Viabilidad y estado acrosomal en espermatozoides de conejo.

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1 Page 1 of 7 Viabilidad y estado acrosomal en espermatozoides de conejo. Vet. Arg.? Vol. XXXIII? Nº 339? Julio Puente M.A.1*, Rodriguez D1., Tartaglione M.1 Resumen En numerosas investigaciones se ha enfatizado la relación que existe entre los parámetros seminales tradicionalmente empleados y las pruebas especiales in vitro y las características funcionales que les permiten a los espermatozoides lograr la fecundación. La importancia de los resultados obtenidos en estas pruebas y su relación con la fertilidad toma en consideración la capacidad del espermatozoide para realizar el proceso de capacitación, la reacción acrosómica y el propio acto de la fecundación. En la correcta realización de estos procesos radica la capacidad fecundante de los espermatozoides. Esta capacidad no puede ser estimada por las variables seminales utilizadas tradicionalmente por lo que se hace necesaria la investigación profunda de estos fenómenos y la implementación de nuevos métodos predictores de la fertilidad. Existen muchos parámetros para evaluar in vitro la calidad de un eyaculado, la evaluación del acrosoma es uno de ellos. Su importancia es debido a que esta estructura es fundamental durante el proceso de la fertilización. La evaluación de la integridad del acrosoma nos permite obtener información esencial sobre la calidad del eyaculado para su posterior uso en planes de mejoramiento reproductivo en granjas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para evaluar la viabilidad y el estado acrosomal de espermatozoides de conejo. Palabras claves: Acrosoma, conejo, espermatozoide, viabilidad, Viability and state of acrosome in sperm of rabbit. Summary Numerous research has emphasized the relationship between parameters semen traditionally used and special tests in vitro and functional characteristics that allow an sperm achieve the fertilization. The importance of the results of these tests and their relationship to fertility takes into account the ability of sperm to make the capacitation process, the acrosome reaction and the act of fertilization itself. In the successful completion of these processes resides at the fertilizing capacity of sperm. This capacity can not be estimated by the seminal variables traditionally used so the thorough investigation of these phenomena and the implementation of new methods of fertility predictors is necessary. There are many parameters to evaluate in vitro the quality of an ejaculate, acrosome evaluation is one of them. Its importance is because this structure is essential during the process of fertilization. The evaluation of the integrity of the acrosome allows us to obtain

2 Page 2 of 7 essential information about the quality of the ejaculate for later use in improving reproductive plans of farms. The aim of this work was to develop a protocol to assess the viability and acrosomal status of sperm rabbit. Keywords: Acrosome, rabbit, spermatozoa, viability. ¹ Facultad de Ciencias Agrarias? Laboratorio de Reproducción Animal- U.N.L.Z. *ingmarcospuente@gmail.com Introducción En el área de la reproducción animal se han realizado muchos tests para valorar adecuadamente una muestra seminal y poder predecir la fertilidad. Podríamos enunciar que el análisis de semen ideal sería aquél que de forma sencilla y eficaz permitiera realizar pruebas diagnósticas para evaluar la capacidad fecundante de un eyaculado. Ensayos de laboratorio han sido desarrollados para estimar la calidad seminal "in vitro" y correlacionar los resultados con la fertilidad "in vivo", cuando se combinan varias pruebas existe una alta correlación entre resultados "in vitro" con la fertilidad (Tartaglione y Ritta, 2004; Lavara y col. 2005). La funcionalidad de la membrana plasmática es un aspecto importante a tener en cuenta en la viabilidad de los espermatozoides, implica el intercambio con el medio circundante y desempeña un papel importante en los acontecimientos que tienen lugar durante la fecundación (capacitación, reacción acrosomal y la fusión espermatozoide-ovocito). Este aspecto ofrece información fiable sobre la potencial fertilidad del eyaculado y, en asociación de análisis de rutina (concentración, motilidad y morfología), lo cual amplía el poder de discriminación entre los diferentes eyaculados sobre la fertilidad.las cualidades que deben tener los espermatozoides de un eyaculado fecundante son muchas entre las que se encuentran la motilidad progresiva, morfología normal, integridad de membrana, acrosoma intacto y viabilidad. La ruptura de la membrana plasmática y/o la membrana acrosomal está claramente asociada con la pérdida de viabilidad celular y posterior muerte

3 Page 3 of 7 celular. El acrosoma es una estructura que juega un papel fundamental en la fecundación. Los daños de la misma genera la liberación de enzimas de su interior perdiendo la capacidad de fecundación (Hernandez y col. 2012). El acrosoma puede visualizarse como un organelo secretor, se encuentra entre el núcleo y la membrana plasmática. La reacción acrosomal es definida como una serie de eventos de que involucran la exocitosis de los gránulos secretados; dicha reacción ocurre de forma espontánea ya sea in vivo o in vitro. Si esta reacción ocurre de forma espontánea se asocia con la detección de un daño al espermatozoide. Uno de los primeros estudios que evaluó el estado funcional de la cabeza espermática fue realizado por Saacke R. y Marshall C. (1968) el cual reportaron una correlación significativa entre el porcentaje de espermatozoides con integridad acrosómica y la fertilidad. Posteriormente, Daas (1992) reportó como una importante característica seminal el porcentaje de células que tienen acrosomas intactos y que a la vez son capaces de realizar la reacción acrosomal. Los métodos clásicos de evaluación de semen generalmente miden la concentración espermática, la motilidad progresiva, el porcentaje de células viables y la morfología del acrosoma. Estos ensayos son pobres para medir la fertilidad, porque solamente las muestras con muy baja calidad son posibles de detectar. En muchas ocasiones, los espermatozoides muestran buena motilidad y morfología pero poseen bajos índices de fertilidad. La reacción acrosómica en los mamíferos es un requisito fundamental para la penetración del espermatozoide en la zona pelúcida y posterior fusión con el ovocito. La información acerca del status del acrosoma es importante para determinar la calidad del semen y por ende su utilización en la inseminación artificial y en programas de fertilización in vitro. Por lo tanto es muy importante desarrollar técnicas especiales para evaluar el estado acrosómica (Lunas-Martín et al., 1996), y que nos pueden evidenciar la verdadera reacción acrosómica de la falsa reacción, que consiste en la degeneración y pérdida del acrosoma tras la muerte del espermatozoide. Kovacs y Foote (1992) desarrollaron una técnica de tinción acrosomal aplicable a varias especies animales, dicha técnica no nos ha dado resultados satisfactorios en nuestros trabajos de investigación sobre calidad seminal en conejos. El conejo posee particularidades que lo diferencian de otras especies de interés pecuario, la eyaculación es bifásica, conjuntamente con los espermatozoides se produce una secreción de las glándulas accesorias que determinan la presencia de una sustancia

4 Page 4 of 7 gelatinosa en el eyaculado que se denomina normalmente "tapón mucoso". Esta particularidad hace que al momento de realizar las evaluaciones seminales tengamos que utilizar protocolos específicos para esta especie. Por tal motivo el objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para la evaluación de la viabilidad y el estado acrosomal del espermatozoide de conejo. Materiales y métodos. Para este estudio se utilizaron conejos machos de la Raza Neozelandes Blanco sexualmente maduros. Los conejos se mantuvieron individualmente en ambiente con luz controlada (16 L: 8 O) y fueron alimentados con una dieta comercial y agua ad libitum. El semen fue recolectado una vez por semana, dos eyaculados por macho a intervalos de 30 min. El semen se recogió mediante una vagina artificial a 42 ºC y en caso de presencia del tapón mucoso en el eyaculado, el mismo fue retirado mediante una pinza. Se evaluó cada eyaculado en forma macroscópica observando el color, olor y volumen medido en un tubo colector graduado. Extrtacción de semen.para el procedimiento de doble tinción se utilizó una solución de Azul Tripán (Sigma) para evaluar la viabilidad, una solución de rojo neutro para la fijación y una solución Giemsa (Merck) para la evaluación del estado acrosomal. Resultados.

5 Page 5 of 7 Se realizó una adaptación al protocolo de Kovacs y Foote (1992) obteniendo una tinción más notoria en la evaluación de la viabilidad y el estado acrosomal del espermatozoide de conejo obteniendo el siguiente protocolo: se utilizó una solución de Azul Tripán al 0,4% en vez de 0,25% como establece el protocolo Kovacs para teñir los espermatozoides realizando un frotis. Luego del secado a temperatura ambiente y la fijación con una solución compuesta por 86 ml HCl 1 N + 14 ml de formaldehido 37 % + 0,2 g. de rojo neutro, el protocolo Kovacs establece incubar las muestras con una solución Giemsa de 7,5 % 2 a 4 h a temperatura ambiente, mientras que en nuestro laboratorio los mejores resultados lo obtuvimos con igual concentración de Giemsa pero incubando 24 h en un baño termostático a 37ºC. Este protocolo determina 4 categorías de espermatozoides al ser observados bajo microscopio: Espermatozoide vivo con acrosoma se observa la zona acrosomal fucsia y la zona posacrosomal blanquecina. Espermatozoide vivo sin acrosoma se observa la zona acrosomal rosa pálido y la zona posacrosomal blanquecina. Espermatozoide muerto con acrosoma se observa la zona acrosomal fucsia y la zona posacrosomal azul oscuro. Espermatozoide muerto sin acrosoma se observa la zona acrosomal rosa pálido y la zona posacrosomal azul oscuro.

6 Page 67 of 7 Espermatozoides con y sin acrosoma. Discusión La técnica de doble tinción fue descripta para espermatozoides de varias especies animales, (Kovacs y Foote, 1992; Polgar y col. 2004), sin embargo, los resultados obtenidos en nuestro laboratorio al utilizar estos protocolos en el semen de conejo no ha dado resultados satisfactorios, motivo por el cual desarrollamos uno específico para el semen de conejo obteniendo una identificación de las cuatro categorías mencionadas. Hay que considerar la importancia de la evaluación del acrosoma debido a que es una estructura fundamental en el proceso de fecundación. Los daños provocan que se liberen las enzimas de su interior necesarias para la fecundación perdiendo así el espermatozoide su capacidad fecundante. Tener una técnica que permita evaluar conjuntamente el estado acrosomal y la viabilidad del espermatozoide es de suma importancia para la evaluación de la calidad seminal en programas de reproducción asistida. Conclusión Se concluye que con el protocolo descripto en este trabajo se obtienen resultados satisfactorios en la determinación del estado acrosomal y la viabilidad de los espermatozoides de conejo.

7 Page 8 of 7 Bibliografía Daas N Laboratory assessment of semen characteristics. Anim. Reprod. Sci. 28: Hernández P., Fernández R., Rodriguez S., Negrete R., Soto M., García R Efecto de la criopreservación de semen de conejo Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) sobre su viabilidad y estado acrosomal. Revista Salud Animal Vol. 34 Nº Kovács A., Foote R Viability and acrosome staining of bull, boar and Rabbit spermatozoa. Biotechnic & Histochemistry 67 Nº 3. Lavara R., Mocé E., Lavara F., Viudes de Castro M.P., Vicente J.S Do parameters of seminal quality correlate with the results o on-farm inseminations in rabbits?. Theriogenology 64: Martín-Lunas E., Martino A., Paramio M.T., Palomo M.J., Mogaz M.T., Bielsa M.A., Andolz P., Martínez P Effect of oocyte-sperm co-incubation on acrosome reaction in the goat. Theriogenology, v.46, n.2, p Polgár Z., Virág G., Baranyai B., Bodó S.,Kovács A., Gócza E Evaluation of effects of cryopreservation on Rabbit spermatozoa membranas with trypan blue-giemsa staining. Proceeding 8º World Rabbit Congress- Puebla Mexico. Saacke R., Marshall C Observations on the acrosomal cap of fixed and unifixed spermatozoa. Journal Reproduction Fertility 16: Tartaglione C. M., Ritta M.N Prognostic value of espermatologicalmparameters as predictors of fertility of frozen bull semen. Theriogenology 62: