Histology FISH Accessory Kit N.º de catálogo K5799

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1 Histology FISH Accessory Kit N.º de catálogo K5799 4ª edición Auflage Para hibridación in situ fluorescente (FISH) con cortes de tejidos fijados con formol e incluidos en parafina. El kit contiene reactivos suficientes para 20 pruebas. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 1/29

2 Índice Uso previsto... 3 Introducción... 3 Reactivos... 3 Material suministrado... 3 Material necesario pero no suministrado... 4 Precauciones... 5 Almacenamiento... 7 Preparación de las muestras... 7 Cortes incluidos en parafina... 7 INSTRUCCIONES DE USO... 8 A. Preparación de los reactivos... 8 A.1 Pre-Treatment Solution... 8 A.2 Stringent Wash Buffer... 8 A.3 Wash Buffer... 8 A.4 Diluciones de etanol... 8 A.5. Solución de pepsina... 8 B Procedimiento de tinción... 9 B.1 Notas sobre el procedimiento... 9 B.2 Tratamiento de los tejidos antes de la tinción... 9 B.3 Protocolo de tinción B3.a. Protocolo de tinción para sondas FISH diluidas en tampón de hibridación a base de carbonato de etileno B.3.b. Protocolo de tinción para sondas FISH diluidas en tampón de hibridación a base de formamida Control de calidad Interpretación de los resultados Solución de problemas Apéndice Apéndice Bibliografía Explicación de los símbolos ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 2/29

3 ESPAÑOL Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro. Histology FISH Accessory Kit está diseñado para su uso en la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) con muestras de cortes de tejidos fijados con formol e incluidos en parafina. Los reactivos suministrados en este Histology FISH Accessory Kit puede utilizarse también junto con HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (n.º de catálogo K5731, Vial 3). Si los reactivos de Dako Histology FISH Accessory Kit, n.º de catálogo K5799, se utilizan junto con los reactivos del n.º de catálogo K5731, debe seguirse el procedimiento descrito en el prospecto del envase del n.º de catálogo K5731. Introducción Histology FISH Accessory Kit contiene todos los reactivos importantes, con la excepción de la sonda, necesarios para completar un procedimiento de FISH con muestras de cortes de tejidos fijados con formol e incluidos en parafina. Después del desparafinado y la rehidratación, las muestras se calientan en la Pre-Treatment Solution, seguido de una digestión proteolítica usando Pepsin. Después de los pasos de calentamiento y pretratamiento proteolítico, se aplican las sondas FISH suministradas por el usuario y las muestras se sellan con Coverslip Sealant, antes de desnaturalizarlas e hibridarlas. Tras la hibridación, se realiza un lavado astringente, que garantiza la eliminación de sondas FISH no unidas y de sondas unidas inespecíficamente, antes de la deshidratación con etanol. Finalmente, las muestras se montan con Fluorescence Mounting Medium que contiene una contratinción fluorescente azul. Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros apropiados (consulte el Apéndice 1). Reactivos Material suministrado Los materiales enumerados a continuación son suficientes para 20 pruebas (una prueba se define como un área diana de 22 mm x 22 mm). El kit proporciona suficientes materiales para 10 ciclos de tinción FISH individuales (cuatro ciclos separados si se usa el método de inmersión en Pepsin). El Histology FISH Accessory Kit se envía en hielo seco. Los componentes del kit no se han expuesto a altas temperaturas durante el transporte siempre que todavía haya hielo seco cuando usted reciba el kit. Debe tenerse en cuenta que algunos componentes del kit pueden estar descongelados, pero no afectará al rendimiento del Histology FISH Accessory Kit. Vial 1 Vial 2A Vial 2B Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentrado 20x Tampón MES (ácido 2-[N-morfolin]etanosulfónico). Pepsin 4 x 6,0 ml, listo para su uso La solución de pepsina, ph 2,0, contiene un estabilizante y un agente antimicrobiano. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, concentrado 10x Búfer de dilución, ph 2,0, contiene un agente antimicrobiano. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 3/29

4 Vial 4 Vial 5 Vial 6 Accesorio 7 Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentrado 20x SSC (citrato de sodio salino) con un detergente Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Fluorescence Mounting Medium listo para su uso con 500 µg/l DAPI (4,6-diamidina-2-fenilindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentrado 20x tampón Tris/HCl. Coverslip Sealant 1 tubo Solución para la eliminación del sellado desmontable del cubreobjetos lista para su uso. NOTA: Todos los reactivos son intercambiables con los reactivos correspondientes de Dako HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731). Si los reactivos de Dako Histology FISH Accessory Kit, n.º de catálogo K5799, se utilizan junto con los reactivos del n.º de catálogo K5731, debe seguirse el procedimiento descrito en el prospecto del envase del n.º de catálogo K5731. Material necesario pero no suministrado Reactivos de laboratorio Agua destilada o desionizada Etanol, 96% Xileno o sustitutos de xileno Equipo de laboratorio Paños absorbentes Pipetas regulables Termómetro calibrado, de inmersión parcial (rango C) Cubreobjetos (18 mm x 18 mm o 22 mm x 22 mm y 24 mm x 50 mm o 24 mm x 60 mm) Pinzas Campana extractora de gases Dako Hybridizer (nº de catálogo S2450/S2451)* Bloque de calentamiento u horno de hibridación* Cámara de hibridación húmeda* Microcentrifugadora Portaobjetos, Dako Silanized Slides, nº de catálogo S3003, portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina o portaobjetos Superfrost. Recipientes o baños de tinción Cunas de metal o plástico Cronómetro (capaz de cronometrar intervalos de 0 60 minutos) Baño de agua con tapa capaz de mantener una temperatura de 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C y de 95 C a 99 C ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 4/29

5 Horno microondas con capacidad de detección, si el pretratamiento se realiza mediante un horno microondas** (consulte el Paso 1 en la Sección B.3.a o B.3.b. Protocolo de tinción, Método B). Recipiente apto para el microondas, la tapa debe tener agujeros con un diámetro de un cm, por ejemplo * Se pueden utilizar un bloque de calentamiento para digestión (37 (±2) C), bloque de calentamiento o hibridación para la desnaturalización (66 (±2) C (B.3.a.) u 82 (±2) C) (B.3.b.) y cámara de hibridación húmeda para la hibridación(45 (±2) C), pero recomendamos Dako Hybridizer, Nº de catálogo S2450/S2451. ** Se puede utilizar un baño de agua con tapa (capaz de conservar una temperatura de C) o una cámara de presión controlada mediante microprocesador, como Dako Pascal, n.º de catálogo S2800, en lugar de un horno microondas. Equipo de microscopía y accesorios Filtros para microscopio de fluorescencia: Filtro para DAPI y filtros adecuados para el fluorocromo utilizado, por ejemplo, filtro doble FITC/Texas Red, filtros simples FITC y Texas Red para sondas FISH de Dako - consulte el Apéndice 1 para obtener más información. Debe utilizarse un microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio de 100 vatios como fuente de luz para las sondas FISH de Dako. No se recomienda el uso de otras fuentes de luz con estos filtros. Bandeja plegable para portaobjetos de microscopía (bandeja de cartón para 20 portaobjetos con cubierta de bisagra o similar). Precauciones 1. Para usuarios profesionales. 2. El Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), contiene de ácido 2-morfolinoetanosulfónico al 1<20%; el Vial 2A, Pepsin, contiene propan-2-ol al 5-10%; y el Vial 6, Wash Buffer (20x), contiene trometamol al 1 < 20%. A las concentraciones en que se encuentran en el producto, estas sustancias no requieren etiquetado de advertencia de productos peligrosos. Los usuarios profesionales pueden solicitar a Dako hojas de datos sobre la seguridad (MSDS, por sus siglas en inglés) de estos productos. 3. Vial 2A, Pepsin, contiene Pepsin A, que puede causar reacciones alérgicas. 4. Vial 2B, Pepsin Diluent (10x) que contiene un 60% de propan-2-ol y está marcado como: Altamente inflamable. Irritante. R11 Altamente inflamable. R36 Irritante para los ojos. R67 Los vapores pueden provocar somnolencia y vértigo. S9 Consérvese el recipiente en lugar bien ventilado. S16 Manténgase lejos de toda fuente de ignición No fumar. S26 En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con abundante agua y busque atención médica. S60 Esta sustancia y su recipiente deben desecharse como material peligroso. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 5/29

6 5. Artículo 7, Coverslip Sealant que contiene nafta (petróleo) al %, ligeramente hidrotratada, está marcado como: Extremadamente inflamable. Peligroso para el medio ambiente. R11 Altamente inflamable. R51/53 Tóxico para los organismos acuáticos, puede causar efectos adversos a largo plazo en el medio ambiente acuático. S16 Manténgase lejos de toda fuente de ignición No fumar. S35 Este material y su envase deben desecharse de forma segura. S57 Utilícese un envase de seguridad adecuado para evitar la contaminación del medio ambiente. S61 Evitar el vertido en el entorno. Siga las instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad. S9 Consérvese el recipiente en lugar bien ventilado. 6. Le rogamos que consulte la hoja de datos de seguridad (MSDS) para obtener información más detallada. 7. El uso de métodos de fijación de tejidos y de grosores de muestras distintos a los especificados pueden afectar negativamente a la morfología del tejido y/o a la intensidad de la señal. 8. El uso de tiempos de incubación, temperaturas o métodos diferentes a los especificados puede causar resultados incorrectos. 9. Los reactivos se suministran a la dilución óptima. Una dilución superior puede provocar un rendimiento deficiente. 10. Solo deben utilizarse recipientes de tinción limpios para el método de inmersión en pepsina (Paso 2, Método C). ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 6/29

7 Almacenamiento Guardar en la oscuridad a una temperatura de 2-8 C. Alternativamente, todos los reactivos toleran su almacenamiento congelados. La Pepsin (Vial 2A) puede resultar afectado negativamente si se expone al calor. No deje este componente a temperatura ambiente. El Fluorescence Mounting Medium (Vial 5) puede resultar afectado negativamente si se expone a niveles excesivos de luz. No almacene este componente en un lugar expuesto a la luz. No utilice el kit después de la fecha de caducidad impresa en el envase del kit. Si los reactivos se almacenan en condiciones diferentes a las especificadas, el usuario deberá validar el rendimiento del reactivo (1). No existen signos evidentes que indiquen inestabilidad de este producto. Por lo tanto, es importante evaluar tejido normal que haya demostrado previamente una buena FISH como control del ciclo de ensayo. Si observa una fluorescencia inesperada que no puede explicarse por variaciones en los procedimientos del laboratorio y sospecha de la existencia de un problema con el Histology FISH Accessory Kit, póngase en contacto con los servicios técnicos de Dako. Preparación de las muestras Las muestras de biopsias, escisiones o resecciones deben manipularse de tal forma que se conserve el tejido para el análisis FISH. Siga el método recomendado para el procesamiento de tejidos para tinción inmunocitoquímica descritos a continuación. Para obtener más información consulte la referencia (2). El uso de un tejido expuesto a descalcificación ácida no se recomienda para FISH (3 6). Se ha observado que el uso de EDTA como descalcificador conserva mejor el ADN (6) en las técnicas (F)ISH (3, 4, 7). NOTA: El rendimiento de Dako Histology FISH Accessory Kit no se ha validado en tejidos descalcificados. Cortes incluidos en parafina Sólo los tejidos conservados con formol tamponado neutro e incluidos en parafina son adecuados para su uso. Las muestras deben cortarse en bloques de, por ejemplo, 3 ó 4 mm de espesor, y fijarse durante horas con formol tamponado neutro. A continuación, los tejidos se deshidratan en una serie graduada de etanol y xileno, seguido de infiltración con parafina fundida mantenida a no más de 60 C. Los tejidos correctamente fijados e incluidos se conservarán indefinidamente antes de su seccionamiento y montaje en portaobjetos si se almacenan correctamente (15-25 C) (2, 8). No es adecuado ningún otro fijador. Un tiempo de fijación prolongado podría aumentar el tiempo de incubación necesario para el paso de digestión con Pepsin. Las muestras de tejido se deben cortar en secciones de 2-6 µm, recogerse en portaobjetos desde un baño de agua y secarse al aire. El grosor óptimo de los cortes de tejido es de 2-3 µm para las sondas FISH de señal dividida de Dako. Para otras aplicaciones de FISH pueden utilizarse cortes de 4 6 µm. La parafina se debe fundir a 60 C durante minutos. Los cortes deben enfriarse a temperatura ambiente (20 25 C) y conservarse a 2 8 C. Se recomienda montar los cortes de tejido en los portaobjetos Dako Silanized Slides, nº de catálogo S3003, en portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina o en portaobjetos Superfrost Plus. En general, las muestras se deben analizar en los 6 meses siguientes al corte si se conservan a 2-8 C. Si los cortes de tejido se conservan en condiciones distintas a las especificadas, el usuario debe verificar las mismas. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 7/29

8 INSTRUCCIONES DE USO A. Preparación de los reactivos Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de proceder con la tinción: A.1 Pre-Treatment Solution Es posible que aparezcan cristales en el Vial 1, pero, a temperatura ambiente, se disuelven. Asegúrese de que no haya cristales antes de la preparación del reactivo. Diluya una cantidad suficiente del Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) diluyendo el concentrado 1:20 en agua destilada o desionizada. La solución diluida sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Deseche la solución diluida si está turbia. A.2 Stringent Wash Buffer Diluya una cantidad suficiente del Vial 4 (Stringent Wash Buffer 20x) diluyendo el concentrado 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Si el tampón diluido presenta un aspecto turbio, deséchelo. A.3 Wash Buffer Diluya una cantidad suficiente del Vial 6 (Wash Buffer 20x) diluyendo el concentrado al 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2 8 C durante un mes. Si el tampón diluido presenta un aspecto turbio, deséchelo. A.4 Diluciones de etanol A partir de una solución de etanol al 96%, prepare 3 recipientes que contengan etanol al 70%, 85% y 96%. Almacene los recipientes tapados a temperatura ambiente o a una temperatura de 2 8 C, y utilícelos con un máximo de 200 portaobje tos. Si las soluciones presentan un aspecto turbio, deséchelas. A.5. Solución de pepsina Solo se necesita una solución de pepsina cuando se usa el método de inmersión en pepsina (B.3.a. y B.3.b Paso 2 Método C). Prepare la solución de pepsina como sigue; Para un recipiente con una capacidad de seis portaobjetos prepare 60 ml de solución de pepsina: Añada 48 ml de agua destilada o desionizada (20 25 C) al recipiente. Añada 6 ml de Pepsin Diluent frío (2 8 C) (10x) (Vial 2B) al recipiente. Añada 6 ml de Pepsin fría (2 8 C) (Vial 2A) al recipiente. Tape el recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. Para un recipiente con una capacidad de 24 portaobjetos, prepare 240 ml de solución de pepsina: Añada 192 ml de agua destilada o desionizada (20 25 C) al recipiente. Añada 24 ml de Pepsin Diluent frío (2 8 C) (10x) (Vial 2B) al recipiente. Añada 24 ml de Pepsin fría (2 8 C) (Vial 2A) al recipiente. Tape el recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. La solución de pepsina equilibrada se debe usar dentro de las 5 horas siguientes. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 8/29

9 B Procedimiento de tinción B.1 Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer detenidamente estas instrucciones y familiarizarse con todos los componentes antes de su uso (consulte la Sección Precauciones). Si los componentes del kit se almacenan congelados, se recomienda dejar que los reactivos alcancen una temperatura entre 2 y 8 C el día anterior al análisis para que la temperatura se equilibre adecuadamente. Todos los reactivos deben equilibrarse a la temperatura pertinente antes de usarlos. Vial 1: Vial 2A: Vial 2B: Vial 4: Vial 5: La Pre-Treatment Solution diluida debe equilibrarse a C si se utiliza un baño de agua (Sección B.3.a o B.3.b. Protocolo de tinción, Paso 1: Pretratamiento, método A). Si se utiliza un horno microondas con capacidad de detección para el pretratamiento (Sección B.3.a. o B.3.b. Protocolo de tinción, Paso 1: Pretratamiento, Método B), la Pre-Treatment Solution debe equilibrarse a la temperatura ambiente de C. La Pepsin se puede aplicar a 2-8 C (Sección B.3.a. o B.3.b. Protocolo de tinción, Paso 2: Método A y B) y mantenerse fría en todo momento. El Pepsin Diluent (10x) debe aplicarse a 2-8 C (Sección B.3.a. o B.3.b. Protocolo de tinción, Paso 2: Método C) Un recipiente de Stringent Wash Buffer debe equilibrarse a temperatura ambiente y el otro equilibrarse a 63 (±2) C (Sección B.3.a.) o 65 (±2) C (Sección B.3.b) antes del uso. El Fluorescence Mounting Medium puede aplicarse a cualquier temperatura de 2-25 C. Vial 6: El Wash Buffer diluido debe equilibrarse a temperatura ambiente (20-25 C). Accesorio 7: El Coverslip Sealant puede aplicarse a temperatura ambiente (20-25 C). Todos los pasos deben llevarse a cabo a las temperaturas indicadas. El procedimiento anterior a la tinción incluye deshidrataciones seguidas del secado de las muestras. Asegúrese de que las muestras están completamente secas antes de proceder al siguiente paso. No deje secar las muestras durante los otros pasos del procedimiento. Si el procedimiento de tinción se ha de interrumpir, los portaobjetos se pueden mantener en Wash Buffer después del paso de eliminación de la parafina hasta 1 hora a temperatura ambiente (20 25 C). B.2 Tratamiento de los tejidos antes de la tinción Desparafinado y rehidratación: Antes de realizar el procedimiento, los portaobjetos de tejido deben desparafinarse para eliminar la parafina y volverse a hidratar. Trate de no dejar restos de parafina. Cualquier residuo de parafina provocaría un aumento de la tinción no específica. Este paso debe realizarse a temperatura ambiente (20 25 C). 1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie el baño y repita una vez este proceso. 2. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 96% durante 2 (±1) minutos. Cambie el baño y repita una vez este proceso. 3. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en etanol al 70% durante 2 (±1) minutos. Cambie el baño y repita una vez este proceso. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 9/29

10 4. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en el Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2) durante un mínimo de 2 minutos. Inicie el procedimiento de tinción de la forma descrita en el Paso 1 de la Sección B.3.a. o B.3.b., Pretratamiento. Se debe preparar soluciones de xileno y alcohol nuevas cada 200 portaobjetos procesados. Puede utilizar sustitutivos del xileno. NOTA: Los reactivos y las instrucciones suministrados con este kit se han diseñado para obtener resultados óptimos. Una mayor dilución de los reactivos o la modificación de las temperaturas de incubación pueden producir resultados erróneos o discordantes. Cualquier diferencia en el procesamiento del tejido y en los procedimientos técnicos que el usuario llevase a cabo en su laboratorio podría invalidar los resultados del ensayo. Maduración opcional de las muestras: Antes de eliminar la parafina y de rehidratar, incube los portaobjetos a 60 C durante, por ejemplo, 1 hora en un bloque de calentamiento, un bloque en un horno de hibridación o en el Dako Hybridizer. Como alternativa, incube los portaobjetos a 37 C durante 1 o 2 días y, a continuación, durante 1 hora a 60 C. Continúe con el desparafinado y la rehidratación. NOTA: Este paso es opcional. Las muestras maduradas pueden reducir el ruido de fondo potencial. B.3 Protocolo de tinción Siga una de las dos variantes del protocolo de tinción, B.3.a o B3.b. No intercambie pasos entre los dos procedimientos: El protocolo de tinción B.3.a describe el procedimiento de medio día de duración que se debe aplicar a las sondas FISH diluidas en un tampón de hibridación a base de carbonato de etileno. El protocolo de tinción B.3.b describe el procedimiento de dos días de duración que se debe aplicar a las sondas FISH diluidas en un tampón de hibridación a base de formamida. B3.a. Protocolo de tinción para sondas FISH diluidas en tampón de hibridación a base de carbonato de etileno Paso 1: Pretratamiento (horno microondas, baño de agua, Pascal) El pretratamiento se puede realizar o bien mediante un baño de agua, según lo descrito en el método A) o con un horno microondas con capacidad de detección, según lo descrito en el método B), o bien con una olla a presión Pascal, como se describe en el Método C). Método A: Pretratamiento mediante baño de agua Llene jarras de tinción, por ejemplo jarras de Coplin, con la Pre-Treatment Solution diluida (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.1). Coloque los recipientes de tinción con la Pre-Treatment Solution diluida en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Pre-Treatment Solution a C. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Cubra las jarras con tapas a fin de estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Pre-Treatment Solution precalentada de las jarras de tinción. Vuelva a comprobar la temperatura e incube durante 10 (±1) minutos a C. Saque la jarra entera con los portaobjetos del baño de agua. Retire la tapa y deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre-Treatment Solution durante 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos en un recipiente que contenga Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 10/29

11 NOTA: La Pre-Treatment Solution está diseñada para aplicarse una sola vez. No la reutilice. Método B: Pretratamiento utilizando un horno microondas con capacidad de detección (recomendado) Llene un recipiente de plástico con Pre-Treatment Solution diluida a temperatura ambiente (20-25 C). Sumerja los cortes desparafinados en la Pre-Treatment Solution, cubra el recipiente con una tapa perforada y colóquelo en el horno microondas. Seleccione la función de detección de ebullición y un programa que funcione 10 minutos tras haber alcanzado la temperatura de ebullición*. Tras los 10 minutos de incubación, saque del microondas la jarra con los portaobjetos, retire la tapa y deje enfriar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un recipiente con Wash Buffer diluido y déjelos a remojo durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. * La utilización de un microondas con capacidad de detección significa que el horno debe incluir un sensor y programas que calienten inicialmente la Pre-Treatment Solution hasta el punto de ebullición y, posteriormente, mantengan la temperatura de pretratamiento necesaria (por encima de 95 ºC) mientras realizan una cuenta atrás del tiempo prefijado (10 (±1) minutos). Es posible que algunos microondas con capacidad de detección no incluyan la posibilidad de fijar libremente una cuenta atrás. Si el modelo solo incluye programas predefinidos, asegúrese de seleccionar un programa que mantenga la temperatura de pretratamiento necesaria (por encima de 95 ºC) durante al menos 10 (±1) minutos y detenga manualmente el programa transcurridos 10 (±1) minutos. NOTA: La Pre-Treatment Solution está diseñada para aplicarse una sola vez. No la reutilice. Método C: Pretratamiento mediante la cámara de presión Pascal Coloque 500 ml de agua desionizada dentro del platillo Pascal. Llene un recipiente de plástico con 250 ml de Pre-Treatment Solution. Sumerja los cortes desparafinados en la Pre-Treatment Solution y coloque el recipiente dentro del platillo Pascal. Incúbelo a 121 C durante 1 minuto. Libere la presión después de enfriar a 90 C. Lea a tentamente el manual de Pascal para obtener información sobre la manipulación correcta de la cámara de presión Pascal. Retire el recipiente una vez liberada la presión. Retire las tapas y deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre- Treatment Solution durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos a un recipiente que contenga Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2). Sumerja los cortes durante 3 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el Paso 2. NOTA: La Pre-Treatment Solution está diseñada para aplicarse una sola vez. No la reutilice. No utilice un recipiente hermético cuando realice un pretratamiento en un horno microondas, ya que la presión dentro del recipiente aumentará y puede explotar o causar daños cuando se abra. Puede utilizar un soporte para portaobjetos de metal en el horno microondas si el soporte de metal se sumerge en solución de pretratamiento durante el tiempo que dure el tratamiento en el microondas. En caso contrario no use metal en un horno microondas. Siga las instrucciones del fabricante del microondas. No permita que la Pre-Treatment Solution hierva continuamente durante los 10 minutos de incubación. Realice un control regular de la temperatura utilizando un termómetro calibrado para verificar que las condiciones de temperatura son correctas. Paso 2: Pepsin, lista para su uso (RTU) o solución de pepsina La incubación en pepsina se puede realizar mediante la aplicación directa de gotas de Pepsin RTU en los portaobjetos a temperatura ambiente (20-25 C) (Método A) o a 37 C (Método B). De igual modo, también puede sumergir los portaobjetos en una solución de pepsina e incubarlos a 37 (±2) C (Método C). Método A y Método B: Golpee suavemente para eliminar el exceso de tampón. Utilizando un paño sin pelusa (por ejemplo, un paño absorbente o almohadillas de gasa), frote con cuidado alrededor de la muestra a fin de eliminar cualquier resto de líquido y de mantener los reactivos dentro del área prescrita. Aplique 5-8 gotas (250 µl) de Pepsin (Vial 2A) fría (2-8 C) para cubrir la muestra. Almacene siempre la Pepsin a una temperatua de 2-8 C. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 11/29

12 Método A: Pepsin, RTU: incubación a C Incube durante 5-15 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Un tiempo de incubación de 5-15 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar cualquier resto de Pepsin y empape los cortes en Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el Wash Buffer diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. Método B: Pepsin, RTU: incubación a 37 C Coloque la muestra con Pepsin en un bloque calentador a 37 C (p. ej. Dako Hybridizer) e incube durante 3-5 minutos. Un tiempo de incubación de 3-5 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar cualquier resto de Pepsin y empape las secciones en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire completamente. Método C: Solución de pepsina: inmersión de los portaobjetos en una solución de pepsina a 37 C El kit incluye reactivos suficientes para cuatro ensayos independientes (60 ml de solución de pepsina, recipiente pequeño para seis portaobjetos) o un único ensayo (240 ml de solución de pepsina, recipiente grande para 24 portaobjetos). Prepare la solución de pepsina de la forma descrita en la Sección A.5. Tape el recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Golpee para eliminar el exceso de tampón de lavado. Sumerja los portaobjetos en solución de pepsina a 37 (±2) C e incúbelos durante minutos. Un tiempo de incubación de minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar cualquier resto de solución de pepsina y empape los cortes en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe hasta la deshidratación. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire completamente. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 12/29

13 Paso: 3 Sonda FISH diluida en tampón de hibridación a base de carbonato de etileno (proporcionada por el usuario) NOTA: Las mezclas FISH Probe Mix diluidas en tampón de hibridación a base de carbonato de etileno se deben conservar a -18 C entre cada uso. Cuando se almacena a -18 C, el tampón se separa en dos fases. Antes de utilizarlo, asegúrese de que solo hay una fase. Para ello, equilibre la Probe Mix a temperatura ambiente (20-25 C) y mézclela después. Descongele la FISH Probe Mix a temperatura ambiente (20-25 C) durante 30 mi nutos como máximo (protegiéndola de la luz intensa) y agite meticulosamente el vial durante 15 segundos a 2500 rpm con un agitador vórtex. Aplique una cantidad adecuada de Probe Mix en el centro del corte de tejido, p. ej., 10 µl. Coloque inmediatamente un cubreobjetos de vidrio de 22 mm x 22 mm sobre la Probe Mix y deje que ésta se distribuya uniformemente debajo del cubreobjetos. Evite la formación de burbujas de aire. Si observa burbujas de aire, golpee suavemente con unas pinzas para retirarlas del tejido. Selle el cubreobjeto con el Coverslip Sealant extendiendo el sellador alrededor de la periferia del cubreobjeto. Deje que el Coverslip Sealant se superponga al cubreobjetos y al portaobjetos; así se formará un sello alrededor del cubreobjetos. Asegúrese de que el Coverslip Sealant cubra todo el borde del cubreobjeto. Prepare el Dako Hybridizer* (Código S2450 o S2451) para realizar un ciclo de hibridación. Asegúrese de que las Humidity Control Strips (Código S2452) estén saturadas y en estado óptimo para su utilización. Encienda el Hybridizer y elija un programa que: Realice la desnaturalización a 66 C durante 10 minutos y, a continuación, la hibridación a 45 C durante minutos. Coloque los portaobjetos en el Hybridizer, asegúrese de que la tapa esté bien cerrada e inicie el programa. Consulte el manual de instrucciones del Dako Hybridizer si desea más información. * Para la desnaturalización y la hibridación puede utilizar instrumentos que permitan condiciones idénticas a las arriba descritas. Coloque los portaobjetos en una superficie plana metálica o de piedra (sobre un bloque calentador o un bloque de un horno de hibridación) precalentada a 66 (±1) C. Realice la desnaturalización durante 10 minutos exactos. Introduzca los portaobjetos en una cámara de hibridación humidificada precalentada. Cubra la cámara con una tapa e incube a 45 (±2) C durante minutos. Paso 4: Lavado astringente Llene dos jarras de tinción, por ejemplo, jarras de Coplin, con Stringent Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2). Se recomienda utilizar un volumen mínimo de 100 ml o 15 ml por portaobjetos en cada recipiente. Introduzca una de las jarras de tinción que contiene Stringent Wash Buffer diluido a temperatura ambiente en una campana extractora de gases, y la otra jarra en un baño de agua. Caliente el agua de baño y el Stringent Wash Buffer diluido hasta 63 (±2) C. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida la temperatura del interior de la jarra que está en el baño de agua con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Stringent Wash Buffer contiene detergente y puede volverse turbio a 63 C; esto no afecta a su eficacia. Utilizando pinzas o guantes, saque los portaobjetos de la cámara de hibridación y, con cuidado, retire el Coverslip Sealant, así como los cubreobjetos, e introduzca los portaobjetos en la jarra de prelavado a temperatura ambiente, uno por uno. Tan pronto como todos los cubreobjetos se hayan eliminado, transfiera los portaobjetos del recipiente de prelavado a temperatura ambiente al recipiente del baño de agua a 63 (±2) C. El temporizador se debe poner en marcha justo después de transferir los portaobjetos al Stringent Wash Buffer a 63 (±2) C del baño de agua. Lleve a cabo un lavado astringente durante 10 minutos exactos. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 13/29

14 Saque los portaobjetos del Stringent Wash Buffer diluido y empape los cortes en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Cambie el Wash Buffer diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y 2 minutos en etanol al 96%. Deje que las secciones de tejido se sequen por completo. Paso 5: Montaje Aplique 15 µl del Fluorescence Mounting Medium que contiene DAPI (Vial 5) al área diana del portaobjetos y cubra con un cubreobjeto de vidrio. NOTA: Puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. No obstante, tenga en cuenta que si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. A fin de minimizar el desvanecimiento, almacene los portaobjetos en la oscuridad a C. B.3.b. Protocolo de tinción para sondas FISH diluidas en tampón de hibridación a base de formamida DÍA 1 Paso 1: Pretratamiento (horno microondas, baño de agua, Pascal) El pretratamiento se puede realizar mediante un baño de agua, según lo descrito en el método A), o con un horno microondas con capacidad de detección, según lo descrito en el método B), o bien con una cámara de presión Pascal, como se describe en el Método C). Método A: Pretratamiento mediante baño de agua Llene los recipientes de tinción con la Pre-Treatment Solution diluida (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.1). Coloque los recipientes de tinción con la Pre- Treatment Solution diluida en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Pre-Treatment Solution a C. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Cubra los recipientes con tapas (sin orificios) a fin de estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados en la Pre-Treatment Solution precalentada. Vuelva a comprobar la temperatura, cierre la tapa del baño de agua e incube durante 10 (±1) minutos a C. Saque la jarra entera con los portaobjetos del baño de agua. Quite la tapa (no quite los portaobjetos). Deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre-Treatment Solution durante 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos a un recipiente que contenga Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2) durante 3 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el Paso 2. Método B: Pretratamiento utilizando un horno microondas con capacidad de detección (recomendado) Rellene un recipiente con Pre-Treatment Solution diluida a temperatura ambiente (20 25 C). Sumerja los cortes desparafinados en la solución y cierre la tapa. La tapa debe tener orificios para que la presión pueda escapar. Coloque el recipiente con los portaobjetos en el horno microondas y caliente. Antes de calentar, asegúrese de que la parte externa del recipiente y el interior del horno microondas estén secos. Incube justo por debajo del punto de ebullición (a no menos de 95 C) durante 10 minutos. Después de la incubación, quite la tapa (no quite los portaobjetos). ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 14/29

15 Deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre-Treatment Solution durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Los portaobjetos deben cubrirse con tampón durante el pretratamiento. Introduzca los portaobjetos a un recipiente que contenga Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2) durante 3 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el Paso 2. Método C: Pretratamiento mediante la cámara de presión Pascal Coloque 500 ml de agua desionizada dentro del platillo Pascal. Llene un recipiente de plástico con 250 ml de Pre-Treatment Solution. Sumerja los cortes desparafinados en la Pre-Treatment Solution y coloque el recipiente dentro del platillo Pascal. Incúbelo a 121 C durante 1 minuto. Libere la presión después de enfriar a 90 C. Lea a tentamente el manual de Pascal para obtener información sobre la manipulación correcta de la cámara de presión Pascal. Retire el recipiente una vez liberada la presión. Retire las tapas y deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre- Treatment Solution durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos a un recipiente que contenga Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2). Sumerja los cortes durante 3 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el Paso 2. NOTA: La Pre-Treatment Solution está diseñada para aplicarse una sola vez. No la reutilice. No utilice un recipiente hermético cuando realice un pretratamiento en un horno microondas, ya que la presión dentro del recipiente aumentará y puede explotar o causar daños cuando se abra. Puede utilizar un soporte para portaobjetos de metal en el horno microondas si el soporte de metal se sumerge en solución de pretratamiento durante el tiempo que dure el tratamiento en el microondas. En caso contrario no use metal en un horno microondas. Siga las instrucciones del fabricante del microondas. No permita que la Pre-Treatment Solution hierva continuamente durante los 10 minutos de incubación. Realice un control regular de la temperatura utilizando un termómetro calibrado para verificar que las condiciones de temperatura son correctas. Paso 2: Pepsin, lista para su uso (RTU) o solución de pepsina La incubación en Pepsin se puede realizar aplicando directamente gotas de Pepsin RTU en los portaobjetos a temperatura ambiente (20-25 C) (Método A) o a 37 C (Método B). De igual modo, también puede sumergir los portaobjetos en una solución de pepsina e incubarlos a 37 (±2) C (Método C) Método A y Método B: Golpee suavemente para eliminar el exceso de tampón. Utilizando un paño sin pelusa (por ejemplo, un paño absorbente o almohadillas de gasa), frote con cuidado alrededor de la muestra a fin de eliminar cualquier resto de líquido y de mantener los reactivos dentro del área requerida. Aplique 5-8 gotas (250 µl) de Pepsin fría (2-8 C) (Vial 2A) de forma que la muestra quede cubierta. Almacene siempre la Pepsin a 2-8 C. Método A: Pepsin, RTU: incubación a C Incube durante 5-50 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Para la mayoría de las muestras es adecuado un tiempo de incubación de minutos a temperatura ambiente, pero el usuario debe determinar el tiempo de incubación óptimo. Golpee suavemente para eliminar cualquier resto de Pepsin y empape los cortes en Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Sustituya el Wash Buffer diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el paso 3, Sonda FISH, o consulte el Apéndice 2 para optimizar el tiempo de digestión (opcional). Método B: Pepsin, RTU: incubación a 37 C Coloque las muestras con Pepsin a 37 C en el Dako Hybridizer o en un bloque de calentamiento precalentado. Incube durante 2-6 minutos a 37 C. Esto es adecuado para la mayoría de las muestras preparadas, como se describe en la sección Preparación de las muestras. El tiempo de ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 15/29

16 incubación óptimo depende del tipo de tejido, la fijación del tejido, el grosor de la muestra y de la maduración de la muestra y es el usuario quien debe determinarlo. Estos factores pueden dilatar el tiempo necesario para la digestión a 7 15 minutos o incluso más. Los usuarios primerizos deberían identificar una digestión óptima analizando una muestra representativa del tejido durante 1, 3, 6, 12 y 18 minutos. Golpee suavemente para eliminar la Pepsin y empape los cortes en Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3) durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el paso 3, Sonda FISH o consulte el Apéndice 2 para optimizar el tiempo de digestión (opcional). Método C: Solución de pepsina: inmersión de los portaobjetos en una solución de pepsina a 37 C El kit contiene suficientes reactivos para cuatro ciclos separados (60 ml de solución de pepsina, recipiente pequeño para seis portaobjetos) o un único ciclo (240 ml de solución de pepsina, recipiente grande para 24 portaobjetos). Prepare la solución de pepsina de la forma descrita en la Sección A.5. Tape el recipiente y equilibre la solución de pepsina a 37 (±2) C en un baño de agua. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Golpee para eliminar el exceso de tampón de lavado. Sumerja los portaobjetos en solución de pepsina a 37 (±2) C e incúbelos durante minutos. Un tiempo de incubación de minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender de la fijación del tejido y/o del grosor de la muestra y debe ser determinado por el usuario. Golpee suavemente para eliminar los restos de solución de pepsina y sumerja los cortes en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Sustituya el Wash Buffer y empape los cortes durante 3 minutos más. Continúe con el paso 3, Sonda FISH o consulte el Apéndice 2 para optimizar el tiempo de digestión (opcional). NOTA: Se recomienda seguir el procedimiento indicado en la sección Preparación de las muestras. Un tejido mal digerido puede hacer que no haya señales o que sean difusas, a menudo con un fondo citosílico verde elevado. Paso 3: Sonda FISH (suministrada por el usuario) NOTA: Si los reactivos de Dako Histology FISH Accessory Kit, n.º de catálogo K5799, se utilizan junto con los reactivos del n.º de catálogo K5731, debe seguirse el procedimiento descrito en el prospecto del envase del n.º de catálogo K5731. El siguiente paso debe realizarse en una campana extractora de gases. Las sondas marcadas con fluorocromos pueden verse afectadas negativamente si se exponen a niveles excesivos de luz. No realice el resto del procedimiento con mucha luz, como por ejemplo luz solar directa. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y 2 minutos en etanol al 96% (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.4). Deje que los cortes de tejido se sequen al aire completamente. Aplique una cantidad apropiada de sonda marcada con fluorocromo, por ejemplo, 10 µl de una sonda FISH de Dako en el centro del corte del tejido. Coloque inmediatamente un cubreobjetos de vidrio de 18 mm x 18 mm (o 22 mm x 22 mm) sobre la sonda y deje que se distribuya por igual bajo el cubreobjetos. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan burbujas de aire, elimínelas suavemente con unas pinzas. Selle el cubreobjetos aplicando el Coverslip Sealant alrededor de la periferia del cubreobjetos. Deje que el Coverslip Sealant se superponga al cubreobjetos y al portaobjetos; así se formará un sello alrededor del cubreobjetos. Asegúrese de que el Coverslip Sealant selle todo el borde del cubreobjetos. Introduzca los portaobjetos en Dako Hybridizer (n.º de catálogo S2450/S2451) y ajuste la desnaturalización a 82 C durante 5 minutos y la hibridación a 45 C durante la noche (14-20 h) ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 16/29

17 si se usan sondas FISH de Dako. Continúe con el Día 2, Paso 4, Lavado astringente. Consulte el manual del Hybridizer para obtener más instrucciones. NOTA: De forma alternativa, se puede utilizar un bloque de calentamiento, un horno de hibridación y una cámara de hibridación. Consulte más abajo. Coloque el portaobjetos en una superficie plana metálica o de piedra (sobre un bloque calentador o un bloque de un horno de hibridación) precalentada a 82 (±2) C. Desnaturalícelo durante 5 minutos para asegurarse de que la temperatura del bloque no baje de 80 C. Introduzca los portaobjetos en una cámara de hibridación humidificada precalentada. Cubra la cámara con una tapa e incúbela durante una noche (14-20 horas) a 45 (±2) C cuando use sondas FISH de Dako. DÍA 2 Paso 4: Lavado astringente Llene dos recipientes de tinción con Stringent Wash Buffer diluido (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2). Se requiere un volumen mínimo de 100 ml de Stringent Wash Buffer diluido para 1-6 portaobjetos en un recipiente. Para más de 6 portaobjetos use al menos 15 ml de tampón por portaobjetos. Introduzca una de las jarras de tinción que contiene Stringent Wash Buffer diluido a temperatura ambiente en una campana extractora de gases, y la otra jarra en un baño de agua. Caliente el baño de agua y el Stringent Wash Buffer diluido a 65 (±2) C. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Extraiga los portaobjetos de la cámara de hibridación. Con la ayuda de unas pinzas, elimine cuidadosamente el Coverslip Sealant y transfiera el portaobjetos al recipiente de prelavado a temperatura ambiente. Tan pronto como todos los cubreobjetos se hayan eliminado, transfiera los portaobjetos del recipiente de prelavado a temperatura ambiente al recipiente del baño de agua a 65 (±2) C en el baño de agua. Cierre la tapa del recipiente y luego la del baño de agua. Lleve a cabo un lavado astringente durante 10 minutos exactos a 65 (±2) C. Saque los portaobjetos del Stringent Wash Buffer diluido y empape los cortes en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20 25 C). Cambie el Wash Buffer diluido y empape los cortes durante 3 minutos más. Deshidrate los cortes de tejido mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y 2 minutos en etanol al 96% (consulte INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.4). Deje que los portaobjetos se sequen completamente al aire. Paso 5: Montaje Aplique 15 µl de Fluorescence Mounting Medium (Vial 5), que contiene una contratinción fluorescente azul, al área diana del portaobjetos y aplique un cubreobjetos de vidrio (p. ej., de 24 mm x 50 mm o 24 mm x 60 mm). Deje que el medio se extienda de forma uniforme sobre la muestra. NOTA: Puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. Si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. Los portaobjetos deben almacenarse en la oscuridad a C. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 17/29

18 Control de calidad 1. Las señales deben ser brillantes, bien diferenciadas y fáciles de evaluar. 2. Los tejidos normales que hayan demostrado previamente una buena FISH se deben usar como control de cada ciclo de análisis. 3. Las células de tejido normal deben tener señales de fluorescencia claramente visibles, lo que indica que las sondas FISH se han hibridado con éxito en las regiones diana. 4. Si no se detectan señales en células de tejidos normales, es una indicación de que el ensayo no ha funcionado correctamente y los resultados se deben considerar no válidos. 5. Debido a los cortes del tejido, algunas células normales pueden producir un número inferior de señales a las esperadas. 6. La morfología del núcleo debe estar intacta y homogéneamente teñida para evaluarla utilizando un filtro para DAPI. Muchas células fantasma, células en donut y, en general, una morfología nuclear pobre, indican una sobredigestión o una sobredesnaturalización de la muestra, que tiene como resultado la pérdida o fragmentación de las señales. Una tinción periférica, agujeros en las células (filtro DAPI) y/o un fondo citosílico verde elevado en la tinción cuando se observan con un doble filtro para Texas Red/FITC pueden indicar una infradigestión, que provoca una pérdida de la señal. Tales muestras deben considerarse no válidas. 7. Las diferencias en la fijación, el procesado y la inclusión del tejido en el laboratorio del usuario pueden generar variabilidad en los resultados, por lo que es necesario que el usuario lleve a cabo una evaluación regular de sus propios controles. Interpretación de los resultados Examine varias áreas de células para tener en cuenta una posible heterogenicidad. Seleccione una área que tenga una distribución óptima de núcleos. Empezando el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada, vaya examinando de izquierda a derecha y cuente el número de señales dentro de los límites del núcleo de cada núcleo evaluado según las siguientes pautas. Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales. No cuente los núcleos sin señales. No incluya núcleos que requieran un juicio subjetivo. Ignore los núcleos que presenten una intensidad de señal débil y tinción no específica o tinción de fondo alta. El usuario debe determinar el número de núcleos que se deben contar para cada sonda. Evite las áreas donde los bordes nucleares sean ambiguos. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 18/29

19 Solución de problemas Problema Causa probable Solución sugerida 1. No hay señales o son débiles 1a. Tiempo de digestión inadecuado. 1b. El kit ha sido expuesto a altas temperaturas durante el transporte o el almacenamiento. 1c. Condiciones de pretratamiento incorrectas. 1d. Condiciones de desnaturalización incorrectas. 1e. Temperatura de hibridación incorrecta. 1a. Asegúrese de usar cortes de tejido fijados con formol e incluidos en parafina. Puede ayudar un tiempo de digestión prolongado de, por ejemplo, 7-15 minutos o más a 37 C. Consulte el Paso 2 de la Sección B.3.a o B.3.b, los puntos 4d y 4e de la sección Solución de problemas y el Apéndice 2. 1b. Compruebe las condiciones de almacenamiento. Asegúrese de que había hielo seco presente en el kit cuando lo recibió. Asegúrese de que los viales 2A y 5 se hayan almacenado a 2 8 C y que el vial 5 haya sido almacenado en la oscuridad. 1c. Asegúrese de que se haya usado la temperatura de pretratamiento y los tiempos recomendados. Asimismo, asegúrese de que el tiempo de incubación para la digestión se haya optimizado en caso necesario; consulte el Paso 2 de la Sección B.3.a o B.3.b. Cuanto más cerca esté del punto de ebullición la temperatura de pretratamiento, más fuertes serán las señales. Asegúrese de que la Pepsin se manipule a la temperatura correcta. Consulte la Sección B.1. 1d. Asegúrese de que se haya usado la temperatura de desnaturalización y los tiempos recomendados. 1e. Realice la hibridación a 45 (±2) C cuando utilice sondas FISH de Dako. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 19/29

20 1f. Evaporación del tampón de sonda durante la hibridación. 1g. Condiciones de lavado astringente incorrectas. 1h. El microscopio no funciona correctamente - Juego de filtros inapropiado - Lámpara no adecuada - Lámpara de mercurio demasiado vieja - Filtros quemados - Objetivos colectores sucios y/o con fisuras - Aceite de inmersión inadecuado 1f. Asegúrese de que haya suficiente humedad en la cámara de hibridación. Utilice Dako Hybridizer (n.º de catálogo S2450/S2451) e Hybridizer Humidity Control Strips (n.º de catálogo S2452). Use un Coverslip Sealant. Consulte el punto 5a y 5b de la Solución de problemas. 1g. Asegúrese de usar el volumen, temperatura y el tiempo de lavado astringente recomendados y de quitar los cubreobjetos antes del lavado astringente. 1h. Compruebe el microscopio y asegúrese de que se estén empleando los filtros adecuados para los fluorocromos, que no estén gastados, que la lámpara de mercurio sea la adecuada y que no se haya usado durante más tiempo de la vida media esperada (consulte el Apéndice 1). Utilice un aceite de inmersión adecuado para la fluorescencia. En caso de duda, contacte con el vendedor del microscopio. 1i. Señales poco intensas. 1i. Evite el examen microscópico prolongado y minimice la exposición a fuertes fuentes de luz. 2. Áreas sin señal. 2a. Volumen de sonda demasiado pequeño. 2b. Burbujas de aire atrapadas durante la aplicación de la sonda o el montaje. 2a. Asegúrese de que el volumen de sonda sea lo suficientemente grande como para cubrir el área bajo el cubreobjetos. 2b. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan, elimínelas suavemente con la ayuda de unas pinzas. 2c. Desparafinado deficiente. 2c. Asegúrese de haber eliminado por completo la parafina de los cortes. Consulte la Sección B.2. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 20/29

21 3. Excesiva tinción de fondo 4. Morfología nuclear pobre o tinción débil de los núcleos 3a. Tiempo de digestión inadecuado. Un fuerte fondo citosílico verde puede indicar una infradisgestión. 3b. Los cortes se han secado en B.3. 3c. No se eliminó completamente la parafina. 3d. Temperatura del lavado astringente demasiado baja. 3e. Exposición prolongada del corte hibridado a una luz fuerte. 3f. Los portaobjetos de vidrio o no adecuados pueden causar una excesiva tinción roja de cielo estrellado). 3g. Aceite de inmersión no fluorescente mezclado en Fluorescence Mounting Medium. 4a. Unas condiciones de pretratamiento incorrectas pueden tener como resultado un aspecto poco claro y turbio. 4b. Si se hierve durante el pretratamiento, se pueden producir daños en la morfología y la ausencia de señales. 3a. Asegúrese de usar cortes de tejido fijados con formol e incluidos en parafina. Puede ayudar un tiempo de digestión prolongado de, por ejemplo, 7 15 minutos a 37 C. Consulte la Sección B.3.a o B.3.b. Paso 2, Solución de problemas, punto 4e, y Apéndice 2. 3b. Siga las instrucciones y evite el secado de los portaobjetos a no ser que se indique lo contrario. 3c. Siga los procedimientos de desparafinado y rehidratación descritos en la Sección B.2 3d. Asegúrese de que se utiliza la temperatura de lavado astringente recomendada. 3e. Evite el examen microscópico prolongado y minimice la exposición a luz fuerte. 3f. Utilice los tipos de portaobjetos recomendados y asegúrese de que no hayan caducado. Consulte la Sección Cortes incluidos en parafina. 3g. Use cubreobjetos de vidrio grandes en el montaje según se recomienda. Consulte el Paso 5 de la Sección B.3.a o B.3.b. Esto evita que el aceite de inmersión se mezcle con el medio de montaje y la autofluorescencia y la eliminación accidental de los cubreobjetos con el objetivo del microscopio. 4a. Asegúrese de que se haya usado la temperatura de pretratamiento y los tiempos recomendados. Consulte también el punto 4b-e de Solución de problemas. 4b. Evite la ebullición. Consulte la Sección B.3, Paso 1. Consulte además el punto 4d de Solución de problemas. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 21/29

22 5. El cubreobjetos se pega fuertemente al portaobjetos de vidrio después de la hibridación y resulta difícil de quitar. 4c. Tratamiento con Pepsin incorrecto. 4d. Un tratamiento con Pepsin excesivamente largo disolverá el tejido y producirá la ausencia de señales. Una sobredigestión puede hacer que aparezcan células fantasma o núcleos en donut y núcleos con una morfología general deficiente. 4e. Un tratamiento con Pepsin excesivamente corto puede traducirse en la ausencia de señales. Un tejido deficientemente digerido puede causar la tinción de los núcleos periféricos y agujeros en los núcleos (filtro DAPI); fuerte fondo verde en el citosol (doble filtro Texas Red/FITC). Observe que los núcleos de los tejidos infradigeridos tienen una buena morfología, en contraste con los tejidos sobredigeridos. 4f. Temperatura de desnaturalización demasiado alta. 4g. Condiciones de hibridación incorrectas. 5a. Cubreobjetos incorrectamente sellado al portaobjetos de vidrio. 4c. Cíñase a los tiempos de incubación con Pepsin recomendados. Consulte la Sección B.3, paso 2 y el Apéndice 2. Véanse, además, los puntos 1a, 1c, 3a, 4d y 4e en la Sección Solución de problemas. 4d. Acorte el tiempo de incubación con Pepsin. Consulte el Paso 2 de la Sección B.3.a o B.3.b y el Apéndice 2. Asegúrese de que el grosor del corte es de 2-6 µm. Consulte además los puntos 1a, 1c, 4b y 4e en la Sección Solución de problemas. 4e. Prolongue el tiempo de incubación de Pepsin a, por ejemplo, 2 3 veces el tiempo de digestión usado. Consulte también los puntos 1a, 1c, 3a, 4a y 4d de la Sección Solución de problemas. 4f. Asegúrese de que se utiliza la temperatura de desnaturalización recomendada. 4g. Consulte los puntos 1f y 5b de la Sección Solución de problemas. 5a. No fuerce el cubreobjetos si se ha quedado muy pegado al portaobjetos de vidrio. Sumerja el portaobjetos en el recipiente que contiene Stringent Wash Buffer diluido a temperatura ambiente durante cinco minutos y retire luego el cubreobjetos. Siga las recomendaciones para el sellado del cubreobjetos en el Paso 3 de la Sección B.3. Consulte además los puntos 1f y 5b de la Sección Solución de problemas. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 22/29

23 6. Alto nivel de autofluorescencia verde en el portaobjetos, incluyendo las zonas sin tejido FFPE 5b. Condiciones de hibridación incorrectas. Puede provocar la reducción o ausencia de señales, daños en el tejido y tinción de fondo. 6. Uso de portaobjetos de vidrio caducados o no recomendados 5b. Asegúrese de que haya suficiente humedad en la cámara de hibridación. Utilice Dako Hybridizer (n.º de catálogo S2450/S2451) e Hybridizer Humidity Control Strips (n.º de catálogo S2452). Siga las instrucciones del prospecto del envase de Hybridizer Humidity Control Strips. Consulte las condiciones de hibridación recomendadas en el Paso 3 de la Sección B.3.a o B.3.b. Consulte además los puntos 1f y 5a de la Sección Solución de problemas. 6. Asegúrese de que el portaobjetos revestido de vidrio (Dako Silanized Slides, nº de catálogo S3003 o portaobjetos recubierto de poli-l-lisina) no haya caducado. NOTA: Si no puede atribuirse el problema a ninguna de las circunstancias anteriores, o si la acción correctiva sugerida no lo soluciona, póngase en contacto con el Servicio Técnico de Dako para solicitar más ayuda. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 23/29

24 Apéndice 1 Histology FISH Accessory Kit, nº de catálogo K5799 Especificaciones del microscopio de fluorescencia Dako recomienda el siguiente equipamiento para su uso con el Histology FISH Accessory Kit cuando se utilicen sondas FISH de Dako: 1. Tipo de microscopio Microscopio de epifluorescencia. 2. Lámpara Lámpara de mercurio de 100 vatios (por lo general se debe reemplazar cada 200 horas). 3. Objetivos Para el cribaje del tejido, puede aplicar objetivos de fluorescencia a seco 10X u objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión 16X. Para un aumento de alta potencia y para la puntuación de las señales, le recomendamos que utilice exclusivamente objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión, por ejemplo, 63X o 100x. 4. Filtros Los filtros están diseñados individualmente para cada fluorocromo concreto, y debe elegirlos en consonancia. Dako recomienda el uso de un filtro específico para DAPI en combinación con un doble filtro de alta calidad específico para Texas Red/FITC cuando se utilicen sondas FISH de Dako. Filtro DAPI, por ejemplo filtro Omega Optical nº XF06 o filtro Chroma nº Filtro doble Texas Red/FITC, por ejemplo, filtro Omega Optical nº XF53 o filtro Chroma nº Puede utilizar un filtro sencillo para Texas Red y FITC con fines de confirmación, p. ej., filtro Omega Optical n.º XF102-2 y XF202, respectivamente. Fluorocromo Longitud de onda de excitación Longitud de onda de emisión FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Los filtros son específicos de cada tipo de microscopio y el uso de los filtros adecuados es crucial para la interpretación. Su proveedor de, el representante de Dako o la página Web de Dako le pueden proporcionar información adicional más detallada. 5. Aceite Aceite de inmersión no fluorescente. Precauciones Los fluorocromos específicos requieren un equipamiento diferente. No se recomienda una lámpara de mercurio de 50 vatios para las sondas FISH de Dako; no se pueden usar filtros de rodamina y no se recomiendan, en general, los filtros triples. Un microscopio no optimizado puede causar problemas al leer las señales fluorescentes. Es importante que la fuente de luz no haya caducado y que esté correctamente alineada y enfocada. Los clientes deben comprobar y seguir las recomendaciones del fabricante para la lámpara de mercurio y deben realizar el mantenimiento del microscopio. Debe esforzarse por exponer la muestra a la menor cantidad de luz de excitación posible a fin de minimizar el desvanecimiento de la fluorescencia. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 24/29

25 Le recomendamos que consulte acerca del ajuste de su microscopio con el fabricante antes de comenzar con la hibridación in situ fluorescente o vea la bibliografía pertinente. Apéndice 2 Paso opcional para optimizar el tiempo de digestión con Pepsin Este paso opcional se puede usar para evaluar el efecto de la digestión con Pepsin y para ayudar a optimizar el tiempo de digestión usado en el paso 2, Pepsin. Para controlar si el tiempo de digestión con Pepsin usado es suficiente, tiña el corte de tejido lavado y digerido con Pepsin con 10 µl de yoduro de propidio suministrado por el usuario (400 ng/ml). Coloque un cubreobjetos de vidrio de 22 mm x 22 mm sobre el yoduro de propidio y deje que se distribuya por igual bajo el cubreobjetos. Incúbelo durante 1 minuto. Use un microscopio de fluorescencia con un filtro doble Texas Red/FITC (consulte el Apéndice 1) para evaluar la tinción roja de los núcleos con el yoduro de propidio. Si la digestión del tejido es aceptable, debería haber núcleos rojos bien delimitados. Elimine el yoduro de propidio sumergiendo los cortes dos veces en el Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) y continúe en la Sección B3, Protocolo de tinción, Paso 3, Sonda FISH. Si los núcleos son aún verdes mediante autofluorescencia y no se tiñen de rojo con el yoduro de propidio, es necesario que repita el ciclo de digestión. Sumerja los cortes en el Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) hasta eliminar el yoduro de propidio. Aplique 5-8 gotas (250 µl) de Pepsin (Vial 2) fría (2-8 C) para cubrir la muestra. Conserve siempre el vial de Pepsin a 2-8 C. Coloque los portaobjetos a 37 C en un bloque de calentamiento precalentado o en el Dako Hybridizer. Incúbelos durante 10 minutos si no se ha producido la digestión o ésta ha sido insuficiente. Los 10 minutos son sólo una pauta, el usuario debe determinar el tiempo óptimo. Sumerja de nuevo los cortes en el Wash Buffer diluido dos veces durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) hasta eliminar la Pepsin. Aplique una vez más 10 µl de yoduro de propidio (400 ng/ml) durante 1 minuto. Evalúe la tinción y sumerja dos veces los cortes en el Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Repita el ciclo si fuera necesario o continúe en la Sección B.3.a o B.3.b, Protocolo de tinción, Paso 3, Sonda FISH. NOTA: El kit contiene reactivos suficientes para 20 pruebas. El uso del Wash Buffer y la Pepsin en este paso opcional reducirá el número total de pruebas posibles con el kit. ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 25/29

26 Bibliografía 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Explicación de los símbolos Nú mero d e catálo go Límite d e temp eratu ra Có digo de lote Ir ritante Prod ucto san itario p ara diag nóstico in vitro Co nsu lte las in stru ccion es de u so Manté nga se aleja do de la luz solar (consu lte la se cc ión sobre alm acen amie nto) salmacen amie nto Co ntenido suficien te p ara <n > e nsayos Fech a de ca ducidad Fab rican te Extre mad ame nte inflama ble Pe lig roso pa ra el me dio am bie nte ( ) SSK5799CE_003/ES/SVM/ p. 26/29

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