge again for 10 minutes at 1500 rcf to insure platelet-poor plasma. Transfer supernatant plasma into another plastic tube using a plastic transfer pipet. Stopper tube until ready to test. Alternatively, guidelines on NCCLS** Document H21-A2, Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and Performance of Coagulation Assays may be followed for specimen collection and preparation. Neutralization with Dade Hepzyme should be done at room temperature (20 to 25 C) as soon as possible without exceeding the time requirement for the coagulation test procedure. Reagent Provided Dade Hepzyme Materials Required but Not Provided or 0.13 mol/l (3.2% or 3.8%) sodium citrate for blood collection. 2. Controls: Dade Ci-Trol Coagulation Control Levels 1, 2 and 3, Dade Ci-Trol Heparin Controls, Low and High. 3. Plastic tubes and plastic transfer pipettes. 4. Pipetting devices capable of accurately measuring 5.0 ml, 1.0 ml, 0.5 ml, 0.2 ml, 0.1 ml and 0.02 ml. Procedure 1. Add 1 ml platelet-poor citrated plasma to each Dade Hepzyme vial, re-stopper and invert gently 5 to 10 times. Note: If plasma volume is limited, add no less than 0.5 ml plasma. All the lyophilized material should be dissolved. This applies to aptt and PT testing only. 2. Let vials stabilize for 15 minutes at room temperature (20-25 C). Note: If heparin level in plasma is greater than 2 USP units but less than 4 USP units, sequential neutralization may be done not to exceed two vial passages per sample. This applies to aptt and PT testing only. After the first vial has stabilized, transfer at least 0.5 ml plasma to the second vial and allow it to stabilize for 15 minutes at room temperature. 3. Perform desired coagulation determination(s). Neutralized plasmas should be kept at room temperature and tested as soon as possible and not to exceed the time requirements for the test procedure to be employed. Quality Control 1. Dade Ci-Trol Levels 1, 2 and 3 for aptt and PT. Dade Ci-Trol Heparin Control High and Low for aptt. Dade Ci-Trol Level 1 for TCT. Refer to respective product inserts. Control material should be run in the same manner as the specimen samples. Control results must be within the established acceptable range based on ± 2.0 to ± 2.5 Standard Deviations (SD) from the mean control value. If a value outside of the established control range is encountered, a complete check of the instrument and reagents should be undertaken. Neutralization 2. Use the Dade Ci-Trol Heparin Control Low: reconstitute one vial as specified in the package insert. a. Perform aptt determination. Result must be within the acceptable range established in each laboratory based on ± 2.0 to ± 2.5 SD from mean control value. b. Neutralize remaining Dade â Ci-Trol Heparin Control Low with Dade Hepzyme, handling in the same manner as a patient plasma. c. Perform aptt of neutralized Dade Ci-Trol Heparin Control Low. Results should be within a range of allowable variation established in each laboratory for this control when treated with Dade Hepzyme. Because of stabilizers in the Dade Ci-Trol Heparin Control Low, the neutralized control may not be expected to be within the normal range for aptt. 3. Alternatively use Dade Ci-Trol Level 1: reconstitute two vials of the same lot, as specified in the package insert and combine. a. Perform aptt determination. Result must be within the established acceptable range based on ± 2.0 to ± 2.5 SD from the mean control value. b. Prepare a heparin stock solution containing approximately 19.6 U/mL (using the same heparin as administered for heparin therapy) in physiological saline as follows: For 1000 USP units/ml: Add 0.1 ml to 5.0 ml saline and mix well. c. To 1.5 ml Dade Ci-Trol Level 1 add 0.02 ml (19.6 U/mL) heparin stock solution. Control will contain approximately 0.26 U/mL heparin. Gently invert to mix well. * This product is covered by U.S. Patents 4,443,545; 5,169,772 and patents pending. The heparinase in this product is manufactured by,, Canada. ** National Committee for Clinical Laboratory Standards, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, PA. Copyright Dade Behring Inc. All rights reserved. B4240 G10 E0533 (0583) W 1 Edition July 1999 d. Perform aptt determinations of heparin-spiked Dade Ci-Trol Level 1. Results must be within a range of allowable variation established in each laboratory for this control spiked with the specific source and manufacturer of heparin. e. Neutralize 1 ml of the spiked Dade Ci-Trol Level 1 with Dade Hepzyme handling in the same manner as a patient plasma. f. Perform aptt of neutralized Dade Ci-Trol Level 1. Results should be within the laboratory s established normal range for aptt or within a range of allowable variation established in each laboratory for this control when treated with Dade Hepzyme. Results Results of aptt and TCT should be reported in seconds (refer to the package insert for the respective coagulation tests). PT may be reported in seconds, INR or in percent (refer to the package insert for the PT reagent used). If unfractionated heparin is present in the specimen at a level of 2 USP units/ml, Dade Hepzyme will eliminate the heparin effect. Differences in test values before and after plasma treatment with Dade Hepzyme indicate the presence of heparin in the sample. Results should be related to the laboratory s normal range or to within 15% of the patient s baseline for aptt testing, to within 10% of the patient s baseline for PT, and to the baseline for TCT testing. For patients on oral anticoagulant therapy, Dade Hepzyme will neutralize heparin for PT testing. Limitations of Procedure 1. Dade Hepzyme will neutralize up to 2 USP units of unfractionated heparin when reconstituted with 1.0 ml of citrated plasma. Addition of plasma volumes between 0.5 to 1.0 ml will not alter Dade Hepzyme neutralization. 2. In evaluating Dade Hepzyme results of patients during heparin therapy, the presence of Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) should be considered. The levels of TFPI increase in blood severalfold following heparin injection. 11 An increase in TFPI activity has been associated with an anticoagulant effect that is not removed by heparin neutralization and may result in prolonged clotting times. 12,13 3. For patients receiving oral anticoagulants, thrombolytic therapy, or patients with circulating inhibitors or anti-phospholipid antibodies, the medication and clinical histories should be considered when interpreting results. These patients may have underlying conditions that result in a prolongation of the aptt and/or PT in the absence of heparin. Abnormal aptts and/or PTs should be followed by additional coagulation studies to determine the source of abnormal results. 4. If Dade Hepzyme neutralization does not return the aptt to within the normal range and high levels of heparin are suspected, sequential neutralization may be tried. A plasma specimen should not be subjected to more than two sequential neutralizations and heparin levels should not exceed 4 USP units. 5. Thrombin Clotting times are subject to variation in sensitivity, depending on the thrombin concentration in the reagent and the instrument used. Stabilizers in Dade Hepzyme can interfere with TCT results. A shift in the normal range may be expected. TCT testing should not be performed on samples that have been neutralized by sequential vial passages. 6. Refer to the package insert of the respective coagulation test to be performed for additional limitations. Expected Values Normal values vary from laboratory to laboratory depending on technique, reagent and instrument used. Each laboratory should establish its own normal ranges for aptt, PT and TCT testing. Acceptable limits for correction should be established by each laboratory for the testing system used. Specific Performance Characteristics Studies have shown that Dade Hepzyme will neutralize up to 2 USP units/ml of unfractionated heparin in normal samples spiked in vitro. In 34 samples of unheparinized plasmas, the aptt was 25.7 ± 1.7 sec. before and 25.2 ± 1.7 sec. after Dade Hepzyme treatment. Paired factor assays were performed on untreated and Dade Hepzyme treated plasmas from (a) frozen heparinized specimens, and (b) normal samples to which heparin was added in vitro. Results showed no significant changes in levels of Factors II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII or fibrinogen. In multi-center studies, plasma specimens from 157 individuals were evaluated. Of these, 47 specimens were from patients on unfractionated heparin therapy (cardiac, orthopedic surgery and DVT patients) with heparin levels ranging from 0.1 to 1.1 U/mL. Treatment with Dade Hepzyme showed a reversal of the heparin effect with aptt results returning to within the aptt reagent's normal range or within 15% of the patient s baseline. PT testing was also done on 32 of these patients. Results after Dade Hepzyme treatment were within 10% of the patient's baseline PT. Similarly, aptt values for 60 apparently healthy donors were within 15% of the pre-treatment aptt. Samples from 11 patients on low molecular weight heparin therapy were also neutralized by Dade Hepzyme. Thirty specimens from patients receiving coumadin had an aptt mean value of 53.5 ± 7.2 sec. Addition of heparin (0.3 to 1.2 U/mL) increased the aptt mean value to >200 sec. After Dade Hepzyme treatment, the aptt mean value was 54.6 ± 8.7 sec. Also, 9 plasma samples taken during the induction phase of oral anticoagulation (coumadin), while patients were still on heparin, showed an aptt mean value of 75.7 ± 28.6 sec. Dade Hepzyme treatment reduced this mean value to 31.8 ± 4.2 sec. PT values before and after Dade Hepzyme treatment were prolonged, as expected. Factor assays and/or chromogenic substrate tests for residual heparin proved that the prolongation of these values even after Dade Hepzyme treatment was not due to heparin. Bibliography 1. Penner, J.A. and Hiss, R.G. Heparin therapy in the 70 s. Univ. Mich. Med. Cent. J., 40:57, Wessler, S. Prevention of venous thromboembolism by low-dose heparin. Mod. Con. Cardiovascular Dis., 45:105, Triplett, D.A. Laboratory Evaluation of Coagulation. American Soc. of Clinical Pathologists, Chicago, , Lindhardt, R., Grant, A., Cooney, C.L. and Langen, R. Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase. J. Biol. Chem., 257: , Hutt, E.D. and Kingdon, H.S. Use of heparinase to eliminate heparin inhibition in routine coagulation assays. J. Lab. Clin. Med., 79: , Baugh, R.F., Deemar, K.A. and Zimmermann, J.J. Heparinase in the Activated Clotting Time Assay: Monitoring heparin independent alterations in coagulation function. Anesthesia Analgesia, 72: , Zimmermann, J.J., Oddie, K., Lungar, R. and Cooney, C.L. The release of heparinase from the periplasmic space of Flavobacterium heparinum by three-step osmotic shock. App. Biochem. and Biotech., 30: , Cumming, A.M., Jones, G.R., Wensley, R.T. and Cundall, R.B. In vitro neutralization of heparin in plasma prior to the activated partial thromboplastin time test: an assessment of four heparin antagonists and two anion exchange resins. Thrombo. Res., 41:43-56, Thompson, A.R. and Counts, R.B. Removal of heparin and protamine from plasma. J. Lab. Clin. Med., 88: , Wenz, B. and Burns, E. Rapid removal of heparin from plasma by affinity filtration. Am. J. of Clin. Path., 96: , Sandset, P.M., Abildgaard, U. and Larsen, M.D. Heparin induces release of extrinsic pathway inhibitor. Thromb. Res., 50: , Lindahl, A.K., Abildgaard, U. and Staalesen, R. The anticoagulant effect in heparinized blood and plasma resulting from interactions with Extrinsic Pathway Inhibitor. Throm. Res., 64: , Abildgaard, U., Lindahl, A.K. and Sandset, P.M., Heparin requires both Antithrombin and Extrinsic Pathway Inhibitor for its anticoagulant effect in human blood. Haemostasis, 21: , This product is warranted to perform as described in the labeling and the product literature, and Dade Behring disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for any other purpose, and in no event shall Dade Behring be liable for any consequential damages arising out of the aforesaid express warranty. Manufacturer: USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE U.S.A.

2 , Inc. Zur Neutralisierung von Heparin im Plasma, zum Ausschluß einer eparinkontamination bei Gerinnungstests Zusammenfassung und Wirkungsprinzip Heparin ist ein wirksames und häufig verwendetes Antikoagulans, das die Inaktivierung von Thrombin und anderen Serinproteasen durch Antithrombin III (ATIII) katalysiert (1,2). Es wird bei der Behandlung thrombotischer Erkrankungen sowie als Prophylaktikum bei Dialysepatienten und Patienten, die sich schweren Operationen unterziehen müssen, eingesetzt, um eine Gerinnung des Blutes in Verweilkathetern und extrakorporalen Hilfsmitteln zu verhindern (3). Bei einigen Gerinnungstests kann die Interpretation durch in der Probe vorhandenes Heparin erschwert werden. Heparinase I, der aktive Bestandteil von Dade Hepzyme, ist ein heparinspezifisches Enzym. Heparinase spaltet das Heparinmolekül an mehreren Stellen - darunter die AT-Bindungsstelle. Hierdurch entsteht eine Mischung aus Oligosacchariden ohne antithrombotische Aktivität, deren durchschnittliches Molekulargewicht 1000 Dalton beträgt (4). Vor kurzem gelang der Heparinabbau in Plasmaproben durch Heparinase vor der Bestimmung der Thromboplastinzeit (TPZ) und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aptt) (5). Mit Heparinase beschichtete Testbehälter wurden bei ACT-Tests zur Überwachung von Bypass-Operationen eingesetzt und dienen auch dazu, grundlegende Information über die Gerinnungsaktivität von heparinhaltigen Vollblutproben zu erhalten (6). Dade Hepzyme ist ein stabiles Lyophilisat aus gereinigter Heparinase I (E.C ) des Bakteriums Flavobacterium heparinum. Das Enzym ist durch ein von der Firma (7) entwickeltes Reinigungs- und Fermentations-verfahren in großen Mengen verfügbar. Dade Hepzyme kann bis zu 2 USP-Einheiten unfraktioniertes Heparin in 1 ml Citratplasma spezifisch neutralisieren. Dade Hepzyme erfordert nur wenig Zeit im Umgang mit Plasma und ist deshalb leicht zu handhaben. Andere im Handel erhältliche Verfahren zur Entfernung von Heparin sind in ihrer Wirksamkeit eingeschränkt. Der Einsatz von Protamin zur Heparinneutralisierung erfordert exakte Titration, um die Auswirkungen einer unvollständigen Neutralisierung oder der antikoagulatorischen Eigenschaften von Protamin auszuschlieben (8). Heparinadsorbanzien und Filter, die Heparin aus dem Plasma entfernen, binden Faktor IX und X und verlängern oftmals die Gerinnungszeiten (8,9,10). Dade Hepzyme kann eingesetzt werden, (a) um Verunreinigungen mit Heparin als mögliche Ursache für abnormale Ergebnisse bei der Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aptt), Thromboplastinzeit (TPZ) und Thrombinzeit (TZ) auszuschließen. (b) um die aptt-ergebnisse von heparinisierten Proben bei der Überwachung der Heparintherapie miteinander zu vergleichen. (c) um Patienten bei einer kombinierten Therapie mit Heparin und Cumarin zu untersuchen. Reagenzien In-Vitro-Diagnostikum Dade Hepzyme : Gefriergetrocknetes Präparat aus gereinigter Heparinase I von Bakterien; mit Konservierungsstoffen. Das Reagenz ist bei Aufbewahrung bei 2-8 C bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Jedes Fläschchen mit 1 ml Citratplasma anlösen. Vor der Testdurchführung 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen lassen. Neutralisierte Plasmaproben sollten bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden und so bald wie möglich getestet werden, wobei die für einzelne Tests zulässige Lagerungszeit der Proben nicht überschritten werden darf. Zeichen von Verfall: Beim Öffnen des Fläschchens besteht kein Vakuum; ungenügende Neutralisierung der Kontrolle (siehe Abschnitt Qualitätskontrolle). Probenentnahme- und aufbereitung Nur Citratplasma verwenden. Hierzu neun Teile frisch abgenommenes Blut des Patienten mit einem Teil 0,11 oder 0,13 mol/l (3,2% oder 3,8%) Natriumcitrat versetzen. Vakuumröhrchen mit dem benötigten Antikoagulans sind im Handel erhältlich und können bei vorsichtiger Handhabung bei Gerinnungstests eingesetzt werden. Probe möglichst bald nach der Abnahme, spätestens 60 Minuten danach, mindestens 10 Minuten lang bei 1500 RZB zentrifugieren. Plasma mit einer Kunststoffpipette in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff geben und erneut mindestens 10 Minuten bei 1500 RZB zentrifugieren, um thrombozytenarmes Plasma zu erhalten. Überstand mit einer Kunststoff-Transferpipette in ein anderes Röhrchen umfüllen, dann dieses Röhrchen bis zum Test mit einem Gummistopfen verschließen. Alternativ kann die DIN-Norm zur "Gewinnung von Citratplasma für hämostaseologische Analysen", DIN 58905, zugrunde gelegt werden. Die Neutralisierung mit Dade Hepzyme soll bei Zimmertemperatur (20-25 C) und möglichst bald durchgeführt werden, ohne daß die für den Gerinnungstest zulässige Zeit überschritten wird (Probenhaltbarkeit). Geliefertes Material Dade Hepzyme Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien 1. 0,11 oder 0,13 mol/l (3,2% oder 3,8%) Natriumcitrat für die Blutabnahme 2. Kontrollen: Dade Ci-Trol Gerinnungskontrolle, Bereiche 1, 2 und 3; Dade Ci-Trol Heparin-Kontrollen, hoch und niedrig 3. Pipetten und Transferpipetten aus Kunststoff 4. Präzisionspipetten für 5,0 ml; 1,0 ml; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml und 0,02 ml Testvorgang 1. In jedes Fläschchen mit Dade Hepzyme 1 ml thrombozytenarmes Plasma geben, Fläschchen mit Gummistopfen verschließen und vorsichtig 5-10mal kippen. Hinweis: Wenn die zur Verfügung stehende Plasmamenge begrenzt ist, müssen mindestens 0,5 ml Plasma zugefügt werden. Alle lyophilisierten Substanzen müssen gelöst werden. Dies trifft nur auf aptt- und TPZ-Tests zu. 2. Fläschchen 15 Minuten bei Zimmertemperatur (20-25 C) stehen lassen. Hinweis: Bei einem Heparinspiegel des Plasmas von über 2 aber unter 4 USP-Einheiten kann eine sequentielle Neutralisierung durchgeführt werden. Dies trifft nur auf aptt- und TPZ-Tests zu. Die Neutralisierung erfolgt, indem das Plasma nach der ersten Behandlung mit Hepzyme noch einer zweiten Heparinasebehandlung unterzogen wird. Dazu werden aus dem ersten Fläschchen mit Hepzyme nach 15 Minuten mindestens 0,5 ml Flüssigkeit in ein zweites Fläschchen umgefüllt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 3. Gewünschte(n) Gerinnungstest(s) durchführen. Neutralisiertes Plasma sollte bei Zimmertemperatur aufbewahrt und möglichst bald getestet werden, wobei die für den Test erforderliche Zeit nicht überschritten werden sollte. Qualitätskontrolle 1. Dade Ci-Trol 1, 2 und 3 für aptt und TPZ. Dade Ci-Trol Heparin-Kontrolle hoch und niedrig für die aptt. Dade Ci-Trol Bereich 1 für die TZ. Siehe jeweilige Packungsbeilage. Die Kontrollen sollten wie eine Patientenprobe behandelt werden. Der Streubereich beträgt normalerweise ± 2,0 bis ± 2,5 Standardabweichung (SD) vom mittleren Kontrollwert. Wenn die Werte außerhalb des Bereichs liegen, sollten alle Funktionen des Geräts und alle Reagenzien überprüft werden. Neutralisierung 2. Verwenden Sie die Dade Ci-Trol Heparin-Kontrolle, niedrig: Ein Fläschchen wie auf der Pakkungsbeilage angegeben anlösen. a. Bestimmen Sie die aptt. Die Ergebnisse müssen innerhalb des von jedem Labor festgelegten Streubereichs liegen, der von der Standardabweichung - ± 2,0 bis ± 2,5 vom mittleren Kontrollwert - abhängt. b. Neutralisieren Sie die restliche Dade Ci-Trol Heparin-Kontrolle, niedrig, mit Dade Hepzyme, und behandeln Sie dabei die Kontrolle wie eine Patientenprobe. c. Führen Sie eine aptt mit neutralisierter Dade Ci-Trol Heparin-Kontrolle, niedrig, durch. Die Ergebnisse sollten in einem erlaubten, von jedem Labor selbst festgelegten Streubereich für diese Kontrolle bei Behandlung mit Dade Hepzyme liegen. Da Dade Ci-Trol Heparin-Kontrolle, niedrig, Konservierungsmittel enthält, kann es vorkommen, dab mit der neutralisierten Kontrolle Werte auberhalb des Normalbereichs für aptt gemessen werden. 3. Alternativ hierzu kann Dade Ci-Trol, Bereich 1, verwendet werden: Zwei Fläschchen derselben Charge wie im Beipackzettel beschrieben anlösen und mischen. a. aptt-bestimmung durchführen. Das Ergebnis muß im festgelegten Streubereich auf der Grundlage der Standardabweichung von ± 2,0 bis ± 2,5 vom mittleren Kontrollwert liegen. b. Eine Heparin-Stammlösung aus ca. 19,6 U/ml Heparin (es soll das gleiche Heparin verwendet werden, welches auch bei der Heparintherapie eingesetzt wurde) in physiologischer Kochsalzlösung herstellen: Für Heparin mit 1000 USP-Einheiten/ml: 0,1 ml Heparin gut mit 5,0 ml Kochsalzlösung mischen. c. Fügen Sie 0,02 ml (19,6 U/ml) Heparin-Stammlösung zu 1,5 ml Dade Ci-Trol, Bereich 1, hinzu. Die Kontrolle enthält ca. 0,26 U/ml Heparin. Durch vorsichtiges Kippen mischen. d. Bestimmen Sie die aptt des mit Heparin versetzten Dade Ci-Trol, Bereich 1. Die Ergebnisse müssen innerhalb des erlaubten Streubereichs liegen, den jedes Labor für diese, mit Heparin aus einer bestimmten Quelle/Hersteller versetzte Kontrolle erstellt. e. Neutralisieren Sie 1 ml der mit Heparin versetzten Dade Ci-Trol Kontrolle, Bereich 1, mit Dade Hepzyme und gehen Sie dabei genauso vor wie bei Patientenplasma. f. Bestimmen Sie die aptt der neutralisierten Dade Ci-Trol, Bereich 1. Die Ergebnisse sollten dabei im vom Labor bestimmten Normalwertebereich für eine aptt oder in einem (ebenfalls von jedem Labor selbst erstellten) erlaubten Streubereich für diese Kontrolle bei Neutralisierung mit Dade Hepzyme liegen. Ergebnisse Die Ergebnisse der aptt und TZ sollten in Sekunden angegeben werden (siehe Beipackzettel der entsprechenden Gerinnungstests). Die TPZ kann in Sekunden, INR oder Prozent angegeben werden (siehe Packungsbeilage des verwendeten TPZ-Reagenzes). Bei 2 USP-Einheiten/ml unfraktioniertem Heparin in der Probe hebt Dade Hepzyme die Wirkung des Heparins auf. Unterschiede in den Testwerten vor und nach der Behandlung des Plasmas mit Dade Hepzyme dienen als Nachweis für Heparin in der Probe. Die Ergebnisse sollten im Normalwertebereich des Labors liegen, können jedoch auch innerhalb von 15% des APTT- oder 10% des TPZ- und TZ-Testergebnisses des Patienten vor Heparin liegen. Bei Patienten, die mit oralen Antikoagulantien behandelt werden, neutralisiert Dade Hepzyme Heparin bei der TPZ-Bestimmung. Grenzen des Verfahrens 1. Mit 1,0 ml Citratplasma angelöstes Dade Hepzyme neutralisiert bis zu 2 USP-Einheiten unfraktioniertes Heparin. Die Neutralisierung durch Dade Hepzyme ist in Plasmavolumina zwischen 0,5 und 1,0 ml möglich. 2. Bei der Bestimmung der Ergebnisse von Dade Hepzyme bei Heparintherapie-Patienten sollte überprüft werden, ob TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) vorhanden ist. Der TFPI-Spiegel erhöht sich nach einer Heparininjektion um ein Vielfaches (11). Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Aktivitätszunahme von TFPI und der Antikoagulans-Wirkung, die nicht durch die Heparinneutralisierung aufgehoben wird und somit zu verlängerten Gerinnungszeiten führen kann (12,13). 3. Bei Patienten unter oraler Antikoagulantien-Therapie, Patienten, die sich einer Thrombolyse- Therapie unterziehen oder Patienten mit zirkulierenden Inhibitoren oder Anti-Phospholipid-Antikörpern sollten die Medikamente und die Krankheitsgeschichte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. In diesen Fällen kann auch das Nichtvorhandensein von Heparin zu einer verlängerten aptt und/oder TPZ führen. Auf abnormale aptts und/oder TPZs sollten zusätzliche Gerinnungsuntersuchungen folgen, um die Ursache der Abweichung festzustellen. 4. Führt die Neutralisierung mit Dade Hepzyme nicht zu einer aptt im Normalbereich und es wird ein hoher Heparinspiegel vermutet, so kann eine sequentielle Neutralisierung versucht werden. Mit einer Plasmaprobe sollten nicht mehr als zwei sequentielle Neutralisierungsvorgänge durchgeführt werden und der Heparinspiegel sollte 4 USP-Einheiten nicht überschreiten. 5. Je nach Thrombinkonzentrationen im Reagenz und nach verwendetem Gerät können die Gerinnungszeiten von Thrombin in ihrer Empfindlichkeit schwanken. In Dade Hepzyme enthaltene Konservierungsmittel können das TZ-Ergebnis beeinflussen. Es kann zu Verschiebungen des Normalwertebereichs kommen. Mit Proben, die zweimal sequentiell neutralisiert wurden, sollten keine TZ-Tests durchgeführt werden. 6. Siehe Beipackzettel des jeweiligen Gerinnungstests für weitere Einschränkungen. Zu erwartende Werte Die Referenzwerte können je nach Technik und Gerät von Labor zu Labor unterschiedlich sein. Jedes Labor sollte deshalb seinen eigenen Normalwertebereich für aptt, TPZ und TZ erstellen. Jedes Labor sollte für das verwendete Testverfahren eigene Grenzwerte festlegen. Testcharakteristika Untersuchungen haben gezeigt, daß Dade Hepzyme in normalen, in vitro behandelten Proben bis zu 2 USP-Einheiten/ml unfraktioniertes Heparin neutralisieren kann. Bei 34 nicht heparinisierten Plasmaproben lag die aptt vor der Behandlung mit Dade Hepzyme bei 25, 7 ± 1,7 Sekunden, nach der Behandlung bei 25,2 ± 1,7 Sekunden. Tests wurden mit unbehandelten und mit Dade Hepzyme behandelten Plasmaproben durchgeführt, wobei die Proben a) von gefrorenen, mit Heparin versetzten Proben und b) von normalen Spendern stammten, deren Blut in vitro mit Heparin versetzt wurde. Die Ergebnisse zeigten keine auffälligen Veränderungen der Faktoren II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII oder Fibrinogen. Bei Multi-Center-Untersuchungen wurden die Plasmen von 157 Patienten untersucht. Davon stammten 47 von Patienten, die mit 0,1 bis 1,1 U/ml unfraktioniertem Heparin behandelt wurden (Patienten mit Herzkrankheiten, orthopädischen Operationen und tiefer Venenthrombose). Bei der Behandlung mit Dade Hepzyme kam es zu einer Neutralisierung des Heparins, wobei die aptt- Ergebnisse wieder im Normalbereich des Reagenzes bzw. innerhalb von 15% des Ausgangswertes des Patienten vor der Heparinbehandlung lagen. Auch die aptt-werte von 60 augenscheinlich gesunden Spendern lagen in diesem Bereich. Bei 32 der heparinbehandelten Patienten wurde die TPZ bestimmt. Nach der Behandlung mit Dade Hepzyme lagen die TPZ-Ergebnisse wieder innerhalb von 10% des Ausgangswerts des Patienten vor der Heparinbehandlung. Die Proben von 11 Patienten, therapiert mit niedermolekularem Heparin, wurden ebenfalls durch Dade Hepzyme neutralisiert. Dreißig Proben von Patienten, die mit Cumarin behandelt wurden, hatten einen aptt-milttelwert von 53,5 ± 7,2 Sek. Nach Heparinzugabe (0,3 bis 1,2 U/ml) stieg der Wert auf >200 Sek. Durch die Behandlung mit Dade Hepzyme erreichte der Mittelwert 54,6 ± 8,7 Sek. 9 Plasmaproben, die während der Einstellphase der oralen Antikoagulation (Cumarin) bei gleichzeitiger Heparingabe abgenommen wurden, hatten einen aptt-mittelwert von 75,7 ± 28,6 Sek. Nach der Behandlung mit Dade Hepzyme fiel der Wert auf 31,8 ± 4,2 Sek. Erwartungsgemäß war die TPZ sowohl vor als auch nach der Behandlung mit Dade Hepzyme verlängert. Durch Faktorentests und/oder Heparintests mit chromogenem Substrat wurde bewiesen, daß die Verlängerung der TPZ auch nach der Behandlung mit Dade Hepzyme nicht auf Heparin zurückzuführen ist. Literatur Siehe englische Packungsbeilage. Garantie Es wird garantiert, daß die Wirkungsweise dieses Produkts den Angaben auf der Packung und in der Produktliteratur entspricht. Dade Behring haftet nicht für die handelsübliche Qualität oder die Eignung des Produkts, falls dieses für irgendwelche anderen als die angegebenen Zwekke verwendet wird, noch für irgendwelche Folgeschäden, die sich aus den vorstehenden vertraglichen Gewährleistungen ergeben. Hersteller: D Marburg H4S 1W6 Kanada * Bestehende US-Patente: ; Weitere Patente beantragt. Die in diesem Produkt enthaltene Heparinase wurde hergestellt von, St. Laurent, Quebec, Kanada. B4240 G10 E0533 (0583) W 2 Ausgabe Juli 1999

3 , Inc. A utiliser comme agent neutralisant de l'héparine dans le plasma, pour éliminer une contamination par l'héparine dans les tests de coagulation Résumé et principe L'héparine est un puissant anticoagulant largement utilisé qui catalyse l'inactivation de la thrombine et d'autres sérine-protéases par l'antithrombine III (ATIII) (1,2). Il est utilisé en thérapeutique pour réduire les maladies thrombotiques et en prophylaxie chez des patients devant subir des interventions chirurgicales majeures ou au cours de la dialyse pour prévenir la formation de caillot dans les cathéters à demeure et le matériel de circulation extracorporelle (3). La présence d'héparine dans un échantillon peut interférer au niveau de l'interprétation de différents tests de coagulation. L'héparinase I, composant actif de l'hepzyme Dade, est spécifique de l'héparine. L'héparinase clive l'héparine au niveau de nombreux sites par molécule, y compris au niveau du site de liaison de l'atiii, produisant des oligosaccharides avec des poids moléculaires moyens de 1000 daltons qui ont perdu leur activité antithrombotique (4). L'utilisation avec succès de l'héparinase pour digérer l'héparine dans les échantillons plasmatiques avant des dosages de temps de prothrombine (TP) et de temps de thromboplastine partielle activée (TCA) a déjà été rapportée (5). Des cartouches recouvertes avec de l'héparinase ont été utilisées en association avec des dosages de TCA pour suivre une opération de pontage et obtenir une information de base précise sur la coagulation sur sang total hépariné (6). L'Hepzyme Dade est une préparation stable, lyophilisée d'héparinase I d'origine bactérienne, purifiée (E.C ) produite chez Flavobacterium heparinum. La disponibilité de cette enzyme en très grande quantité a été rendue possible par des méthodes de purification et de fermentation développées par (7). L'Hepzyme Dade est utilisé pour neutraliser spécifiquement jusqu'à 2 Unités USP d'héparine non-fractionnée dans 1 ml de plasma citraté. L'Hepzyme Dade est facile à utiliser, nécessitant une manipulation minimum du plasma. Les autres techniques disponibles pour éliminer la contamination par l'héparine sont limitées. L'utilisation de la protamine pour neutraliser l'héparine nécessite une titration soigneuse pour prévenir les effets d'une neutralisation incomplète ou des propres propriétés anticoagulantes de la protamine (8). Les agents adsorbants de l'héparine et les filtres qui éliminent l'héparine du plasma ont été démontrés comme liant les Facteurs IX et X et allongeant fréquemment les tests de coagulation (8,9,10). L'Hepzyme Dade peut être utilisé pour: (a) écarter la possibilité d'une contamination par l'héparine responsable de résultats anormaux de dosages du temps de thromboplastine partielle activée (TCA), du temps de prothrombine (TP) et du temps de thrombine (TT). (b) comparer les résultats de TCA d'échantillons héparinés dans la surveillance de traitement par l'héparine. (c) évaluer des patients traités par une association héparine-dérivés coumariniques. Réactif In vitro-test Hepzyme Dade : préparation lyophilisée d'héparinase I d'origine bactérienne, purifiée, additionnée d'agents stabilisants. Conservation à 2-8 C. Le réactif est stable à 2-8 C jusqu'à la date de péremption imprimée sur l'étiquette. Reconstituer chaque flacon avec 1 ml de plasma citraté du patient. Laisser reposer à température ambiante 15 minutes avant dosage. Les plasmas neutralisés doivent être maintenus à température ambiante et testés le plus rapidement possible, en ne dépassant pas le temps nécessaire dans la procédure de test utilisé. Signe de détérioration: absence de vide dans le flacon à l'ouverture initiale, mauvaise neutralisation du contrôle comme spécifié dans le paragraphe Contrôle de qualité. Recueil et préparation des échantillons Utiliser du plasma citraté. Pour l'obtenir, mélanger neuf volumes de sang du patient fraîchement prélevé avec un volume de citrate de sodium 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2% ou 3,8%). Des tubes contenant l'anticoagulant désiré sont disponibles sur le marché et peuvent être utilisés avec précaution dans les études de coagulation du sang. Centrifuger les échantillons sanguins pendant 10 minutes minimum à 1500 rcf aussitôt que possible après le prélèvement et dans les 60 minutes. Transférer le plasma à l'aide d'une pipette en plastique dans des tubes à centrifuger en plastique et centrifuger de nouveau pendant 10 minutes à 1500 rcf pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes. Transférer le surnageant dans un autre tube en plastique à l'aide d'une pipette en plastique. Boucher le tube jusqu'au moment du test. Les recommandations du document H21-A2 du NCCLS** sur le Recueil, le Transport et le Traitement des échantillons sanguins pour les tests de coagulation et les Performances des tests de coagulation peuvent être suivies pour le recueil et la préparation des échantillons. La neutralisation avec l'hepzyme Dade doit être réalisée à température ambiante (20-25 C) aussitôt que possible sans dépasser le temps nécessaire pour le procédé du test de coagulation. Réactif fourni Hepzyme Dade Matériel nécessaire mais non fourni 1. Citrate de sodium 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2% ou 3,8%) pour les prélèvements sanguins. 2. Contrôles: Contrôle pour coagulation Ci-Trol Dade, Niveaux 1, 2 et 3, Contrôles Héparine Ci- Trol Dade, taux faible et élevé. 3. Tubes en plastique et pipettes pour transfert en plastique. 4. Pipettes capables de mesurer avec précision 5,0 ml; 1,0 ml; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml et 0,02 ml. Technique 1. Ajouter 1 ml de plasma pauvre en plaquettes dans chaque flacon d'hepzyme Dade, reboucher le flacon et l'inverser doucement 5 à 10 fois. Remarque: si le volume de plasma est limité, ajouter moins de 0,5 ml de plasma. Tout le matériel lyophilisé doit être dissous. Ceci s'applique unique-ment aux tests TCA et TP. 2. Laisser les flacons se stabiliser 15 minutes à température ambiante (20-25 C). Remarque: si le taux d'héparine dans le plasma est supérieur à 2 unités USP mais inférieur à 4 unités USP, une neutralisation séquentielle peut être faite sans dépasser deux passages sur un flacon par échantillon. Ceci s'applique uniquement aux tests TCA et TP. Après la stabilisation du premier flacon, transférer au moins 0,5 ml de plasma dans le second flacon et le laisser se stabiliser 15 minutes à température ambiante. 3. Réaliser le(s) test(s) de coagulation désiré(s). Les plasmas neutralisés doivent être maintenus à température ambiante et testés aussitôt que possible et le temps nécessaire pour le procédé du test ne doit pas être dépassé. Contrôle de qualité 1. Ci-Trol Dade Niveaux 1, 2 et 3 pour le TCA et le TP. Contrôle Héparine Ci-Trol Dade, taux faible et élevé pour le TCA. Ci-Trol Dade Niveau 1 pour le TT. Se référer aux modes d'emploi respectifs des produits. Le matériel de contrôle doit être traité de la même manière que les échantillons cliniques. Les résultats des contrôles doivent se trouver à l'intérieur des limites établies correspondant à ± 2 à 2,5 déviations standard (DS) par rapport à la valeur moyenne du contrôle. Si une valeur en dehors des limites établies pour le contrôle apparaît, une vérification complète de l'appareil et des réactifs doit être entreprise. Neutralisation 2. Utiliser le Contrôle Héparine Ci-Trol Dade faible: reconstituer un flacon selon les recommandations du mode d'emploi. a. Réaliser un TCA. Le résultat doit se trouver dans les limites établies dans chaque laboratoire correspondant à la valeur moyenne du contrôle ± 2,0 à 2,5 DS. * Ce produit est couvert par les Brevets U.S ; et des brevets en attente. L'héparinase de ce produit est fabriqué par, St-Laurent, Quebec, Canada. ** National Committee for Clinical Laboratory Standards, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, PA. B4240 G10 E0533 (0583) W 3 Edition Juillet 1999 b. Neutraliser le restant du Contrôle Héparine Ci-Trol Dade faible avec l'hepzyme Dade, de la même manière qu'un échantillon clinique. c. Réaliser un TCA sur le Contrôle Héparine Ci-Trol Dade faible neutralisé. Les résultats doivent se trouver à l'intérieur d'un domaine de variations permises établi dans chaque laboratoire pour ce contrôle lorsqu'il est traité par l'hepzyme Dade. A cause de la présence d'agents stabilisants dans le Contrôle Héparine Ci-Trol Dade faible, le contrôle neutralisé peut ne pas se trouver dans les valeurs normales pour le TCA. 3. Alternativement, utiliser le Ci-Trol Dade Niveau 1: reconstituer deux flacons du même lot comme spécifié dans le mode d'emploi et les mélanger. a. Réaliser un TCA. Le résultat doit se trouver dans les limites établies correspondant à ± 2,0 à 2,5 DS par rapport à la valeur moyenne du contrôle. b. Préparer une solution mère d'héparine contenant environ 19,6 U/ml (en utilisant la même héparine que celle administrée dans le traitement héparinique) en sérum physiologique de la façon suivante: Pour une 1000 Unités USP/ml: ajouter 0,1 ml à 5,0 ml de sérum physiologique et bien mélanger. c. A 1,5 ml de Ci-Trol Dade Niveau 1, ajouter 0,02 ml (19,6 U/ml) de la solution mère d'héparine. Le contrôle renfermera environ 0,26 U/ml d'héparine. Inverser doucement pour bien mélanger. d. Réaliser un TCA sur le Ci-Trol Dade Niveau 1 surchargé en héparine. Les résultats doivent se trouver dans le domaine de variations permises établi dans chaque laboratoire pour ce contrôle surchargé avec une source spécifique d'héparine commercialisée. e. Neutraliser 1 ml du Ci-Trol Dade Niveau 1 surchargé avec l'hepzyme Dade en le traitant de la même manière qu'un plasma de patient. f. Réaliser un TCA sur le Ci-Trol Dade Niveau 1 neutralisé. Les résultats doivent se trouver dans les valeurs normales établies dans le laboratoire pour le TCA ou à l'intérieur du domaine de variations permises établi dans chaque laboratoire pour ce contrôle quand il est traité par l'hepzyme Dade. Résultats Les résultats de TCA et de TT doivent être rapportés en secondes (se référer au mode d'emploi des différents tests de coagulation). Le TP peut être rendu en secondes, INR ou pourcentage (se référer au mode d'emploi du réactif de TP utilisé). Si de l'héparine non-fractionnée est présente dans l'échantillon à un taux 2 Unités USP/ml, l'hepzyme Dade éliminera l'effet de l'héparine. Des différences entre les valeurs des tests avant et après le traitement du plasma par l'hepzyme Dade indiquent la présence d'héparine dans l'échantillon. Les résultats doivent être en rapport avec le domaine des valeurs normales du laboratoire ou dans la limite de 15% par rapport à la valeur de base pour un TCA, dans la limite de 10% par rapport à la valeur de base du patient pour le TP, et en rapport avec la valeur de base pour le TT. Pour les patients sous traitement anticoagulant par voie orale, l'hepzyme Dade neutralisera l'héparine pour le TP. Limites de la technique 1. L'Hepzyme Dade neutralisera jusqu'à 2 Unités USP d'héparine non-fractionnée quand il est reconstitué avec 1,0 ml de plasma citraté. L'addition de volumes plasmatiques compris entre 0,5 et 1,0 ml n'affectera pas une neutralisation par l'hepzyme Dade. 2. En évaluant des résultats de l'hepzyme Dade obtenus chez des patients au cours d'un traitement par l'héparine, la présence d'un Inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) doit être prise en considération. Les taux de TFPI augmentent dans le sang après injection d'héparine (11). Une augmentation de l'activité TFPI a été associée avec un effet anticoagulant qui n'est pas éliminé par neutralisation de l'héparine et qui peut entraîner un allongement des temps de coagulation (12,13). 3. Chez les patients recevant des anticoagulants par voie orale, un traitement thrombolytique ou les patients avec des anticoagulants circulants ou des anticorps anti-phospholipides, le traitement médicamenteux et le passé clinique doivent être pris en compte lors de l'interprétation des résultats. Ces patients peuvent présenter des situations sous-jacentes qui provoquent un allongement du TCA et/ou du TP en l'absence d'héparine. Des résultats de TCA et/ou de TP anormaux doivent être suivis par des études supplémentaires de la coagulation pour déterminer l'origine des résultats anormaux. 4. Si une neutralisation par l'hepzyme Dade ne permet pas d'avoir un TCA dans les limites des valeurs normales et si des taux élevés d'héparine sont suspectés, une neutralisation séquentielle peut être tentée. Un échantillon plasmatique ne doit pas être soumis à plus de deux neutralisations en série et les taux d'héparine ne doivent pas être supérieurs à 4 unités USP. 5. Les temps de thrombine sont sujets à des variations au niveau de la sensibilité, suivant la concentration de thrombine dans le réactif et l'appareil utilisé. Les agents stabilisants présents dans l'hepzyme Dade peuvent interférer au niveau des résultats de TT. Une dérive au niveau des valeurs normales peut être attendue. Des tests de TT ne doivent pas être réalisés sur des échantillons qui ont subi une neutralisation séquentielle. 6. Se référer aux modes d'emploi respectifs des différents tests de coagulation pouvant être réalisés pour les limites supplémentaires. Valeurs normales Les valeurs normales varient d'un laboratoire à l'autre suivant la technique, le réactif et l'appareil utilisé. Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs normales pour le TCA, le TP et le TT. Les limites acceptables concernant la correction doivent être établies par chaque laboratoire pour le système de test utilisé. Critères de qualité Des études ont montré que l'hepzyme Dade neutralise jusqu'à 2 unités USP/ml d'héparine nonfractionnée dans des échantillons normaux surchargés in vitro. Sur 34 échantillons de plasmas non héparinés, le TCA était de 25,7 ± 1,7 secondes avant et 25,2 ± 1,7 secondes après traitement par l'hepzyme Dade. Des dosages couplés de facteurs ont été réalisés sur des échantillons plasmatiques non-traités et traités par l'hepzyme Dade à partir (a) d'échantillons congelés héparinés et (b) d'échantillons normaux auxquels de l'héparine a été ajoutée in-vitro. Les résultats n'ont pas montré de changements significatifs au niveau des taux de Facteur II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII ou du fibrinogène. Au cours d'études multicentriques, des échantillons plasmatiques de 157 individus ont été évalués, dont 47 plasmas de patients traités par une héparine non-fractionnée (chirurgie cardiaque et orthopédique, patients atteints de thromboses des veines profondes) avec des taux d'héparine compris entre 0,1 et 1,1 U/ml. Le traitement avec l'hepzyme Dade a neutralisé l'effet de l'héparine, les résultats de TCA retournant dans le domaine des valeurs normales du réactif ou dans les limites de 15% par rapport à la valeur de base du patient. Le TP a aussi été réalisé sur 32 de ces plasmas. Les résultats après traitement par l'hepzyme Dade se trouvaient à 10% par rapport à la valeur de base du TP chez les patients. De même les valeurs de TCA de 60 donneurs apparemment sains se trouvaient à 15 % par rapport à la valeur de TCA avant traitement. Des échantillons de plasmas de 11 patients recevant un traitement par de l'héparine de bas poids moléculaire ont aussi été neutralisés par l'hepzyme Dade. Trente échantillons plasmatiques de patients recevant un traitement coumarinique avaient une valeur moyenne de TCA de 53,5 ± 7,2 s. L'addition d'héparine (0,3 à 1,2 U/ml) a entraîné une valeur moyenne de TCA > 200s. Après traitement par l'hepzyme Dade, la valeur moyenne du TCA était de 54,6 ± 8,7s. De même, 9 échantillons plasmatiques prélevés au cours de la phase d'induction d'un traitement anticoagulant par voie orale (commariniques) alors que les patients étaient encore sous héparine, ont donné une valeur moyenne de TCA de 75,7 ± 28,6s. Le traitement par l'hepzyme Dade a réduit la valeur moyenne à 31,8 ± 4,2s. Les valeurs de TP avant et après traitement par l'hepzyme Dade étaient allongées comme attendu. Des dosages de facteurs et/ou des dosages à l'aide de substrat chromogénique pour l'héparine résiduelle ont montré que les résultats. Bibliographie Voir mode d'emploi anglais. Ce produit est garanti à condition de l'utiliser selon les indications des étiquettes et de la documentation. La responsabilité de Dade Behring ne saurait être engagée pour tout autre usage ni commercialement, ni techniquement. En aucun cas, Dade Behring ne pourra être tenu pour responsable des dommages survenant en dehors des garanties susmentionnées. France: Fabriqué par, Marburg (Allemagne), et commercialisé en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du Capitaine Guynemer, Paris-La Défense Ce test est enregistré auprès de l'agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé.

4 , Inc. Da utilizzare come neutralizzante dell eparina nel plasma, per eliminare la contaminazione da eparina nelle analisi di studio della Coagulazione Introduzione e principio metodologico L eparina è un anticoagulante molto efficace e ampiamente diffuso che catalizza l'inattivazione della trombina e di altre proteasi seriniche da parte dell' Antitrombina III (AT III) (1,2). Viene utilizzata in terapia per ridurre la patologia trombotica e nella profilassi dei pazienti che devono sottoporsi a interventi chirurgici importanti, oppure durante la dialisi per prevenire la coagulazione nei cateteri a permanenza e nei dispositivi extracorporei (3). La presenza di eparina in un campione può interferire con l'interpretazione di vari test coagulativi. L eparinasi I, il componente attivo di Dade Hepzyme, è specifica per l eparina. L eparinasi attacca l'eparina in molti siti per molecola, compreso il sito di legame dell AT III, producendo una miscela di oligosaccaridi con pesi molecolari medi di 1000 daltons, privi dell'attività antitrombotica (4). L efficacia dell impiego dell eparinasi per digerire l eparina nei campioni di plasma prima dell esecuzione del tempo di protrombina (PT) e del tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT) è già stata documentata (5). L eparinasi viene utilizzata contemporaneamente alla determinazione del TCA per il monitoraggio dei by-pass chirurgici e per ottenere accurate informazioni sulle condizioni di base del sistema coagulativo operando su sangue intero eparinizzato (6). Dade Hepzyme è un preparato stabile liofilizzato di eparinasi I batterica purificata (E.C ) prodotta da Flavobacterium heparinum. La disponibilità di questo enzima in grandi quantità è stata resa possibile dai metodi di purificazione e fermentazione sviluppati presso la (7). Dade Hepzyme è in grado di neutralizzare in modo specifico fino a 2 unità USP di eparina non frazionata in 1 ml di plasma citratato. Dade Hepzyme è di facile uso, in quanto richiede una minima manipolazione del plasma. Altri metodi disponibili per eliminare la contaminazione da eparina presentano dei limiti. L impiego della protamina per la neutralizzazione dell eparina richiede una titolazione accurata per prevenire gli effetti dovuti ad incompleta neutralizzazione oppure alle proprietà anticoagulanti della protamina stessa (8). E stato dimostrato che gli adsorbenti per eparina ed i filtri che rimuovono l eparina dal plasma legano i Fattori IX e X e spesso allungano i tempi dei test coagulativi (8, 9, 10). Dade Hepzyme può essere utilizzato per: (a) Escludere la contaminazione da eparina come responsabile dei risultati anomali del Tempo di Tromboplastina Parziale Attivata (APTT), del Tempo di Protrombina (PT) e del Tempo di Trombina (TCT). (b) Confrontare i risultati di APTT per i campioni eparinizzati nel monitoraggio della terapia eparinica. (c) Monitorare i pazienti in terapia combinata con eparina e cumarinici. Reattivo Per uso diagnostico in vitro Dade Hepzyme : preparazione liofila di eparinasi I batterica purificata con aggiunta di stabilizzanti. Conservare a 2-8 C. Il reattivo è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Ricostituire ogni flacone con 1 ml di plasma citratato del paziente. Lasciare a temperatura ambiente per 15 minuti prima dell uso. I plasmi neutralizzati dovrebbero essere mantenuti a temperatura ambiente ed analizzati nel più breve tempo possibile, per non superare i parametri di tempo richiesti per la procedura analitica da impiegare. Indice di deterioramento: assenza di vuoto nel flacone al momento dell apertura, inadeguata neutralizzazione del controllo come specificato nella Sezione Controllo Qualità. Raccolta e preparazione dei campioni Utilizzare plasma citratato. Per la preparazione, miscelare nove parti di sangue fresco del paziente con una parte di citrato di sodio 0,11 oppure 0,13 mol/l (3,2% oppure 3,8%). Sono disponibili in commercio provette sotto vuoto contenenti anticoagulante, che possono essere usate, con la debita attenzione, nello studio della coagulazione del sangue. Centrifugare i campioni di sangue per un minimo di 10 minuti a 1500 rcf immediatamente dopo il prelievo e comunque entro 60 minuti. Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire il plasma in una provetta di plastica per centrifuga e centrifugare nuovamente per 10 minuti a 1500 rcf, al fine di garantire che il plasma sia povero di piastrine. Trasferire il plasma sovranatante in un altra provetta di plastica utilizzando una pipetta di plastica. Tappare la provetta fino al momento dell esecuzione dell analisi. In alternativa, è possibile seguire le indicazioni del Documento H21-A2 del NCCLS** (Raccolta, Trasporto, e Trattamento dei Campioni di Sangue, ed Esecuzione delle Analisi Coagulative). La neutralizzazione con Dade Hepzyme dovrebbe essere effettuata a temperatura ambiente (20-25 C) non appena possibile, senza superare i parametri di tempo richiesti per la procedura analitica. Reattivo fornito Dade Hepzyme Materiali richiesti ma non forniti 1. Citrato di sodio 0,11 o 0,13 mol/l (3,2% o 3,8%) per la raccolta del sangue. 2. Controlli: Dade Ci-Trol Coagulation Control Livelli 1, 2 e 3; Dade Ci-Trol Heparin Controls, Low e High. 3. Provette e pipette di plastica. 4. Pipette di precisione da 5,0 ml; 1,0 ml; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml e 0,02 ml. Procedura 1. Aggiungere 1 ml di plasma citratato povero di piastrine ad ogni flacone di Dade Hepzyme, richiudere e capovolgere delicatamente da 5 a 10 volte. Nota: Se il volume di plasma disponibile è scarso, aggiungere una quantità non inferiore a 0,5 ml. Tutto il materiale liofilizzato deve essere sciolto. Tale indicazione vale solo per PT ed APTT. 2. Lasciar riposare i flaconi per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Nota: Se il livello di eparina nel plasma è superiore a 2 unità USP ma inferiore a 4 unità USP, può essere effettuata una neutralizzazione sequenziale, ma senza effettuare più di due passaggi di flacone per campione. Tale indicazione vale solo per PT ed APTT. Dopo che il primo flacone si è stabilizzato, trasferire una quantità di plasma di almeno 0,5 ml nel secondo flacone e lasciar stabilizzare per 15 minuti a temperatura ambiente. 3. Effettuare la determinazione desiderata. Il plasma neutralizzato deve essere mantenuto a temperatura ambiente ed analizzato non appena possibile, in modo da non superare i parametri di tempo richiesti per la procedura analitica prescelta. Controllo di Qualità 1. Dade Ci-Trol Livelli 1, 2 e 3 per APTT e PT. Dade Ci-Trol Heparin Control Livelli Basso ed Alto per APTT. Dade Ci-Trol Livello 1 per TCT. Per l uso fare riferimento ai rispettivi fogli illustrativi dei prodotti. I plasmi di controllo devono essere trattati allo stesso modo dei campioni in esame. I risultati dei controlli devono essere all interno dell intervallo di accettabilità (± 2,0 fino a ad un massimo di ± 2,5 deviazioni standard (DS) dal valore medio del controllo). Qualora si trovasse un valore al di fuori del range di controllo definito, effettuare una verifica completa dello strumento e dei reattivi. Neutralizzazione 2. Utilizzare il Dade Ci-Trol Heparin Control Livello Basso: ricostituire un flacone come indicato nella metodica acclusa alla confezione. a. Effettuare una determinazione di APTT. Il risultato deve rientrare nell intervallo di accettabilità definito in ogni laboratorio (± 2,0 fino ad un massimo di ± 2,5 DS dal valore medio di controllo). b. Neutralizzare il rimanente Dade Ci-Trol Heparin Control Low con Dade Hepzyme, trattandolo nello stesso modo del plasma dei pazienti. * Questo prodotto è coperto dai brevetti U.S ; (altri brevetti sono attesi). L'eparinasi è prodotta da,, Canada. ** National Committee for Clinical Laboratory Standards, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, PA. c. Effettuare una determinazione di APTT del Dade Ci-Trol Heparin Control Low neutralizzato. I risultati dovrebbero essere all interno dell intervallo di variazione accettabile definito in ciascun laboratorio per lo stesso controllo trattato con Dade Hepzyme. A causa dei prodotti stabilizzanti contenuti nel Dade Ci-Trol Heparin Control Low, i valori di APTT del controllo ottenuti dopo neutralizzazione potrebbero non rientrare nell'intervallo di normalità dell'aptt. 3. In alternativa utilizzare Dade Ci-Trol Livello 1: ricostituire due flaconi dello stesso lotto, come specificato nel foglio illustrativo della confezione, e mescolarli insieme. a. Effettuare una determinazione di APTT. Il risultato deve essere all interno dell intervallo di accettabilità (± 2,0 fino ad un massimo di ± 2,5 DS dal valore medio di controllo). b. Preparare una soluzione madre di eparina contenente approssi-mativamente 19,6 U/ml (utilizzando la stessa eparina somministrata per la terapia eparinica) in soluzione fisiologica nel modo seguente: Per 1000 unità USP/ml: Aggiungere 0,1 ml a 5,0 ml di soluzione fisiologica e miscelare accuratamente. c. A 1,5 ml di Dade Ci-Trol Livello 1 aggiungere 0,02 ml (19,6 U/ml) di soluzione madre di eparina. Il controllo conterrà approssimativamente 0,26 U/ml di eparina. Capovolgere delicatamente per miscelare. d. Effettuare le determinazioni di APTT del Dade Ci-Trol Livello 1 addizionato di eparina. I risultati devono essere all interno di un intervallo di variabilità accettabile, definito in ciascun laboratorio per questo controllo nei confronti della fonte specifica e del produttore dell eparina in uso. e. Neutralizzare 1 ml del Dade Ci-Trol Livello 1 con Dade Hepzyme trattandolo allo stesso modo del plasma dei pazienti. f. Effettuare un APTT del Dade Ci-Trol Livello 1 neutralizzato. I risultati devono essere all interno dell intervallo normale del laboratorio per l APTT oppure all interno di un intervallo di variazione accettabile definito in ciascun laboratorio per lo stesso controllo trattato con Dade Hepzyme. Risultati I risultati di APTT e TCT devono essere riportati in secondi (fare riferimento all inserto della confezione per i rispettivi test di coagulazione). I risultati per il PT possono essere riportati in secondi, in INR oppure in percentuale (fare riferimento alla metodica del reattivo per PT in uso). Se nel campione è presente eparina non frazionata ad un livello 2 unità USP/ml, Dade Hepzyme eliminerà l effetto dell eparina. Differenze nei valori del test prima e dopo il trattamento del plasma con Dade Hepzyme indicano la presenza di eparina nel campione. I risultati devono essere riferiti all intervallo di normalità del laboratorio oppure entro ± 15% del valore basale del paziente per l APTT, entro ±10% del valore basale del paziente per il PT, e al valore basale per l analisi del TCT. Per i pazienti in terapia anticoagulante orale, Dade Hepzyme neutralizzerà l eparina per l analisi del PT. Limiti della procedura 1. Dade Hepzyme neutralizza fino a 2 unità USP di eparina non frazionata se ricostituito con 1,0 ml di plasma citratato. L aggiunta di volumi di plasma tra 0,5 e 1,0 ml non modifica la neutralizzazione con Dade Hepzyme. 2. Nella valutazione dei risultati di pazienti in terapia eparinica trattati con Dade Hepzyme si deve considerare la presenza del Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI - fattore tissutale di inibizione della via metabolica). I livelli di TFPI nel sangue aumentano di diverse volte dopo iniezione di eparina (11). Un aumento nell attività TFPI è stato associato ad un effetto anticoagulante che non viene rimosso dalla neutralizzazione dell eparina e può provocare allungamento dei tempi di coagulazione (12, 13). 3. Per i pazienti in terapia anticoagulante orale, in terapia trombolitica o nei pazienti aventi in circolo inibitori di tipo lupus oppure anticorpi anti-fosfolipidi, nell interpretazione dei risultati si devono considerare la terapia e l anamnesi clinica. Questi pazienti possono avere patologie di base che provocano un allungamento dell APTT e/o del PT in assenza di eparina. Valori di APTT e/o di PT anormali devono essere seguiti da ulteriori studi della coagulazione per determinare le cause dei risultati anomali. 4. Se la neutralizzazione con Dade Hepzyme non fa ritornare l APTT entro l intervallo di normalità e si sospettano livelli elevati di eparina, si può tentare la neutralizzazione sequenziale. Un campione di plasma non deve essere sottoposto a più di due neutralizzazioni sequenziali ed i livelli di eparina non devono superare le 4 unità USP. 5. Le determinazioni del tempo di trombina sono soggette a variazioni nella sensibilità, in dipendenza dalla concentrazione di trombina nel reagente e dallo strumento utilizzato. Gli stabilizzanti contenuti in Dade Hepzyme possono interferire con i risultati del TCT. Ci si può aspettare uno spostamento dell intervallo di normalità. Non bisognerebbe eseguire il TCT su campioni che siano stati sottoposti a neutralizzazione sequenziale. 6. Fare riferimento al foglio illustrativo presente nella confezione del rispettivo test di coagulazione per ulteriori dettagli. Valori attesi I valori normali variano da laboratorio a laboratorio, in base alla tecnica, al reattivo ed allo strumento utilizzati. Ogni laboratorio dovrebbe definire i propri intervalli normali per le analisi di APTT, PT e TCT. Ogni laboratorio dovrebbe definire limiti accettabili di correzione per il sistema analitico utilizzato. Caratteristiche analitiche Gli studi effettuati hanno dimostrato che Dade Hepzyme è in grado di neutralizzare fino ad un massimo di 2 unità USP/ml di eparina non frazionata in campioni normali addizionati di eparina in vitro. In 34 campioni di plasma non eparinati, l'aptt ha dato valori di 25,7 ± 1,7 sec. e di 25,2 ± 1,7 sec. rispettivamente prima e dopo trattamento con Dade Hepzyme. Sono stai effettuati in parallelo dosaggi di fattori su plasmi non trattati e trattati con Dade Hepzyme provenienti da (a) campioni eparinizzati congelati, e (b) campioni normali a cui era stata aggiunta Eparina in vitro. I risultati non hanno evidenziato variazioni significative nei livelli dei Fattori II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII e del Fibrinogeno. Nel corso di studi multicentrici, sono stati valutati 157 campioni di plasma di pazienti. Tra questi, 47 campioni provenivano da pazienti in terapia con Eparina non frazionata (pazienti cardiopatici, della chirurgia ortopedica ed affetti da TVP) con livelli di Eparina variabili da 0,1 a 1,1 U/ml. Il trattamento con Dade Hepzyme ha mostrato un 'inversione dell'effetto dell'eparina con valori di APTT compresi nell'intervallo di normalità del reattivo oppure entro ± 15% dell'aptt di base del pazienti. Su 32 di tali soggetti è stato determinato anche il PT. I risultati dopo trattemento con Dade Hepzyme sono stati entro ±10% del PT di base del paziente. Allo stesso modo, i valori di APTT di 60 donatori apparentemente sani sono risultati entro ± 15% dell'aptt pretrattamento. Anche i campioni di 11 pazienti in terapia con Eparina a basso peso molecolare sono stati neutralizzati con Dade Hepzyme. Trenta campioni di pazienti in terapia con Coumadin hanno presentato un valore medio di APTT di 53,5 ± 7,2 sec. L'aggiunta di Eparina (da 0,3 a 1,2 U/ml) ha portato il valore medio di APTT a >200 sec. Dopo trattamento con Dade Hepzyme, il valore medio di APTT è risultato pari a 54,6 ± 8,7 sec. Ancora, 9 campioni di plasma prelevati durante la fase di induzione dell'anticoagulazione orale (Coumadin), mentre i pazienti erano ancora in Eparina, hanno mostrato un valore medio di APTT di 75,7 ± 28,6 sec. Il trattamento con Dade Hepzyme ha ridotto tale valore medio a 31,8 ± 4,2 sec. I valori di PT prima e dopo trattamento con Dade Hepzyme erano alluganti, come previsto. I dosaggi di Fattori e/o i test con substrati cromogenici per l'eparina residua hanno dimostrato che l'allungamento di tali valori anche dopo trattamento con Dade Hepzyme non era dovuto all'eparina. Bibliografia Vedi testo inglese. La Dade Behring garantisce che questo prodotto è conforme alle caratteristiche riportate sull etichetta e nel materiale bibliografico relativo al prodotto stesso, e declina ogni responsabilità per commercializzazione o utilizzo del prodotto per scopi diversi da quelli dichiarati; la Dade Behring non potrà in nessun caso essere ritenuta responsabile di alcun danno che possa eventualmente verificarsi al di fuori di questa forma di garanzia. Confezioni originali: D Marburg Rappresentante per l'italia: Dade Behring SPA Via Lampedusa 11/A Milano/Italy B4240 G10 E0533 (0583) W 4 Edizione Luglio 1999

5 , Inc. Para usar como neutralizador de la heparina en plasma, para evitar la contaminación de la heparina en las pruebas de coagulación Resumen y fundamento La heparina es un anticoagulante muy potente que cataliza la inactivación de la Trombina y de otras serin-proteasas por la antitrombina III (ATIII) (1,2). Se usa terapéuticamente para reducir la enfermedad trombótica y profilácticamente para los pacientes que están sometidos a métodos de cirugía mayor o durante la diálisis para evitar la coagulación en los catéteres y en los aparatos para circulación extracorpórea (3). La presencia de heparina en las muestras puede interferir en la interpretación de algunos test de coagulación. La heparinasa I, el componente activo de la Hepzyme Dade, es específica para la heparina. La heparinasa rompe la molécula de heparina por multiples sitios, incluyendo el lugar de enlace de la antitrombina III, produciendo una mezcla de oligosacáridos con unos pesos moleculares promedios de daltons que han perdido su actividad antitrombótica (4). Se ha publicado previamente el éxito del uso de la heparinasa para digerir la heparina en muestras de plasma antes del análisis del tiempo de protrombina (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (ATTP) (5). Se han usado cartuchos recubiertos de heparinasa juntamente con los análisis de ACT para controlar la cirugía de by-pass y obtener una información de la linea de base de coagulación exacta con sangre total heparinizada (6). La Hepzyme Dade es estable, una preparación liofilizada de heparinasa I bacteriana purificada (E.C ) producida por Flavobacterium heparinum. La disponibilidad de esta enzima en grandes cantidades se hizo posible por métodos de purificación y fermentación desarrollados en IBEX Technologies (7). La Hepzyme Dade está preparada para neutralizar específicamente hasta 2 unidades USP de heparina sin fraccionar en 1 ml de plasma citratado. La Hepzyme Dade es fácil de usar, requiere un mínimo de manipulación del plasma. Otros métodos disponibles para separar la contaminación de la heparina tienen limitaciones. El uso de la protamina para neutralizar la heparina requiere una valoración cuidadosa para prevenir los efectos de una neutralización incompleta o por las propiedades anticoagulantes que posee la protamina (8). Los adsorbentes de heparina y los filtros que separan la heparina del plasma se ha demostrado que se ligan a los factores IX y X y frecuentemente dan pruebas de coagulación prolongadas (8, 9, 10). La Hepzyme Dade puede ser usada para: (a) Evitar la contaminación de la heparina como responsable de resultados de coagulación anormales en los análisis del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa), el tiempo de protrombina (TP) y del tiempo de coagulación de trombina (TCT). (b) Comparar los resultados de TTPa para las muestras heparinizadas cuando se está valorando la terapia con heparina. (c) Evaluar a los pacientes en terapias combinadas con heparina y cumadina. Reactivo Para uso diagnóstico in vitro Hepzyme Dade : Preparación liofilizada de heparinasa I bacteriana purificada con estabilizantes. Conservar a 2-8 C. El reactivo es estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Reconstituir cada frasco con 1 ml de plasma del paciente citratado. Dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos antes del análisis. Los plasmas neutralizados deben mantenerse a temperatura ambiente y analizarse tan pronto como sea posible. No exceder los tiempos necesarios para el método del análisis que se va a emplear. Indicación de deterioro: falta de vacío en el frasco en el momento de abrirlo, neutralización inadecuada del control como se especifica en la Sección Control de Calidad. Extracción y preparación de la muestra Usar plasma citratado. Para prepararlo mezclar nueve partes de sangre del paciente recien extraida con una parte de citrato sódico 0,11 ó 0,13 mol/l (3,2% ó 3,8%). Los tubos con vacío conteniendo el anticoagulante indicado están disponibles comercialmente y pueden usarse con precaución en los estudios de coagulación de la sangre. Centrifugar la muestra de sangre por un mínimo de 10 minutos a 1500 g tan pronto como sea posible después de la extracción y en el intervalo de 60 minutos. Pasar el plasma usando una pipeta de plástico a un tubo de centrífuga de plástico y centrifugarlo otra vez durante 10 minutos a 1500 g para asegurar un plasma pobre en plaquetas. Pasar el plasma sobrenadante a otro tubo de plástico usando otra pipeta de plástico. Tapar el tubo hasta que se vaya a realizar la prueba. Alternativamente pueden seguirse para la extracción y preparación de muestras, las indicaciones del NCCLS**, documento H21-A2 sobre extracción, transporte y procesamiento de las muestras de sangre para realizar las pruebas de coagulación. La neutralización con Hepzyme Dade debe hacerse a temperatura ambiente (20-25 C) tan pronto como sea posible sin exceder los requisitos de tiempo para las pruebas de coagulación. Reactivo que se proporciona Hepzyme Dade Materiales necesarios pero no suministrados 1. Citrato sódico 0,11 ó 0,13 mol/l (3,2% ó 3,8%) para la extracción de la sangre. 2. Controles: Ci-Trol Control para Coagulación Dade Niveles 1, 2 y 3, Ci-Trol Controles para Heparina, Dade Niveles Bajo y Alto. 3. Tubos de plástico y pipetas de plástico para la transferencia. 4. Pipetas capaces de medir exactamente 5,0 ml; 1,0 ml; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml y 0,02 ml. Descripción del método 1. Añadir 1 ml de plasma citratado pobre en plaquetas a cada frasco de Hepzyme Dade, volverlo a tapar e invertirlo suavemente de 5 a 10 veces. Nota: Si el volumen de plasma es limitado, añadir no menos de 0,5 ml de plasma. Todo el producto liofilizado debe estar disuelto. Esto aplica solamente al ensayo de TP y TTPa. 2. Dejar los frascos estabilizarse durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Nota: Si el nivel de heparina en plasma es mayor de 2 unidades USP pero menor de 4 unidades USP, debe hacerse la neutralización secuencial pero no utilizar mas de 2 frascos por muestra. Esto aplica solamente al ensayo de TP y TTPa. Después que el primer frasco se ha estabilizado transferir al menos 0,5 ml de plasma a un segundo frasco y dejar que se estabilice 15 minutos a temperatura ambiente. 3. Realizar las determinaciones de coagulación deseadas. El plasma neutralizado debe mantenerse a temperatura ambiente y analizarse tan pronto como sea posible y no exceder los requisitos de tiempo para el método de análisis que se vaya a emplear. Control de Calidad 1. Ci-Trol Dade, niveles 1, 2 y 3 para TTPa y TP. Ci-Trol Control para Heparina Dade, Alto y Bajo para TTPa. Ci-Trol Dade Nivel 1 para TCT. Consultar los folletos del producto que corresponda. Los productos de control deben analizarse de la misma manera que las muestras de los pacientes. Los resultados del control deben estar dentro del intervalo aceptable establecido basado en ±2,0 a ±2,5 desviaciones estándar (DE) del valor medio del control. Si se obtiene un valor fuera del intervalo establecido para el control hay que hacer una comprobación completa del instrumento y de los reactivos. Neutralización 2. Usar el Ci-Trol Control Bajo para Heparina Dade : reconstituir el frasco según las indicaciones del folleto interior. a. Realizar la determinación de TTPa. El resultado debe estar dentro del intervalo aceptable establecido en cada laboratorio basado en el valor medio del control ± 2,0 a 2,5 DE. * Este producto está protegido por las patentes ; y patentes pendientes de U.S. La heparinasa de este producto está fabricada por IBEX Technologies,, Canada. ** National Committee for Clinical Laboratory Standards, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, PA (Comité Americano de Standards de Laboratorios Clínicos). B4240 G10 E0533 (0583) W 5 Edición Julio 1999 b. Neutralizar el control restante Ci-Trol Control para Heparina Bajo Dade con Hepzyme Dade tratándolo de la misma manera que el plasma del paciente. c. Realizar el TTPa del Ci-Trol, Control para Heparina Bajo Dade neutralizado. Los resultados deben estar dentro del intervalo de variación permisible establecido para cada laboratorio para este control cuando se trata con Hepzyme Dade. Debido a los estabilizadores que contiene el Ci-Trol Control para Heparina Bajo Dade, su neutralización quizá no dé los resultados de TTPa esperados dentro de los rangos normales. 3. Alternativamente usar Nivel 1 de Ci-Trol Dade : reconstituir dos frascos del mismo lote como se especifica en el folleto y mezclarlos. a. Realizar una determinación de TTPa. El resultado debe estar entre el intervalo aceptable basado entre ±2,0 a ±2,5 DE sobre el valor medio del control. b. Preparar una solución matriz de heparina que contenga aproximadamente 19,6 U/ml (usando la misma heparina que se administra para la terapia con heparina) en solución salina fisiológica como sigue: Para la 1000 unidades USP/ml: añadir 0,1 ml a 5,0 ml de solución salina y mezclar bien. c. A 1,5 ml de Nivel 1 de Ci-Trol Dade añadir 0,02 ml (19,6 U/ml) de solución matriz de heparina. El control contendrá aproximadamente 0,26 U/ml de heparina. Invertir suavemente para mezclar bien. d. Realizar determinaciones de TTPa del Nivel 1 de Ci-Trol Dade al que se le ha añadido heparina. Los resultados deben estar entre el intervalo de variación permisible establecido en cada laboratorio para este control al que se le ha añadido heparina de origen y fabricante específicos. e. Neutralizar 1 ml de Nivel 1 de Ci-Trol Dade al que se le ha añadido heparina con Hepzyme Dade, manipulado de la misma manera que elplasma del paciente. f. Realizar un TTPa del Ci-Trol Nivel 1 Dade neutralizado. Los resultados deben estar entre el intervalo normal establecido por el laboratorio para TTPa o entre un intervalo de variación permisible establecido en cada laboratorio para este control cuando se trate con Hepzyme Dade. Resultados El informe de los resultados de TTPa y TCT debe darse en segundos (consultar el folleto para las pruebas de coagulación correspondientes). Los resultados del TP pueden expresarse en segundos, I.N.R. o en porcentaje (consultar el folleto del reactivo utilizado). Si la heparina sin fraccionar está presente en la muestra en un nivel 2 unidades USP/ml, la Hepzyme Dade eliminará el efecto de la heparina. Las diferencias en los valores del análisis antes y después del tratamiento del plasma con Hepzyme Dade indican la presencia de heparina en la muestra. Los resultados deben relacionarse con el intervalo normal del laboratorio o entre un 15% de la línea base del paciente para el análisis de TTPa, dentro del 10% de la línea base del paciente para TP y con la línea base del análisis para TCT. Para los pacientes con anticoagulantes orales, la Hepzyme Dade neutralizará la heparina para las pruebas de TP. Limitaciones del método 1. La Hepzyme Dade neutralizará hasta 2 unidades USP de heparina no fraccionada cuando se reconstituya con 1,0 ml de plasma citratado. La adición de volúmenes de plasma entre 0,5 a 1,0 ml no altera la neutralización de Hepzyme Dade. 2. En la evaluación de los resultados de Hepzyme Dade de los pacientes durante la terapia con heparina, debe considerarse la presencia del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI). Los niveles de TFPI aumentan varias veces en sangre después de la inyección de heparina (11). Un aumento de la actividad de TFPI se ha asociado con un efecto anticoagulante que no desaparece por la neutralización de la heparina y puede dar como resultado unos tiempos de coagulación alargados (12,13). 3. Para los pacientes que reciben anticoagulantes orales, terapia trombolítica o pacientes con inhibidores circulantes o anticuerpos anti-fosfolípidos, cuando se interpreten los resultados deben tenerse en cuenta la medicación y las historias clínicas. Estos pacientes pueden tener unas condiciones subyacentes que den como resultado una prolongación del TTPa y/o del TP en ausencia de heparina. El TTPa y/o TP anormales deben ser seguidos por unos estudios de coagulación adicionales para determinar el origen de los resultados anormales. 4. Si la neutralización con Hepzyme Dade no lleva el TTPa a un intervalo normal y se sospecha la existencia de niveles elevados de heparina, puede probarse una neutralización secuencial. Una muestra de plasma no debe ser sometida a más de dos neutralizaciones secuenciales y los niveles de heparina no deberán exceder de 4 unidades USP. 5. Los Tiempos de Coagulación de Trombina están sujetos a variación en sensibilidad, dependiendo de la concentración de la trombina en el reactivo y del instrumento usado. Los estabilizantes en la Hepzyme Dade pueden interferir en los resultados de TCT. Se puede prever la presencia de un desplazamiento en el intervalo normal. El Tiempo de Coagulación de Trombina no puede realizarse en muestras que hayan sido neutralizadas repetidas veces. 6. Consultar el folleto del ensayo de coagulación correspondiente para comprobar las limitaciones adicionales. Valores previstos Los valores normales varían de un laboratorio a otro dependiendo de la técnica, del reactivo y del instrumento usado. Cada laboratorio debe establecer sus propios intervalos normales para las pruebas de TTPa, TP y TCT. Para cada laboratorio deben establecerse los límites aceptables para la corrección en el sistema de análisis usado. Características específicas del procedimiento Se han visto en distintos estudios que el Hepzyme Dade puede neutralizar muestras de sangre normales a las que se les ha añadido in vitro hasta 2 unidades USP/ml de heparina no fraccionada. En 34 muestras de plasmas sin heparinizar el TTPa fué de 25,7 ± 1,7 seg. antes del tratamiento y de 25,2 ± 1,7 seg. después del tratamiento con Hepzyme Dade. Se realizaron determinaciones emparejadas de factores en muestras de plasma tratados con Hepzyme Dade y sin tratar de (a) muestras congeladas heparinizadas y (b) de donantes normales a los cuales se les había añadido heparina in vitro. Los resultados no presentaron cambios significativos en los niveles de los Factores II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII o Fibrinógeno. En estudios multicéntricos se estudiaron 157 muestras de plasmas. De estas, 47 muestras eran de pacientes con terapia de heparina no fraccionada (cardíacos, cirugía ortopédica y pacientes con TVP) con un intervalo de los niveles de heparina entre 0,1 y 1,1 U/ml. Tratándolas con Hepzyme Dade se vió una inversión del efecto de esta heparina respecto a los resultados del TTPa, volviendolos al intervalo normal, de acuerdo a los reactivos, o en un intervalo del 15% respecto a la línea base de los pacientes normales. El TP también fue analizado en 32 de estos pacientes. Los resultados, después del tratamiento con Hepzyme Dade estaban en un intervalo del 10% respecto a la línea base de los pacientes normales. Igualmente, los valores de TTPa de 60 donantes, aparentemente sanos, estaban entre el 15% de los valores de TTPa de los pacientes pretratados. 11 muestras de pacientes bajo terapia de heparina de bajo peso molecular fueron también neutralizadas por la Hepzyme Dade. Se analizaron 30 pacientes que estaban recibiendo terapia con cumadina, los cuales tenían una media de los valores de TTPa de 53,5 ± 7,2 seg. Al añadirles heparina (0,3-1,2 U/ml) aumentó esta media de los valores de TTPa a > 200 seg. Después del tratamiento con Hepzyme Dade la media de los valores de TTPa volvió a ser de 54,6 ± 8,7 seg. También se analizaron 9 muestras de plasma tomadas durante la fase de inducción de la terapia con anticoagulación oral (cumadina), cuyos pacientes todavía estaban con tratamiento heparínico, dieron una media del valor de TTPa de 75,7 ± 28,6 seg. El tratamiento con Hepzyme Dade redujo estos valores medios a 31,8 ± 4,2 seg. Los valores de TP antes y después del tratamiento con Hepzyme Dade fueron prolongados, tal como se esperaba. Las determinaciones de factores y/o pruebas por sustratos cromogénicos para la determinación de la heparina residual, prueban que la prolongación de estos valores, incluso después del tratamiento con Hepzyme Dade, no son debidos a la heparina. Bibliografía Ver la del original en inglés. Este producto está garantizado para realizar lo descrito en su etiqueta y en la literatura del producto y Dade Behring declina cualquier garantía implicita de comercialización o aplicación para cualquier otro fin, y en ningún caso Dade Behring será responsable de cualquier perjuicio originado fuera de la garantía descrita. Fabricante:

6 , Inc. Dade Hepzime * Para neutralização da heparina no plasma e exclusão duma contaminação pela heparina nos testes da coagulação Resumo e princípio activo A heparina é um anticoagulante eficaz e largamente difundido que catalisa a inactivação da trombina e de outras serina-proteases pela antitrombina III (AT III) (1,2). É utilizada na terapêutica de doenças trombóticas e na profilaxia de dialisados e de pacientes sujeitos a intervenções cirúrgicas de maior porte, a fim de prevenir uma formação de coágulo em cateteres permanentes e máquinas de circulação extracorporal (3). A presença de heparina numa amostra pode levantar problemas de interpretação dos resultados de alguns testes da coagulação. A heparinase I, componente activo de Dade Hepzime, é uma enzima específica da heparina. A heparinase desdobra a molécula de heparina em múltiplos sítios, inclusivamente ao nível de ligação da AT III, produzindo oligossacáridos sem actividade antitrombótica e com pesos moleculares médios de 1000 dáltons (4). A eficácia da heparinase no desdobramento da heparina em amostras plasmáticas antes das determinações dos tempos de tromboplastina (PT) e de tromboplastina parcial activado (aptt) encontra-se já documentada (5). Recipientes de teste recobertos com heparinase têm sido utilizados em testes do ACT para vigilância de operações de bypass, assim como obtenção de informações de base precisas sobre a actividade de coagulação de amostras de sangue total heparinizado (6). Dade Hepzime é um liofilizado estável de heparinase I purificada (E.C ) de origem bacterial (Flavobacterium heparinum). Esta enzima pode ser hoje facilmente obtida em grandes quantidades, graças a procedimentos de purificação e fermentação desenvolvidos por (7). Dade Hepzime está concebido para neutralizar especificamente até 2 unidades USP de heparina não-fraccionada em 1 ml de plasma citratado. Dade Hepzime é fácil de utilizar, exigindo uma manipulação mínima do plasma. Outros métodos disponíveis para eliminar a heparina são de reduzida eficácia. A utilização da protamina para neutralizar a heparina exige uma titulação exacta para excluir os efeitos de uma neutralização incompleta ou das propriedades anticoagulantes da protamina (8). Adsorventes heparínicos e filtros que eliminam a heparina do plasma ligam os factores IX e X e prolongam frequentemente os tempos de coagulação (8, 9, 10). Dade Hepzime pode ser utilizado para: (a) afastar contaminações pela heparina como possível causa de resultados anormais das medições do tempo de tromboplastina parcial activado (aptt), do tempo de tromboplastina (PT) e do tempo de trombina (TT); (b) comparar os resultados aptt de amostras heparinizadas na vigilância do tratamento pela heparina; (c) monitorar os pacientes numa terapia combinada de heparina e cumarina. Reagentes Para uso diagnóstico in vitro Dade Hepzime : preparado liofilizado de heparinase I bacterial purificada, com adição de conservantes. Conservado entre +2 e +8 C, o reagente mantém-se estável até à data de vencimento indicada no rótulo. Reconstituir cada frasco com 1 ml de plasma citratado. Deixar repousar à temperatura ambiente 15 min antes da determinação. Plasmas neutralizados devem ser mantidos à temperatura ambiente e testados o mais cedo possível. Não ultrapassar o tempo de conservação das amostras prescrito pelo teste utilizado. Sinal de deterioração: ausência de vácuo no frasco à primeira abertura, insuficiente neutralização do controlo (v. Controlo de qualidade). Obtenção e preparação das amostras Utilizar somente plasma citratado. Para o obter, misturar 9 volumes de sangue de paciente colhido de fresco com 1 volume de citrato de sódio 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2% ou 3,8%). Tubos sob vácuo com o anticoagulante desejado são disponíveis no mercado e podem ser utilizados com as devidas precauções em testes da coagulação. Centrifugar a amostra durante 10 min, pelo menos, a 1500 rcf tão cedo quanto possível após a colheita, em todo o caso dentro de 60 min. Transferir o plasma com uma pipeta de plástico para os tubos de centrifugação de plástico e centrifugar novamente durante 10 min, pelo menos, a 1500 rcf, a fim de obter um plasma pobre de trombócitos. Transferir o sobrenadante com uma pipeta de plástico para outro tubo. Tapar o tubo com um obturador de borracha até ao momento do teste. Alternativamente pode proceder-se segundo o documento-norma Obtenção de plasma citratado para análises hemostasiológicas, DIN A neutralização com Dade Hepzime deve efectuar-se à temperatura ambiente (+20 a +25 C) e tão cedo quanto possível, sem ultrapassar o tempo prescrito pelo teste da coagulação (estabilidade das amostras). Material fornecido Dade Hepzime Outro material necessário 1. Citrato de sódio 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2% ou 3,8%) para a obtenção do sangue 2. Controlos: Dade Ci-Trol níveis 1, 2, e 3; Dade Ci-Trol Controlos de heparina, concentrações alta e baixa 3. Pipetas e pipetas de transferência, de plástico 4. Pipetas de precisão para 5,0 ml; 1,0 ml; 0,5 ml; 0,2 ml; 0,1 ml e 0,02 ml Procedimento 1. Juntar 1 ml de plasma citratado pobre de trombócitos a cada frasco de Dade Hepzime. Tapar o frasco com um obturador de borracha e invertê-lo cuidadosamente 5 a 10 vezes. Nota: Se o volume de plasma disponível é reduzido, juntar pelo menos 0,5 ml de plasma. Todas as substâncias liofilizadas têm de mostrar-se dissolvidas. Isto diz respeito apenas aos testes aptt e PT. 2. Deixar os frascos em repouso durante 15 min a temperatura ambiente (+20 a +25 C). Nota: Se o nível de heparina em plasma é superior a 2 unidades USP, mas inferior a 4 unidades USP, pode fazer-se uma neutralização sequencial. Isto com respeito somente aos testes aptt e PT. A neutralização efectua-se submetendo o plasma, depois do primeiro tratamento com Hepzyme, a um segundo tratamento com heparinase. Para tal, transferir do primeiro frasco com Hepzyme, após 15 min, pelo menos 0,5 ml de líquido para um segundo frasco e deixar repousar 15 min à temperatura ambiente. 3. Efectuar a determinação ou as determinações de coagulação desejadas. Plasma neutralizado deve ser mantido à temperatura ambiente e testado tão cedo quanto possível, sem exceder o tempo exigido pelo teste previsto. Controlo de qualidade 1. Dade Ci-Trol níveis 1, 2, e 3 para aptt e PT. Dade Ci-Trol Controlo de heparina (concentrações alta e baixa) para aptt. Dade Ci-Trol nível 1 para TT. Consultar o Folheto informativo do respectivo produto. Os controlos devem ser manipulados tal como amostras de paciente. O âmbito de dispersão compreende normalmente um desvio-padrão (DE) de ±2,0 a ±2,5 relativamente ao valor médio do controlo. Se os valores se acham fora do âmbito estabelecido, controlar todas as funções do instrumento e todos os reagentes. Neutralização 2. Usar Dade Ci-Trol Controlo de Heparina (baixa concentração): reconstituir o frasco segundo as indicações do folheto adjunto. a. Determinar o aptt. Os resultados devem achar-se compreendidos no âmbito de dispersão estabelecido por cada laboratório e que depende do DE ±2,0 a ±2,5 relativamente ao valor médio. b. Neutralizar o Controlo restante Dade Ci-Trol (baixa concentração) com Dade Hepzime. Manipular o controlo tal como uma amostra de paciente. * Patentes existentes nos EUA: ; Outras patentes requeridas. A heparinase contida neste produto foi fabricada por, St. Laurent, Quebec, Canadá. B4240 G10 E0533 (0583) W 6 Edição Julho 1999 c. Determinar o aptt com Dade Ci-Trol Controlo de heparina (baixa concentração) neutralizado. Os resultados devem achar-se compreendidos no âmbito de dispersão estabelecido por cada laboratório para este controlo quando tratado com Dade Hepzime. Devido aos conservantes contidos em Dade Ci-Trol Controlo de Heparina (baixa concentração), pode ocorrer que sejam medidos valores do controlo neutralizado fora do escalão normal aptt. 3. Alternativamente pode utilizar-se Dade Ci-Trol, nível 1: reconstituir 2 frascos do mesmo lote como indicado no Folheto informativo e misturá-los. a. Determinar o aptt. O resultado deve achar-se compreendido no âmbito de dispersão estabelecido com base no DE ±2,0 a ±2,5 relativamente ao valor médio do controlo. b. Preparar, como adiante se diz, uma solução matriz de heparina de aprox. 19,6 U/ml (usando a mesma heparina administrada na terapia) em soro fisiológico: Para Heparina com 1000 unidades USP/ml: misturar bem 0,1 a 5,0 ml de soro fisiológico. c. Adicionar a 1,5 ml de Dade Ci-Trol (Nível 1) 0,02 ml (19,6 U/ml) de solução matriz de heparina. O controlo contém então aprox. 0,26 U/ml de heparina. Inverter suavemente para misturar bem. d. Determinar o aptt do Dade Ci-Trol (Nível 1) misturado com heparina. Os resultados devem achar-se compreendidos no âmbito de dispersão permitido e estabelecido por cada laboratório para este controlo quando misturado com heparina de origem e fabricante especificados. e. Neutralizar, com Dade Hepzime, 1 ml de Dade Ci-Trol (Nível 1) misturado com heparina. Manipular o controlo tal como plasma de paciente. f. Determinar o aptt do Dade Ci-Trol (Nível 1) neutralizado. Os resultados devem achar-se compreendidos no escalão de valores normais estabelecido pelo laboratório para aptt ou no âmbito de dispersão permitido (e estabelecido igualmente por cada laboratório) para este controlo quando neutralizado com Dade Hepzime. Resultados Os resultados aptt e TT devem ser expressos em segundos (consultar folhetos informativo do respectivo teste). O PT pode ser expresso em segundos, INR ou percentagem (consultar Folheto informativo do reagente PT utilizado). Se a amostra contém 2 unidades USP/ml de heparina não-fraccionada, Dade Hepzime neutraliza o efeito da heparina. A variação dos valores do teste antes e depois do tratamento do plasma com Dade Hepzime é indicativa da heparina na amostra. Os resultados devem achar-se compreendidos no escalão de valores normais do laboratório, podem contudo mover-se numa margem de 15% do resultado, antes da heparina, do teste aptt ou 10% do resultado PT ou TT. Em pacientes sob terapia com anticoagulantes orais, Dade Hepzime neutraliza a heparina na determinação. Limitações do método 1. Dade Hepzime neutraliza até 2 unidades USP de heparina não-fraccionada quando reconstituído com 1,0 ml de plasma citratado. A neutralização com Dade Hepzime é possível em volumes de plasma entre 0,5 e 1,0 ml. 2. Na avaliação dos resultados de Dade Hepzime em pacientes sob terapia com heparina deve verificar-se a presença ou não presença de TFPI (inibidor da via do factor tecidual). O nível de TFPI multiplica-se por um factor múltiplo depois de uma injecção de heparina (11). O aumento da actividade de TFPI está em correlação com o efeito anticoagulante que não é eliminado por neutralização da heparina e pode por isso levar a tempos de coagulação prolongados (12,13). 3. Em pacientes sob terapia anticoagulante oral, terapia antitrombolítica ou com inibidores circulantes ou anticorpos contra fosfolípidos deve tomar-se em consideração, ao interpretar os resultados, a medicação e as respectivas histórias clínicas. Em tais casos, também a não-presença de heparina pode produzir valores aptt e/ou PT prolongados. Valores aptt e/ou PT anormais devem ser investigados mediante outros exames da coagulação, a fim de identificar a causa de tais resultados. 4. Se a neutralização com Dade Hepzime não leva o aptt a um escalão normal e se suspeita de níveis elevados de heparina, pode tentar-se uma neutralização sequencial. Uma amostra de plasma não deve ser submetida a mais de 2 operações de neutralização sequenciais e o nível de heparina não deve exceder 4 unidades USP. 5. Os tempos de coagulação de trombina estão sujeitos a variação de sensibilidade, conforme a concentração de trombina no reagente e o instrumento utilizado. Os conservantes contidos em Dade Hepzime podem interferir nos resultados TT. Podem verificar-se desvios do escalão de valores normais. Não submeter ao teste TT amostras que tenham sido neutralizadas 2 vezes. 6. Para outras limitações, consultar o Folheto informativo do respectivo teste de coagulação. Valores a esperar Os valores normais podem variar consoante a técnica, o instrumento e o laboratório. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios escalões de valores normais para os testes aptt, PT e TT. Cada laboratório deve estabelecer os limites aceitáveis para a correcção no sistema de análise utilizado. Características do teste Diversos estudos comprovaram que Dade Hepzime pode neutralizar até 2 unidades USP/ml de heparina não-fraccionada em amostras normais tratadas in vitro. Em 34 amostras plasmáticas não heparinizadas, o aptt foi de 25,7 ± 1,7 seg antes do tratamento e de 25,2 ± 1,7 seg depois do tratamento com Dade Hepzime. Foram efectuadas em paralelo determinações de factores com amostras plasmáticas não-tratadas com Dade Hepzime e com amostras tratadas com Dade Hepzime, e tanto com amostras a) congeladas e heparinizadas, como b) normais adicionadas de heparina in vitro. Os resultados não revelaram nenhuma variação significativa dos níveis dos factores II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII ou de fibrinogénio. Em estudos multi-centro foram avaliados plasmas de 157 pacientes, 47 dos quais obtidos de pacientes (doenças cardíacas, operações ortopédicas e trombose venosa profunda) sob terapia com 0,1 a 1,1 U/ml de heparina não-fraccionada. O tratamento com Dade Hepzime produziu uma neutralização do efeito da heparina e um retorno dos valores aptt ao escalão normal do reagente ou à margem de 15% relativamente ao valor-base do paciente antes do tratamento pela heparina. A este nível se encontraram também os valores aptt de 60 dadores, segundo todas as aparências saudáveis. O PT foi medido em 32 pacientes tratados pela heparina. Depois do tratamento com Dade Hepzime, os resultados PT reencontraram-se novamente na margem de 10% do valorbase do paciente de antes do tratamento. As amostras de 11 pacientes tratados com heparina de baixo peso molecular foram igualmente neutralizadas mediante Dade Hepzime. 30 amostras de pacientes sob terapia com cumarina tinham mostrado um valor médio de aptt de 53,5 ± 7,2 seg. Após adição de heparina (0,3 a 1,2 U/ml), este valor subiu para >200 seg. Após tratamento com Dade Hepzime, o valor médio foi de 54,6 ± 8,7 seg. Também 9 amostras de plasma colhidas durante a fase de indução da anticoagulação oral (cumarina) e administração simultânea de heparina revelaram um valor médio de 75,7 ± 28,6 seg. Após tratamento com Dade Hepzime, o valor desceu para 31,8 ± 4,2 seg. Os valores PT mostraram-se prolongados, como era de esperar, tanto antes como depois do tratamento com Dade Hepzime. Testes de factores e/ou de heparina com substrato cromogénico demonstraram que a prolongação dos valores PT, mesmo depois do tratamento com Dade Hepzime, não é devida à heparina. Bibliografia V. Folheto em inglês. Garante-se que o efeito deste produto corresponde ao descrito no rótulo e na literatura do produto. Dade Behring não se responsabiliza pela qualidade comercial nem pela aptidão do produto, se ele é usado para outros fins que não os indicados, e tão pouco por quaisquer danos subsequentes, decorrentes da garantia contratual acima expressa. Fabricante: Distribuidor: Dade Behring Portugal Meios de Diagnóstico Médico Lda. Estrada Nacional Lisboa/Sintra, Km 15 Apartado 145 P-2726 Mem Martins Codex H4S 1W6 Kanada,