3.1 Replicación y reparación del ADN.

Transcripción

1 3 Replicación, trascripción y traducción del material genético. Objetivo: Describir como una célula duplica su material genético precisamente a partir del ADN y explicar como decodifica y utiliza la información contenida en su genoma. 3.1 Replicación y reparación del ADN.

2 Dogma Central de la Biología Molecular Replicación Transcripción Traducción

3 Uno de los mecanismos mas importantes de toda célula es la Replicación del DNA continuación de la vida. Proceso extremadamente complicado en el que participan gran cantidad de enzimas. Debe asegurarse que las células hijas sean idénticas a la célula madre y que estas no sean defectuosas.

4 Tres etapas fundamentales de la replicación: I Iniciación II Elongación III Terminación I Iniciación: Reconocimiento del sitio de origen. Separar y estabilizar cadenas parentales (Helicasa). Iniciar síntesis del DNA en horquilla de replicación por complejo protéico llamado Primosoma. II Elongación: Formación del complejo de síntesis de cadenas hijas o Replisoma (complejo activo DNA polimerasa III). III Terminación: Unión o reacción de terminación de la síntesis al final del replicón. Bloqueo inhibiendo helicasa, Metilación (Hemimetilación).

5 La replicación tiene las siguientes características: 1) Ocurre en el citoplasma en procariotas y en el núcleo en eucariotas. 2) Es semiconservativa, es decir que conserva una cadena del ADN original. 3) Bidireccional y simultánea. 4) Necesita cebadores de ARN. 5) La adición de nucleótidos sólo ocurre en dirección ) Ocurre sólo una vez por ciclo celular. 7) Se replica el genoma completo.

6 1) Ocurre en el citoplasma en procariotas y en el núcleo en eucariotas. Replicón

7 2) Es semiconservativa, es decir que conserva una cadena del DNA original. Experimento de Meselson Stahl

8 5) La adición de nucleótidos sólo ocurre en dirección 5-3

9 Formación del complejo de síntesis de cadenas hijas o Replisoma. Una de las cadenas es replicada discontinuamente: Fragmentos Okazaki Cadena molde II. Elongación. Cadena retrasada Cadena líder Dirección del movimiento de la horquilla 3) La replicación es bidireccional y ocurre simultáneamente en ambas cadenas, por lo que la horquilla o burbuja de iniciación se va haciendo más larga conforme avanza la replicación al sintetizar nuevo ADN. Cada extremo de la horquilla representa una cuña creciente donde ambas cadenas se sintetizan, sin embargo, una cadena es sintetizada de forma continua a partir de un solo cebador de RNA (4) Necesita cebadores de ARN). La cadena que va en dirección 5 3 crece en la misma dirección en la que crece la horquilla y por ello se le denomina la cadena líder.

10 Una de las cadenas es replicada discontinuamente: Fragmentos Okazaki III II <15 nucleótidos La síntesis de la otra cadena se complica mucho ya que la dirección global de su crecimiento debe ser en dirección contraria a la que trabaja la ADN polimerasa. Este requerimiento incompatible con las funciones de la enzima que polimeriza el ADN, es solucionado mediante un proceso que involucra un copiado discontinuo de la cadena retrasada mediante el uso de muchos cebadores de ARN.

11 Hayvarias familias de ADN Polimerasas: Familia Función Taxón A Replicación y reparación Eucariotas y procariotas B Replicación y reparación Eucariotas y procariotas C Replicación Procariotas D Replicación Archaea X Replicación y reparación Eucariotas Y Replicación y reparación Eucariotas y procariotas RT Replicación y reparación Virus, retrovirus y eucariotas Principales DNA polimerasas eneucariota: Polimerasa Familia Función α B Síntesis de cebadores, síntesis de cadena de retraso β X Reparación de ambas cadenas de ADN γ A Replicación del ADN mitocodrial δ B Síntesis de cadena lider, llenado de huecos después de remover cebadores. ε B Reparación de ambas cadenas de ADN

12 1) Las ADN polimerasas no pueden desenrollar la doble hélice del ADN. 2) Las cadenas son antiparalelas y las ADN polimerasas solo pueden añadir nucleótidos en dirección ) Requieren de la presencia de un cebador de ARN para adicionar nucleótidos. Es decir dependen de la preexistencia de un fragmento patrón para iniciar el copiado de las cadenas molde Cadena lider Cadena retrasada

13 La ADN polimerasa procesa hasta 500,000 nucleótidos sin desprenderse, actividad indispensable para el crecimiento de la cadena líder. La habilidad de la ADN polimerasa para comportarse como un centro procesador se lo da la subunidad b que forma una estructura cerrada alrededor de la doble hélice y posteriormente asociarse y anclar el centro activo al final del cebador. Velocidad natural: nucleótidos por segundo

14 Reparación del ADN Células envejecidas à 1- Senescencia 2- Suicidio celular (apoptosis) 3- Carcinogénesis Reparación y Protección à Trabajo correcto y eficiente de la célula 1- REPARACIÓN DIRECTA: enzimas especialistas que detectan bases con errores. Ejemplos: - metil-guanina-metil transferasa - Fotoliasa 2- REPARACIÓN SOBRE LA MARCHA: La polimerasa que sintetiza la nueva cadena de ADN detecta el error y lo repara. polimerasa - exonucleasa

15 Reparación

16 Reparación del ADN REPARACIÓN POR MALAPAREAMIENTO 4- REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES 5- REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS 6- RESPUESTA SOS (emergencia) 7- PROTEÍNA p53 (suicidio)

17 Proteínas involucradas en la replicación DNA ligasa: forma enlaces reparando los cortes en la molécula de DNA replicada DNA primasa: sintetizan los cebadores de ARN en los sitios de iniciación DNA polimerasa: añade nucleótidos complementarios a la cadena molde Helicasa: estimula la separación de las dos cadena Proteínas SSB: estabilizan la estructura de cadena simple Topoisomerasa (DNA girasa): encargada del enrollamiento y desenrollamiento de la doble hélice

18 Replicación del ADN

19 Reparación del AND What happens when your DNA is damaged?

20 Primer examen parcial: Lunes 25 de septiembre Entregar título del trabajo y una breve descripción (media cuartilla). Formato electrónico. Título del correo-e y del documento: TítuloTrabajoFinal_Apellido Ejemplos de temas para trabajo final: Variabilidad genética Triploides Híbridos Reversión sexual Super machos YY Transgénesis Selección asistida Prohibido copiar y pegar los textos íntegros Usen sus propias palabras Citen correctamente (ver anexo 1 del manual de lab) Cada faltas de ortografía = -1 punto

21 3 Replicación, trascripción y traducción del material genético. Objetivo: Describir como una célula duplica su material genético precisamente a partir del ADN y explicar como decodifica y utiliza la información contenida en su genoma. 3.2 Mecanismos de transcripción.

22 Dogma Central de la Biología Molecular Replicación La expresión génica se concretiza por la transformación de la información genética desde moléculas de ADN a moléculas de ARN y desde Transcripción éstas hasta los polipéptidos correspondientes. ADN ARN Proteína Traducción expresión génica

23 Síntesis de ARN La transcripción es el proceso de obtención de un ARN mensajero (ARNm) a partir del ADN correspondiente a un gen.

24 Síntesis de ARN La cadena de ARN crece en dirección 5 3. Esta dirección coincide con la síntesis de ADN. La ARN polimerasa, a diferencia de la ADN polimerasa, es capaz de iniciar su síntesis sin la presencia de ningún tipo de molécula cebadora. En eucariotas, los nucelosomas deben ser removidos y reestablecidos una vez que la lectura se ha realizado.

25 Síntesis de ARN Los precursores en la síntesis de ARN (unidades estructurales) son cuatro ribonucleótidos trifosfatados: ratp; rctp; rgtp; rutp. La secuencia de bases del ARN a polimerizar está determinada por la secuencia de bases de la molécula de ADN utilizada como molde para su síntesis. He ahí que se la denomine Cadena Molde de ADN (o cadena templada). Las moléculas de ARN son sintetizadas usando como molde a segmentos específicos de ADN, en la reacción de polimerización que es catalizada por la ARN polimerasa. Ribonucleótidos trifosfatados

26 Síntesis de ARN La burbuja de síntesis se mueve a lo largo de la cadena de ADN y, simultáneamente, una cadena de ARN se va formando. ARN polimerasa Cadena Molde de ADN Cadena de codificación de ADN Cadena de ARN

27 Síntesis de ARN Cadena molde Cadena codificante 1 etapa- UNIÓN de la ARN polimerasa al ADN 2 etapa- INICIACIÓN de la síntesis 3 etapa- ELONGACIÓN de la cadena de ARN mensajero 4 etapa- TERMINACIÓN de la síntesis y liberación de la cadena de ARN Archea factor B Eucariota factor de transcripción II B

28 Características de la ARN polimerasa La ARN polimerasa es una de las enzimas más grandes que se conoce. Consta de varias subunidades: dos alfa (a), beta (b), beta prima (b ) y omega (ω). La enzima completa es denominada holoenzima y se divide en dos componentes principales: 1. La enzima central, denominada Core, formada por las subunidades 2 a, b, b y ω. 2. El Factor Sigma ( el polipéptido s) b ω a a b s ω a b b a s

29 ARN polimerasa La RNA polimerasa es una enzima crucial para la sintesis de nuevas moléculas de RNA. En bacterias existe solo un tipo de ARN polimerasa y consta de cuatro subunidades. En eucariotas hay tres diferentes tipos de RNA polimerasa. ARN Pol I: Transcribe ARN de los ribosomas ARN Pol II: Transcribe ARN mensajero ARN Pol III: Transcribe tarn, 5s rarn, snarn

30 Estructura básica de un gen Eucariota Inicio de la transcripción Señal de Poli-A Región de Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 terminación Promotor Inicio de la traducción ATG Transcripción Codon de terminación de traducción TGA, TTA, TAG ARN transcrito primario 5 3 Splicing RNA mensajero maduro G CH 3 P Estructura CAP 5 Codón de inicio AUG P P Maduración Codón de terminación UGA, UUA, UAG AAAAA 3 Poliadenilación

31 ESTRUCTURA DEL ARN mensajero en EUCARIOTAS a) Las células eucariotas poseen tres clases de ARN polimerasas (I, II y III), las cuales se utilizan para sintetizar los distintos tipos de ARNexistentes. b) Los extremos 3 y 5 de los ARNm están modificados. En el caso del extremo 5 encontraremos una estructura denominada CAP y, en el correspondiente extremo 3, se encuentra adherido una larga secuencia de nucleótidos cuya base nitrogenada es la Adenina (Cola Poly A). c) Las moléculas de ARNm, luego de ser sintetizas, son modificadas. Los transcritos primarios eucariotas sufren un proceso por el cual determinadas secuencias (Intrones) soneliminadas. d) Los ARNm eucariotas son Monocistrónicos - codifica para una cadena polipeptídica simple.

32 ESTRUCTURA DEL ARN mensajero en PROCARIOTAS En células Procariotas es común hallar ARNm que codifican para varias cadenas polipeptídicas diferentes, en este caso esta molécula se denomina ARNm policistrónico. Todo ARNm Procariota contiene dos tipos de regiones: No codificante: segmentos Líder y Trailer Codificante: cistrones o segmentos con codones que determinan la serie de aminoácidos de la proteína. Esta región se extiende desde un codón de inicio (usualmente AUG) hasta un codón stop (UAA, UAG, UGA). Cada Cistrón posee un codón de inicio y un stop. Regiones espaciadoras: secuencias de longitud variable ( 10 pb) que separan las regiones codificantes o cistrones. ARNm policistrónico Inicio Stop Inicio Stop

33 Terminación de la transcripción 1. Dependiente del factor Rho 2. Independiente del factor Rho Secuencia terminadora Todas contienen secuencias complementarias justo antes del punto de terminación. Esta zona está caracterizada por poseer repeticiones inversas conteniendo un segmento central no repetido. La secuencia de uracilos suministra la señal que permite a la RNA polimerasa disociarse del DNA molde. La secuencia complementaria continúa con una secuencia de pares A-T, las cuales producen, en el RNA mensajero, una secuencia de 6 a 8 Uracilos en el extremo transcrito.

34 Principales Diferencias en la Transcripción y Traducción entre Procariotas y Eucariotas

35 3 Replicación, trascripción y traducción del material genético. Objetivo: Describir como una célula duplica su material genético precisamente a partir del ADN y explicar como decodifica y utiliza la información contenida en su genoma. 3.3 Síntesis de proteínas.

36 Dogma Central de la Biología Molecular Replicación La expresión génica se concretiza por la transformación de la información genética desde moléculas de ADN a moléculas de ARN y desde Transcripción éstas hasta los polipéptidos correspondientes. ADN ARN Proteína Traducción expresión génica

37 Traducción La información del ADN transcrita a ARNm es interpretada por el ARNr, lo que permite el transporte (ARNt) e incorporación de los aa s específicos de la proteína codificada. Es la síntesis de proteínas a partir del ARN mensajero (ARNm) Consta de 3 etapas: 1- Iniciación 2- Elongación 3- Terminación Esta estrechamente acoplado a la trascripción

38 Traducción 1- Iniciación representa todos los procesos requeridos para ensamblar el ribosoma con el codón de inicio. 2- Durante la elongación se lleva a cabo la síntesis de polipéptidos en la sub-unidad ribosomal grande. 3- La terminación se da cuando el ribosoma alcanza la señal de stop se libera con el péptido. Durante todo el proceso el ribosoma requiere factores de traducción que le auxilian a enlazarse al mrna, a seleccionar los aa y a mediar la terminación. Proceso particularmente complejo en eucariotas.

39 Características de un ARN mensajero ü El ARN mensajero es una cadena sencilla de ARN. ü Lleva la información genética del ADN al Ribosoma y es usado como molde para la síntesis de proteínas. ü Lleva el código genético (mensaje) como una secuencia de codones. ü Cada codón consiste en un triplete de bases. ü El mensaje del ARNm se lee de forma consecutiva en dirección 5 3. Cada aa es reconocido por un codón específico.

40 Iniciación Representa todos los procesos requeridos para ensamblar el ribosoma con el codón de inicio. 1. Unión de la subunidad pequeña ribosomal al ARNm. 2. Unión del complejo aminoácido/arnt al ribosoma. 3. Establecer el complejo de iniciación con subunidad grande. 4. Inicia fase de elongación.

41 Estructura del ribosoma Componente de los ribosomas (ARNr 60-65%, proteínas 35-40%)

42 1. Unión de la subunidad pequeña ribosomal al codón de inicio. Reunir los elementos necesarios Reconocer el sitio de inicio (AUG) Proveer sitios para que se inicie la elongación Reconocimiento Secuencia de Shine-Delgarno: 5 a 10 primeros nucleótidos antes del codón de inicio complementaria a los nucleótidos cerca del extremo 3 de lasubunidad. Secuencias complementarias que permiten que llegue la subunidad y se pegue.

43 Elongación Se lleva a cabo la síntesis de polipéptidos en la subunidad ribosomal grande. Etapas: 5. Selección del aminoacil-arnt. 6. Formación del enlace peptídico. 7. Translocación y liberación del trna deacilado.

44 Terminación El ribosoma alcanza la señal de stop se libera con el péptido 3 codones è terminación de la adición de aa UAA, UAG o UGA è detener la elongación y liberar el polipéptido asociado al último ARNt. Reconoce que aquí ha terminado la proteína 1. Complejo covalente con el codón. 2. Cambio en la conformación del ribosoma, se une al RF. 3. Hidrólisis Factores de liberación (RF:release factors) RF1: UAA y UAG RF2: UAA y UGA RF3: no específico, incrementa la actividad de RF1 y RF2. RF è sitio A. Tripéptido interactúa con el codón STOP, hidroliza el enlace éster del ARNt y libera el aa.

45 Terminación

46 Terminación El proceso de terminación es de crítica importancia en la síntesis de proteínas. Mala interpretación del STOP è adición no funcional e incluso dañina a la cadena de polipéptidos è pérdida de la función real de la proteína.

47 Diferencia entre la traducción de procariotas y eucariotas En PROCARIOTAS: La metionina inicial (AUG) presenta el grupo formil (formilmetionil-trna). La traducción y la trascripción están acopladas. Genes policistrónicos