Protocolo. Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes

Transcripción

1 Protocolo Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes ES Minitüb GmbH Hauptstrasse Tiefenbach Germany Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) minitube@minitube.de Internet:

2 El siguiente protocolo ha sido específicamente diseñado para congelar semen en pajuelas de 0,25 ml. Paso 1: Colección Colecte el semen utilizando una vagina artificial (temperatura máxima al interior de la vagina: +45ºC). Paso 2: Evaluación del semen y cálculo del volumen de diluyente Control de temperatura: Platina temperada del microscopio: C a +39 C Portaobjetos y cubreobjetos precalentados Baño maría: +28 C a +34 C Ponga el semen recién colectado en un baño maría. Mida el volumen, preferentemente con una balanza electrónica. Determine la motilidad con un microscopio y la concentración espermática con un fotómetro (SDM6), o utilice idealmente el sistema CASA Sperm Vision para ambas evaluaciones. Exigencias mínimas al eyaculado: Volumen: >1,5 ml Concentración: >0,6 x 10 9 /ml Motilidad progresiva del semen nativo: 70% Motilidad progresiva del semen descongelado: >40% Morfología: <20% espermios morfológicamente alterados, <10% anormalidades de acrosoma y <5% anormalidades de cabeza Sistema CASA Sperm Vision Calcule el volumen necesario de diluyente y el número de pajuelas a llenar. Imprima las pajuelas (HDR/EasyCoder). 2 Protocolo: Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes

3 Paso 3: Dilución del eyaculado Prediluya el eyaculado al menos 1+1 dentro de 10 minutos posteriores a la colección. La temperatura del semen y del diluyente debe ser igual (+/-1 C) para la primera dilución. La segunda dilución y las siguientes pueden efectuarse a temperatura ambiente. Homogenice revolviendo suavemente después de cada paso. Determine el porcentaje de motilidad progresiva de las células espermáticas bajo el microscopio antes de proceder al procesamiento (mínimo 70% de motilidad progresiva). Diluyentes apropiados son: Triladyl/Biladyl o AndroMed. Elija tipo del diluyente (para 1 o 2 pasos) de acuerdo al protocolo (vea paso 4). Paso 4: Equilibrio (adaptación) y envasado de pajuelas (empaque) Alternativa 1: Empaque a temperatura ambiente seguido de adaptación a +5 C Envase y selle las pajuelas con una máquina envasadora y selladora automática (p. Ej.,MPP Uno) o semiautomática (SFS) bajo control visual. Controle el cierre mediante un mandril tomando muestras de pajuelas al azar. Coloque las pajuelas envasadas y selladas sobre rampas, controle el número de pajuelas producidas y retenga pajuelas de muestra para el control de cada partida. Coloque las rampas en un espacio refrigerado para adaptarlas a +5ºC dentro de 30 a 45 minutos. El tiempo de equilibrio a +5ºC es de al menos 1,5 horas generalmente de 2 a 5 horas. Alternativa 2: Dilución monofásica con empaque a +5 C Tras la dilución final del eyaculado a temperatura ambiente, enfríe el semen a +5ºC por 30 a 45 minutos. El tiempo de adaptación es de 2 a 5 horas. Envase y selle las pajuelas con una envasadora y selladora (MPP Uno o SFS) puesta en un espacio refrigerado (gabinete o cámara fría) a +5 C. Protocolo: Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes 3

4 Alternativa 3: Dilución en 2 fases con empaque a +5 C La dilución bifásica utiliza 2 diluyentes: un diluyente libre de Glicerina para la fase 1 y un diluyente con Glicerina para la fase 2. Diluya primero el eyaculado hasta el 50% del volumen final con diluyente sin Glicerina y enfríelo a +5ºC dentro de 20 a 45 minutos. Una vez a +5ºC, agregue el otro 50% del volumen final con diluyente conteniendo Glicerina. Importante: Controle que ambos, semen y diluyente deben estar a +5ºC. El tiempo de adaptación total es de 2 a 5 horas. Envase el semen en las pajuelas a +5 C. Paso 5: Congelación de la pajuelas de semen Congele las pajuelas en posición horizontal sobre rampas en un equipo congelador (IceCube). Curva de congelación recomendada para pajuelas 0,25 ml +5 C Coloque rampas con pajuelas y manténgalas por un mínimo 2 minutos +4 C a -120 C A una velocidad de 60ºC/min -120 C Mantenga por 2,0 min Como alternativa, utilice una caja de Poliexpan con nitrógeno liquido (N 2 L) y congele las pajuelas en el vapor del nitrógeno posicionándolas en una rampa a 4 cm sobre el nivel de N 2 L por 10 minutos. En seguida sumerja inmediatamente las pajuelas en el N 2 L. Después de la congelación transfiera las pajuelas inmediatamente a un contenedor de almacenamiento con N 2 L. Guarde separadamente las pajuelas necesarias para el control de la partida. Paso 6: Control de la partida de semen Descongele 2 pajuelas de cada partida procesada, y evalúe la motilidad progresiva de las células espermáticas ya sea subjetivamente o utilizando el Sistema CASA Sperm Vision. La exigencia mínima de motilidad progresiva es de >40% después de la descongelación. 4 Protocolo: Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes

5 Paso 7: Descongelación del semen y preparación de la dosis de IA Retire las pajuelas del contenedor de N2L y transfiéralas inmediatamente a un descongelador (MT35/42) ajustado a +38ºC. Descongele las pajuelas por 25 a 30 segundos. Seque las pajuelas mediante una toalla limpia de papel. Sacuda la pajuela para posicionar la burbuja de aire junto al extremo sellado, y corte este extremo mientras mantiene la pajuela en posición vertical. Cargue la pajuela en el instrumento inyector de IA e insemine con o sin la ayuda de un espéculo vaginal, dependiendo de la técnica y el instrumental utilizado. Inyector QuickLock con vaina universal para IA vaginal de ovejas y cabras Inyector con pipetas de punta excéntrica para IA intra/transcervical de ovejas y cabras Protocolo: Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes 5

6 Anexo: Equipos y suministros requeridos Triladyl (13500/0250) Biladyl A, B, AB (13500/xxxx) AndroMed (13503/0200) AndroMed CSS one step (monofásico) (13503/1200) AndroMed CSS two step (bifásico) (13503/125x) Vasos de vidrio o plásticos (15423/xxxx) Toallas de papel libres de pelusas (15230/9001) Balanza (14295/0444) Baño maría (14078/0001) SDM6 (12300/0006) Cubetas para SMD5 (12301/0003) NaCl, 0.9%, 1 l (12301/4667) Dispensador de NaCl (12428/1815) Pipetas fijas o variables (12425/4810) Microscopio de contraste de fases (12004/0331) Portaobjetos (15400/2400) Cubreobjetos (15401/0990) Micropipetas desechables (15404/1000) Pajuelas de 0,25 ml (13407/xxxx) MPP Uno (13017/0000) SFS (13133/0135) EasyCoder (13038/0000) IceCube 14M (16820/7000) Rampas para pajuelas de 0,25 ml (15040/xxxx) Bloque cargador (15041/xxxx) Nitrógeno líquido Contenedor de N 2 L a presión (16501/0070) Goblets, varios tamaños (16xxx/xxxx) Pinzas (17060/0025) Guantes crioprotectores (23830/0520) Contenedor criogénico MVE (16520/2006) Equipo descongelador (17043/3542) Pipeta de IA con punta excéntrica para semen fresco (17300/1000) Pipeta de IA con punta excéntrica para pajuelas de 0,25 ml y minitubos (17300/0000) Inyector para pajuelas de 0,25/0,5 ml y minitubos (17320/0000) QuickLock para pequeños rumiantes (17350/0000) Vaina universal para QuickLock (17350/0010) Guantes de inseminación, azules (17080/xxxx) Kit de IA (17350/0100) Sistema Sperm Vision CASA y accesorios: por favor consulte a su contacto en Minitube. 6 Protocolo: Congelación de Semen de Pequeños Rumiantes