TOP2A IQFISH pharmdx. Nº de catálogo K ª edición. Para uso en diagnóstico in vitro El kit contiene reactivos suficientes para 20 pruebas.

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1 / TOP2A IQFISH pharmdx Nº de catálogo K5733 3ª edición Para uso en diagnóstico in vitro El kit contiene reactivos suficientes para 20 pruebas. P04092ES_02/K p. 1/40

2 Índice Página Uso previsto... 3 Resumen y explicación... 3 Principio del procedimiento... 4 Reactivos... 4 Material suministrado... 4 Material necesario pero no suministrado... 6 Precauciones... 6 Almacenamiento... 9 Preparación de las muestras... 9 Cortes incluidos en parafina... 9 INSTRUCCIONES DE USO A. Preparación de los reactivos A.1 Solución de pretratamiento A.2 Tampón de lavado astringente A.3 Tampón de lavado A.4 Diluciones de etanol A.5. Solución de pepsina B. Procedimiento de tinción B.1 Notas sobre el procedimiento B.2 Tratamiento de los tejidos antes de la tinción B.3 Protocolo de tinción Control de calidad Interpretación de la tinción Limitaciones Limitaciones generales Características de resultados Sensibilidad analítica Especificidad analítica Estudios de robustez Repetibilidad Reproducibilidad Utilidad clínica Estudio piloto Estudio de confirmación - DBCG 89D/TOP2A Diseño del estudio Metodología estadística Resultados Discusión y conclusión Solución de problemas Apéndice Apéndice Apéndice Referencias Explicación de símbolos P04092ES_02/K p. 2/40

3 Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro. TOP2A IQFISH pharmdx se ha diseñado para detectar amplificaciones y eliminaciones (cambios en el número de copias) del gen TOP2A usando la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en muestras de tejido de cáncer de mama humano fijadas en formol e incluidas en parafina. Las eliminaciones y amplificaciones del gen TOP2A sirven como marcador de un pronóstico deficiente en pacientes con alto riesgo de cáncer de mama. La amplificación del gen TOP2A detectada por el ensayo TOP2A IQFISH pharmdx, además, también está indicada como ayuda en predicción de la supervivencia sin recurrencia en pacientes con alto riesgo de cáncer de mama tratados con quimioterapia coadyuvante con epirubicina. Los resultados del ensayo TOP2A IQFISH pharmdx están destinados a su uso como complemento a la información clínica y patológica existente. Resumen y explicación El gen TOP2A gene codifica la enzima topoisomerasa IIα (topo IIα), que cataliza la ruptura y la reunión del ADN bicatenario, lo que produce la relajación del ADN superenrollado. Las topoisomerasas de tipo II son enzimas esenciales que interconvierten formas topológicas de ADN provocando rupturas transitorias bicatenarias en el soporte principal del ADN (1). Estas enzimas juegan papeles importantes en procesos fundamentales del núcleo (2), incluyendo la replicación del ADN, la transcripción, la estructura cromosómica, la condensación y la segregación (3). El gen de la topoisomerasa IIα, TOP2A, está presente en 2 copias en todas las células diploides normales y se localiza en el cromosoma 17q21 (4). El gen TOP2A abarca un área de aproximadamente 27,5 kb y contiene 35 exones que codifican una proteína 170 kda (5). La proteína topo IIα está reconocida como marcador de proliferación, y la expresión de topo IIα varía en función del ciclo celular, tanto en células normales como cancerosas (6). La expresión de topo IIα en tumores de mama se correlaciona con la expresión de Ki-67 (7-10). No se ha encontrado una relación simple para topo IIα al nivel de la proteína y el gen (7, 9, 10). Solo el 20% de los casos de proteína topo IIα sobreexpresada presentan amplificación del gen TOP2A, pero entre los casos de gen TOP2A amplificado, el 93% presentaron sobreexpresión de la proteína topo IIα (11). La sobreexpresión de Topo IIα parece estár compuesta de varios factores que contribuyen, tanto la amplificación específica del cáncer como la elevada tasa de proliferación celular. Las proteínas Ki-67 y topo IIα se expresan en paralelo, lo que puede interpretarse como una confirmación de la influencia de la tasa de proliferación celular en la expresión de topo IIα, incluso en casos con amplificación de TOP2A (12). Las topoisomerasas de tipo II son dianas de antraciclinas como doxorubicina y epirubicina, denominadas también inhibidores de la topoisomerasa (13-15). El estado de HER2 como marcador predictivo para las antraciclinas es un tema controvertido, y se ha señalado la ausencia de un fundamento biológico en esta relación. Además, se discute si HER2 debe contemplarse como un marcador sustituto o pseudomarcador para la auténtoca diana de la antraciclina, la topoisomerasa II (16-18). Se ha observado que el número de copias de TOP2A influye en la sensibilidad del tumor a los inhibidores de la topoisomerasa (16-28). La eficacia en el ámbito clínico del kit Dako TOP2A FISH pharmdx ha sido investigada en dos estudios realizados por el Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) en Copenhague (21, 29, 30). Los estudios más recientes (21, 30) indican una amplificación del gen TOP2A en P04092ES_02/K p. 3/40

4 aproximadamente el 10% de los cánceres de mama y eliminaciones con la misma frecuencia cuando se incluyen en los estudios tanto tumores positivos como negativos a HER2. Inicialmente, se supuso que los anormales números de copias del gen TOP2A, como resultado de la amplificación o de la eliminación, se limitaban a tumores de HER2 amplificado (16, 31). Más recientemente, se han detectado cambios en el número de copias del gen TOP2A en muestras de tumores con un estado normal del gen HER2 (21, 23, 29, 30, 32, 33). En el estudio DBCG, los cambios en TOP2A se encontraron en casi el 60% de los tumores de mama primarios de HER2 amplificado, mientras que un 20% de los tumores anormales de TOP2A presentaban un estado normal de HER2 (21, 23, 29, 30, 32). El estudio se ha visto confirmado por otro estudio canadiense que muestra que el estado del gen TOP2A (amplificación o eliminación) es un factor predictivo significativo del beneficio del tratamiento con quimioterapia con epirubicina (23). Aproximadamente un 35% de los pacientes de este estudio presentaban tumores de HER2 amplificado y una asociación estadísticamente significativa con el estado de HER2 y con las aberraciones de TOP2A (23, 34). La gran mayoría de estudios de las aberraciones del gen TOP2A son coherentes respecto al valor predictivo del análisis de TOP2A (21-25, 30), lo que contrasta con los resultados, más conflictivos, de la prueba con HER2 (35). Aunque los genes HER2 y TOP2A se localizan en el mismo amplicón y algunos estudios se han centrado en la coamplificación de los genes (22, 24, 25), el estudio DBCG 89D y otros han mostrado que los genes deben contemplarse de manera independiente y analizarse por separado (10, 20, 21, 26-30). Principio del procedimiento TOP2A IQFISH pharmdx contiene todos los reactivos clave necesarios para llevar a cabo un procedimiento FISH con cortes de tejido incluidos en parafina y fijados en formol procesados de forma rutinaria. Después del desparafinado y la rehidratación, las muestras se calientan en una solución de pretratamiento, seguido de la digestión proteolítica usando pepsina. Después del calentamiento y el pretratamiento proteolítico, este kit emplea una mezcla de sondas FISH, lista para su uso y no tóxica, basada una combinación de tecnologías de ANP (ácido nucléico peptídico) (36) y ADN. Esta mezcla de sondas consiste en una mezcla de clones cósmidos de ADN marcados con Texas Red que cubren un total de 228 kb del amplicón de TOP2A, y una mezcla de sondas ANP marcadas con fluoresceína dirigidas a la región centromérica del cromosoma 17. La hibridación específica a las dos dianas produce la formación de una señal roja fluorescente distintiva en cada amplicón de TOP2A, y una señal verde fluorescente distintiva en cada región centromérica del cromosoma 17. Tras un lavado astringente, las muestras se montan con un medio de montaje fluorescente que contiene DAPI y se cubre con un portaobjetos. Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros apropiados (véase el Apéndice 3). Las células cancerosas se localizan y luego se evalúan respecto a la proporción de la señal TOP2A/CEN-17. Las células normales presentes en el corte de tejido analizado sirven como control positivo interno de la eficacia del pretratamiento y de la hibridación. Consulte la Sección Interpretación de la tinción para obtener información detallada al respecto. TOP2A IQFISH pharmdx, nº de catálogo K5733, se aplica a la tinción manual. Reactivos Material suministrado Los materiales enumerados a continuación son suficientes para 20 pruebas (una prueba se define como una área diana de 22 mm x 22 mm). El número de pruebas se basa en el uso de 250 µl por portaobjetos del Vial 2A (5 8 gotas), 10 µl por portaobjetos del Vial 3 y 15 µl por portaobjetos del Vial 5. Las soluciones del Vial 3 y del Vial 5 son viscosas y es posible que haya que centrifugarlas brevemente en una microcentrifugadora para poder recoger todo el reactivo proporcionado. P04092ES_02/K p. 4/40

5 El kit proporciona suficientes materiales para 10 ciclos de tinción individuales (cuatro ciclos separados si se usa el método de inmersión en pepsina). TOP2A IQFISH pharmdx se suministra en hielo seco. Los componentes del kit no se han expuesto a altas temperaturas durante el transporte siempre que todavía haya hielo seco cuando usted reciba el kit. Si algunos componentes del kit permanecen sin congelar, esto no afecta a la eficacia de TOP2A IQFISH pharmdx. Vial 1 Vial 2A Vial 2B Vial 3 Vial 4 Vial 5 Vial 6 Solución de pretratamiento (20x) 150 ml, concentrado 20x Tampón MES (ácido 2-[N-morfolin]etanosulfónico). Pepsina 4 x 6,0 ml, listo para su uso La solución de pepsina, ph 2,0, contiene un estabilizante y un agente antimicrobiano. Diluyente de pepsina (10x) 24 ml, concentrado 10x Búfer de dilución, ph 2,0, contiene un agente antimicrobiano. Mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH 0,2 ml, listo para su uso Mezcla de sondas de ADN de TOP2A marcadas con Texas Red y sondas de ANP CEN-17 marcadas con fluoresceína; suministradas en tampón de hibridación IQISH. Tampón de lavado astringente (20x) 150 ml, concentrado 20x Tampón SSC (solución salina con citrato sódico) con detergente (Tween-20). Medio de montaje fluorescente 0,4 ml, listo para su uso Medio de montaje fluorescente con 500 µg/l de DAPI (4,6-diamidina-2-fenilindol). Tampón de lavado (20x) 500 ml, concentrado 20x Tampón Tris/HCl. Sellador de cubreobjetos 1 tubo, listo para su uso Solución para el sellado eliminable de cubreobjetos. NOTA: Los siguientes reactivos del kit: la solución de pretratamiento (20x), pepsina, diluyente de pepsina (10x), tampón de lavado astringente (20x), medio de montaje fluorescente, tampón de lavado (20x) y sellador de cubreobjetos son intercambiables con los reactivos correspondientes del Dako Histology FISH Accessory Kit, nº de catálogo K5799. P04092ES_02/K p. 5/40

6 Material necesario pero no suministrado Reactivos de laboratorio Agua destilada o desionizada Etanol, 96% Xileno o sustitutos de xileno Equipo de laboratorio Paños absorbentes Pipetas regulables. Termómetro calibrado, de inmersión parcial (intervalo C) Termómetro de superficie calibrado (intervalo C) Cubreobjetos (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (nº de catálogo S2450/S2451)* Bloque de calentamiento u horno de hibridación* Cámara de hibridación húmeda* Pinzas Campana extractora de gases Portaobjetos para microcentrifugadora, Dako Silanized Slides, nº de catálogo S3003, o portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina (consulte Preparación de las muestras) Recipientes o baños de tinción Cronómetro (capaz de cronometrar intervalos de 2-15 minutos) Mezclador vórtex Baño de agua con tapa (capaz de mantener una temperatura de 37 (±2) C, 63 (±2) C y de 95 C a 99 C) Microondas con capacidad de detección, si el pretratamiento se realiza mediante un microondas (véase B3. Protocolo de tinción. Paso 1: Pretratamiento, método B). * Se puede utilizar un bloque de calentamiento o un horno de hibridación para desnaturalización (66 (±1) C) e hibridación (45 (±2) C) junto con una cámara de hibridación húmeda. Equipo de microscopía y accesorios Filtros para microscopio de fluorescencia: doble filtro para DAPI y FITC/Texas Red, o monofiltros para FITC y Texas Red - consulte el Apéndice 3 para obtener detalles al respecto. Debe utilizarse un microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio de 100 vatios como fuente de luz. No se recomienda el uso de otras fuentes de luz con estos filtros. Bandeja plegable para portaobjetos de microscopía (bandeja de cartón para 20 portaobjetos con cubierta de bisagra o similar). Precauciones 1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Para usuarios profesionales. 3. El Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), no requiere etiquetado de producto peligroso. La hoja de datos de seguridad (SDS) se encuentra disponible para los usuarios profesionales. 4. El Vial 2A, Pepsin, contiene 5-<10% de propan-2-ol, 0,1-<0,3% de pepsina A y 0,011- <0,1% de 5-cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona. El Vial 2a está etiquetado: P04092ES_02/K p. 6/40

7 Peligro H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Provoca graves quemaduras en la piel y lesiones oculares. Puede provocar una reacción cutánea alérgica. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Usar ropa de protección. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la persona al aire libre y mantenerla en una posición que le facilite la respiración. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA o a un médico. EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico. NO provocar el vómito. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la piel con agua o ducharse. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA o a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico. Guardar bajo llave. Eliminar el contenido/recipiente conforme a la reglamentación local, regional, nacional e internacional. 5. El Vial 2B, Pepsin Diluent (10x), contiene 50-<75% de propan-2-ol y 5-<10% de clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil) propano-1,3-diol. El Vial 2B está etiquetado: Peligro H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Líquido y vapores muy inflamables. Provoca irritación ocular grave. Puede provocar somnolencia o vértigo. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies calientes. No fumar. Utilizar un material eléctrico, de ventilación o de iluminación/antideflagrante. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la persona al aire libre y mantenerla en una posición que le facilite la respiración. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la piel con agua o ducharse. Mantener fresco. Eliminar el contenido/recipiente conforme a la reglamentación local, regional, nacional e internacional. 6. El Vial 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, contiene 10-<25% de carbonato de etileno y 3-<5% de cloruro de sodio. El Vial 3 está etiquetado: H319 P280 P264 Advertencia Provoca irritación ocular grave. Usar protección para los ojos o la cara. Lavarse cuidadosamente después de la manipulación. P04092ES_02/K p. 7/40

8 P305 + P351 + P338 SI HA ENTRADO EN CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con cuidado con agua durante varios minutos. Retirar lentes de contacto, si las hubiera y fuera una tarea sencilla. Continuar con el enjuagado. 7. El Vial 4, Stringent Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% de cloruro de sodio y 10-<20% de clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil) propano-1,3-diol. El Vial 4 está etiquetado: H319 H315 P280 Advertencia P264 P305 + P351 + P338 Provoca irritación ocular grave. Provoca irritación en la piel. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Lavarse cuidadosamente después de la manipulación. SI HA ENTRADO EN CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con cuidado con agua durante varios minutos. Retirar lentes de contacto, si las hubiera y fuera una tarea sencilla. Continuar con el enjuagado. 8. El Vial 6, Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% de cloruro de sodio y 10-<20% de trometamol. El Vial 6 está etiquetado: H319 H315 P280 Advertencia P264 P305 + P351 + P338 Provoca irritación ocular grave. Provoca irritación en la piel. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Lavarse cuidadosamente después de la manipulación. SI HA ENTRADO EN CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con cuidado con agua durante varios minutos. Retirar lentes de contacto, si las hubiera y fuera una tarea sencilla. Continuar con el enjuagado. 9. Coverslip Sealant contiene nafta (petróleo) al 100%, ligeramente hidrotratada, y está etiquetado: Peligro H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 Líquido y vapores muy inflamables. Puede ser mortal en caso de ingestión y penetración en las vías respiratorias. Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies calientes. No fumar. Utilizar un material eléctrico, de ventilación o de iluminación/antideflagrante. No dispersar en el medio ambiente. EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico. NO provocar el vómito. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la piel con agua o ducharse. P04092ES_02/K p. 8/40

9 P235 P501 Mantener fresco. Eliminar el contenido/recipiente conforme a la reglamentación local, regional, nacional e internacional. 10. Las muestras, antes y después de la fijación, así como todos los materiales expuestos a ellas, deben manipularse como capaces de transmitir infecciones, y desecharse con las precauciones apropiadas (37). Nunca pipetee reactivos con la boca y evite el contacto de la piel y membranas mucosas con reactivos y muestras. Si los reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lávelas con abundante agua. 11. A fin de evitar resultados erróneos, minimice la contaminación microbiana de los reactivos. 12. La aplicación de tiempos y temperaturas de incubación o de métodos distintos a los especificados puede producir resultados erróneos. 13. El uso de métodos de fijación de tejidos y de grosores de muestras distintos a los especificados pueden afectar negativamente a la morfología del tejido y/o a la intensidad de la señal. 14. Evite la evaporación de TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix durante la hibridación; para ello, asegúrese de que haya humedad suficiente en la cámara de hibridación. 15. Los reactivos se suministran a la dilución óptima. Una mayor dilución puede provocar pérdida de eficacia. 16. Lleve puesto equipo protector personal apropiado a fin de evitar que el producto entre en contacto con los ojos y la piel. Consulte la hoja de datos de seguridad (SDS) para obtener información más detallada. 17. Solo debe utilizar recipientes de tinción limpios para el método de inmersión en pepsina (paso 2, método C). Almacenamiento Conserve la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH (Vial 3) a -18 C en un lugar oscuro. El resto de reactivos se pueden conservar a 2 8 C en la oscuridad. Todos los reactivos se pueden almacenar congelados. Los reactivos se pueden congelar y descongelar hasta 10 veces sin que pierdan su eficacia. La pepsina lista para su uso, la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH y el medio de montaje fluorescente (Viales 2A, 3 y 5) puede verse afectados negativamente si se exponen al calor. No deje estos componentes a temperatura ambiente. La mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH y el medio de montaje fluorescente (Viales 3 y 5) pueden verse afectados negativamente si son expuestos a niveles lumínicos excesivos. No almacene estos componentes ni lleve a cabo análisis bajo una luz intensa, por ejemplo, la luz solar directa. No utilice el kit después de la fecha de caducidad impresa en la caja del kit. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones distintas de las especificadas en este documento, el usuario debe validar la eficacia de los reactivos (38). No existen signos evidentes que indiquen inestabilidad de este producto. Por lo tanto, es importante evaluar células normales presentes en el corte de tejido analizado. Si observa un patrón de fluorescencia inesperado que no pueda atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con TOP2A IQFISH pharmdx, póngase en contacto inmediatamente con el servicio técnico de Dako. Preparación de las muestras Las muestras de biopsias deben manipularse de tal forma que se conserve el tejido para el análisis FISH. Deben utilizarse con todas las muestras los métodos estándar de procesamiento de tejidos para su tinción inmunohistoquímica (39). Cortes incluidos en parafina Sólo los tejidos conservados con formol tamponado neutro e incluidos en parafina son adecuados para su uso. Las muestras de biopsias deben cortarse en bloques de, por ejemplo, 3 ó 4 mm de espesor, y fijarse durante horas con formol tamponado neutro. Después, P04092ES_02/K p. 9/40

10 se deshidratan los tejidos en distintas diluciones de etanol y xileno, seguido de una infiltración con parafina fundida a una temperatura no superior a 60 C. Los tejidos fijados e incluidos correctamente se conservarán indefinidamente antes del corte y el montaje en portaobjetos si se guardan en un lugar fresco (15 25 C) (39, 40). No es adecuado ningún otro fijador. Las muestras de tejido deben cortarse en cortes de 4 6 µm. Los portaobjetos requeridos para el análisis de la aberración del gen TOP2A y la verificación de la presencia de tumores deben prepararse a la vez. Se recomienda realizar un mínimo de 3 cortes en serie, 1 corte para la verificación de la presencia de tumores teñido con hematoxilina y eosina (tinción H&E), 1 corte para el análisis de la aberración del gen TOP2A y 1 corte como respaldo. Se recomienda montar los cortes de tejido en los portaobjetos Dako Silanized Slides, Nº de catálogo S3003, SuperFrost Plus, o en portaobjetos con poli-l-lisina. Las muestras deben analizarse dentro de un período de 4 6 meses tras el corte, siempre que se almacenen a temperatura ambiente (20 25 C), o 2 años si se almacenan a 2 8 C. P04092ES_02/K p. 10/40

11 INSTRUCCIONES DE USO A. Preparación de los reactivos Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de proceder con la tinción: A.1 Solución de pretratamiento Es posible que aparezcan cristales en el Vial 1, pero, a temperatura ambiente, se disuelven. Asegúrese de que no haya cristales antes de la preparación del reactivo. Diluya una cantidad suficiente del Vial 1 (solución de pretratamiento 20x) a 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Deseche la solución tampón si tiene un aspecto turbio. A.2 Tampón de lavado astringente Diluya una cantidad suficiente del Vial 4 (tampón de lavado astringente 20x) a 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Deseche la solución tampón si tiene un aspecto turbio. A.3 Tampón de lavado Diluya una cantidad suficiente del Vial 6 (tampón de lavado 20x) a 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Si el tampón diluido presenta un aspecto turbio, deséchelo. A.4 Diluciones de etanol A partir de una solución de etanol al 96%, prepare 3 recipientes con etanol al 70%, 85% y 96%, respectivamente. Almacene los recipientes tapados a temperatura ambiente o a una temperatura de 2 8 C, y utilícelos con un máximo de 200 portaobjetos. Si las soluciones presentan un aspecto turbio, deséchelas. A.5. Solución de pepsina Solo se necesita una solución de pepsina cuando se usa el método de inmersión en pepsina (Método C). Prepare la solución de pepsina como sigue; Para un recipiente con una capacidad de seis portaobjetos prepare 60 ml de solución de pepsina: Añada 48 ml de agua destilada o desionizada (20 25 C) al recipiente. Añada 6 ml de diluyente de pepsina frío (2 8 C) (10x) (Vial 2B) al recipiente. Añada 6 ml de pepsina fría (2 8 C) (Vial 2A) al recipiente. Coloque la tapa del recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. Para un recipiente con una capacidad de 24 portaobjetos, prepare 240 ml de solución de pepsina: Añada 192 ml de agua destilada o desionizada (20 25 C) al recipiente. Añada 24 ml de diluyente de pepsina frío (2 8 C) (10x) (Vial 2B) al recipiente. Añada 24 ml de pepsina RTU fría (2 8 C) (Vial 2A) al recipiente. Coloque la tapa del recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. La solución de pepsina equilibrada se debe usar dentro de las 5 horas siguientes. P04092ES_02/K p. 11/40

12 B. Procedimiento de tinción B.1 Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer detenidamente estas instrucciones y familiarizarse con todos los componentes antes de su uso (consulte la Sección Precauciones). Todos los reactivos deben equilibrarse a la temperatura ambiente antes de su uso, de la manera descrita a continuación. Vial 1, la solución de pretratamiento diluida, debe equilibrarse a C si se utiliza un baño de agua para el pretratamiento (B3. Protocolo de tinción, Paso 1: Pretratamiento, método A). Si se utiliza un microondas con capacidad de detección para el pretratamiento (B3. Protocolo de tinción, Paso 1: Pretratamiento, Método B). La solución de pretratamiento debe equilibrarse a la temperatura ambiente de C. Vial 2A, la pepsina, debe aplicarse a 2 8 C (B3, Protocolo de tinción, Paso 2: Método A. y B) y mantenerse fría en todo momento. Vial 2B: el diluyente de pepsina (10x) debe aplicarse a 2 8 C (B3, Protocolo de tinción, Paso 2: Método C). Vial 3, la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH se separa en dos fases cuando se conserva a -18 C. Antes de utilizar el Vial 3, asegúrese de que sólo haya una fase, equilibrando la mezcla de sondas a temperatura ambiente (20 25 C) seguido de la mezcla. Descongele el Vial 3 a temperatura ambiente (20 25 C) durante un máximo de 30 minutos (protéjalo de fuentes de luz intensas) y luego mezcle bien en remolino el vial durante 15 segundos a 2500 rpm usando un mezclador vórtex. Guarde el Vial 3 a -18 C inmediatamente después de usarlo. Vial 4, tampón de lavado astringente diluido; uno de los recipientes debe equilibrarse a temperatura ambiente, y el otro recipiente a 63 (±2) C antes de su uso. Vial 5, el medio de montaje fluorescente puede aplicarse a cualquier temperatura desde 2 a 25 C. Vial 6, el tampón de lavado diluido debe equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C). El sellador de cubreobjetos puede aplicarse a cualquier temperatura en el intervalo 2 25 C. Todos los pasos deben llevarse a cabo a las temperaturas indicadas. El procedimiento incluye una serie de deshidrataciones, seguidas del secado de los cortes de tejido. Asegúrese de que los cortes de tejido estén completamente secos antes de continuar con el paso siguiente. No permita que los cortes de tejido se sequen durante los demás pasos del procedimiento. Si tiene que interrumpir el procedimiento de tinción, puede conservar los portaobjetos en el tampón de lavado tras el paso de desparafinado durante un máximo de 1 hora a temperatura ambiente (20 25 C) sin que esto afecte a los resultados. B.2 Tratamiento de los tejidos antes de la tinción Eliminación de la parafina y rehidratación: Antes de llevar a cabo el análisis, debe eliminar la parafina de los portaobjetos de tejido para eliminar el medio de inclusión y rehidratarlos. Trate de no dejar restos de parafina. Cualquier residuo del medio de inclusión provocaría un aumento de la tinción no específica. Este paso debe realizarse a temperatura ambiente (20 25 C). 1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. 2. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 96% durante 2 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. 3. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en etanol al 70% durante 2 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. P04092ES_02/K p. 12/40

13 4. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en el tampón de lavado diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante un mínimo de 2 minutos. Inicie el procedimiento de tinción de la forma descrita en la Sección B.3, Paso 1, Pretratamiento. Cambie las soluciones de xileno y de alcohol después de cada 200 portaobjetos o menos. Puede utilizar sustitutivos del xileno. NOTA: Los reactivos y las instrucciones suministrados con este kit se han diseñado para obtener resultados óptimos. Una mayor dilución de los reactivos o la modificación de las temperaturas de incubación pueden producir resultados erróneos o discordantes. Cualquier diferencia en el procesamiento del tejido y en los procedimientos técnicos que el usuario llevase a cabo en su laboratorio podría invalidar los resultados del ensayo. B.3 Protocolo de tinción Paso 1: Pretratamiento El pretratamiento se puede realizar o bien mediante un baño de agua, según lo descrito en el método A) o, alternativamente, utilizando un microondas con capacidad de detección, según lo descrito en el método B). Método A: Pretratamiento mediante baño de agua Llene un recipiente con la solución de pretratamiento diluida (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.1). Coloque el recipiente de tinción con la solución de pretratamiento diluida en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la solución de pretratamiento a C. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la solución de pretratamiento precalentada en el recipiente de tinción. Vuelva a comprobar la temperatura e incube durante 10 (±1) minutos a C. Retire del baño de agua el recipiente completo con los portaobjetos. Retire la tapa y deje que los portaobjetos se enfríen en la solución de pretratamiento durante 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos en un recipiente que contenga tampón de lavado diluido (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el tampón de lavado y empape los cortes durante 3 minutos más. NOTA: La solución de pretratamiento está diseñada para aplicarla una sola vez. No reutilizar. Método B: Pretratamiento utilizando un microondas con capacidad de detección Rellene un recipiente de plástico con solución de pretratamiento diluida a temperatura ambiente (20 25 C). Sumerja los cortes desparafinados en la solución de pretratamiento, cubra el recipiente con una tapa perforada y colóquelo en el horno microondas. Seleccione la función de detección de ebullición y un programa que funcione 10 minutos tras haber alcanzado la temperatura de ebullición*. Tras los 10 minutos de incubación, saque del microondas el recipiente con los portaobjetos, retire la tapa y deje enfriar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un recipiente con tampón de lavado diluido y déjelos a remojo durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el tampón de lavado y empape los cortes durante 3 minutos más. * El uso de un horno microondas con capacidades de detección significa que el horno debe contar con un sensor y programas que calienten inicialmente la solución de pretratamiento hasta el punto de ebullición y mantengan posteriormente la temperatura de pretratamiento necesaria (por encima de los 95 ºC) mientras realiza una cuenta atrás del tiempo preseleccionado (10 (±1) minutos). Es posible que algunos microondas con capacidad de detección no incluyan la posibilidad de fijar libremente una cuenta atrás. Si el modelo sólo incluye programas predefinidos, asegúrese de seleccionar un programa que mantenga la temperatura de pretratamiento necesaria (por encima de 95 ºC) durante al menos 10 (±1) minutos y detenga manualmente el programa transcurridos 10 (±1) minutos. NOTA: La solución de pretratamiento está diseñada para aplicarla una sola vez. No reutilizar. P04092ES_02/K p. 13/40

14 Paso 2: Pepsina, lista para su uso (RTU) o solución de pepsina La incubación en pepsina se puede realizar aplicando directamente gotas de pepsina RTU en los portaobjetos a temperatura ambiente (20 25 C) (Método A) o a 37 C (Método B). O bien, puede sumergir los portaobjetos en una solución de pepsina e incubarlos a 37 (±2) C (Método C) Método A) y Método B) Golpee suavemente para eliminar el exceso de tampón. Utilizando un paño sin pelusa (por ejemplo, un paño absorbente o almohadillas de gasa), frote con cuidado alrededor de la muestra a fin de eliminar cualquier resto de líquido y de mantener los reactivos dentro del área prescrita. Aplique 5 8 gotas (250 µl) de pepsina fría (2 8 C) (Vial 2A) para cubrir la muestra. Almacene siempre la pepsina a 2 8 C. Método A: Pepsina, RTU - Incubación a C Incube durante 5 15 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Un tiempo de incubación de 5 15 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar cualquier resto de pepsina y empape los cortes en tampón de lavado diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el tampón de lavado y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. Método B: Pepsina, RTU - Incubación a 37 C Coloque la muestra con pepsina en un bloque calefactor a 37 C (p. ej. Dako Hybridizer) e incube durante 3 5 minutos. Un tiempo de incubación de 3 5 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar el exceso de pepsina y sumerja los cortes en tampón de lavado diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el tampón de lavado y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85%, y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire completamente. Método C: Solución de pepsina - Inmersión de los portaobjetos en una solución de pepsina a 37 C El kit contiene suficientes reactivos para cuatro ciclos separados (60 ml de solución de pepsina, recipiente pequeño para seis portaobjetos) o un único ciclo (240 ml de solución de pepsina, recipiente grande para 24 portaobjetos). Prepare la solución de pepsina de la forma descrita en la Sección A.5. Coloque la tapa del recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Golpee suavemente para eliminar el exceso de tampón de lavado. Sumerja los portaobjetos en la solución de pepsina a 37 (±2) C e incube durante minutos. Un tiempo de incubación de minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar el exceso de solución de pepsina y sumerja los cortes en tampón de lavado diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el tampón de lavado y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. P04092ES_02/K p. 14/40

15 Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85%, y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire completamente. Paso 3: Mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH La mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH se separa en dos fases cuando se conserva a -18 C. Antes de utilizar el Vial 3, asegúrese de que sólo haya una fase, equilibrando la mezcla de sondas a temperatura ambiente C) seguido de la mezcla. Descongele el Vial 3 a temperatura ambiente (20 25 C) durante un máximo de 30 minutos (protéjalo de fuentes de luz intensas) y luego mezcle bien en remolino el vial durante 15 segundos a 2500 rpm usando un mezclador vórtex. Guarde el Vial 3 a -18 C inmediatamente después de usarlo. Aplique 10 µl de la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH (Vial 3) en el centro del corte de tejido. Coloque inmediatamente un cubrebojetos de vidrio de 22 x 22 mm sobre la mezcla de sondas y deje que ésta se distribuya uniformemente debajo del cubreobjetos. Evite la formación de burbujas de aire. Si observa burbujas de aire, golpee suavemente con unas pinzas para retirarlas del tejido. Recuerde guardar el Vial 3 a -18 C inmediatamente después de usarlo. Selle el cubreobjetos con el sellador de cubreobjetos, extendiendo el sellador alrededor de la periferia del cubreobjetos. Deje que el sellador de cubreobjetos se superponga al cubreobjetos y al portaobjetos; así se formará un sello alrededor del cubreobjetos. Asegúrese de que el sellador de cubreobjetos cubra todo el borde del cubreobjetos. Prepare Dako Hybridizer* (nº de catálogo S2450/S2451) para un ciclo de hibridación. Asegúrese de que las Humidity Control Strips (nº de catálogo S2452) estén saturadas y en estado óptimo para su utilización. Inicie el Hybridizer y seleccione un programa que: Desnaturalice a 66 C durante 10 minutos seguido de una hibridación a 45 C durante minutos. Coloque los portaobjetos en el Hybridizer, asegúrese de que la tapa esté bien cerrada e inicie el programa. Consulte el manual de instrucciones de Dako Hybridizer para obtener más detalles. *Para la desnaturalización y la hibridación puede utilizar instrumental que permita condiciones idénticas a las arriba descritas, como por ejemplo el indicado más adelante: Coloque los portaobjetos sobre una superficie metálica o de piedra plana (sobre un bloque de calentamiento o un bloque en un horno de hibridación) precalentado a 66 (±1) C. Desnaturalice durante exactamente 10 minutos. Introduzca los portaobjetos en una cámara de hibridación humidificada precalentada. Cubra la cámara con una tapa e incube a 45 (±2) C durante minutos. Tenga en cuenta que una temperatura de hibridación de 37 C no es adecuada para las sondas incluidas en este kit. Paso 4: Lavado astringente Llene dos recipientes de tinción con tampón de lavado astringente diluido (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2). Se recomienda utilizar un volumen mínimo de 100 ml o 15 ml por portaobjetos en cada recipiente. Introduzca uno de los recipientes de tinción con tampón de lavado astringente diluido a temperatura ambiente en una campana extractora de gases, y el otro recipiente en un baño de agua. Caliente el baño de agua y el tampón de lavado astringente diluido a 63 (±2) C. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida la temperatura del interior del recipiente que está en el baño de agua con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. El tampón de lavado astringente contiene detergente y puede volverse turbio a 63 C; esto no afecta a su eficacia. Utilizando pinzas o guantes, saque los portaobjetos de la cámara de hibridación y, con cuidado, retire el sellador de cubreobjetos, así como los cubreobjetos, e introduzca los portaobjetos en la jarra de prelavado a temperatura ambiente, uno por uno. No introduzca los portaobjetos en tampón de lavado astringente antes de quitar los cubreobjetos. P04092ES_02/K p. 15/40

16 Tan pronto como se hayan quitado todos los cubreobjetos, transfiera los portaobjetos del recipiente de prelavado a temperatura ambiente al recipiente del baño de agua a 63 (±2) C. Inmediatamente después de transferir los portaobjetos al recipiente a 63 (±2) C al baño de agua, inicie el cronómetro. Lleve a cabo un lavado astringente durante 10 minutos exactos. Saque los portaobjetos del tampón de lavado astringente diluido y empape los cortes en tampón de lavado diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Cambie el tampón de lavado diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85%, y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen por completo. Paso 5: Montaje Aplique 15 µl del medio de montaje fluorescente que contiene DAPI (Vial 5) al área diana del portaobjetos y cubra con un cubreobjetos de vidrio. NOTA: Puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. No obstante, tenga en cuenta que si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. A fin de reducir al mínimo el desvanecimiento, almacene los portaobjetos en la oscuridad a C. Control de calidad 1. Las señales deben ser brillantes, bien diferenciadas y fáciles de evaluar. 2. Las células normales son un control interno del ensayo de tinción. Las células normales deberían presentar 1 2 señales verdes claramente visibles que indican que la sonda ANP de CEN-17 se ha hibridado satisfactoriamente con la región centromérica del cromosoma 17. Las células normales deberían presentar también 1 2 señales rojas claramente visibles que indican que la sonda de ADN de TOP2A se ha hibridado satisfactoriamente en la región diana de TOP2A. Debido al corte del tejido, algunas células normales presentarán menos de las 2 señales de cada color esperadas. Las células normales que están experimentando división celular pueden tener más de las 1 2 señales normales de cada color. Si no se pueden detectar señales en las células normales, el ensayo ha fracasado y los resultados deben considerarse no válidos. 3. La morfología del núcleo debe estar intacta al evaluarla utilizando un filtro para DAPI. Numerosas células fantasma y una morfología nuclear general pobre indican una sobredigestión de la muestra, que tiene como resultado la pérdida o fragmentación de las señales. Tales muestras deben considerarse no válidas. 4. Las diferencias en la fijación, el procesado y la inclusión del tejido en el laboratorio del usuario pueden generar variabilidad en los resultados, por lo que es necesario que el usuario lleve a cabo una evaluación regular de sus propios controles. Interpretación de la tinción Tejidos evaluables Sólo debe evaluar muestras de pacientes con carcinoma invasivo. En los casos de carcinoma in situ y carcinoma invasivo en la misma muestra, sólo debe evaluarse el componente invasivo. Evite las áreas de necrosis y las áreas donde los bordes nucleares sean ambiguos. No incluya los núcleos que requieran una valoración subjetiva. Ignore los núcleos que presenten una intensidad de señal débil y tinción no específica o tinción de fondo alta. Utilice el filtro DAPI para comprobar la tinción uniforme de los núcleos. P04092ES_02/K p. 16/40

17 Enumeración de la señal: Localice el tumor dentro del contexto del portaobjetos teñido con H&E y evalúe el mismo área en el portaobjetos teñido mediante FISH. Examine varias áreas de células tumorales a fin de tener en cuenta una posible heterogeneidad. Seleccione una área que tenga una distribución óptima de núcleos. Comience el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada y, explorando de izquierda a derecha, cuente el número de señales comprendidas dentro del borde nuclear de cada núcleo evaluado, con arreglo a las pautas siguientes (consulte también el Apéndice 3). Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales. Cuando dos señales sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de la señal, cuente éstas como una sola señal. En los núcleos con altos niveles de amplificación del gen TOP2A, las señales de TOP2A pueden estar muy cerca unas de las otras, formando un grupo de señales. En estos casos no es posible contar el número de señales de TOP2A; en vez de contarlo, debe realizarse una estimación. Debe prestar especial atención a las señales verdes, ya que los grupos de señales de TOP2A pueden cubrir las señales verdes, haciéndolas imposibles de ver. En caso de duda, compruebe las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC. No cuente los núcleos sin señales verdes. Puntúe sólo los núcleos que presenten una o más señales de referencia verdes. Registre los recuentos en una tabla como la que se indica en el Apéndice 2. Pautas para el recuento de señales 1 No contar. Los núcleos se superponen; no todas las áreas de los núcleos son visibles. 2 Contar como dos señales verdes. 3 Dos señales rojas; no puntúe los núcleos que presenten solo señales rojas. 4 Contar como 3 señales verdes y 12 señales rojas (estimación del grupo). 5 Contar como 1 señal verde y 1 señal roja. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 6 No contar (núcleos sobre o infradigeridos). o Ausencia de señales en el centro del núcleo (núcleo en forma de donut). 7 Contar como 2 señales verdes y 3 señales rojas. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 8 Contar como 1 señal verde y 5 señales rojas. 9 Contar como 3 señales verdes (1 señal verde está fuera de foco) y 3 señales rojas. 10 Grupo de señales rojas que están tapando a señales verdes; comprobar las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC, o no contar. P04092ES_02/K p. 17/40

18 Las señales se pueden puntuar por el método convencional (41) o por uno alternativo que ahorra tiempo y trabajo (21, 29). En lugar del método convencional de recuento de señales en 60 núcleos, se puntúan un total de 60 eventos, donde un evento es una señal del gen roja. Mediante este método de recuento alternativo, se puntúan un número variable de núcleos hasta llegar a las 60 señales rojas de TOP2A. Las señales verdes de CEN-17 correspondientes en los mismos núcleos se registran. El número mínimo de núcleos a puntuar es 6. En muestras normales, será suficiente un promedio de 35 núcleos para llegar a las 60 señales. El casos amplificados, se incluirán 6-35 núcleos. Incluso en los casos con eliminaciones, a menudo serán suficientes menos de 60 núcleos. Si es posible, cuente los núcleos de 3 áreas distintas del tumor (42). Calcule la proporción TOP2A/CEN-17 dividiendo el número total de señales rojas de TOP2A entre el número total de señales verdes de CEN-17. Las muestras con una proporción TOP2A/CEN-17 superior o igual a 2 deben considerarse como que presentan amplificación de TOP2A, y las muestras con una proporción TOP2A/CEN-17 inferior a 0,8 deben considerarse como que presentan eliminación de TOP2A (18, 21, 29). Los resultados que estén en el punto de corte (1,8 2,2 para amplificaciones y 0,7 0,9 para eliminaciones) o cerca de él deben interpretarse con precaución. Es recomendable comprobar que las puntuaciones no incluyan un alto porcentaje de núcleos normales. Si la proporción se encuentra en una de las dos zonas ambiguas, o en caso de incertidumbre, es recomendable verificar la puntuación de la muestra haciendo que una segunda persona vuelva a puntuar, contando los núcleos de 3 o más áreas del tumor y/o contando un total de 60 núcleos. Como criterio de aceptación se recomienda un CV de ±10%. La proporción final se debe calcular a partir de todas las puntuaciones. En los casos de proporción dudosa, el patólogo debe consultar con el médico a cargo de los tratamientos. Limitaciones Limitaciones generales 1. FISH es un proceso de varios pasos que requiere formación especializada en la selección de los reactivos apropiados, selección, fijación y procesamiento de tejidos, preparación de los portaobjetos para FISH, e interpretación de los resultados de las tinciones. 2. Los resultados de FISH dependen de la manipulación y el procesamiento del tejido antes de su tinción. Una fijación, lavado, secado, calentamiento o corte incorrectos, o la contaminación con otros tejidos o líquidos, pueden afectar a la hibridación de las sondas. La aparición de resultados no coherentes puede deberse a variaciones en los métodos de fijación y de inclusión, o a irregularidades inherentes al tejido. 3. A fin de obtener resultados óptimos y reproducibles, debe desparafinar por completo los portaobjetos de tejido. La eliminación de la parafina debe realizarse al principio del proceso de tinción. (Consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección B.2). 4. Sólo debe utilizar baño de agua, bloque de calentamiento y horno de hibridación con calibración de la temperatura. El uso de otros tipos de equipos puede dar lugar a la evaporación de la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH durante la hibridación y debe ser validado por el usuario. Características de resultados Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica de la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH se investigó utilizando 18 muestras de epitelio normal de mama humano. La proporción entre el número de señales de TOP2A y de señales de CEN-17 se calculó basándose en un recuento de 60 núcleos por muestra. La proporción de TOP2A/CEN-17 de las 18 muestras de epitelio normal de mama humano fue 0,97 1,11. P04092ES_02/K p. 18/40

19 Especificidad analítica Las sondas de ADN TOP2A contenidas en la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH se han secuenciado y mapeado, confirmando una cobertura total de 228 kb incluido el gen TOP2A. Las sondas de PNA CEN-17 contenidas en la mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 se han testado individualmente y combinadas, confirmando su hibridación específica con la región centromérica del cromosoma 17. Para medir la capacidad del ensayo para identificar de forma exclusiva las sustancias diana TOP2Ay CEN-17 sin interferencia de otras sustancias, se realizaron estudios en muestras de tejido de epitelio normal de mama humano usando el Vial 3 que contenía el tampón de hibridación pero no la mezcla de sondas. Se evaluaron un total de 18 muestras en busca de la presencia de señales no relacionadas con la mezcla de sondas. No se observó detección de otras dianas cromosómicas ni interferencia con sustancias estrechamente relacionadas en ninguno de las 18 muestras. Estudios de robustez La robustez del ensayo TOP2A IQFISH pharmdx se evaluó variando el tiempo y la temperatura de pretratamiento y los métodos de calentamiento del tampón de pretratamiento (horno microondas o baño de agua), el tiempo y el método de incubación con pepsina (pepsina RTU o inmersión), la temperatura y el tiempo de desnaturalización, el tiempo de hibridación, y el tiempo y la temperatura del lavado astringente. No se observó ninguna diferencia significativa en los resultados bajo las siguientes condiciones experimentales: Método de pretratamiento A) Baño de agua durante 10 minutos combinado con cada una de las siguientes temperaturas: 95 C, C, y 99 C junto a 9, 10 y 11 minutos a C. Método de pretratamiento B) Horno microondas durante 9, 10 y 11 minutos a temperaturas de >95 C. Método de digestión con pepsina A) con tiempos de incubación de 5, 10 y 15 minutos temperatura ambiente (20 25 C). Método de digestión con pepsina B) con tiempos de incubación de 3, 4 y 5 minutos a 37 C. Método de digestión con pepsina C) con tiempos de incubación de 20, 25 y 30 minutos combinados con cada una de las siguientes temperaturas: 35, 37 y 39 C. Desnaturalización durante 10 minutos combinado con cada una de las siguientes temperaturas: 65, 66 y 67 C junto a 9, 10 y 11 minutos a 66 C. Tiempo de hibridación de 60, 90 y 120 minutos a 45 C. Lavado astringente durante 10 minutos combinado con cada una de las siguientes temperaturas: 61, 63 y 65 C junto a 9, 10 y 11 minutos a 63 C. Algunas combinaciones de tiempo y temperatura en los extremos de tolerancia produjeron un calidad ligeramente inferior de la estructura del tejido, si bien no se apreciaron diferencias significativas en la intensidad de la señal. El procedimiento de tinción de TOP2A IQFISH pharmdx ofrece variables de protocolo para el pretratamiento de calor, la digestión con pepsina y el tiempo de hibridación. Cada combinación única se ha validado respecto al estado del gen TOP2A. La validación se realizó en 10 muestras FFPE de carcinoma de mama humano con cada una de las 12 posibles combinaciones. Se utilizó el kit TOP2A FISH pharmdx (K5333) como referencia. La proporción TOP2A/CEN-17 de cada muestra individual se muestra en la Figura 1. La tabulación cruzada entre las 12 pruebas y la tinción de P04092ES_02/K p. 19/40

20 referencia mostró una coincidencia general en el estado del gen TOP2A del 100% (10/10) con límites del 95% de confianza inferior de dos colas inferior y superior en el 78,3% y el 100%, respectivamente. El valor Kappa fue de 1,00 y la prueba de McNemars mostró la ausencia de sesgo (valor p de dos colas de 1,00). Figura 1. Proporciones TOP2A/CEN-17 para 10 muestras de carcinoma de mama humano teñidas usando las 12 posibles combinaciones de protocolo con TOP2A IQFISH pharmdx (nº de catálogo K5733) (Prueba 1-12) y la referencia (R) del kit TOP2A FISH pharmdx (nº de catálogo K5333). La línea horizontal de arriba ilustra el punto de corte 2,0, y la línea horizontal de abajo el punto de corte 0,8. Repetibilidad La repetibilidad de la proporción TOP2A/CEN-17 se investigó con el ensayo TOP2A IQFISH pharmdx utilizando cortes consecutivos de nueve muestras de carcinoma de mama humano mamario, con el estado del gen TOP2A no amplificado o amplificado. Se analizaron cortes por triplicado de cada muestra en el mismo procedimiento. El coeficiente de variación promedio fue del 3% (intervalo desde el 1% al 4%) para las muestras eliminadas de TOP2A, del 7% (intervalo desde el 2% al 10%) para muestras normales de TOP2A y del 5,3% para muestras amplificadas de TOP2A (intervalo desde el 4% al 7%). Se analizaron un total de cinco cortes consecutivos de cuatro muestras de carcinoma de mama humano de diferentes grosores (3, 4, 5, 6 y 7 µm) con TOP2A IQFISH pharmdx. El coeficiente de variación promedio de la proporción TOP2A/CEN-17 fue del 9,8% (intervalo desde el 6% al 13%). Reproducibilidad Se probó el ensayo TOP2A IQFISH pharmdx en lo referente a reproducibilidad lote a lote y observador a observador usando tres lotes de TOP2A IQFISH pharmdx y tres observadores. La reproducibilidad se analizó en nueve muestras de carcinoma de P04092ES_02/K p. 20/40

21 mama humano diferentes con los estados del gen TOP2A no amplificado y amplificado. El coeficiente de variación promedio de la reproducibilidad lote a lote fue del 3,7% para muestras eliminadas detop2a (intervalo desde el 2% al 6%), 10,3% para muestras normales de TOP2A (intervalo desde el 10% al 11%), y 9,3% para muestras amplificadas de TOP2A (intervalo desde el 5% al 12%). El coeficiente de variación promedio de la reproducibilidad observador a observador fue del 13,7% para muestras eliminadas detop2a (intervalo desde el 7% al 17%), 7% para muestras normales de TOP2A (intervalo desde el 2% al 11%), y 12,7% para muestras amplificadas de TOP2A (intervalo desde el 10% al 15%). Utilidad clínica Doxorubicina y epirubicina son antraciclinas, que se encuentran entre los fármacos antitumorales más ampliamente usados, y se ha demostrado que la topoisomerasa IIα es la diana molecular de la acción farmacológica de estos compuestos (14, 15). Doxorubicina y epirubicina han demostrado su eficacia en diferentes malignidades, incluyendo el cáncer de mama, donde se usan tanto para la enfermedad metastásica como en tratamiento complementario (15). Para el tratamiento complementario del cáncer de mama, una serie de datos clínicos han demostrado que los regímenes de quimioterapia que incluyen doxorubicina o epirubicina se traducen en mejoras estadísticamente significativas en la supervivencia si se comparan con otros regímenes que no incluyen antraciclinas (43, 44). El índice terapéutico de las antraciclinas es bajo, y la mejora de la eficacia se produce a expensas de una mayor toxicidad, comparada con otros regímenes de quimioterapia como CMF (ciclofosfamida/metotrexato/5-fluorouracilo) (19, 45). Además de toxicidad aguda, el tratamiento con doxorubicina o epirubicina puede producir efectos secundarios a largo plazo como cardiotoxicidad y leucemia mieloide aguda (LMA) secundaria (6, 15). La cardiopatía inducida por la terapia es a menudo irreversible y puede evolucionar a una insuficiencia cardíaca congestiva meses años después de la finalización del tratamiento. Para aprovechar al máximo el tratamiento médico con doxorubicina y epirubicina, es importante que los médicos dispongan de las herramientas necesarias para identificar qué pacientes tienen más probabilidad de beneficiarse de la terapia con doxorubicina y epirubicina. La eficacia en el ámbito clínico del kit Dako TOP2A FISH pharmdx (nº de catálogo K5333) ha sido investigado en dos estudios realizados por el Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) en Copenhague (21, 29, 30, 46). Estudio piloto La eficacia en el ámbito clínico del kit TOP2A FISH pharmdx ha sido evaluado en un estudio piloto con muestras de 120 pacientes con cáncer de mama (29) en colaboración con el DBCG. Un total de 20 tumores experimentaron cambios en el número de copias de TOP2A, divididos casi por igual entre amplificaciones (n=11) y eliminaciones (n=9). Los cambios de TOP2A no se hallaron exclusivamente en tumores HER2 positivos, ya que 4 tumores (el 20% de los casos anormales de TOP2A) fueron HER2 negativos. Una proporción (señales rojas/señales verdes) superior o igual a 2 discrimina entre casos amplificados y normales, mientras que una proporción inferior a 0,8 se asocia a la eliminación en el gen. El estudio piloto mostró que 2 métodos de recuento distintos producían resultados idénticos: Las señales se contaron en 60 núcleos, o bien se contó un total de 60 señales rojas junto a señales verdes en los mismos núcleos. Este último método tiene la ventaja de que el número más alto de células se cuenta en los casos de eliminación y normales, mientras que el número más bajo de células se cuentan en los casos de amplificación. Los casos de amplificación a menudo se identifican fácilmente con el microscopio, pero exigen más tiempo en la evaluación si hay que puntuar 60 núcleos. P04092ES_02/K p. 21/40

22 Estudio de confirmación - DBCG 89D/TOP2A A una mayor escala, se evaluó la eficacia en el ámbito clínico del kit TOP2A FISH pharmdx a partir de muestras de tumores recogidas prospectivamente del estudio complementario DBCG 89D (21, 30, 46, 47). Diseño del estudio El objetivo principal del estudio DBCG 89D/TOP2A era investigar si las aberraciones del gen TOP2A (amplificación o eliminación) podrían servir como marcador predictivo para la supervivencia general sin recurrencia en pacientes con cáncer de mama de alto riesgo para los que se indica un tratamiento complementario de quimioterapia con epirubicina. Como objetivos secundarios, se estudiaron las propiedades de pronóstico de las aberraciones del gen TOP2A y la correlación entre TOP2A y HER2. El estudio DBCG 89D se diseñó como abierto, prospectivo y aleatorizado. Tras la cirugía, se aleatorizaron 980 mujeres pre y posmenopáusicas con alto riesgo de cáncer de mama invasivo a CMF o CEF (ciclofosfamida/epirubicina/5-fluorouracilo). El criterio de valoración principal en cuanto a eficacia fue la SSR (supervivencia sin recurrencia) con la SG (supervivencia general) como criterio de valoración secundario. Para el subestudio biológico DBCG 89D/TOP2A, se recogieron bloques de tejido de pacientes que habían participado e el estudio DBCG 89D de los centros del estudio y se analizaron central y retrospectivamente para las aberraciones de los genes TOP2A y HER2 (kit Dako HER2 FISH pharmdx), así como la sobreexpresión de HER2 (Dako HercepTest ). Hubo disponibles bloques de tejido de 806 de las 980 pacientes incluidas en el estudio DBCG 89D. Respecto a las aberraciones de los genes TOP2A y HER2, la proporción se calculó como el número de señales de las sondas del gen dividido por el número de señales para el centrómero 17. Los casos se puntuaron como con amplificación FISH de HER2o TOP2A cuando la proporción fue de 2. Se consideró que había eliminación de TOP2A cuando la proporción fue < 0,8. El estado de TOP2A se categorizó en los siguientes grupos: Eliminado: Proporción TOP2A/CEN-17 < 0,8 Normal: 0,8 Proporción TOP2A/CEN-17 < 2,0 Amplificado: Proporción TOP2A/CEN-17 2,0 En HercepTest, todas las muestras 1+, 2+ y 3+ positivas se sometieron al análisis FISH de HER2. La puntuación de la positividad de HER2 (48) en el estudio fue como sigue: Positivo: HercepTest=3+, o HercepTest=2+ y proporción FISH HER2 de 2,0 Negativo: HercepTest=0,1+, o HercepTest=2+ y proporción FISH HER2 < 2,0 El estudio clínico (DBCG 89D) y el subestudio biológico (DBCG 89D/TOP2A) se realizaron de acuerdo a la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por los Comités Éticos locales. Metodología estadística El criterio de valoración principal del estudio fue la SSR, definida como el tiempo desde la aleatorización hasta un evento o el descarte. El criterio de valoración secundario del estudio fue la SG, definida como el tiempo desde la aleatorización hasta la muerte o el descarte. El efecto del tratamiento con CEF sobre CMF en SSR y SG se cuantificó en términos del índice de riesgo, calculado usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se ajustó de acuerdo a los resultados de los procedimientos de bondad de ajuste y de la investigación de la interacción, definiendo el modelo básico multivariable de Cox para el análisis de SSR y SG. Se proporcionó el índice de riesgo (IR), el intervalo de confianza del 95% y el valor p de la prueba de Wald para cada covariable y término de interacción en el modelo Cox. El IR para el tratamiento con CEF frente al tratamiento con CMF en cada subgrupo de P04092ES_02/K p. 22/40

23 TOP2A (y subgrupo de HER2) se dedujo de los resultados, y se representa mediante una representación de Forrest. Una vez ajustados el modelo riesgos proporcionales de Cox en SSR y SG según los resultados de los procedimientos de bondad de ajuste y de las investigaciones de interacción, se realizaron 3 tipos de análisis secundarios. Estimación multivariable en los 3 subgrupos de TOP2A: Eliminado, Normal, Amplificado. Estimación multivariable en los 2 subgrupos de HER2: Negativo, Positivo. Estimación multivariable unificada de todas las pacientes, incluyendo la interacción de TOP2A y HER2. Las correlaciones entre el estado de TOP2A y las variables clínicas y patológicas, incluyendo el estado de HER2, se analizaron mediante la prueba χ2. El tiempo de seguimiento se cuantificó en términos de una estimación de Kaplan-Meier de un seguimiento potencial. Se realizaron análisis del posible sesgo de selección usando la prueba χ2 y la prueba log-rank. Los pacientes con valores ausentes, salvo para el estado del receptor, se excluyeron de los análisis multivariables en el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Resultados El análisis FISH de TOP2A fue satisfactorio en 773 de las 806 (96%) muestras de cáncer de mama. La distribución general del estado de TOP2A entre las pacientes elegibles se indica en la Tabla 1. Se observó amplificación de TOP2A en 92 (11,9%) de las 773 pacientes elegibles y eliminación en 87 (11,3%). Tabla 1. Distribución del estado de TOP2A Estado de TOP2A n (%) Eliminado Normal Amplificado 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Total 773 (100) La distribución de las amplificaciones y eliminaciones de TOP2A en relación con el estado de HER2 se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Distribución del estado de HER2 en relación al estado de TOP2A Estado de HER2 TOP2A N n (%) Eliminado n (%) Normal n (%) Negativa 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) Positivo 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) Total 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) Amplificad o n (%) 14 (2,7) 78 (31,7) 92 (11,9) Valor p χ 2 p< 0,0001 Observando el estado de HER2, se encontraron más aberraciones de TOP2A entre los tumores HER2 positivos. Se observaron aberraciones de TOP2A en 139 (56,5%) de los 246 tumores HER2 positivo y en 40 (7,6%) de los 527 tumores HER2 negativos. En consecuencia, 40 (22,3%) pacientes con aberraciones de TOP2A podrían haberse pasado por alto si solo se hubieran analizado las muestras HER2 positivas. P04092ES_02/K p. 23/40

24 La distribución de las aberraciones de TOP2A en relación al estado FISH de HER2 se indica en la Tabla 3. En cuanto al estado de HER2, se halló una correlación significativa con el estado de TOP2A. Tabla 3. Distribución del estado FISH de HER2 en relación al estado de TOP2A FISH PARA HER2 TOP2A N n (%) Normal 539 (100) Amplificad 234 o (100) Total 773 (100) Eliminad o n (%) Normal n (%) 31 (5,8) 493 (91,5) 56 (23,9) 101 (43,2) 87 (11,3) 594 (76,8) Amplificad o n (%) 15 (2,8) 77(32,9) 92 (11,9) Valor p χ 2 p< 0,0001 La distribución de las aberraciones de TOP2A en relación a la puntuación de HercepTest se indica en la Tabla 4. En cuanto al estado de HER2, se halló una correlación significativa con el estado de TOP2A. Tabla 4. Distribución de la puntuación de HercepTest en relación al estado de TOP2A HercepTes t TOP2A N n (%) Eliminado n (%) Normal n (%) (100) 11 (5,3) 192 (91,9) (5,1) 238 (100) (92,6) (100) 3 (3,9) 65 (83,3) (26,2) 99 (100) (43,3) Total (11,3) 594 (100) (76,8) Amplificad o n (%) 6 (2,9) 6 (2,3) 10 (12,8) 70 (30,6) 92 (11,9) Valor p χ 2 p< 0,0001 En seis de las 773 con datos de TOP2A faltaban datos clínicos que las excluyeron de los análisis multivariables. En el caso de pacientes con resultados de TOP2A disponibles, el tiempo potencial de seguimiento para SSR fue de 9,4 años, y el número de eventos correspondiente de 371. La mediana del tiempo de seguimiento potencial para la SG fue de 11,1 años, y el número de eventos 336. Las representaciones Kaplan Meier para el con respecto a los 2 grupos de tratamiento en cada uno de los 3 grupos de TOP2A se muestran en la Figura 2-4. P04092ES_02/K p. 24/40

25 Figura 2. SSR para pacientes tratados con CMF y CEF con tumores de TOP2A amplificado Figura 3. SSR para pacientes tratados con CMF y CEF con tumores de TOP2A normal Figura 4. SSR para pacientes tratados con CMF y CEF con tumores de TOP2A eliminado Tanto en los grupos de pacientes TOP2A amplificado como de TOP2A eliminado, el tratamiento con CEF mostró ser superior que CMF. En los pacientes de TOP2A P04092ES_02/K p. 25/40

26 amplificado, la diferencia era significativa (p=0,037). No pudo detectarse esta diferencia en el grupo de pacientes de TOP2A normal. Para el criterio de valoración principal del estudio (SSR), los análisis con el modelo de riesgos proporcionales de Cox mostraron un valor predictivo significativo de las aberraciones del gen TOP2A (p=0,016). El grupo de pacientes con amplificaciones de TOP2A presentaron una reducción del riesgo relativa de más del 60% cuando fueron tratados con CEF en comparación a CMF (IR=0,389, Valor p=0,0017). Asimismo, en las eliminaciones de TOP2A se halló una reducción de riesgo, si bien no era estadísticamente significativa (IR=0,608, valor p=0,0828) En la Figura 5, se muestra el efecto relativo de CEF en cada uno de los subgrupos de TOP2A y HER2 respecto a SSR. Figura 5. Efecto relativo de CEF en cada uno de los subgrupos de TOP2A y HER2 con en la SSR (representación de Forrest) Para la SG se muestran resultados similares a SSR, pero no son significativos (p=0,14). Los pacientes con amplificaciones de TOP2A experimentaron una reducción del riesgo de más del 50% cuando fueron tratados con CEF en comparación a CMF (IR=0,485, valor p=0,0142). En cuanto a SSR, no se halló una reducción de riesgo significativa para las eliminaciones de TOP2A (IR=0,678, valor p=0,155). La Figura 6 muestra el efecto relativo de CEF en cada uno de los subgrupos de TOP2A y HER2 respecto a SG. P04092ES_02/K p. 26/40

27 Figura 6. Efecto relativo de CEF en cada uno de los subgrupos de TOP2A y HER2 en la SG (representación de Forrest). Se investigó también el valor predictivo del estado de HER2 y los datos no mostraron un efecto significativo con respecto a las interacciones de tratamientos, ni para SSR ni para SG. Un análisis de la distribución de las aberraciones de TOP2A con respecto a las características del valor de referencia mostró una asociación significativa con algunos de los factores de pronóstico histopatológicos establecidos. Además, los datos demostraron que la proporción de mujeres con aberraciones de TOP2A se incrementaba con la edad, resultando en una mayor frecuencia entre mujeres posmenopáusicas que entre mujeres premenopáusicas. Los análisis de supervivencia multivariables indicaron un significativo efecto negativo tanto en SSR como en SG, y los pacientes con amplificaciones y eliminaciones experimentaron una reducción significativa de la supervivencia en comparación a las pacientes con un estado de TOP2A normal. Las curvas de supervivencia indicaban también que las pacientes con eliminaciones tenían un pronóstico incluso peor que las pacientes con un estado de TOP2A amplificado o normal. Las curvas de supervivencia de los pacientes con un estado de TOP2A amplificado, normal o eliminado se muestran en la Figura 7. P04092ES_02/K p. 27/40

28 Figura 7. Estado de TOP2A con respecto a SSR y SG (N=767) Además de la asociación con los factores de pronóstico clínico establecidos, se vio que las aberraciones de TOP2A tenían un pronóstico independiente. Usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, se demostró que una aberración del gen TOP2A se asociaba a un peor pronóstico tanto respecto a SSR (p=0,0169) como a SG (p=0,0118). El IR y los límites de confianza del 95% basados en el modelo de Cox para SSR y SG se muestran en las tablas 5 y 6. P04092ES_02/K p. 28/40

29 Tabla 5. IR para SSR TOP2A e interacción de tratamientos incluida Variable valor p IR IC del 95% Menopausia 0,0576 Pre Post 1 1,26 (0,99 1,60) Incremento del tamaño <0,0001 del tumor por cm increm. Nodos linfáticos positivos Estado de TOP2A Eliminado Normal Amplificado Estado de HER2 Negativa Positivo <0,0001 0,0169 0,2998 1,15 (1,09 1,22) 1 2,01 4,16 1,66 1 1,56 (1,39 2,91) (2,88 6,02) (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Tabla 6. IR para SG TOP2A e interacción de tratamientos incluida Variable valor p IR IC del 95% Menopausia 0,0124 Pre Post 1 1,37 (1,07 1,75) Incremento del tamaño <0,0001 del tumor por cm increm. Nodos linfáticos positivos Estado de TOP2A Eliminado Normal Amplificado Estado de HER2 Negativa Positivo <0,0001 0,0118 0,0519 1,16 (1,10 1,23) 1 2,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Cuando los IR de las diferentes variables de la Tabla 5 (SSR) se clasifican con respecto al valor de pronóstico, la lista es como sigue: número de nodos linfáticos positivos > estado de TOP2A > estado menopáusico > estado de HER2 y tamaño del tumor. Como muestra esta clasificación, el número de nodos linfáticos positivos es la variable que tiene el mayor impacto sobre el pronóstico, seguido del estado de TOP2A, el estado menopáusico, el tamaño del tumor y el estado de HER2. Cuando se repitió la clasificación para SG (Tabla 6), los resultados fueron similares a los de SSR, indicando un fuerte valor pronóstico para el estado de TOP2A. También se investigó el valor de pronóstico del estado de HER2 y los análisis multivariables de supervivencia indicaron un significativo efecto negativo tanto en SSR como en SG, ya que los pacientes HER2 positivos experimentaron una reducción de la supervivencia al compararse con los pacientes con un estado de HER2 normal. El análisis principal de SSR P04092ES_02/K p. 29/40

30 usando análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox no mostró un efecto significativo en el estado de HER2. Al repetir el análisis con respecto a SG, el estado HER2 positivo resultó tener un significativo impacto negativo en la supervivencia. Discusión y conclusión El estudio DBCG 89D/TOP2A ha demostrado un valor predictivo y pronóstico significativo de las aberraciones del gen TOP2A, A partir de las comparaciones con el estado de HER2, puede concluirse que el estado de HER2 y de TOP2A no son intercambiables ni para el valor predictivo ni para el valor de pronóstico. TOP2A es la diana molecular de la acción farmacológica de la epirubicina, y el estudio ha demostrado que una aberración del gen TOP2A, especialmente las amplificaciones, es útil como marcador predictivo para la respuesta a la epirubicina. La quimioterapia de antraciclina con doxorubicina epirubicina se encuentra entre los regímenes más activos contra el cáncer de mama. No obstante, estos compuestos tienen efectos secundarios agudos y a largo plazo graves, como cardiotoxicidad y leucemia. Estudio comparativo entre el kit TOP2A FISH pharmdx y TOP2A IQFISH pharmdx Dako TOP2A IQFISH pharmdx (nº de catálogo K5733) se ha comparado con el kit Dako TOP2A FISH pharmdx (nº de catálogo K5333) en un estudio comparativo con 80 muestras de tejido de mama de carcinoma de mama humano. La tabulación cruzada del estado del gen TOP2A obtenida por los dos ensayos arrojaron una coincidencia general del 100% con los limites inferior y superior del intervalo de confianza del 95% en 96,9% y 100%. El valor kappa fue 1. P04092ES_02/K p. 30/40

31 Solución de problemas Problema Causa probable Solución sugerida 1. No hay señales o son débiles 1a. El kit ha sido expuesto a altas temperaturas durante el transporte o el almacenamiento. 1a. Compruebe las condiciones de almacenamiento. Asegúrese de que había hielo seco presente en el kit cuando lo recibió. Asegúrese de que Vial 3 se ha almacenado a -18 C en la oscuridad. Asegúrese de que los Viales 2A y 5 se han almacenado como máximo a 2 8 C, y de que los viales se han almacenado en la oscuridad. 1b. El microscopio no funciona correctamente - Juego de filtros inapropiado - Lámpara incorrecta - Lámpara de mercurio demasiado vieja - Objetivos colectores sucios y/o con fisuras - Aceite de inmersión inadecuado 1b. Compruebe el microscopio y asegúrese de que los filtros que se están utilizando son adecuados para su uso con los fluorocromos del kit; asegúrese también de que la lámpara de mercurio es la correcta y que no se haya utilizado más allá de su vida útil esperada (consulte el Apéndice 3). En caso de duda, contacte con el vendedor del microscopio. 1c. Señales desvanecidas 1c. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición de las muestras a fuentes de luz intensa. 2. No hay señales verdes 3. No hay señales rojas 1d. Condiciones de pretratamiento incorrectas 1e. Evaporación de la mezcla de sondas durante la hibridación 2a. Condiciones de lavado astringente incorrectas 3a. Condiciones de pretratamiento incorrectas 1d. Asegúrese de utilizar la temperatura y el tiempo de pretratamiento recomendados. 1e. Asegúrese de que haya suficiente humedad en la cámara de hibridación. 2a. Asegúrese de utilizar la temperatura y el tiempo recomendados para el lavado astringente, y de retirar los cubreobjetos antes de llevar a cabo el lavado astringente 3a. Asegúrese de utilizar la temperatura y el tiempo de pretratamiento recomendados. 4. Áreas sin señal 4a. Volumen insuficiente de sonda 4a. Asegúrese de que el volumen de sonda sea lo suficientemente grande como para cubrir el área bajo el cubreobjetos. P04092ES_02/K p. 31/40

32 Problema Causa probable Solución sugerida 5. Excesiva tinción de fondo 6. Morfología tisular deficiente 7. Alto nivel de autofluorescencia verde en el portaobjetos, incluyendo las zonas sin tejido FFPE 4b. Burbujas de aire atrapadas durante la aplicación de la mezcla de sondas o durante el montaje 4b. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan, elimínelas suavemente con la ayuda de unas pinzas. 5a. Fijación inadecuada del tejido 5a. Asegúrese de que sólo se usen cortes de tejido fijados con formol e incluidos en parafina. 5b. Parafina eliminada de forma incompleta 5c. Temperatura de lavado astringente demasiado baja 5d. Exposición prolongada del corte hibridado a una luz intensa 6a. Tratamiento con pepsina incorrecto 6b. Unas condiciones de pretratamiento incorrectas pueden tener como resultado un aspecto poco claro y turbio. 6c. Un tratamiento con pepsina muy prolongado o un espesor de corte muy reducido puede hacer que aparezcan células fantasma o células tipo donut. 7. Uso de portaobjetos de vidrio caducados o no recomendados 5b. Siga los procedimientos de desparafinado y rehidratación descritos en la Sección B.2 5c. Asegúrese de que la temperatura del lavado astringente sea de 63 (±2) C 5d. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición a fuentes de luz intensa 6a. Cíñase a los tiempos de incubación con pepsina recomendados. Consulte la Sección B.3, Paso 2. Asegúrese de que la pepsina se manipule a la temperatura correcta. Consulte la Sección B.1. 6b. Asegúrese de utilizar la temperatura y el tiempo de pretratamiento recomendados. 6c. Acorte el tiempo de incubación con pepsina. Consulte la Sección B.3, paso 2. Asegúrese de que el espesor del corte sea de 4 6 µm 7. Asegúrese de que el portaobjetos revestido de vidrio (Dako Silanized Slides, nº de catálogo S3003 o portaobjetos recubierto de poli-l-lisina) no haya caducado. NOTA: Si no puede atribuirse el problema a ninguna de las circunstancias anteriores, o si la acción correctiva sugerida no lo soluciona, póngase en contacto con el Servicio Técnico de Dako para solicitar más ayuda. P04092ES_02/K p. 32/40

33 Apéndice 1 TOP2A IQFISH pharmdx, nº de catálogo K5733 Lista de comprobación del protocolo Fecha del ensayo: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Lote: ID de muestra: ID de equipo: ID del registro del ensayo de tinción: Fecha de la dilución/caducidad del tampón de lavado 1x (Vial 6 diluido al 1:20): / Tejido fijado con formol tamponado neutro Sí No Paso 1: Pretratamiento Fecha de la dilución/caducidad de la solución de pretratamiento (Vial 1 diluido al 1:20) / Temperatura medida de la solución de pretratamiento (95 99 C) C Pretratamiento (10 minutos) y enfriamiento (15 minutos) Lavado en tampón de lavado (Vial 6 diluido al 1:20) (2 x 3 minutos) Paso 2: Pepsina Duración del tratamiento con pepsina (Vial 2) a 37 C o bien Duración del tratamiento con pepsina (Vial 2) a temperatura ambiente o bien Duración de la inmersión en pepsina a 37 (±2) C Lavado en tampón de lavado (Vial 6 diluido al 1:20) (2 x 3 minutos) Deshidrate los portaobjetos (3 x 2 minutos) en series graduadas de etanol, y seque al aire Paso 3: Mezcla de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH Aplique la mezcla de sondas (Vial 3), cubra con el cubreobjetos y selle con el sellador de cubreobjetos Minutos Minutos Minutos Temperatura de desnaturalización medida (66 ±1) C) C Desnaturalización durante 10 minutos Temperatura de hibridación medida (45 ±2 C) C Hibridación durante la noche (proteger de la luz) Paso 4: Lavado astringente Fecha de la dilución/caducidad del tampón de lavado astringente (Vial 4 diluido al 1:20) / Temperatura medida del tampón de lavado astringente (63 ±2 C) C Lavado astringente (10 minutos) tras retirar los cubreobjetos Lavado en tampón de lavado (Vial 6 diluido al 1:20) (2 x 3 minutos) Deshidrate los portaobjetos (3 x 2 minutos) en series graduadas de etanol, y seque al aire Paso 5: Montaje Aplique 15 µl de medio de montaje fluorescente (Vial 5) y cubra con cubreobjetos Comentarios: Fecha y firma del técnico: P04092ES_02/K p. 33/40

34 Apéndice 2 TOP2A IQFISH pharmdx, nº de catálogo K5733 Sistema de puntuación ID del registro del ensayo de tinción: Fecha del ensayo: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Lote: ID de muestra: Núcleo nº Puntuación TOP2A Puntuación CEN-17 Núcleo nº Puntuación TOP2A Puntuación CEN-17 Núcleo nº Puntuación TOP2A Puntuación CEN Total (1-20) Total (21-40) Total (41-60) Para determinar la proporción TOP2A/CEN-17, cuente el número de señales de TOP2A y el número de señales de CEN- 17 en 60 núcleos o en el número de núcleos necesarios para 60 señales de TOP2A (consulte la Sección Interpretación de la tinción). Divida el número total de señales de TOP2A por el número total de señales CEN-17. Si la proporción TOP2A/CEN-17 es dudosa (0,7 0,9 o 1,8 2,2), vuelva a contar la muestra y recalcule la proporción a partir de todas las células contadas. Número de células contadas Señales de TOP2A Señales de CEN-17 Proporción TOP2A/CEN-17 Eliminación del gen TOP2A (Proporción < 0,8) Gen del estado de TOP2A normal (0,8 Proporción < 2) Amplificación del gen TOP2A (Proporción 2) Fecha y firma del técnico: Fecha y firma del anatomopatólogo: Comentarios: P04092ES_02/K p. 34/40

35 Para conocer las pautas de recuento: consulte Interpretación de la tinción. Apéndice 3 TOP2A IQFISH pharmdx, nº de catálogo K5733 Especificaciones del microscopio de fluorescencia Dako le recomienda que utilice el siguiente equipo con el kit TOP2A IQFISH pharmdx, K5733: 1. Tipo de microscopio Microscopio de epifluorescencia. 2. Lámpara Lámpara de mercurio de 100 vatios (mantenga un registro del tiempo de combustión). 3. Objetivos Para el cribaje del tejido, puede aplicar objetivos de fluorescencia a seco 10X u objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión 16X. Para un aumento de alta potencia y para la puntuación de las señales, le recomendamos que utilice exclusivamente objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión, por ejemplo, 100X. 4. Filtros Los filtros están diseñados individualmente para cada fluorocromo concreto, y debe elegirlos en consonancia. Dako recomienda el uso de un filtro específico para DAPI en combinación con un doble filtro de alta calidad específico para Texas Red/FITC. Filtro para DAPI Doble filtro para Texas Red/FITC Puede utilizar un filtro sencillo para Texas Red y otro filtro sencillo para FITC con fines de confirmación. Fluorocromo Longitud de onda de excitación FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Longitud de onda de emisión Los filtros son específicos de cada tipo de microscopio y el uso de los filtros adecuados es crucial para la interpretación. Si desea obtener información detallada al respecto, contacte con el proveedor de su microscopio o con el representante de Dako. 5. Aceite Aceite no fluorescente. Precauciones No se recomienda utilizar una lámpara de mercurio de 50 vatios. No se pueden utilizar filtros para rodamina. No se recomienda utilizar triples filtros. Un microscopio no optimizado puede causar problemas al leer las señales fluorescentes. Es importante que la fuente de luz no haya caducado y que esté correctamente alineada y enfocada. Los clientes deben monitorizar y seguir las recomendaciones del fabricante de la lámpara de mercurio. Antes de interpretar los resultados, debe haberse realizado el mantenimiento del microscopio y la lámpara de mercurio debe estar alineada. Debe esforzarse por exponer la muestra a la menor cantidad de luz de excitación posible a fin de minimizar el desvanecimiento de la fluorescencia. P04092ES_02/K p. 35/40

36 Le recomendamos que estudie la configuración de su microscopio concreto con el fabricante de éste antes de empezar la hibridación in situ fluorescente, o que consulte la literatura. P04092ES_02/K p. 36/40

37 Referencias 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: P04092ES_02/K p. 37/40

38 21. Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER- 2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p P04092ES_02/K p. 38/40

39 37. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092ES_02/K p. 39/40

40 Explicación de símbolos Número de catálogo Límite de temperatura Código de lote Producto sanitario para diagnóstico in vitro Manténgase alejado de la luz solar (consulte la sección sobre almacenamiento) salmacenamiento Fecha de caducidad Consulte las instrucciones de uso Contenido suficiente para <n> ensayos Fabricante Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Revisión Fabricado por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tfno Fax P04092ES_02/K p. 40/40