CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ARTRÓPODOS EN LA CUEVA: BOCA DE RÍO APETLANCA, GUERRERO, UTILIZANDO HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS

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1 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ARTRÓPODOS EN LA CUEVA: BOCA DE RÍO APETLANCA, GUERRERO, UTILIZANDO HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS Francisco García-Franco 1, Ezel Jacome Galindo-Pérez 1-2, Edson Mario Espinoza-Graciano 2, María Teresa Castañeda-Briones 1, María del Pilar Villeda-Callejas 2, Blanca Estela Chávez-Sandoval 1. 1 Laboratorio de Microbiología Ambiental, Universidad Autónoma Metropolitana-Azcapotzalco (UAM-A). Av. San Pablo #180, Col. Reynosa Tamaulipas. C.P , México, D.F. 2. Laboratorio de Zoología. Universidad Nacional Autónoma De México (FES-I, UNAM). Avenida De los Barrios S/N. Los Reyes Iztacala. C.P , Tlalnepantla, Estado de México. ez_gp553381@hotmail.com; fgf@correo.azc.uam.mx. RESUMEN. Las nuevas herramientas moleculares, han permitido un gran avance para una más acertada determinación y caracterización taxonómica y filogenética de la gran variedad de especies que existen en nuestro país, sin embargo existen pocos estudios moleculares de los organismos presentes en las cuevas de México, por lo que su estudio es de gran ya que que tienen una historia evolutiva compleja, han tenido una adaptación a ambientes extremos y son altamente especializados. En el presente trabajo se realizó la caracterización molecular de las familias Lestidae (Genero: Archilestes), Coenagrionidae (Género: Argia), Colopterigidae (Genero: Heterina), Carabidae, Dysticidae, Heptageniidae (Género: Stenonema), Corydadidae, Noucoridae (Genero: Cyphocricos), Vellidae (Genero: Rhagovelia), Guerridae, Blatellidae, Hydrophilidae, Micropholcus, Leptonetidae, Pseudothelphusoidea (Genero: Pseudothelphusa), Parasitidae, Phalangodidae (Genero: Eurybunus), Gonyleptidae y Phalangiidae de la cueva de Boca de Río Apetlanca, Guerrero, México. Palabras clave: Artrópodos, Caracterización molecular, Análisis Microbiológico, GENBANK. Arthropod molecular characterization in the cave: "Boca de Rio Apetlanca" Guerrero, using bioinformatics tools ABSTRACT. Newmolecular toolshave enableda breakthroughfor amore accuratedetermination, taxonomic and phylogeneticcharacterizationofthe varietyof speciesthat exist inour country. While there area fewmolecular studiesof organisms presentin the cavesof Mexico, which produces a great interest inits study, becausethey have acomplexevolutionary historyto adaptto the extreme environmentsand are highlyspecialized. In thiswork, we analized by biomolecularcharacterizationthe families:lestidae(gender: Archilestes) Coenagrionidae(Genre: Argia) Colopterigidae(Gender: Heterina), Carabidae, Dysticidae, Heptageniidae(Genre: Stenonema) Corydadidae, Noucoridae(Gender: Cyphocricos) Vellidae(Gender: Rhagovelia) Guerridae, Blatellidae, Hydrophilidae, Micropholcus, Leptonetidae, Pseudothelphusoidea(Gender: Pseudothelphusa) Parasitidae, Phalangodidae(Gender: Eurybunus), andphalangiidaegonyleptidae, which habit thecaveapetlancabocario, Guerrero, Mexico. Key words: Arthropods, molecular characterization, microbiological, GENBANK Introducción. México es uno de los lugares más interesantes del mundo en estudios de bioespeleología, teniendo diversas formaciones de cuevas que permiten albergar a nuevos géneros y especies de animales troglobias, trogofilas y trogloxenas (Hoffmann et al., 2004). La clasificación de estos organismos, se ha basado en estudios anatómicos y morfológicos, sin embargo las nuevas herramientas y técnicas de la biología molecular han cambiado esencialmente la forma de estudiar la taxonomía y sistemática, permitiendo pasar de un estudio de taxonomía morfológica a una taxonomía molecular. Actualmente con la ayuda de la Ecología Molecular se han obtenido marcadores genéticos para decidir si un organismo pertenece o no a una especie. Sin embargo no se debe de caer en un error al pensar que este tipo de técnicas son suficientes y definitivas, sino que se han convertido en un complemento indispensable de las técnicas empleadas, han abierto un gran campo para el estudio filogenético y evolutivo de las especies asociadas a las cuevas de México, éstos organismos constituyen un gran reto para la biología actual, dada la enorme variabilidad debida 1402

2 en parte a la evolución diferenciada que les ha permitido adquirir una serie de adaptaciones que les permiten vivir permanente mente en las cuevas, formando la principal fauna cavernícola; tal es el caso los artrópodos, los cuales representan la mayor diversidad de especies en comparación a otros grupos (Hoffmann et al., 1986). Es por lo anterior que es de gran relevancia la elaboración de estudios filogenéticos y taxonómicos que muestren la gran diversidad de esta cueva, considerando que los estudios que se han elaborado para organismos aislados, son pocos. También es importante observar los diferentes cambios morfológicos y etológicos que los animales han adquirido a lo largo de su evolución, al irse adaptando paulatinamente a vivir en forma permanente en estos medios aislados y obscuros (Hoffmann et al., 2004). En el presente trabajo se obtuvo la filogenia de los organismos encontrados en la cueva Boca de Río Apetlanca, Acahuizotla, Guerrero, México, colectados en el año 2011, obteniendo las secuencias genéticas del banco de datos GeneBank y alineándolos mediante análisis bioinformáticos. Materiales y Métodos Área de estudio. La zona del estado de Guerrero contiene una gran cantidad de cuevas, las cuales por su origen geológico, permitieron la diversificación de nuevas especies con adaptaciones particulares, Dentro del estado, el municipio de Acahuizotla, se encuentra ubicado al sur de Chilpancingo, Guerrero, en las coordenadas 17 22' 60 latitud Norte, 99 27' 0 de longitud Oeste (INEGI, 1995), está compuesta por una longitud de 2869 m. Se encuentra un clima Aw2 (w), éste clima corresponde al tipo cálido subhúmedo con lluvias en verano, el más húmedo de los subhúmedos, con un porcentaje de lluvia invernal menor de 5 mm, se presenta una precipitación media anual de mm y una temperatura media máxima de 28.1 C, una media anual de 22.5 C y una media mínima de 16.9 C (García, 1988). De acuerdo a con el Atlas Forestal de México (SEMARNAP, 1999), Acahuizotla se encuentra en la región hidrológica número 20, denominada Costa Chica de Guerrero, donde reúne las aguas de los ríos Omitlán, Azul y Papagayo. La estructura geológica que presenta esta zona se define claramente en imágenes de satélite y en fotografías aéreas (Fig. 1). Figura 1. Localización de la localidad de Acahuizotla (Tomado de

3 El tipo de vegetación en las partes más bajas está compuesta por selva baja caducifolia (Miranda y Hernández, 1963). En cuanto a la fauna de la zona, las especies más representativas son: Odocoileus virginianus (venado cola blanca), Didelphis marsupialis (tlacuache), Nasua narica (tejón), Pecari tajacu (jabalí), Euterenia sp. (culebra de campo), Crotalus molossus (culebra de cascabel), Cyrtonix sp. (codorniz) (Leopold, 1977). Muestreos. Se realizaron dos salidas a la cueva de Acahuizotla en los meses de febrero y noviembre del 2011, se tomaron factores fisicoquímicos de las zonas en donde se recolectaron los organismos. Para el caso de la captura de los organismos acuáticos se realizo un barrido con un colador de mano, que permitió capturar la mayor cantidad de organismos, los cuales fueron tomados con ayuda de pinzas entomológicas y pinceles (Hoffmann et al., 1986). Los crustáceos fueron fijados en Formol al 40%, los insectos y quelicerados fueron fijados en alcohol al 70% (Borror et al., 1989) y etiquetados para su posterior determinación morfológica en el Laboratorio de Entomología de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. Para la determinación morfológica de los ejemplares de odonatos tanto adultos como náyades e insectos acuáticos se utilizaron las claves taxonómicas de Needham y Westfall (1951), Usinger (1956), Westfall y May (1996), para la clase Crustácea, se utilizó la descripción de Álvarez y Villalobos (1996). Posteriormente a la determinación morfológica se llevó a cabo el análisis bioinformático, las secuencias del gen mitocondrial para la Citocromo Oxidasa subunidad 1 (CO1) de cada Familia y Genero se obtuvieron de la base de datos GENBANK. Posteriormente las secuencias obtenidas, se alinearon y se compararon entre sí, utilizando el programa de alineamiento múltiple de secuencias Clustal W del EBI (European Bioinformatics Institute). Resultados y Discusión Se recolectaron un total de 47 organismos dentro de las tres estaciones de muestreo, agrupándose en 10 familias, 6 géneros. La gran mayoría de los organismos se encuentran representados principalmente por cuatro Clases, de los cuales la Clase Insecta representa el 78% del total de organismos, seguida de la Clase Acárida con el 11%, Arácnida con el 7% y finalmente el Clase Malacostráca con el 4% (Fig. 2). Figura 2. Porcentaje de organismos por Clase de artrópodos encontrados en la Cueva de Acahuizotla, Guerrero, México. 1404

4 Se obtuvieron las secuencias mitocondriales de GENBANK de cada organismos determinado (Cuadro 1). Las secuencias utilizadas fueron de la Citocromo Oxidasa subunidad 1 (CO1) para cada Familia y Genero. Cuadro 1. Secuencias utilizadas para el alineamiento y el análisis de agrupamiento. CLAVE CLAVE ORGANISMO ORGANISMO GENBANK GENBANK Archilestes FJ Blatellidae JN Lestidae FJ Stenonema JN Argia FJ Hydrophilidae KC Hetaerina AY Corydalidae HQ Rhagovelia EU Phalangiidae JQ Cryphocricos AY Parasitidae JX Eurybunus JQ Gonyleptidae JF Leptonetidae JN Dytiscidae HE Gerridae JN Micropholcus DQ Pseudothelphusoidea AY Se elaboró el cladograma para observar los parentescos más cercanos de los organismos encontrados en el presente estudio (Fig. 3) por medio de las secuencias obtenidas anteriormente, el cual genero principalmente cuatros grupos independientes. Figura 3. Muestra el agrupamiento de los organismos, con respecto a los clados obtenidos. 1405

5 En los cuales se puede observar que en el primer grupo se obtiene una filogenia cercana del orden Odonatos, sin embargo existe también una diferenciación significativa en cuanto a las secuencias encontradas para la familia Rhagovellia, debido a la falta de información disponible en el GENBANK, por lo cual fue agrupado con estos organismos más cercanos. Para el grupo cuarto se obtuvo una filogenia más precisa relacionando al orden Hemíptera, agrupando a la familia Dysticidae con la Familia Gerridae, así como también en la agrupación del grupo tres para la clase Arachnida, sin embargo este tipo de estudios permite establecer un panorama más amplio adentro de la investigación taxonómica molecular, debido a que permite una la identificación taxonómica más precisa, en base a su características genotípicas de cada individuo, generando con esto información altamente confiable para el estudio de los marcadores moleculares más apropiados que permitan el análisis de manera más rápida. Literatura Citada Alvarez, F. and Villalobos, J. L Two new species and one new combination of freshwater crabs from Mexico (Crustacea: Brachyura: Pseudothelphusidae). Proceedings of the Biological Societyof Washington, Lawrence. 107(4): Borror, D. J, Triplehorn, C. A. and Johnson N. F An Introduction to the Study of Insects, Sixth Edition. Saunders College Publishing, New York, Pp García, G. A Las cuevas de México: pasado presente y... futuro? Laboratorio de Ecología y Sistemática de Microartrópodos. Departamento de Ecología y Recursos Naturales. Facultad de Ciencias, UNAM. Hoffmann, A. Palacios V. J. G. y Morales, M. J. B Manual de bioespeleología con nuevas aportaciones de Morelos y Guerrero. Dr. Gral. UNAM. México. PP 274. Hoffmann, A., López, C M. G. y Vásquez, M. I. M Los artrópodos de las cavernas de México. Biodiversidad, taxonomía y biogeografía de artrópodos de México. Universidad Nacional Autónoma de México. México. Pp INEGI, Carta Geológica Chilpansingo, Guerrero. (Escala: 1:5,000,). Leopold, A. S Fauna Silvestre de México: Aves y Mamíferos de Caza en México, 2ª Ed. Instituto Mexicano de Recursos Naturales Renovables, México. Miranda, F. y Hernández, X Los tipos de vegetación de México y su Clasificación. Boletín de la Sociedad Botánica de México. Pp 28: Needham, J. y Westfall Jr, M A Manual of the dragonflies of North America (Anisoptera).University of California, Berkeley. Pp 615 SEMARNAT Atlas Forestal de México. Secretaría de Medio Ambiente Recursos Naturales y Pesca. Universidad Autónoma Chapingo. México, DF. PP Usinger, R Aquatic Insects of California. University of California Press. Berkeley and Los Angeles. Pp Westfall, Jr., M. y. May, M. L Damselflies of North America. Ed. Scienti Publishers. E.U.A. Pp