CURSO MICROSCOPÍA ÓPTICA Y LÁSER CONFOCAL SSTTI UA Octubre 2011 PRÁCTICA CON EL MICROSCOPIO CONFOCAL ESPECTRAL LEICA - TCS SP2

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1 CURSO MICROSCOPÍA ÓPTICA Y LÁSER CONFOCAL SSTTI UA Octubre 2011 PRÁCTICA CON EL MICROSCOPIO CONFOCAL ESPECTRAL LEICA - TCS SP2 1

2 1. ARRANQUE DEL SISTEMA PANEL DE CONTROL Llave de encendido del láser de Ar (458, 476, 488, 514 nm) Llave de encendido del láser de He/Ne (543 nm) Llave de encendido del láser de He/Ne (633 nm) Botón de nivel del láser de Ar Láser de Ar Scanner Encendido del PC SECUENCIA DE ENCENDIDO 1. Encender el botón rojo PC del panel de control. 2. Encender el microscopio óptico. 3. Encender la lámpara de fluorescencia de su fuente de alimentación. 4. Encender el botón rojo LASER del panel de control. 5. Encender, asegurándose de que el botón de nivel esté al mínimo!, el láser de Ar con la llave del panel de control. 6. Encender el botón rojo SCANNER del panel de control. 7. Entrar con el perfil TCS-user 8. Ejecutar la aplicación LEICA CONFOCAL SOFTWARE pinchando en el icono: 2

3 9. Seleccionar el perfil Personal y pulsar Start 10. Encender el/los otros láser que se vayan a utilizar con la llave del panel de control. 11. Si se va a utilizar el diodo de 405 nm, encender el botón y después la llave: 12. Subir el botón de nivel del láser de Ar hasta una posición entre las 10 y las 11 de un reloj. 13. Ajustar el microscopio óptico para la observación que se vaya a realizar. (Ver su manual correspondiente si es necesario). 3

4 2. ADQUISICIÓN DE LA IMAGEN CONFIGURACIÓN DE LA ADQUISICIÓN Pulsar el botón que abre el sistema de adquisición: Seleccionar una de las configuraciones preestablecidas de la ventana superior derecha. 1. FORMATO DE LA IMAGEN: Seleccionar el formato de barrido con el botón Format. Para los ajuste iniciales el formato 512 x 512 permite un barrido rápido, es decir, la respuesta en la pantalla se ve de forma inmediata. Sin embargo, para la adquisición de la imagen es preferible el formato 1024 x

5 2. POTENCIA DEL LÁSER: Ajustar la potencia del láser. El 50% es un buen comienzo. 3. BANDA DE RECOGIDA DE LA SEÑAL EMITIDA: Comprobar que la banda de recogida del fotomultiplicador es la adecuada al fluorocromo que se está utilizando. Si es necesario, se ajusta haciendo doble clic sobre la barra indicada en la imagen inferior: 4. PINHOLE: Ajustar el diámetro del pinhole a la posición Airy 1 pulsando sobre el icono 5

6 5. BARRIDO CONTINUO: Pulsar el botón Continuous y dará comienzo la adquisición. Ahora se pueden optimizar los parámetros de captura mediante la consola de mando: La asignación de las funciones de los botones de esta consola aparecen en la parte inferior de la pantalla del programa. 6. AJUSTE DE LA POSICIÓN Z ÓPTIMA: Con el botón de la derecha de la consola de mando se ajusta la altura Z de la muestra donde se va a adquirir la imagen. Si se pulsa con el botón derecho del ratón sobre la casilla Z position se puede ajustar la sensibilidad del botón. Es aconsejable poner 1 µm por vuelta. 6

7 7. AJUSTE DE LA GANANCIA DEL FOTOMULTIPLICADOR: Pulsar sobre la imagen que se vaya optimizar en el monitor de la derecha de forma que aparezca una línea punteada alrededor de la imagen, lo cual significa que los ajustes que se hagan afectarán a ese canal. En la pantalla de la derecha pulsar sobre el botón Q LUT para que la imagen aparezca en una escala de colores anaranjados cuyo máximo será el azul y el mínimo el verde. Ajustar la ganancia del fotomultiplicador girando la primera rueda de la izquierda de la consola de mandos Smart Gain de forma que la imagen aparezca con unos pocos puntos azules. Ajustar a continuación el offset del fotomultiplicador girando la segunda rueda de la izquierda de la consola de mandos Smart Offset de forma que la imagen aparezca con unos pocos puntos verdes. De este modo se aprovecha todo el rango dinámico de niveles de gris de la imagen y se evita que haya puntos que aparezcan saturados. Este ajuste se debe realizar para todos los canales que se estén usando. Una vez hecho esto se vuelve a pulsar el botón Q LUT y la imagen aparecerá en escala de grises y si se pulsa de nuevo el mismo botón aparecerá en el color seleccionado para su adquisición. 7

8 CAPTURA DE UNA IMAGEN INDIVIDUAL Se pulsa de nuevo el botón Continuous en el que ahora aparecerá la palabra STOP para detener la adquisición. Se pulsa el botón Single Scan adquiriendo así una imagen individual. Se selecciona la opción de menú File Save as... para guardar los datos. CAPTURA DE UNA SERIE DE IMÁGENES Se inicia la adquisición en modo de barrido continuo según el punto 5 de la configuración de la adquisición. Se selecciona el plano Z de la imagen donde la emisión sea máxima, según el punto 6 de la configuración de la adquisición. Una vez localizado el plano se ajustan la ganacia y el offset en ese plano según se indica en el punto 7 de la configuración de la adquisición. Se pulsa el botón Series en serie. y se abre el cuadro de diálogo de la adquisición Se gira el botón Z Position de la consola de mandos (el de la derecha) hasta alcanzar el plano donde se quiere comenzar la serie y se pulsa 8

9 Se gira el mismo botón Z Position de la consola de mandos (el de la derecha) en sentido contrario hasta alcanzar el plano donde se quiere terminar la serie y se pulsa Queda definido de este modo el grosor de la serie que se va a adquirir. Se comprueba el número de secciones pulsando el botón Aparecerá indicado el número óptimo de secciones para alcanzar la máxima resolución en Z. Si se quiere adquirir un número menor de secciones se selecciona de la lista o se pulsa en Others... Se pulsa de nuevo el botón Continuous en el que ahora aparecerá la palabra STOP para detener la adquisición. Se pulsa el botón Series adquiriendo así la serie de imágenes configurada. Se selecciona la opción de menú File Save as... para guardar los datos. 9

10 3. VISUALIZACIÓN DE LA IMAGEN Se pulsa la pestaña View para acceder al menú de visualización de datos. Se selecciona el tipo de proyección deseada: Máxima, Media o Transparente. 4. CONTROL DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Cuando se desee visualizar la muestra en el microscopio óptico se debe pulsar el botón Microscope control y seleccionar la opción Visual. Cuando se quiera volver a la adquisición con el software confocal se pulsa el mismo botón y se selecciona Scan. No es posible la observación en pantalla y a través del ocular al mismo tiempo. También es posible cambiar de objetivo desde el software del microscopio confocal con el botón Objectives 10

11 5. SECUENCIA DE APAGADO Una vez terminado el trabajo se deben guardar todos los datos y proceder con la secuencia de apagado siempre que se compruebe que ningún usuario va a utilizar el microscopio en las siguientes 3 horas. 1. Bajar el nivel del láser de Ar al mínimo con el botón del panel de control. 2. Apagar con las llaves respectivas los láser que haya encendidos. 3. Apagar el botón rojo SCANNER del panel de control. 4. Cerrar al aplicación y salir de Windows. 5. Apagar el botón rojo PC del panel de control. 6. Apagar la lámpara de fluorescencia y el microscopio. 7. Esperar 15 minutos antes de apagar el botón rojo LASER del panel de control. 8. LIMPIAR LOS OBJETIVOS!! 9. Poner la funda del microscopio cuidando de que no se queme con el calor de la lámpara de fluorescencia. 11