Exocitosis, Endocitosis y Reciclado Vesicular

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Julia Silva Marín
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1 Exocitosis, Endocitosis y Reciclado Vesicular

2 Exocitosis Secreción Exocitosis: proceso por el cual uno o más compuestos sintetizados dentro de la célula y transportados en vesículas son liberados o expuestos al medio extracelular luego de la fusión de la membrana vesicular con la plasmática.

3 Endocitosis Exocitosis endosoma

4 Funciones de la exocitosis (constitutiva o activada por Ca 2+ ) Excreción de un producto de desecho metabólico (exocitosis lisosomal) Formación de una interfase de comunicación y/o protección (glicocálix, proteínas matriz extracelular, mucus) Reciclado de Proteínas de membrana (por exocitosis) Secreción de sustancias mensajeras al medio extracelular (activada por calcio)

5 Exocitosis Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). CONSTITUTIVA NSF, SNAP INESTABLE Se libera en reposo a baja [Ca 2+ ]i Sorensen, Pflugers Arch

6 Exocitosis Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). DISPARADA POR Ca 2+ NSF, SNAP ESTABLE Velocidad baja en reposo Y muy alta cuando Ca2+ Sorensen, Pflugers Arch

EXOCITOSIS ASOCIADA SECRECION HORMONAL O DE NEUROTRANSMISORES: DOS TIPOS DE VESÍCULAS Las hormonas hidrofílicas son almacenadas en vesículas Vesículas sinápticas Pequeñas (40 nm) y claras

7 EXOCITOSIS ASOCIADA SECRECION HORMONAL O DE NEUROTRANSMISORES: DOS TIPOS DE VESÍCULAS Las hormonas hidrofílicas son almacenadas en vesículas Vesículas sinápticas Pequeñas (40 nm) y claras Sinapsis convencionales Neurotransmisores clásicos Vesículas Secretorias grandes (200 nm) y densas al ME células neurosecretoras y ciertas terminales nerviosas catecolaminas, neuropéptidos

8 Tipo de vesícula vesículas secretorias o gránulos densos nm Altas concentraciones de proteína soluble muy condensada nm vesículas sinápticas Bajas concentraciones de proteína soluble

9 Ciclo de las vesículas sinápticas en terminales presinápticas Kiss-and-run Ready Releasable Pool

10 Ciclo de las vesículas secretorias en células endócrinas

11 Docking Priming (SNAREs) Ca 2+ Kiss-and-Run

12 MODOS DE FUSION Colapso completo vs. Kiss-and-Run K&R C.C. Ceccarelli, 1973 Heuser and Reese, 1973

13 Colapso completo, Kiss-and-Run, Exocitosis Compuesta

14 Similitudes entre secreción de NTs desde terminal sináptica y de hormonas desde una célula neuroendócrina - Dependencia del calcio - Mecanismo acoplado a cambios del potencial de membrana - Maquinaria exocítica - Maquinaria Endocítica COMPARTIDO CON PROCESOS CONSTITUTIVOS

15 Diferencias entre secreción desde una célula neuroendócrina y la liberación de NTs en presinapsis. - Polarización celular

16 Polarización en la distribución vesicular

17 Diferencias entre secreción desde una célula endocrina (cromafín) y la liberación de NTs en presinapsis. Presinapsis Cromafín Fuertemente polarizada Prácticamente no polarizada Vesículas muy localizadas Distribución vesicular difusa Generación vesicular a partir de endosoma de reciclado Vesículas sinápticas Generación vesicular a partir de Golgi Vesículas secretorias densas Alto acople con estímulo Pools vesiculares con acople variado

18 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Terminales Presinápticas Célula Cromafín

19 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Sinapsis (placa) neuromuscular, paradigma de sinapsis química 50 mv presinapsis 5 mv postsinapsis Latencia 2-5 ms EPP (PPT) 19

20 Liberación evocada Liberación espontánea EPPs minis 20

21 PLACA NEUROMUSCULAR Liberación cuántica QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. 21

22 Placa Neuromuscular Vesiculas presinapticas El Nro de cuantos liberados correlaciona con el numero de vesiculas fusionadas. 4-AP: 4-aminopiridina Heuser y col,

23 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Técnica de patch-clamp / whole-cell para medición de corrientes de Ca 2+ y capacitancia C = ε. A d

24 Técnica de patch clamp-whole cell para medición de corrientes de Ca 2+ y capacitancia ΔV

25 Diálisis de Ca 2+ Inducción de Corriente de Ca 2+ Augustine and Neher. 1992

26 Tren de estímulos en voltage clamp Tenemos un claro acople de la exocitosis con la entrada de Ca 2+

27 Registro por capacitancia del Kiss and Run

28 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Amperometría Red Ox + ne - E = E o RT ln [Ox] nf [Red]

30 Aplicación de trenes de APs a frecuencia alta (fight or flight) y basal (breed and feed). 40 mv 80 mv 20 ms Colapso completo kiss and run Fulop, Radabaugh y Smith, 2005

Metodologías para el registro de la exocitosis

mechanism for activitydependent differential

31 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Utilización de fluoróforos e imaging: marcadores de fase fluida, de membrana y anticuerpos (Sulforhodamine B) A proposed mechanism for activitydependent differential transmitter release in adrenal chromaffin cells.. Fulop, Radabaugh y Smith, 2005

32 Proteínas de la maquinaria de fusión La maquinaria de fusión es universal para exocitosis regulada y constitutiva SNAREs (soluble NSF attachment protein receptors): Sintaxina y SNAP-25 (tsnare) y sinaptobrevina o VAMP (vsnare). Membrana plasmática vesícula

33 Utilización de capacitancia, amperometría y toxinas específicas para el estudio de las proteínas involucradas en la exocitosis Liberación de Ca por flash fotólisis vesícula Cliva SNAP-25 Cliva SNAP-25 Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998

34 vesícula vesícula vesícula Cliva Sintaxina+SNAP-25 Cliva Sinaptobrevina Cliva Sinaptobrevina Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998

35 Fusión y ciclado de proteínas SNARE A partir de experimentos de FRET, Lin y Scheller, 1997 N terminal C terminal

36 Dependencia de la Exocitosis con el Ca 2+ Dependencia sigmoidea: implica varios sitios de unión a Ca 2+. (Kd ~ 20 μm) (Kd ~ 100 μm)

37 Si Ca 2+ es el disparador SENSOR de Ca 2+ Clásico: sinaptotagmina 2 dominios citosólicos C2A une 3 Ca 2+ C2B une 2 Ca 2+ En Rta a Ca: une membranas (en ms) une SNAREs Bai y Chapman, 2004 Tokuoka y Goda, 2003

38 Bai y Chapman, 2004

39 Pools vesiculares organización espacial organización espacial?

40 Pools vesiculares Experimentos flash photolysis + capacitancia (UV) Exocytotic Burst

41 ( vesículas) Pool de reserva Intracelular [Ca] i SRP (130) RRP (170) Fusión (en respuesta a Ca) Extracelular Fusión (en respuesta a Ca)

$Una fracción de vesículas hacen docking pero esta fraccíon es$

42 Una fracción de vesículas hacen docking pero esta fraccíon es bastante mayor a RRP y SRP sumados. Ashery y col, EMBO J 19:3586, 2000.

43 Pool de reserva UP (>400) (docking pero no priming) priming SRP RRP Extracelular Fusión (en respuesta a Ca) Fusión (en respuesta a Ca)

44 Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). Munc13 CAPS Ca 2 + Ca 2 + ESTABLE Velocidad baja en reposo Y muy alta cuando Ca2+ Sorensen, Pflugers Arch

45 Y de donde viene el calcio??? Dialisis Augustine and Neher, 1992

46 Liberación de Ca 2+ desde el RE 10 s Activación de CCDV

48 Robinson y col, 1995

49 ENDOCITOSIS Internalización de componentes de la membrana plasmática, asociada a ligandos y fluído. Saheki, De Camilli, 2012

Requiere caveolin 1, actina, dinamina Estructuras Tubulares (~500 nm) Sin cubierta Glicolípidos B-Shiga toxin (STB) Hasta 5 μm de

50 Clasificación por Morfología Clásica No Clásicas 80 nm Cubierta Electrodensa Requiere clatrina, Dinamina,AP2, actina, etc 60 nm Flask-shape Sin cubierta. Requiere caveolin 1, actina, dinamina Estructuras Tubulares (~500 nm) Sin cubierta Glicolípidos B-Shiga toxin (STB) Hasta 5 μm de diámetro Sin cubierta. Independiente de actina Endocitosis Clásica (multiples funciones +Estables que coated pits Transcitosis en endotelios Internalizacion de glicolípidos. Fase fliuida Respuesta a pliegues en la membrana Incorporación de fase fluída.

51 FUNCIONES DE LA ENDOCITOSIS Mantenimiento de la homeostasis de la membrana plasmática - Superficie - Proteínas (turnover) via lisosomal constitutiva Incorporación de nutrientes: ej. transferrina (mediada por receptor) Regulación de receptores de membrana (internalización receptores) Reciclado de pools vesiculares asociados a señalización señalización Fagocitosis Pinocitosis (incorporación de fases líquidas)

52 Reciclado de vesículas sinápticas o secretorias Endocitosis Exocitosis endosoma

53 estímulos breves PA a baja frecuencia estímulos más fuertes. PA a alta frecuencia estímulos muy fuertes. suprafisiológicos?

$por Clatrina Freeze-fracture$ electron microscopic (EM)

54 Endocitosis Clásica o Mediada por Clatrina Freeze-fracture electron microscopic (EM) images of frog neuromuscular junctions

55 triskelion

56 ENDOCITOSIS AP2 dinamina

58 Dinamina

59 El role de la endocitosis mediada por clatrina en el reciclado de vesículas sinapticas se ha demostrado por diferentes estrategias experimentales. (1) La inducción de un burst de exocitosis resulta en una acumulación transtoria de vesículas cubiertas de clathrina. Microscopía electrónica (Heuser and Reese 1973; Gad et al. 1998). (2) El bloqueo de la endocitosis mediada por clatrina resulta en el bloqueo del reciclado de vesículas sinápticas. Electrofisiología, imaging con marcadores de membrana (Shupliakov et al. 1997; Kim and Ryan 2009). (3) Intervenciones que bloquean el reciclado de vesículas sinápticas provocan la acumulación de vesículas cubiertas de clatrina. (Shupliakov et al. 1997; Raimondi et al. 2011). (4) Vesículas cubiertas de caltrina purificadas de cerebro presentaron como principal cargo a proteínas de las vesículas sinápticas (recicladas). (Maycox et al. 1992; Blondeau et al. 2004) Saheki, De Camilli, review 2012

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