Revista Granma Ciencia. Vol. 18, no. 2 mayo - agosto 2014 ISSN X

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1 Título: Producción y calidad de Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1 en el CREE Ciro Redondo, Ciego de Ávila, Cuba. Title: Production and quality of Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Strain CH1 in CREE Ciro Redondo, Ciego de Avila, Cuba. Autores: Danay Rodríguez - Ramos 1. Jacqueline Pereira - Viamonte 2. Nury Pérez - Valdés 1. Instituciones: 1 Centro de Investigaciones de Bioalimentos (CIBA). Carretera a Patria Km 1 y ½.Carlos Leens. Morón. Ciego de Ávila. Cuba. 2 Centro de Reproducción de Entomófagos y entomopatógenos. especialistaambiental3@cibacav.cu 1 especialistazootecnia2@cibacav.cu 1 RESUMEN La investigación se desarrolló en el Centro Reproductor de Entomófagos y Entomopatógenos (CREE) Ciro Redondo, perteneciente a la provincia de Ciego de Ávila, con el objetivo de determinar la influencia del tamaño de las larvas del hospedante Galleria mellonella (L.) en la producción y calidad de Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1. Para esto se determinó el porcentaje de infestación, la concentración de infectivos juveniles de Galleria mellonella (L.) en la etapa de inoculación por Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1 en las variantes: larvas grandes, larvas medianas y larvas pequeñas, así como la viabilidad de los infectivos juveniles. Se utilizó la metodología para la Reproducción de Nemátodos Entomopatógenos. El porcentaje de infestación fue el máximo en las variantes utilizadas del hospedante en la etapa de inoculación por Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1, obteniéndose la mayor concentración de infectivos juveniles y el mayor porcentaje de viabilidad en la variante larvas grandes. Palabras claves: Heterorhabditis bacteriophora, Galleria mellonella, calidad. producción, ABSTRACT The research was developed at the Center and Entomopathogens Entomophages Player (CREE) Ciro Redondo, belonging to Ciego de Avila province, in order to determine the influence of the size of host larvae Galleria mellonella (L.) in production and quality Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Strain CH1. For this, percentage of infestation was determined, young infective concentration of Galleria mellonella (L.) in inoculation stage by Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) CH1 strain in variants: large larvae, medium larvae and small larvae as such as the viability of young infectives. Entomopathogenic Nematode reproduction methodology was used. Infestation percentage was the highest in variants used of host in inoculation stage of

2 Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Strain CH1, getting the highest concentration of young infective larvae and variant large and and the highest percentage of viability in large larvae. Keywords: Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis bacteriophora, production, quality INTRODUCCIÓN La necesidad de incrementar la producción de alimentos para suplir los requerimientos mínimos de la población y a la vez elevar la calidad de la alimentación animal es imperiosa debido a que existen muchos cultivos que su consumo no solo se destinan al hombre sino también a diferentes especies de animales. Utilizándose también en ocasiones residuos de cosechas de estos productos las cuales es necesario se obtengan con la mayor calidad e inocuidad posible. Los controles biológicos han sido usados por el hombre desde tiempos inmemoriales para reducir las pérdidas en los cultivos que provocan los insectos. Un papel muy importante juegan específicamente los nematodos entomopatógenos por las ventajas que ofrecen dentro de estas vías de control. En el manejo de plagas en la agricultura sostenible se hace necesario desarrollar métodos de lucha compatible con el ambiente. Durante los últimos 25 años, el interés en esta técnica se incrementó grandemente a causa de los serios problemas de contaminación ambiental y daños a la salud humana que provoca el uso de los plaguicidas sintéticos (Vázquez et al., 2006). La utilización de entomófagos en Cuba atraviesa un déficit en la producción que influye en las insatisfacciones de las demandas cada vez más crecientes de artrópodos benéficos por no producirse en las cantidades necesarias, con la diversidad requerida y avaladas con un control de la calidad efectivo. El nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa HC1 en estudios realizados ofrece las mayores potencialidades como agente de control biológico con demostrada patogenicidad sobre insectos de los órdenes Lepidóptera, Homóptera, Coleóptera e Himenóptera, su alto potencial reproductivo, infestividad, capacidad de búsqueda y penetración (Sánchez, 2002). Se destacan, entre las plagas pertenecientes a estos órdenes y que pueden ser reguladas por Heterorhabditis el género Phyllophaga la cual ha causado daños de consideración en diferentes cultivos, el maíz (Zea mays L.), papa (Solanum tuberosum L.), caña de azúcar (Saccharum officinarum L.), pastos y vegetales (Pardo et al., 2005). Igualmente el caso de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), palomilla del maíz la cual causa graves daños a este cultivo. Así como Cylas formicarus (tetuán) que afecta a los tubérculos del boniato. MATERIALES Y MÉTODOS El presente trabajo se realizó en el Centro Reproductor de Entomófagos y Entomopatógenos (CREE) Ciro Redondo, perteneciente a la UEB Atención a Productores Cañeros de la Empresa Azucarera Ciego de Ávila. Ubicado en el Km. 1

3 carretera Villa-1 ro de Enero, en el municipio Ciro Redondo, provincia Ciego de Ávila, en los años ( ) en el departamento destinado a la cría del entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1, con una temperatura (28±1 o C) y una humedad relativa de (70±5%). Para la reproducción de H. bacteriophora, así como para el establecimiento de sus controles de calidad y efectividad técnica se utilizó la Metodología para la Reproducción de Nematodos Entomopatógenos establecida por (Sánchez et al., 2007). Se utilizó como hospedante de sustitución larvas de Galleria mellonella (L.) En el diseño de la investigación se utilizaron las siguientes variantes: Variante 1: Larva de Galleria mellonella (L.) con tamaño de ( 18 mm) (larvas grandes). Variante 2: Larva de Galleria mellonella (L.) tamaño de (> 13 y < 18 mm) (Larvas medianas). Variante 3: Larva de Galleria mellonella (L.) tamaño de 13 mm (Larvas pequeñas). Se realizó una selección de 5 larvas de Galleria mellonella (L.) con 5 repeticiones por cada variante (grande, mediana y pequeña), las orugas previamente desinfectadas con agua destilada se colocaron en placas de Petri, con papel de filtro humedecido previamente con 1 ml de una solución con nematodoss Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa HC1 a una concentración de 10 6 ij/ (Sánchez et al., 2007). Porcentaje de infestación de Galleria mellonella (L.) por Heterorharditis bacteriphora (Poinar). A las 48 horas después de realizada la inoculación se contaron las larvas que fueron infectadas (muertas por nematodos), estas se pudieron reconocer por la coloración rojiza que toman las larvas al estar infectadas con la bacteria Photorhabdus luminescens (Akhurst), lo mismo se realizó en cada variante y se determinó el porcentaje de infestación (Sánchez et al., 2007). Concentración de infectivos juveniles de Heterorharditis bacteriphora (Poinar) en el hospedante Galleria mellonella (L.). A los diez días las larvas muertas se pusieron en trampas de agua, dichas trampas se construyeron con placas de Petri invertidas y sobre estas se colocó un disco de papel de filtro que excedió en algo el tamaño de la placa dentro de otras más grandes, vertiendo agua destilada sobre estas últimas, de forma tal que alcanzara solo los bordes del papel de filtro, después se colocaron en cada una de ellas y de forma independiente las larvas por variante, luego de tres días cuando ya habían destilado todas al gradiente de humedad, se procedió a contar la cantidad de individuos contenidos en cada una. Porcentaje de viabilidad de Heterorharditis bacteriphora (Poinar). Para la determinación del porcentaje de viabilidad se tomó una muestra de 1 ml con la solución de nematodos provenientes de la destilación de cada variante después de agitar, para lograr la homogeneidad de la misma se observó en el microscopio, se

4 contaron los nematodos vivos dividiéndolos entre el total contenido en la muestra según (Sánchez et al., 2007). Tratamiento estadístico: Se empleó el utilitario SPSS, versión 17.0 para Windows, las diferencias entre las medias se determinaron mediante análisis de varianza simple y pruebas de Tukey. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Algunas especies de nematodos se encuentran asociadas a insectos, en relaciones que van desde fortuitas hasta parasíticas. Estas últimas, pueden ocasionar diferentes efectos deletéreos sobre sus hospederos, que pueden ir desde reducción en la fecundidad, esterilidad y longevidad, disminución en la actividad, retraso en el desarrollo, cambios fisiológicos, morfológicos, de comportamiento y hasta la muerte (Bustillo, 1989, citado en Gómez 2008). Los nematodos entomopatógenos sirven como vectores de bacterias patogénicas mostrando un alto potencial en el control biológico de plagas que se desarrollan en el suelo. Son similares a los parasitoides debido a que sus estados inmaduros se desarrollan a expensas de un hospedero individual y provocan la muerte (Sánchez y Rodríguez, 2007). Al analizar el porcentaje de infestación se puede apreciar que no existen diferencias entre las variantes evaluadas, debido a que en todas se comportó dicho parámetro de igual forma, coincidiendo con Moreno (2012) y Medina et al., (2005), quienes al evaluar la mortalidad de las larvas de Galleria mellonella (L.) expuestas a la preparación inicial utilizada en el experimento, se pudo observar que a las 48h se alcanzó una mortalidad del 100%. Resultados similares obtuvo Vergara (1997), el cual en condiciones de laboratorio apreció una coloración característica rojiza que se produce en las larvas al ser infestadas con la bacteria Photorhabdus luminenscens (Akhurst.). Las larvas parasitadas al ser trasladadas a la placa para la destilación de los nematodos mostraron, luego de 10 días, la salida de los juveniles infectivos obtenidos. Pozo et al. (2006) exponen que especies pertenecientes a los géneros Cyclocephalla y Phyllophaga mostraron altos porcentajes de mortalidad al ser infestados con cepas de nematodos entomopatógenos CIAP-DEY-6 y CIAP-DEY-7 del género Heterorhabditis en un tiempo menor de 72 horas.

5 Figura 1. Larvas de Galleria mellonella (L.) parasitadas por Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1. Por su parte Salas (2002) y Marineide et al., (2004), coinciden al plantear que estos biorreguladores causan la muerte al organismo entre las 24 y 48 horas en todo su amplio rango de hospedantes, además de tener la capacidad de mantener su actividad después de 12 meses almacenado en condiciones favorables. Según Gerritsen (1997), los nematodos del género Steirnema y del género Heterorhabditis y las bacterias del género Xenorhabdus trabajan juntos en la muerte de un insecto hospedante y su utilización como fuente de alimento. Los estados infectivos del nematodo buscan un insecto hospedante, lo penetran, se mueven dentro de su cuerpo y trasladan la bacteria que llevan en el lúmen intestinal. La bacteria comienza la multiplicación y mata al hospedante, suministrada por los productos de la excreción del nematodo. Los nematodos en el cuerpo del insecto maduran, producen la progenie, la cual emerge del cadáver del insecto como juveniles infectivos, portando la bacteria y estos van a la búsqueda de un nuevo hospedante. Los resultados relacionados con la influencia del tamaño de la larva del hospedante en la concentración de infectivos juveniles se pueden apreciar en la Figura 2. En la misma se observa que existen diferencias en las variantes utilizadas, donde el valor más alto de la concentración de infectivos juveniles se obtiene en la variante (Grandes) con un valor de i/ GP, el valor más bajo se observa en la variante (Pequeñas) con I/j GP, y el valor medio se observa en la variante (Mediana) con I/j GP.

6 *Medias con letras desiguales difieren según Tukey (p 0.05) Figura 2. Concentración de infectivos juveniles en las variantes utilizadas Resultados similares logró Rosales (2008), el cual plantea que la cantidad y calidad de los nematodos contenidos en el hospedante depende en gran medida del tamaño y calidad de los mismos, por lo que es necesario tener presente que la alimentación para la cría del hospedante sea la adecuada ya que al obtener Gallerias de mayor tamaño podremos obtener una mayor producción de este biorregulador. Por su parte Pereira (2012) al analizar el efecto de la cantidad de individuos de Tetrastichus howardi (Olliff) en relación al tamaño de Galleria mellonella (L.), siendo este último el mismo hospedante que se utilizó en la investigación, obtuvo diferencias significativas alcanzando la mayor cantidad de individuos en la crisálida de mayor tamaño (15,1-20mm), y sus valores se encontraron entre 334 y 343 individuos. Medina et al, (2005) evaluaron la patogenicidad del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora pero en larvas de picudo negro (Cosmopolites sordidus) a nivel de laboratorio. Para ello, implementaron la cría de Spodoptera frugiperda y Galleria mellonella para la reproducción de este nematodo obteniendo esta última la mayor cantidad de infectivos juveniles de nematodos individuos en promedio a una temperatura de ºC y una humedad relativa de 71 %. Porcentaje de viabilidad de Heterorharditis bacteriphora (Poinar). En la figura 2 se muestra el porcentaje de viabilidad donde se puede observar que existe diferencia significativa entre las variantes grandes y pequeñas, pero no así de estas con las medianas, donde el valor más alto del porcentaje se encuentra en la variante (Grande) con 95.4%, el valor más bajo se observa en la variante (Pequeña) con un valor de 92.2%, y el valor medio está dado en la variante (mediana) con un valor de 94.7% de viabilidad. Estos resultados coinciden con Sánchez et al., (2007), donde el autor refiere que para que el nematodo mantenga su calidad el porcentaje de viabilidad debe estar por encima de un 91 %, resultados similares obtuvo (Moreno, 2012).

7 *Medias con letras desiguales difieren según Tukey (p 0.05) Figura 3. Porcentaje de viabilidad en las variantes utilizadas. Resultados mayores alcanzó Sánchez y Rodríguez (2008) al obtener en ensayo de viabilidad en placas Petri de juveniles infectivos de H. bacteriophora HC1 entre un 97 y 98% además este autor comprobó que estos organismos son capaces de sobrevivir al menos 36 h en solución de Endosulfan, valores estadísticamente similares a los obtenidos en agua destilada. Koppenhofer y Grewal (2005), en su revisión de este tema, refirieron que los nematodos entomopatógenos (JI) pueden tolerar exposiciones de corto tiempo (2 a 24 horas) a insecticidas químicos y biológicos, así como a fungicidas, herbicidas, fertilizantes y reguladores del crecimiento, y que pueden ser incluso mezclados en el mismo tanque y aplicados juntos, como una alternativa para disminuir los costos por concepto de aplicaciones, lo que facilitará el uso de los nematodos en el MIP o MAP. Según estos resultados las Gallerias de tamaño grande son las que mejores efectos arrojan y utilizando las mismas podremos obtener mayores volúmenes de producción dándole solución a nuestro problema. CONCLUSIONES Se obtuvo un 100% de infestación en las variantes utilizadas del hospedante Galleria mellonella (L.) en la etapa de inoculación por Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1. La mayor concentración de infectivos juveniles se alcanzó en la variante 1 (grande) con un valor de i/j GP. La variante 1 (Grande) alcanzó el mayor porcentaje de viabilidad con un 95.4%. BIBLIOGRAFÍA Gerritsen, L.J. (1997). Symbiotic interaction between the bacterium Photorhabdus luminiscens and the entomopathogenic nematode Heterorhabditis. 120 pp. Gómez, A. (2008). Evaluación del efecto de Heterorhabditis spp, (Heterorhabditidae) en combinación con Metarhizium anisopliae, (Moniliales, Moniliaceae) sobre

8 chinche salivosa Aeneolamia postica (Homoptera, Cercopidae) en caña de azúcar Saccharum officinarum (Poaceae) en Siquinalá, Escuintla. Koppenhofer, A. M, Grewal, P. S. (2005). Compatibility and interactions with agrochemicals and other biocontrol agents Marineide, M., Aguillera, R., Rodríguez, & Devitte, C. M. (2004). Steinernema glaseri Santa Rosa strain (Rhabditida: Steinernematidae) and Heterorhabditis bacteriophora CCA Strain (Rhabditida: Heterorhabditidae) as biological control agents of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Parasitol Res, 94, Medina R., Salcedo G. y Tapia, E. (2005). Evaluación de la patogenicidad del nematodo Heterorhabditis bacteriophora en larvas de Cosmopolites sordidus. Universidad de Guayaquil, Instituto Tecnológico Agropecuario de Vinces. Ecuador. Moreno, M. M. (2012). Análisis de susceptibilidad de la gallina ciega ante Heterorhabditis bacteriophora (Poinar.) Cepa CH1. Tesis presentada en opción al título de Ingeniero Agrónomo. Universidad de Ciego de Ávila. Pardo, L., Montoya, J., Schoonhoven, A. & Belloti, C. (2005). Structure and composition of the white grub complex (Coleóptera: Scarabaeidae) in agroecological systems of northern Cauca, Colombia. Florida Entomol, 88(4), Pereira, J. (2012). Influencia del tamaño del hospedero Galleria mellonella (L.) en la producción y calidad de Tetrastichus howardi (Olliff). Tesis presentada en opción al título de Ingeniero Agrónomo. Universidad de Ciego de Ávila. Pozo, E., Sisne, M. L., Rodríguez, U., González, G. y Valdés, R. (2006). Susceptibilidad de escarabajos (Coleoptera; Scarabaeidae) presentes en la Piña Ananas comosus (L.) Merril en Ciego de Ávila a nematodos entomopatógenos. Parte II. Géneros Phyllophaga y Cyclocephala. Centro Agrícola. 33(3), Rosales, L. Suárez, Z. y Navas, R. (2008). Nematodos Entomopatógenos: II. Uso en control biológico. FONAIAP Divulga. No.64. Disponible en: Salas, L. (2002). Distribución natural de nematodos entomopatógenos (Nematodo: Steinernematidae y Heterorhabditidae) en sistemas agroecológicos de Zacatecas. Tesis presentada en opción al título de Doctor en Ciencias, Tecomán, Colima México. Sánchez, L. y Rodríguez, M. G. (2008). Potencialidades de Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa HC1 para el manejo de Hypothenemus hampei (Ferr. II). Compatibilidad con Beauveria bassiana (BALSAMO) Vuillemin y Endosulfan. Revista Protección Vegetal, 23(2), Sánchez, L. (2002). Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) Cepa CH1. Estrategia de desarrollo como agente de control biológico de plagas insectiles. Tesis en opción

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