HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) N.º de catálogo GM333

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1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) N.º de catálogo GM333 2ª edición HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es un ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH) directo diseñado para la determinación cuantitativa de la amplificación del gen HER2 en muestras tisulares de cáncer de mama fijadas con formol e incluidas en parafina (FFPE) y muestras FFPE procedentes de pacientes con adenocarcinoma metastásico gástrico o de la unión gastroesofágica. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) está indicado como complemento de HercepTest en la evaluación de pacientes para los que se está considerando un tratamiento con Herceptin. El vial contiene reactivos suficientes para 20 pruebas. Reactivos accesorios para usar con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): N.º de catálogo Nombre del producto GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 1/57

2 Índice Página Uso previsto... 3 Principio del procedimiento - Mama... 4 Reactivos - Mama... 5 Precauciones - Mama... 6 Almacenamiento - Mama... 7 Preparación de las muestras - Mama... 7 INSTRUCCIONES DE USO - Mama... 8 A. Preparación de los reactivos - Mama... 8 B. Procedimiento de tinción - Mama Control de calidad - Mama Interpretación de la tinción - Mama Limitaciones - Mama Características de resultados Mama Solución de problemas - Mama Apéndice 1 - Mama Apéndice 2 - Mama Resumen y explicación - Gástrico Principio del procedimiento - Gástrico Reactivos - Gástrico Precauciones - Gástrico Almacenamiento - Gástrico Preparación de las muestras - Gástrico INSTRUCCIONES DE USO - Gástrico A. Preparación de los reactivos - Gástrico B. Procedimiento de tinción - Gástrico Control de calidad - Gástrico Interpretación de la tinción - Gástrico Limitaciones - Gástrico Características de resultados - Gástrico Solución de problemas - Gástrico Apéndice 3 - Gástrico Apéndice 4 - Gástrico Apéndice 5 - Gástrico Referencias Explicación de símbolos ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 2/57

3 Uso previsto Para uso diagnóstico in vitro. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es la sonda de hibridación para el ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH) directo automatizado del instrumento Dako Omnis y, junto con los dispositivos de reactivos accesorios, está diseñada para la determinación cuantitativa de la amplificación del gen HER2 en muestras tisulares de cáncer de mama fijadas con formol e incluidas en parafina (FFPE) y muestras FFPE procedentes de pacientes con adenocarcinoma metastásico gástrico o de la unión gastroesofágica. HER2 IQFISH pharmdx está indicado como complemento de HercepTest en la evaluación de pacientes para los que se está considerando un tratamiento con Herceptin (trastuzumab) (véase el prospecto de Herceptin ). Para los pacientes con cáncer de mama, los resultados de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) están indicados para su uso como complemento de la información clínicopatológica utilizada actualmente para estimar el pronóstico en pacientes con cancer de mama con nodos positivos, de estadio II. En este documento, al adenocarcinoma gástrico o de la unión gastroesofágica también se denomina cáncer gástrico. Consulte las páginas 4-28 para obtener información sobre su aplicación para el cáncer de mama. Consulte las páginas para obtener información sobre su aplicación para el cáncer gástrico. Importante: Obsérvense las diferencias para el tejido de cáncer de mama y el tejido de cáncer gástrico especialmente en los apartados relativos a la Interpretación de la tinción. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 3/57

4 Cáncer de mama Resumen y explicación - Mama El gen HER2 humano (también conocido como ERBB2 o NEU) está ubicado en el cromosoma 17 y codifica la proteína HER2, también llamada p185 HER2. La proteína HER2 es una tirosin quinasa del receptor de membrana que presenta homología con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR o HER1) (1-2). El gen HER2 está presente en dos copias en todas las células diploides normales. En una proporción de pacientes con cáncer de mama, el gen HER2 se amplifica como parte del proceso de transformación maligna y progresión tumoral (3-8). Generalmente, la amplificación del gen HER2 lleva a una sobreexpresión de la proteína HER2 en la superficie de las células cancerosas mamarias (9). Se ha demostrado amplificación del gen HER2 y/o sobreexpresión de su proteína en el 20-25% de los cánceres de mama (10). Este aumento de la expresión se asocia con un pronóstico adverso, un aumento del riesgo de recurrencia y una reducción de las expectativas de vida. Varios estudios han demostrado que el estado en cuanto a HER2 está correlacionado con la sensibilidad o resistencia a determinados regímenes quimioterapéuticos (11). La demostración de una elevada sobreexpresión de la proteína HER2 o de amplificación del gen HER2 es esencial para iniciar la terapia con Herceptin, que es un anticuerpo monoclonal contra la proteína HER2. Los estudios clínicos han demostrado que los pacientes cuyos tumores presentan una alta sobreexpresión de la proteína HER2 y/o amplificación del gen HER2 son los que más se benefician del tratamiento con Herceptin (12). Este producto (HER2 IQFISH pharmdx [Dako Omnis]) es una IQISH Probe Mix para FISH directo automatizado, que detecta la amplificación del gen HER2. Este producto debe utilizarse junto con los reactivos accesorios especificados en Dako Omnis y deriva del ensayo de amplificación del gen HER2 de ejecución manual, HER2 IQFISH pharmdx, n.º de catálogo K5731. Principio del procedimiento - Mama HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es una IQISH Probe Mix que se compone de una mezcla de sondas de ADN marcadas con Texas Red y que cubre una región de 218 kb, incluido el gen HER2 del cromosoma 17 y una mezcla de sondas de ácido nucleico peptídico (ANP) (13) marcadas con fluoresceína específicas para la región centromérica del cromosoma 17 (CEN-17). La hibridación específica de ambas dianas conduce a la formación de una señal fluorescente roja bien definida en cada locus del gen HER2, así como de una señal fluorescente verde bien definida en cada centrómero del cromosoma 17. La evaluación de la amplificación del gen HER2 con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es un método totalmente automatizado en el instrumento Dako Omnis. Se pueden seleccionar tres protocolos de tinción diferentes HER2 FISH validados en el software de la estación de trabajo Dako Link Omnis. Los protocolos solo difieren en el tiempo de digestión con pepsina; por tanto, se puede seleccionar la digestión con pepsina de 10 minutos (el protocolo corto), de 15 minutos (el protocolo medio) o de 20 minutos (el protocolo largo) (consulte más información a continuación). Se recomienda el protocolo medio para el análisis inicial. Tras la tinción en el sistema Dako Omnis, las muestras se montan con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) que contiene 4',6-diamidina-2-fenilindol (DAPI) y se cubren con cubreobjetos. Utilizando un microscopio de fluorescencia dotado de los filtros apropiados (consulte el Apéndice 2), se localizan las células tumorales, y se lleva a cabo la enumeración de las señales rojas (HER2) y verdes (CEN-17). Después, se calcula la proporción HER2/CEN-17. Las células normales presentes en la sección de tejido analizada sirven como control positivo interno de la tinción. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 4/57

5 Cáncer de mama Consulte el apartado Interpretación de la tinción para obtener información detallada al respecto. Consulte los Manuales del usuario de Dako Omnis para ver instrucciones detalladas sobre la carga y descarga de portaobjetos, tapas ISH Lid (Dako Omnis), reactivos, líquidos y residuos. Reactivos - Mama HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y los reactivos accesorios se pueden solicitar por separado como reactivos sueltos. Materiales suministrados HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): mezcla de 1,6 ml lista para su uso de sondas de ADN para HER2 marcadas con Texas Red y sondas de ANP CEN-17 marcadas con fluoresceína, suministrada en el tampón de hibridación IQISH. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se suministra sobre hielo seco. Como garantía de que el reactivo no se ha expuesto a altas temperaturas durante el transporte, aún debe quedar hielo seco en el envío en el momento de la recepción. Los viales de reactivos, junto con su contenido descongelado, deben almacenarse y manipularse en posición vertical en todo momento. El vial del reactivo contiene una bola metálica recubierta de oro que permite la mezcla del reactivo con el dispositivo de mezcla Dako Omnis (consulte el Manual del usuario del dispositivo de mezcla Dako Omnis). Es importante que el reactivo se mezcle concienzudamente antes de cargarlo en Dako Omnis. Material necesario pero no suministrado Reactivos accesorios Los siguientes reactivos son necesarios en el instrumento Dako Omnis para realizar el análisis de la amplificación del gen HER2 con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, concentrado 20x; para diluir 1:20 en una garrafa de 3,5 l Dako Omnis (n.º de catálogo GC109). El producto contiene un agente antimicrobiano y presenta un color verde inerte para favorecer la identificación y facilidad de uso. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml de etanol al 96% (listo para su uso). ISH Pepsin (Dako Omnis): solución de pepsina A de 7 ml (lista para su uso), ph 2,0; contiene un estabilizante y un agente antimicrobiano. La pepsina se suministra sobre hielo seco. Como garantía de que el reactivo no se ha expuesto a altas temperaturas durante el transporte, aún debe quedar hielo seco en el envío en el momento de la recepción. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml, concentrado 20x de tampón con citrato de sodio salino; para diluir 1:20 en una garrafa de 3,5 l Dako Omnis (n.º de catálogo GC109). El producto contiene un agente antimicrobiano, un detergente y presenta un color amarillo inerte para favorecer la identificación y facilidad de uso. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): medio fluorescente para montaje de 0,8 ml (listo para su uso) con DAPI. Aunque los reactivos anteriores no se suministran con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), se describen brevemente a continuación. Consulte las instrucciones de uso de cada dispositivo para obtener más información. Reactivos y dispositivos adicionales Dako Omnis, n.º de catálogo GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), n.º de catálogo GC807 Clearify, n.º de catálogo GC810 Dako Omnis Mixing Device, n.º de catálogo GC116 ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 5/57

6 Tapa ISH Lid, n.º de catálogo GC102 ISH Cleaning Solution, n.º de catálogo GC207 Cubreobjetos de vidrio para montaje (24 mm x 50 mm) Cáncer de mama Consulte los Manuales básico y avanzado del usuario de Dako Omnis si desea obtener más información sobre cómo utilizar los reactivos y los dispositivos adicionales. Equipo de microscopía y accesorios Filtros para microscopio de fluorescencia: doble filtro para DAPI y FITC/Texas Red, o monofiltros para FITC y Texas Red; consulte el Apéndice 2 para obtener detalles al respecto. El uso del filtro para DAPI a alta amplificación afecta negativamente a la intensidad de la señal. Deben evitarse largos tiempos de exposición. Debe utilizarse un microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio de 100 vatios como fuente de luz. No se recomiendan otras fuentes de luz con estos filtros. Bandeja plegable para portaobjetos de microscopía (bandeja de cartón para 20 portaobjetos con cubierta de bisagra o similar). Precauciones - Mama 1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Para usuarios profesionales. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene 10-<25% de carbonato de etileno y 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) está etiquetado como sigue: Atención H319 Provoca irritación grave en los ojos. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos concienzudamente tras la manipulación. P305 + P351 + P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Como regla general, los menores de 18 años no pueden manipular este producto. Los usuarios deben recibir formación detallada sobre el procedimiento de trabajo adecuado, las propiedades peligrosas del producto y las instrucciones de seguridad necesarias. Le rogamos que consulte la hoja de datos de seguridad para obtener información más detallada. 4. Las muestras tisulares, antes y después de la fijación, así como todos los materiales expuestos a ellas, deben manipularse como capaces de transmitir infecciones, y desecharse con las precauciones apropiadas (14). Nunca pipetee reactivos con la boca y evite el contacto de la piel y membranas mucosas con reactivos y muestras. Si los reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lávelas con abundante agua. 5. A fin de evitar resultados erróneos, minimice la contaminación microbiana del reactivo. 6. El uso de métodos de fijación de tejidos y de grosores de muestras distintos a los especificados puede afectar negativamente a la morfología del tejido y/o a la intensidad de la señal. 7. El reactivo suministrado se ha diluido de forma óptima. Una mayor dilución puede provocar pérdida de eficacia. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 6/57

7 Cáncer de mama 8. Lleve puesto equipo protector personal apropiado a fin de evitar que el producto entre en contacto con los ojos y la piel. Le rogamos que consulte la hoja de datos de seguridad (SDS) para obtener información más detallada. 9. La solución no utilizada debe desecharse de acuerdo a las normativas locales, nacionales y de la UE. Almacenamiento - Mama Almacene HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) < -18 C (se recomienda de -18 C a -25 C) en un lugar oscuro. Guarde el vial de reactivo descongelado en posición vertical en todo momento. Congelar y descongelar el reactivo hasta un máximo de 10 veces no afecta a la eficacia. No deje este componente a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y los reactivos accesorios: ISH Pepsin (Dako Omnis) y Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pueden verse afectados negativamente si se exponen al calor. No deje estos componentes a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y el reactivo accesorio Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pueden verse afectados negativamente si se exponen a niveles excesivos de luz. No almacene estos componentes ni lleve a cabo análisis bajo una luz intensa, por ejemplo, la luz solar directa. Almacene los reactivos accesorios ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) y Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) en un lugar oscuro a 2-8 C. Almacene ISH Pepsin (Dako Omnis) a C. El tapón del vial, incluida la t apa superior, debe estar cerrado en todos los reactivos durante el almacenamiento. Las soluciones diluidas (solución de trabajo ISH Stringent Wash Buffer y solución de trabajo ISH Pre-Treatment Solution) se pueden almacenar a 2-8 C durante 30 días. No utilice ningún reactivo después de la fecha de caducidad impresa en el envase del reactivo. Durante el almacenamiento, debe cerrarse el tapón del reactivo (incluida la tapa superior). Si los reactivos se almacenan en condiciones diferentes a las especificadas, el usuario deberá validar el rendimiento del reactivo (15). No existen signos evidentes que indiquen inestabilidad de este producto. Por lo tanto, es importante evaluar células normales presentes en el corte de tejido analizado. Si observa un patrón de fluorescencia inesperado que no pueda explicarse y sospecha que existe un problema con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) o sus reactivos accesorios, póngase en contacto con el servicio técnico de Dako. Estabilidad en el instrumento Dako Omnis La estabilidad de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y de los reactivos accesorios: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) es de 80 horas. La estabilidad de ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluida y de ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) es de 7 días. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo. Si se usan reactivos caducados, el instrumento Dako Omnis emitirá una advertencia; se cambiará el estado de todos los portaobjetos teñidos con el reactivo caducado a sospechoso y en el registro de portaobjetos de la estación de trabajo se indicará que se ha utilizado un reactivo caducado. Preparación de las muestras - Mama Las muestras de biopsias, excisiones o resecciones deben manipularse de tal forma que se conserve el tejido para el análisis FISH. Deben utilizarse con todas las muestras los métodos estándar de procesamiento de tejidos para su tinción inmunocitoquímica (16). ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 7/57

8 Cáncer de mama Cortes de tejido en parafina Solo los tejidos conservados en formol tamponado neutro y en parafina son adecuados para su uso. Las muestras deben cortarse en bloques de, por ejemplo, 3 o 4 mm de espesor, y fijarse durante horas con formol tamponado neutro. Después, se deshidratan los tejidos en una serie graduada de etanol y xileno, seguido de una infiltración con parafina fundida a una temperatura no superior a 60 C. Los tejidos correctamente fijados e incluidos se conservarán indefinidamente antes de su seccionamiento y montaje en portaobjetos si se almacenan en un sitio fresco (15-25 C) (16-17). No es adecuado ningún otro fijador. Las muestras de tejido deben cortarse en secciones de 4-6 µm. Los portaobjetos requeridos para el análisis de la amplificación del gen HER2 y la verificación de la presencia de tumores deben prepararse a la vez. Se recomienda realizar un mínimo de dos secciones en serie, una sección para la verificación de la presencia de tumores teñida con hematoxilina y eosina (tinción H&E), y una sección para el análisis de la amplificación del gen HER2. Se recomienda montar los cortes de tejido en los portaobjetos Dako FLEX IHC Microscope Slides, n.º de catálogo K8020. Los portaobjetos Superfrost Plus Slides (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) también son apropiados. Asegúrese de que los portaobjetos de vidrio no han pasado la fecha de caducidad. Las muestras deben analizarse dentro de un período inferior a 6 meses tras el seccionamiento, siempre que se almacenen a 2-25 C. NOTA: Las muestras tisulares deben colocarse en el vidrio, dentro del área de tinción definida del portaobjetos. Consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis si desea información sobre las dimensiones del área de tinción del portaobjetos. INSTRUCCIONES DE USO - Mama A. Preparación de los reactivos - Mama A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) El vial HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene una bola metálica recubierta de oro que se utiliza para mezclar. Antes de cargar el vial en Dako Omnis, debe descongelarse el reactivo y mezclarse a conciencia, ya que se separa en fases durante la refrigeración. Utilice el dispositivo de mezcla Dako Omnis para mezclar la sonda. Siga el procedimiento que se indica a continuación para mezclar la sonda en el dispositivo de mezcla Dako Omnis y consulte el Manual del usuario del dispositivo de mezcla si desea más información. 1. Saque el vial de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) del congelador. 2. Cargue el vial en el dispositivo de mezcla Dako Omnis. 3. Conecte el dispositivo de mezcla y asegúrese de que esté encendida la luz de estado verde. Seleccione el programa "descongelar + mezclar". Importante: Los viales almacenados por debajo de -25 C deben descongelarse (justo) antes de cargar el vial en el dispositivo de mezcla Dako Omnis y se debe utilizar el programa de "mezcla". 4. Retire el vial del dispositivo de mezcla. 5. Levante hacia atrás la tapa superior y colóquela en la posición de corte (consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis si desea más información). 6. Cargue inmediatamente el vial en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) del instrumento Dako Omnis. Si se utiliza la función de carga continua de reactivos durante la sesión de tinción, asegúrese de que el tiempo desde la mezcla a la aspiración del vial en Dako Omnis es de al menos de 10 minutos. La sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se puede volver a descongelar y utilizar hasta un máximo de 10 veces. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 8/57

9 Cáncer de mama Mezcle siempre la HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Probe Mix justo antes de cargarla en el instrumento. No se debe agitar. La estabilidad total en el instrumento de ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) será transferido inmediatamente tras el tiempo en carga en Dako Omnis a < -18 C (se recomienda de -18 C a -25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Prepare una solución de trabajo diluyendo el concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 de la siguiente forma: 1. Llene una garrafa de 3,5 l del sistema Dako Omnis, marcada como PTB (etiqueta azul), con agua desionizada hasta la línea de llenado (3,325 l). Antes de proceder al llenado, asegúrese de que la garrafa esté colocada en una superficie horizontal. 2. Vacíe un frasco con 175 ml de concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) en la garrafa. 3. Quite la etiqueta del frasco de concentrado y péguela en la garrafa. Cierre la tapa de la garrafa e invierta la garrafa con cuidado 2-3 veces. 4. Utilice el lector de códigos de barras de mano Dako Omnis para identificar el reactivo (escanee la etiqueta despegable y la garrafa). 5. Cargue inmediatamente la garrafa en el instrumento Dako Omnis. La solución diluida puede utilizarse durante un periodo de 7 días si se almacena en el instrumento Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). La solución diluida no utilizada puede almacenarse a 2-8 C durante 30 días. Tras el almacenamiento en frío, asegúrese de que la solución diluida está estabilizada al menos a 18 C antes de cargarla en Dako Omnis. NOTA: Deseche la solución diluida si está turbia. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Prepare una solución de trabajo diluyendo el concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 de la siguiente forma: 1. Llene una garrafa de 3,5 l del sistema Dako Omnis, marcada como PTB (etiqueta azul), con agua desionizada hasta la línea de llenado (3,325 l). Antes de proceder al llenado, asegúrese de que la garrafa esté colocada en una superficie horizontal. 2. Vacíe un frasco con 175 ml de concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) en la garrafa. 3. Quite la etiqueta del frasco de concentrado y péguela en la garrafa. Cierre la tapa de la garrafa e invierta la garrafa con cuidado 2-3 veces. 4. Utilice el lector de códigos de barras de mano Dako Omnis para identificar el reactivo (escanee la etiqueta despegable y, a continuación, la garrafa). 5. Cargue inmediatamente la garrafa en el instrumento Dako Omnis. La solución diluida puede utilizarse durante un periodo de 7 días si se almacena en el instrumento Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). La solución diluida no utilizada puede almacenarse a 2-8 C durante un máximo de 30 días. Tras el almacenamiento en frío, asegúrese de que la solución diluida está estabilizada al menos a 18 C antes de cargarla en Dako Omnis. NOTA: Deseche la solución diluida si está turbia. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) es un reactivo listo para su uso. Antes de cargarlo en Dako Omnis, levante hacia atrás la tapa superior del tapón y colóquela en la posición de corte. La estabilidad total en el instrumento de ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 9/57

10 Cáncer de mama reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). Tras la finalización de una sesión, ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) se puede transferir a temperatura de almacenamiento (2-8 C) para conservar el tiempo de estabilidad en el instrumento. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) es un reactivo listo para su uso. Antes de cargarlo en Dako Omnis, asegúrese de que el reactivo se ha descongelado y levante hacia atrás la tapa superior del tapón y colóquela en la posición de corte. La estabilidad total en el instrumento de ISH Pepsin (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). Tras la finalización de una sesión, ISH Pepsin (Dako Omnis) debe transferirse a temperatura de almacenamiento, entre -18 y 8 C par a conservar el tiempo de estabilidad en el instrumento. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) es un medio de montaje listo para su uso que se utiliza fuera del instrumento Dako Omnis. Transfiera Fluorescence Mounting Medium a temperatura de almacenamiento (2-8 C) inmediatamen te después de utilizarlo. A.7 Accesorios adicionales Se deben cargar además los siguientes accesorios en el instrumento Dako Omnis: agua desionizada; Wash Buffer diluido 20x (Dako Omnis), n.º de catálogo GC807; Clearify, n.º de catálogo GC810; ISH Cleaning Solution n.º de catálogo GC207; y tapas ISH Lid (Dako Omnis), n.º de catálogo GC102, tal como se especifica en los Manuales del usuario de Dako Omnis. B. Procedimiento de tinción - Mama B.1 Notas sobre el procedimiento HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es la sonda de hibridación para el ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH) directo automatizado del instrumento Dako Omnis y que, junto con los reactivos accesorios GM300, GM301, GM302, GM303 y GM304 (GM304 fuera del instrumento), se ha diseñado para la determinación cuantitativa de la amplificación del gen HER2. Antes de su uso, el usuario debe leer todas estas instrucciones atentamente y familiarizarse con todos los componentes y las distintas precauciones. El procedimiento de tinción FISH automatizado en Dako Omnis incluye la desparafinización de cortes de tejido, la recuperación diana, la digestión con pepsina, la hibridación y el lavado astringente. Los portaobjetos se descargan en la estación de descarga seca. Todos los pasos del protocolo están preprogramados en el software Dako Omnis. Consulte los Manuales del usuario de Dako Omnis para ver instrucciones sobre la carga de portaobjetos, tapas ISH Lid, reactivos, etc. Tres protocolos HER2 IQFISH validados: corto HER2 IQFISH con pepsina, medio HER2 IQFISH con pepsina y largo HER2 IQFISH con pepsina, que solo difieren en el tiempo de digestión con pepsina, están preprogramados en el software Dako Omnis y se pueden seleccionar para cada uno de los cinco portaobjetos de la gradilla de portaobjetos. De esta manera se optimiza la digestión del tejido que puede depender de las condiciones anteriores del análisis. El protocolo medio HER2 IQFISH con pepsina se considera el protocolo estándar. Los diferentes protocolos de tinción se pueden ver en la estación de trabajo Dako Link Omnis. B.2. Procedimiento previo a la tinción 1. Seleccione el protocolo HER2 IQFISH que desea aplicar en cada portaobjetos en el software de la estación de trabajo Dako Link Omnis, en los protocolos IQFISH. 2. Imprima las etiquetas para portaobjetos y adjúntelas a los portaobjetos de vidrio. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 10/57

11 Cáncer de mama 3. Coloque los portaobjetos en la gradilla de portaobjetos. Para obtener más información, consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis. Una gradilla de portaobjetos puede incluir hasta cinco portaobjetos. Se recomienda que al menos dos portaobjetos se tiñan en una sesión de tinción HER2 IQFISH. 4. Cargue la gradilla de portaobjetos en el instrumento Dako Omnis. 5. Cargue las tapas ISH Lid (una tapa ISH Lid por gradilla de portaobjetos) en Dako Omnis. 6. Asegúrese de que las garrafas con líquido se encuentran en el instrumento y se registran en Dako Omnis. Garrafas con líquido: Clearify (agente depurador), ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluida, ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluido y Wash Buffer (Dako Omnis) diluido. 7. Cargue ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Pepsin (Dako Omnis), la HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) mezclada recientemente y ISH Cleaning Solution en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos). Asegúrese de que las tapas superiores de los tapones están abiertas. 8. Siga las instrucciones de la pantalla táctil y toque en "Done" (Finalizado) para iniciar el procedimiento de tinción. B.3. Procedimiento de tinción El procedimiento de tinción HER2 IQFISH en el instrumento Dako Omnis (resumido en la Tabla 1) se puede controlar en la estación de trabajo Dako Link Omnis: Tabla 1. Descripción simplificada de los pasos del protocolo de tinción HER2 IQFISH. Paso Reactivo Tiempo y temperatura Descerado Clearify (agente depurador) 10 minutos, 38 C Recuperación antigénica ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) Lavado ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 15 minutos, 97 C 2 x 3 minutos, 32 C Digestión* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10, 15 o 20 minutos Secado 15 minutos, 45 C Desnaturalización 10 minutos, 66 C Hibridación Lavado astringente HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 75 minutos, 45 C 10 minutos, 61 C *Se pueden seleccionar tres tiempos de digestión con pepsina validados con los protocolos HER2 IQFISH anteriormente especificados. Si no se va a realizar ninguna tinción ISH inminente, transfiera todos los reactivos a las temperaturas de almacenamiento recomendadas. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 11/57

12 Cáncer de mama B.4. Procedimiento posterior a la tinción Descargue los portaobjetos y aplique hasta 30 µl de Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) con DAPI al área diana del portaobjetos. El corte de tejido debe cubrirse completamente con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Aplique un cubreobjetos de vidrio. NOTA: Puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. No obstante, tenga en cuenta que si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. A fin de minimizar el desvanecimiento, almacene los portaobjetos en la oscuridad entre -18 y 8 C. Control de calidad - Mama 1. Las señales deben ser brillantes, bien diferenciadas y fáciles de evaluar. 2. Las células normales son un control interno de la sesión de tinción. Las células normales deberían presentar 1-2 señales verdes claramente visibles que indican que la sonda de ANP CEN-17 se ha hibridado satisfactoriamente con la región centromérica del cromosoma 17. Las células normales deberían presentar también 1-2 señales rojas claramente visibles que indican que la sonda de ADN HER2 se ha hibridado satisfactoriamente con el gen o genes HER2. Debido al seccionamiento del tejido, algunas células normales presentarán menos de las dos señales esperadas de cada color. Si no se pueden detectar señales en las células normales, el ensayo ha fracasado y los resultados deben considerarse no válidos. 3. La morfología del núcleo debe estar intacta al evaluarla utilizando un filtro para DAPI. Numerosas células fantasma y una morfología nuclear general pobre indican una sobredigestión de la muestra, que tiene como resultado la pérdida o fragmentación de las señales. Tales muestras deben considerarse no válidas. 4. Un mínimo de 20 células tumorales debe ser evaluable. 5. Las diferencias en la fijación, el procesado y la inclusión del tejido en el laboratorio del usuario pueden generar variabilidad en los resultados, por lo que es necesario que el usuario lleve a cabo una evaluación regular de sus propios controles. Interpretación de la tinción - Mama Tejidos evaluables Solo debe evaluar muestras de pacientes con carcinoma invasivo. En los casos con carcinoma in situ y carcinoma invasivo en la misma muestra, solo debe puntuar el componente invasivo. Evite las áreas de necrosis y las áreas donde los bordes nucleares sean ambiguos. No incluya núcleos que requieran un juicio subjetivo. Ignore los núcleos que presenten una intensidad de señal débil y tinción no específica o tinción de fondo alta. Enumeración de la señal Localice el tumor dentro del contexto del portaobjetos teñido con H&E y evalúe la misma área en el portaobjetos teñido mediante FISH. Examine varias áreas de células tumorales a fin de tener en cuenta una posible heterogeneidad. Seleccione un área que tenga una distribución óptima de núcleos. Comience el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada y, examinando de izquierda a derecha, cuente el números de señales comprendidas dentro del borde nuclear de cada núcleo evaluado, con arreglo a las pautas siguientes (consulte también el Apéndice 2). - Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 12/57

13 Cáncer de mama - Cuando dos señales sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de la señal, cuente éstas como una sola señal. - En los núcleos con altos niveles de amplificación del gen HER2, las señales de HER2 pueden estar muy cerca unas de las otras, formando un grupo de señales. En esos casos no es posible contar el número de señales de HER2; en vez de contarlo, debe calcularlo (realizar una estimación). Debe prestar especial atención a las señales verdes, ya que los grupos de señales de HER2 pueden cubrir las señales verdes, haciéndolas imposibles de ver. En caso de duda, compruebe las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC. No puntúe los núcleos que no presenten señales o que presenten señales de un solo color. Puntúe solo los núcleos que presenten una o más señales FISH de cada color. Pautas para el recuento de señales 1 No contar. Los núcleos se superponen; no todas las áreas de los núcleos son visibles. 2 Dos señales verdes; no puntúe los núcleos que presenten señales de un solo color. 3 Contar como 3 señales verdes y 12 señales rojas (estimación del grupo). 4 Contar como 1 señal verde y 1 señal roja. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 5 No contar (núcleos sobre o infradigeridos). o Ausencia de señales en el centro del núcleo (núcleo en forma de donut). 6 Contar como 2 señales verdes y 3 señales rojas. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 7 Contar como 1 señal verde y 5 señales rojas. 8 Contar como 3 señales verdes (1 señal verde está fuera de foco) y 3 señales rojas. 9 Grupo de señales rojas que están tapando a señales verdes; comprobar las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC, o no contar. Registre los recuentos en una tabla como la que se indica en el Apéndice 1. Cuente 20 núcleos por muestra tisular, y si es posible, de áreas tumorales bien definidas (18). Calcule la proporción HER2/CEN-17 dividiendo el número total de señales rojas de HER2 entre el número total de señales verdes de CEN-17. Las muestras que presenten una proporción HER2/CEN-17 igual o superior a 2 deben considerarse como amplificadas en cuanto al gen HER2 (3, 18-20). ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 13/57

14 Cáncer de mama Los resultados que estén en el punto de corte (1,8-2,2) o cerca de él deben interpretarse con precaución. Si la proporción es dudosa (1,8-2,2), cuente 20 núcleos adicionales y vuelva a calcular la proporción para los 40 núcleos. En caso de duda, vuelva a puntuar con la muestra. En los casos de proporción dudosa, el anatomopatólogo debe consultar con el médico a cargo de los tratamientos. Limitaciones - Mama 1. Para uso automatizado solo en instrumentos Dako Omnis. 2. Se requiere formación especializada en la selección y fijación de tejidos, así como en la preparación de portaobjetos y la interpretación de la tinción IQFISH. La interpretación de las tinciones con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) no deben realizarla personas con deficiencias de la visión cromática. 3. Los resultados de FISH dependen de la manipulación y el procesamiento del tejido antes de su tinción. Una fijación, lavado, secado, calentamiento o seccionamiento incorrectos, o la contaminación con otros tejidos o líquidos, pueden afectar a la hibridación de las sondas. Los resultados incoherentes pueden deberse a variaciones en los métodos de fijación e inclusión, o a irregularidades inherentes al tejido. 4. Los resultados del ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) no han sido evaluados en muestras tumorales de mama con microcalcificaciones. Características de resultados Mama Eficiencia de la hibridación La eficiencia de la hibridación de HER2 IQFISH pharmdx se investigó con 180 cortes de tejido en parafina y fijados con formol analizados en tres centros de estudio. Los 180 cortes de tejido pudieron enumerarse de acuerdo con las directrices de enumeración del producto. La eficiencia de la hibridación fue del 100%. Las proporciones HER2/CEN-17 calculadas y utilizadas en los estudios de características de resultados se basan en el recuento de señales en 20 núcleos realizado según las pautas de puntuación proporcionadas en la sección Interpretación de la tinción de estas instrucciones de uso. Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se investigó con 20 muestras tisulares diferentes de carcinoma de mama (10 muestras con el estado del gen HER2 amplificado y 10 muestras sin amplificar). La proporción entre el número de señales de HER2 y de señales de CEN-17 se calculó en función del recuento realizado en 20 núcleos de células normales de la muestra tisular. La proporción HER2/CEN-17 de células normales que se identificó en las 20 muestras tisulares de carcinoma de mama fue de entre 0,97 y 1,11. Especificidad analítica Las sondas de ADN HER2 de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se han secuenciado en los extremos y mapeado para confirmar una cobertura total de 218 kb, incluido el gen HER2. Las sondas de ANP CEN-17 contenidas en HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se han evaluado individualmente y de forma combinada con FISH, y se ha confirmado su hibridación específica con la región centromérica del cromosoma 17. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 14/57

15 Cáncer de mama A fin de excluir la hibridación cruzada con cromosomas que no son el cromosoma 17, se llevaron a cabo estudios de alineaciones metafásicas con arreglo a los procedimientos de control de calidad estándar de Dako. Se evaluó la hibridación específica de las mezclas de sondas de ADN para HER2 y de ANP para CEN-17 con un total de 275 alineaciones metafásicas con señales distintas. En la totalidad de los 275 casos, la hibridación fue específica del cromosoma 17. No se observó hibridación cruzada con loci de otros cromosomas en ninguno de los 275 casos. De este modo, la especificidad de las sondas fue del 100% (275 de 275). Para medir la capacidad del ensayo IQFISH para identificar exclusivamente las sustancias diana HER2 y CEN-17 sin interferencias con otras sustancias, se llevaron a cabo estudios con muestras tisulares de carcinoma de mama en los que se omitieron las sondas de HER2 y CEN-17 en la mezcla de hibridación y en los que únicamente se utilizó el tampón de hibridación. Se evaluó un total de 20 muestras en busca de señales no relacionadas con la mezcla de sondas. No se observó detección alguna de otras dianas de cromosomas o interferencia con sustancias estrechamente relacionadas en ninguna de las 20 muestras. Estudios de robustez La robustez del ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó variando la concentración de las sondas de ANP, el tiempo de recuperación diana, el tiempo de incubación con pepsina, el tiempo de desnaturalización, el tiempo de hibridación y el tiempo y la temperatura del lavado astringente. Los diferentes parámetros se evaluaron en cinco muestras tisulares FFPE de cáncer de mama. Entre estas había tanto muestras tisulares amplificadas como sin amplificar. Todos los parámetros se analizaron con ajustes inferiores y superiores a los del protocolo estándar, a excepción de la concentración de las sondas de ANP y la temperatura del lavado astringente, para los que el ajuste del protocolo estándar se incluyó en la configuración. Los parámetros de evaluación fueron: Concentración de las sondas de ANP: se evaluó al 100% y al +/-17%. Tiempo de recuperación diana: se evaluó a 13 min 45 s y a 16 min 15 s. Tiempo de incubación con pepsina: se evaluó a 14 min 45 s y a 16 min 15 s. Tiempo de desnaturalización: se evaluó a 9 min 45 s y a 10 min 45 s. Tiempo de hibridación: se evaluó a 70 min y a 80 min. Tiempo de lavado astringente: se evaluó a 8 min 45 s y 11 min 15 s. Temp. de lavado astringente: se evaluó a 59 C, 61 C y 63 C. Las tres concentraciones de las sondas de ANP se valoraron en un diseño de experimento fraccionado (herramienta JMP, SAS) que se realizó con 12 protocolos de tinción diferentes tal y como se indica en la Tabla 2. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 15/57

16 Tabla 2. Se utilizaron doce protocolos de tinción diferentes en el estudio de robustez. Parámetro de evaluación Cáncer de mama N.º de protocolo de robustez Tiempo de recuperación diana (min) Tiempo con pepsina (min) Tiempo de desnaturali -zación (min) Tiempo de hibridación (min) Tiempo de lavado astringente (min) Temp. de lavado astringente ( 0 C) Conc. de ANP en mezcla de sondas 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % El total de las cinco muestras tisulares se tiñeron con los 12 protocolos. La lectura del estudio de robustez incluía los resultados relacionados con la intensidad de las señales y la calidad morfológica. Todos los protocolos produjeron tinciones en todas las muestras tisulares (60 en total) con señales que fueron brillantes, diferenciadas, fáciles de evaluar y, por consiguiente, aptas para la enumeración de señales. Además, el efecto del grosor del tejido en los resultados del ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó variando el grosor del corte de las muestras tisulares FFPE de cáncer de mama. Se evaluó un total de cinco cortes consecutivos de cinco muestras de carcinoma de mama humano con diferentes grosores (3, 4, 5, 6 y 7 µm) mediante el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). El coeficiente promedio de variación de la proporción HER2/CEN-17 fue del 5,8% (con una oscilación de entre el 4,3% y el 7,1%). Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad intralaboratorio día a día y lote a lote con el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). El estudio se diseñó como un estudio interno, ciego y aleatorizado de proporciones HER2/CEN-17 con cortes de ocho muestras diferentes de cáncer de mama incluidas en parafina y fijadas con formol con diversos niveles de amplificación del gen HER2. Las ocho muestras se habían evaluado con HercepTest y entre ellas se incluyeron dos muestras con HER2 IHC 0/1+, dos muestras con HER2 IHC 2+, dos muestras con HER2 IHC 3+, y dos muestras con proporción HER2/CEN-17 FISH predeterminada entre 1,5 y 2,5, y se obtuvieron con HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731). Cada muestra se tiñó con tres lotes diferentes de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) en cinco días no consecutivos. Se procesó un total de 240 tinciones de tejido en todo el estudio, ya que cada combinación se tiñó por duplicado. En la Figura 1 se ilustran las variaciones en las proporciones en función de los días y los lotes. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox a través de un modelo de efectos aleatorios para obtener la homogeneidad de la varianza de los datos. Se estimó que el coeficiente total de variación fue del 4,3% y se halló que la variación entre días y lotes contribuyó con un 1,5% y un 0%, respectivamente. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 16/57

17 Cáncer de mama Figura 1. Proporciones HER2/CEN-17 obtenidas en un estudio de reproducibilidad intralaboratorio con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), incluidos los criterios de valoración de reproducibilidad lote a lote y día a día. Además, se evaluó la reproducibilidad día a día y centro a centro de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) en un estudio estratificado, ciego y llevado a cabo en tres centros (un centro en los Estados Unidos y dos centros en Europa), en el que se utilizaron cortes de tejido de 12 muestras diferentes de cáncer de mama incluidas en parafina y fijadas con formol. Tres muestras fueron HER2 IHC 0/1+; otras tres, HER2 IHC 2+; otras tres, HER2 IHC 3+; y tres muestras tuvieron una proporción HER2/CEN-17 FISH predeterminada entre 1,5 y 2,5, y se obtuvieron con HercepTest y HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731), respectivamente. Las muestras se tiñeron y analizaron en los centros de estudio. Cada muestra se tiñó un mínimo de cinco veces en cinco días no consecutivos y fue puntuada por un observador en cada centro. Se tiñeron 192 cortes y se incluyeron en el análisis estadístico. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox y se calcularon los componentes de la varianza. El coeficiente total de variación, basado en el límite de confianza superior del 95%, fue del 15%. La variación de la proporción HER2/CEN-17 por día y centro queda reflejada en la Figura 2. Figura 2. Gráfico en el que se representa la variabilidad de las proporciones HER2/CEN-17 en unidades no transformadas obtenidas en el estudio de reproducibilidad día a día y centro a centro de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) en muestras tisulares de cáncer de mama. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 17/57

18 Cáncer de mama El ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó para obtener la reproducibilidad observador a observador como parte del estudio de comparación de métodos realizado de forma interna, utilizando tres observadores para puntuar las muestras teñidas por separado. Se evaluó la reproducibilidad en 140 muestras diferentes de carcinoma de mama humano con el estado del gen HER2 amplificado o sin amplificar. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox. El coeficiente promedio de variación de observador a observador fue del 9%. Repetibilidad Se evaluó la repetibilidad intralaboratorio de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) con cortes consecutivos de ocho muestras de carcinoma de mama humano con el estado del gen HER2 amplificado o sin amplificar. Los tejidos se evaluaron por duplicado en cinco días no consecutivos con tres lotes diferentes en un total de 240 portaobjetos (120 cortes duplicados). Se utilizó el modelo de efectos aleatorios para analizar los datos que arrojaron una varianza atribuible a los días y los lotes (como se indicaba en el estudio de reproducibilidad interno). La varianza residual equivale a la varianza entre réplicas y, por consiguiente, equivale a repetibilidad. El límite de confianza superior del 95% para el coeficiente de repetibilidad de variación fue del 4,4%. Estudios de comparación de métodos Comparación de los resultados de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) con los resultados de HER2 IQFISH pharmdx El ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se comparó con el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731) en un estudio comparativo en el que se utilizaron 140 muestras tisulares de carcinoma de mama humano. Entre las muestras se incluyeron 77 casos con el gen HER2no amplificado y 63 casos con el gen HER2 amplificado con la puntuación conocida de HercepTest, tal y como se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Distribución de las muestras en función de la puntuación de HercepTest y la puntuación de HER2 FISH (estados del gen HER2) obtenidas con HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731). Puntuación de tinción de Total HercepTest n Estados de HER2 FISH Amplificado No amplificado N.º total de muestras evaluadas con FISH En la Tabla 4 se recogen los resultados de la tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos mediante los dos ensayos con cálculo de tanto por ciento de concordancia general (OPA), tanto por ciento de concordancia positiva (PPA) y tanto por ciento de concordancia negativa (NPA). La correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 con los dos ensayos se muestra en la Figura 3. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 18/57

19 Cáncer de mama Tabla 4. Tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos con HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731) y HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Estados del gen HER2 (K5731) No amplificado Amplificado Total Estados del gen HER2 No amplificado (Dako Omnis) Amplificado Total OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figura 3. Correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 con los ensayos HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731) en 140 muestras de cáncer de mama (modelo lineal: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. Ponderado con la varianza inversa para permitir el modelo lineal). Las proporciones HER2/CEN-17 se sometieron a transformación logarítmica para el análisis. Se halló que el intervalo de confianza del 95% para la diferencia promedio entre los dos métodos de tinción con una proporción de HER2/CEN-17 = 2 fue de [0,002; 0,031]. Por tanto, no se espera una diferencia superior al 3% con una confianza del 95%. Se halló que la desviación de la media cuadrática (RMSE) fue del 9%, lo que indica el tamaño de la fluctuación media en torno al valor promedio. Comparación de los resultados de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) con los resultados del kit PathVysion HER-2 DNA Probe El ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se comparó con el kit PathVysion HER-2 DNA Probe en un estudio comparativo en el que se utilizaron 140 muestras tisulares de carcinoma de mama humano. Entre las muestras se incluyeron 80 casos con el gen HER2no amplificado y 80 casos con el gen HER2 amplificado con la puntuación conocida de HercepTest, tal y como se muestra en la Tabla 5. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 19/57

20 Cáncer de mama Tabla 5. Distribución de las muestras en función de la puntuación de HercepTest y la puntuación de HER2 FISH (estados del gen HER2) obtenidas con HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731). Puntuación de tinción de Total HercepTest n Estados de HER2 FISH Amplificado No amplificado N.º total de muestras evaluadas con FISH En la Tabla 6 se recogen los resultados de la tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos mediante los dos ensayos con cálculo de tanto por ciento de concordancia general (OPA), tanto por ciento de concordancia positiva (PPA) y tanto por ciento de concordancia negativa (NPA). La correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 con los dos ensayos se muestra en la Figura 4. Tabla 6. Tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos con el kit PathVysion HER-2 DNA Probe y el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Estados del gen HER2 (PathVysion) No amplificado Amplificado Total Estados del gen HER2 No amplificado (Dako Omnis) Amplificado Total OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figura 4. Correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 con el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y el kit PathVysion en 140 muestras de cáncer de mama (modelo lineal: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. Ponderado con la varianza inversa para permitir el modelo lineal). ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 20/57

21 Cáncer de mama Las proporciones HER2/CEN-17 se sometieron a transformación logarítmica para el análisis. Se halló que el intervalo de confianza del 95% para la diferencia promedio entre los dos métodos de tinción con una proporción de HER2/CEN-17 = 2 fue de [0,001; 0,031]. Por tanto, no se espera una diferencia superior al 3% con una confianza del 95%. Se halló que la desviación de la media cuadrática (RMSE) fue del 10%, lo que indica el tamaño de la fluctuación media en torno al valor promedio. Utilidad clínica en la selección de pacientes para el tratamiento con Herceptin (trastuzumab) Se investigó el kit HER2 FISH pharmdx en estudios comparativos tanto con el kit PathVysion HER-2 DNA Probe como con Dako HercepTest. Los resultados de la evaluación de HER2 FISH están disponibles para un total de 940 muestras de cáncer de mama. Comparación de los resultados del kit HER2 FISH pharmdx con los resultados de la evaluación del kit PathVysion HER-2 DNA Probe Se han llevado a cabo tres estudios en los que se comparan los resultados de la evaluación del kit HER2 FISH pharmdx con los resultados de la evaluación del kit PathVysion HER-2 DNA Probe (consulte la Tabla 7). Los estudios se realizaron en ubicaciones separadas geográficamente, por lo que no ha habido superposición en el uso de las muestras. Se ha evaluado un total de 328 muestras. Tabla 7. Resumen de los datos de los estudios de comparación de métodos FISH. Denominación del estudio Concordancia (intervalo de confianza del 95%) Cálculo de tanto por ciento de concordancia positiva (intervalo de confianza del 95%) Cálculo de tanto por ciento de concordancia negativa (intervalo de confianza del 95%) Estudio de concordancia (muestras danesas, N=190) 93,68% (90,22%-97,14%) 86% (77,34%-95,08%) 97% (94,05%-99,89%) Estudio de concordancia (muestras japonesas, N=52) 96,15% 97% Estudio de concordancia (muestras francesas, N=86) (21)* *Los datos de la comparación se proporcionaron en el artículo; sin embargo, no se identificó el ensayo HER2 FISH. Hubo un total de 12 resultados discrepantes entre la evaluación del kit HER2 FISH pharmdx y la evaluación de PathVysion HER-2 DNA Probe para las muestras clínicas danesas (consulte la Tabla 8). 96% ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 21/57

22 Tabla 8. Resumen de los datos de los 12 resultados discrepantes de la evaluación. N.º de ID HER2 FISH(positivo)/PathVysion(negativo) Proporción de HER2 FISH 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) Proporción de PathVysion 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) Puntuación de HercepTest N.º de ID Cáncer de mama HER2 FISH(negativo)/PathVysion(positivo) Proporción de HER2 FISH ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1,52-1,95) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) Proporción de PathVysion 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) Puntuación de HercepTest 2+ *El IC de las proporciones logarítmicas promedio incluyó 2,0. Los números entre paréntesis representan el IC del 95%. En el análisis de discrepancia se utilizaron las proporciones logarítmicas. Se calculó el intervalo de confianza del 95% para las 60 proporciones logarítmicas de los núcleos que se utilizaron para calcular la proporción de PathVysion HER-2 DNA Probe. En los 4 casos en los que el kit HER2 FISH pharmdx arrojó un resultado positivo y el kit PathVysion HER-2 DNA Probe dio un resultado negativo, ningún intervalo incluía el valor crítico de 2. De los 8 casos en los que el kit HER2 FISH pharmdx arrojó un resultado negativo y el kit PathVysion HER-2 DNA Probe dio un resultado positivo, el IC del 95% de 3 (n.º 234, 284 y 735) incluía el valor crítico de 2. De igual modo, se calculó el intervalo de confianza del 95% para las proporciones logarítmicas de los núcleos que se utilizaron para calcular la proporción del kit HER2 FISH pharm Dx. En los 4 casos en los que el kit HER2 FISH pharmdx arrojó un resultado positivo y el kit PathVysion HER-2 DNA Probe dio un resultado negativo, en 2 se incluía el valor crítico de 2 (n.º 160 y 306). De los ocho casos en los que el kit HER2 FISH pharmdx arrojó un resultado negativo y el kit PathVysion HER-2 DNA Probe dio un resultado positivo, el IC del 95% de 1 (n.º 881) incluía el valor crítico de 2. Comparación de los resultados del kit HER2 FISH pharmdx con los resultados de HercepTest Se han llevado a cabo cuatro estudios en los que se compara el kit HER2 FISH pharmdx con los resultados de HercepTest. Se ha comparado un total de 940 muestras con un resultado de puntuación de tinción 3+ como resultado IHC positivo en el ensayo HercepTest (consulte la Tabla 9) ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 22/57

23 Tabla 9. Resumen de los estudios de comparación del kit HER2 FISH pharmdx y IHC (HercepTest ). Denominación del estudio Concordancia (intervalo de confianza del 95%) Cálculo de tanto por ciento de concordancia positiva (intervalo de confianza del 95%) Cálculo de tanto por ciento de concordancia negativa (intervalo de confianza del 95%) Muestras clínicas danesas (N=682) 93,11% (91,21%-95,01%) 91% (87,39%-94,57%) 94% (92,12%-96,46%) Muestras japonesas (N=52) Estudio francés (N=86) (31) Cáncer de mama Estudio piloto danés (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% Los datos de distribución de los resultados de la evaluación de HercepTest y HER2 FISH para las muestras clínicas danesas se presentan en la Tabla 10. Tabla 10. Distribución de los estados del gen HER2 de acuerdo con HercepTest y el kit HER2 FISH pharmdx. Puntuación de tinción de Total HercepTest n % % Estados de HER2 FISH Amplificado No amplificado N.º total de muestras evaluadas con FISH ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 23/57

24 Cáncer de mama Solución de problemas - Mama Problema Causa probable Acción recomendada 1. No hay señales o son débiles. 1a. Los reactivos se han expuesto a altas temperaturas durante su transporte o almacenamiento. 1b. El microscopio no funciona correctamente. - Juego de filtros inapropiado - Lámpara incorrecta - Lámpara de mercurio demasiado vieja - Objetivos colectores sucios y/o con fisuras - Aceite de inmersión inadecuado 1a. Compruebe las condiciones de almacenamiento. Asegúrese de que había hielo seco en los envíos de IQISH Probe Mix y pepsina cuando los recibió. Asegúrese de que los reactivos se han almacenado según lo especificado. 1b. Compruebe el microscopio y asegúrese de que los filtros que se están utilizando son adecuados para su uso con los fluorocromos de la Probe Mix; asegúrese también de que la lámpara de mercurio es la correcta y que no se haya utilizado más allá de su vida útil esperada (consulte el Apéndice 2). En caso de duda, contacte con el vendedor del microscopio. 1c. Señales desvanecidas 1c. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición de las muestras a fuentes de luz intensa. 1d. Tampones identificados incorrectamente 2. Áreas sin señal 2. Burbujas de aire atrapadas durante el montaje 1d. Sustituya los tampones a granel y asegure el registro correcto (en la estación de trabajo) y la identificación (en la pantalla táctil) de los tampones a granel. Para obtener más información, consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis. Atención: ISH Pre- Treatment Solution es verde e ISH Stringent Wash Buffer es amarillo. 2. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan, elimínelas suavemente con la ayuda de unas pinzas. 3. Excesiva tinción 3a. Fijación inadecuada del 3a. Asegúrese de que solo se ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 24/57

25 Cáncer de mama Problema Causa probable Acción recomendada de fondo tejido usen cortes de tejido incluidos en parafina y fijados con formol. 4. Mala morfología del tejido 5. Alto nivel de autofluorescencia verde en portaobjetos, incluidas áreas sin tejido FFPE 3b. Exposición prolongada de la sección hibridada a una luz intensa 4a. Tratamiento incorrecto con pepsina 4b. Un tratamiento con pepsina excesivamente largo, o un grosor muy fino de las secciones, puede hacer que aparezcan células fantasma o células en forma de anillo. 5. Uso de portaobjetos de vidrio caducados o no recomendados 3b. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición a fuentes de luz intensa. 4a. Cambie a alguno de los tres protocolos de tinción diferentes. Asegúrese de que ISH Pepsin (Dako Omnis) se ha almacenado a la temperatura correcta. 4b. Pruebe con un protocolo de tinción de menor tiempo de incubación con pepsina. Asegúrese de que el grosor del corte sea de 4-6 µm. 5. Elija el portaobjetos de vidrio según se ha especificado. Asegúrese de que los portaobjetos de vidrio no han pasado la fecha de caducidad. NOTA: Si no puede atribuirse el problema a ninguna de las circunstancias anteriores, o si la acción correctiva sugerida no lo soluciona, póngase en contacto con el Servicio Técnico de Dako para solicitar más ayuda. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 25/57

26 Cáncer de mama Apéndice 1 - Mama HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), n.º de catálogo GM333 Sistema de puntuación Fecha de la sesión: ID del registro de sesión de tinción: Lote de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ID de muestra: Recuento de señales en 20 núcleos N.º de patrón Puntuación HER2 (roja) Puntuación CEN-17 (verde) N.º núcleo Total (1-10) Total (11-20) Puntuación HER2 (roja) Puntuación CEN-17 (verde) Para determinar la proporción HER2/CEN-17, cuente el número de señales de HER2 y el número de señales de CEN-17 en los mismos 20 núcleos y divida el número total de señales de HER2 entre el número total de señales de CEN-17. Si la proporción de HER2/CEN-17 es dudosa (1,8-2,2), cuente 20 núcleos adicionales y vuelva a calcular la proporción para los 40 núcleos. Una relación que esté en el punto de corte (1,8-2,2) o cerca de él debe interpretarse con precaución (consulte las pautas para el recuento). Puntuación total (1-20) HER2 CEN-17 Proporción HER2/CEN-17 ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 26/57

27 Cáncer de mama Recuento de señales en 20 núcleos adicionales N.º núcleo Puntuación HER2 (roja) Puntuación CEN-17 (verde) N.º núcleo Total (21-30) Total (31-40) Puntuación HER2 (roja) Puntuación CEN-17 (verde) Calcule la proporción de HER2/CEN-17 según los 40 núcleos contados Puntuación total (1-40) HER2 CEN-17 Proporción HER2/CEN-17 Proporción < 2: no se observó amplificación del gen HER2. Proporción 2: se observó amplificación del gen HER2. Fecha y firma del técnico: Fecha y firma del anatomopatólogo: Para conocer las pautas de puntuación: consulte el apartado Interpretación de la tinción. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 27/57

28 Cáncer de mama Apéndice 2 - Mama HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), n.º de catálogo GM333 Especificaciones del microscopio de fluorescencia Dako recomienda el siguiente equipo para usar con HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Tipo de microscopio Microscopio de epifluorescencia 2. Lámpara Lámpara de mercurio de 100 vatios (mantenga un registro del tiempo de combustión) 3. Objetivos Para el cribaje del tejido, puede aplicar objetivos de inmersión de aceite de 16X o 20X. Para un aumento de alta potencia y para la enumeración de las señales, le recomendamos que utilice exclusivamente objetivos de inmersión de aceite, por ejemplo, 100x. 4. Filtros Los filtros están diseñados individualmente para cada fluorocromo concreto, y debe elegirlos en consonancia. Dako recomienda el uso de un filtro específico para DAPI en combinación con un doble filtro de alta calidad específico para Texas Red/FITC. Filtro para DAPI, por ejemplo, filtro Chroma n.º Filtro doble Texas Red/FITC, por ejemplo, filtro óptico Omega n.º XF53 o filtro Chroma n.º Puede utilizar un filtro sencillo para Texas Red y otro filtro sencillo para FITC con fines de confirmación y enumeración Fluorocromo Longitud de onda de excitación Longitud de onda de emisión FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Los filtros son específicos de cada tipo de microscopio y el uso de los filtros adecuados es crucial para la interpretación. Si desea obtener información detallada al respecto, contacte con el proveedor de su microscopio o con el representante de Dako. 5. Aceite Aceite no fluorescente Precauciones No se recomienda utilizar una lámpara de mercurio de 50 vatios. No se pueden utilizar filtros para rodamina. No se recomienda utilizar filtros triples. Un microscopio no optimizado puede causar problemas al leer las señales fluorescentes. Es importante que la fuente de luz no haya caducado y que esté correctamente alineada y enfocada. Los clientes deben monitorizar y seguir las recomendaciones del fabricante de la lámpara de mercurio. Antes de interpretar los resultados, debe haberse realizado el mantenimiento del microscopio, y la lámpara de mercurio debe estar alineada. Debe esforzarse por exponer la muestra a la menor cantidad de luz de excitación posible a fin de minimizar el desvanecimiento de la fluorescencia. Le recomendamos que estudie la configuración de su microscopio concreto con el fabricante de éste antes de empezar la hibridación in situ fluorescente, o que consulte la literatura. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 28/57

29 Cáncer gástrico Resumen y explicación - Gástrico El gen HER2 humano (también conocido como ERBB2 o NEU) está ubicado en el cromosoma 17 y codifica la proteína HER2, también llamada p185 HER2. La proteína HER2 es una tirosin quinasa del receptor de membrana que presenta homología con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR o HER1) (1-2). El gen HER2 está presente en dos copias en todas las células diploides normales. La sobreexpresión de la proteína HER2 y la amplificación del gen HER2 en el cáncer gástrico se ha puesto de manifiesto en un gran número de estudios (que se revisan en [23]). La positividad para HER2 se puede detectar en aproximadamente el 20% de los pacientes mediante IHC o FISH (23). Los estudios preclínicos in vitro e in vivo han demostrado que trastuzumab (Herceptin ) es eficaz en diferentes tipos de cáncer gástrico impulsando de este modo el inicio de varios estudios clínicos (23-27). Todos los pacientes del estudio BO18255 de fase III (ToGA "estudio multicéntrico de fase III, abierto, aleatorizado de trastuzumab en combinación con fluoropirimidina y cisplatino frente a exclusivamente quimioterapia como tratamiento de primera línea en pacientes con cáncer gástrico avanzado con positivo para HER2") patrocinado por Hoffmann-La Roche AG se seleccionaron utilizando el kit Dako HercepTest (IHC) y Dako HER2 FISH pharmdx (FISH) con la positividad para HER2 definida como IHC 3+ o FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). El estudio demostró la utilidad clínica tanto de la prueba HercepTest (IHC) como del kit HER2 FISH pharmdx (FISH) para la evaluación del estado de HER2 en pacientes con adenocarcinoma avanzado gástrico o de la unión gastroesofágica para quienes se está considerando un tratamiento con trastuzumab (28). No se reclutó a pacientes cuyos tumores no fueran de amplificación del gen pero sí de sobreexpresión débil a fuerte de la proteína HER2 [FISH(-)/IHC 2+]. Por tanto, aún no está claro si los pacientes cuyos tumores no sean de amplificación pero sí de sobreexpresión de la proteína HER2 [es decir, FISH(-), IHC 2+ o 3+] se beneficiarán del tratamiento con Herceptin. El estudio también demostró que la amplificación del gen (FISH) y la sobreexpresión de la proteína (IHC) no están tan correlacionadas como con el cáncer de mama, así que no debe utilizarse un solo método para determinar el estado de HER2. Este producto (HER2 IQFISH pharmdx [Dako Omnis]) es una IQISH Probe Mix para FISH directo automatizado, que detecta la amplificación del gen HER2. Este producto debe utilizarse junto con los reactivos accesorios especificados en Dako Omnis y deriva del ensayo de amplificación del gen HER2 de ejecución manual, HER2 IQFISH pharmdx, n.º de catálogo K5731. Principio del procedimiento - Gástrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es una IQ ISH Probe que se compone de una mezcla de sondas de ADN marcadas con Texas Red que cubre una región de 218 kb incluido el gen HER2 del cromosoma 17 y una mezcla de sondas de ácido nucleico peptídico (ANP) (13) marcadas con fluoresceína específicas para la región centromérica del cromosoma 17 (CEN-17). La hibridación específica de ambas dianas conduce a la formación de una señal fluorescente roja bien definida en cada locus del gen HER2, así como de una señal fluorescente verde bien definida en cada centrómero del cromosoma 17. La evaluación de la amplificación del gen HER2 con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es un método totalmente automatizado en el instrumento Dako Omnis. Se pueden seleccionar tres protocolos de tinción diferentes HER2 FISH validados en el software de la estación de trabajo Dako Link Omnis. Los protocolos solo difieren en el tiempo de digestión; por tanto, se puede seleccionar la digestión con pepsina de 10 minutos (el protocolo corto), de 15 minutos (el protocolo medio) o de 20 minutos (el protocolo largo) (consulte más información a continuación). Se recomienda el protocolo medio para el análisis inicial. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 29/57

30 Cáncer gástrico Tras la tinción en el sistema Dako Omnis, las muestras se montan con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) que contiene 4',6-diamidina-2-fenilindol (DAPI) y se cubren con cubreobjetos. Utilizando un microscopio de fluorescencia dotado de los filtros apropiados (consulte el Apéndice 5), se localizan las células tumorales, y se lleva a cabo la enumeración de las señales rojas (HER2) y verdes (CEN-17). Después, se calcula la proporción HER2/CEN-17. Las células normales presentes en la sección de tejido analizada sirven como control positivo interno de la eficiencia del pretratamiento y de la hibridación. Consulte el apartado Interpretación de la tinción para obtener información detallada al respecto. Consulte los Manuales del usuario de Dako Omnis para ver instrucciones detalladas sobre la carga y descarga de portaobjetos, tapas ISH Lid (Dako Omnis), n.º de catálogo GC102, reactivos, líquidos y residuos. Reactivos - Gástrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y los reactivos accesorios se pueden solicitar por separado como reactivos sueltos. Materiales suministrados HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): mezcla de 1,6 ml lista para su uso de sondas de ADN para HER2 marcadas con Texas Red y sondas de ANP CEN-17 marcadas con fluoresceína, suministrada en el tampón de hibridación IQISH. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se suministra sobre hielo seco. Como garantía de que el reactivo no se ha expuesto a altas temperaturas durante el transporte, aún debe quedar hielo seco en el envío en el momento de la recepción. Los viales de reactivos, junto con su contenido descongelado, deben almacenarse y manipularse en posición vertical en todo momento. El vial del reactivo contiene una bola metálica recubierta de oro que permite la mezcla del reactivo con el dispositivo de mezcla Dako Omnis (consulte el Manual del usuario del dispositivo de mezcla Dako Omnis). Es importante que el reactivo se mezcle concienzudamente antes de cargarlo en Dako Omnis. Material necesario pero no suministrado Reactivos accesorios Los siguientes reactivos son necesarios en el instrumento Dako Omnis para realizar el análisis de la amplificación del gen HER2 con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, concentrado 20x; para diluir en una garrafa de 3,5 l Dako Omnis (n.º de catálogo GC109). El producto contiene un agente antimicrobiano y presenta un color verde inerte para favorecer la identificación y facilidad de uso. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml de etanol al 96% (listo para su uso). ISH Pepsin (Dako Omnis): solución de pepsina A de 7 ml (lista para su uso), ph 2,0; contiene un estabilizante y un agente antimicrobiano. La pepsina se suministra sobre hielo seco. Como garantía de que el reactivo no se ha expuesto a altas temperaturas durante el transporte, aún debe quedar hielo seco en el envío en el momento de la recepción. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml, concentrado 20x de tampón con citrato de sodio salino; para diluir 1:20 en una garrafa de 3,5 l Dako Omnis (CG109). El producto contiene un agente antimicrobiano, un detergente y presenta un color amarillo inerte para favorecer la identificación y facilidad de uso. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): medio fluorescente para montaje de 0,8 ml (listo para su uso) con DAPI. Aunque los reactivos anteriores no se suministran con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), se describen brevemente a continuación. Consulte las instrucciones de uso de cada dispositivo para obtener más información. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 30/57

31 Reactivos y dispositivos adicionales Dako Omnis, n.º de catálogo GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), n.º de catálogo GC807 Clearify TM, n.º de catálogo GC810 Dako Omnis Mixing Device, n.º de catálogo GC116 Tapa ISH Lid, n.º de catálogo GC102 ISH Cleaning Solution, n.º de catálogo GC207 Cubreobjetos de vidrio para montaje (24 mm x 50 mm) Cáncer gástrico Consulte los Manuales básico y avanzado del usuario de Dako Omnis si desea obtener más información sobre cómo utilizar los reactivos y los dispositivos adicionales. Equipo de microscopía y accesorios Filtros para microscopio de fluorescencia: doble filtro para DAPI y FITC/Texas Red, o monofiltros para FITC y Texas Red; consulte el Apéndice 5 para obtener detalles al respecto. El uso del filtro para DAPI a alta amplificación afecta negativamente a la intensidad de la señal. Deben evitarse largos tiempos de exposición. Debe utilizarse un microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio de 100 vatios como fuente de luz. No se recomiendan otras fuentes de luz con estos filtros. Bandeja plegable para portaobjetos de microscopía (bandeja de cartón para 20 portaobjetos con cubierta de bisagra o similar) Precauciones - Gástrico 1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Para usuarios profesionales. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene 10-<25% de carbonato de etileno y 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) está etiquetado como sigue: Atención H319 Provoca irritación grave en los ojos. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos concienzudamente tras la manipulación. P305 + P351 + P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Como regla general, los menores de 18 años no pueden manipular este producto. Los usuarios deben recibir formación detallada sobre el procedimiento de trabajo adecuado, las propiedades peligrosas del producto y las instrucciones de seguridad necesarias. Le rogamos que consulte la hoja de datos de seguridad para obtener información más detallada. 4. Las muestras tisulares, antes y después de la fijación, así como todos los materiales expuestos a ellas, deben manipularse como capaces de transmitir infecciones, y desecharse con las precauciones apropiadas (14). Nunca pipetee reactivos con la boca y evite el contacto de la piel y membranas mucosas con reactivos y muestras. Si los reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lávelas con abundante agua. 5. A fin de evitar resultados erróneos, minimice la contaminación microbiana del reactivo. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 31/57

32 Cáncer gástrico 6. El uso de métodos de fijación de tejidos y de grosores de muestras distintos a los especificados pueden afectar negativamente a la morfología del tejido y/o a la intensidad de la señal. 7. El reactivo suministrado se ha diluido de forma óptima. Una mayor dilución puede provocar pérdida de eficacia. 8. Lleve puesto equipo protector personal apropiado a fin de evitar que el producto entre en contacto con los ojos y la piel. Le rogamos que consulte la hoja de datos de seguridad (SDS) para obtener información más detallada. 9. La solución no utilizada debe desecharse de acuerdo a las normativas locales, nacionales y de la UE. 10. Debido a la naturaleza heterogénea de las muestras de cáncer gástrico es importante realizar un examen riguroso de la totalidad de la muestra para evaluar la distribución de la señal antes de seleccionar el área para la enumeración de las señales. 11. No se recomienda evaluar muestras muy pequeñas (es decir, las muestras tienen que tener una morfología intacta y suficientes núcleos para realizar la enumeración). 12. Si el análisis de HER2 FISH se realiza en una muestra de biopsia, para garantizar una determinación fiable del estado en cuanto a HER2 se deberán analizar varias (7-8) biopsias evaluables de diferentes regiones del tumor. 13. Para la identificación de todos los cilindros tisulares en una muestra de biopsia es importante examinar el portaobjetos teñido con H&E. 14. La amplificación del gen HER2 y la sobreexpresión de la proteína HER2 no están tan correlacionadas con el cáncer gástrico como en el cáncer de mama; por consiguiente, no debe utilizarse un solo método para determinar el estado de HER2. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 32/57

33 Cáncer gástrico Almacenamiento - Gástrico Almacene HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a < -18 C (se recomie nda de -18 C a -25 C) en un lugar oscuro. Guarde el vial de react ivo descongelado en posición vertical en todo momento. Congelar y descongelar el reactivo hasta un máximo de 10 veces no afecta a la eficacia. No deje este componente a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y los reactivos accesorios ISH Pepsin (Dako Omnis) y Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pueden verse afectados negativamente si se exponen al calor. No deje estos componentes a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y el reactivo accesorio Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pueden verse afectados negativamente si se exponen a niveles excesivos de luz. No almacene estos componentes ni lleve a cabo análisis bajo una luz intensa, por ejemplo, la luz solar directa. Almacene los reactivos accesorios ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) y Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) en un lugar oscuro a 2-8 C. Almacene ISH Pepsin (Dako Omnis) a C. El tapón del vial, incluida la t apa superior, debe estar cerrado en todos los reactivos durante el almacenamiento. Las soluciones diluidas (solución de trabajo ISH Stringent Wash Buffer y solución de trabajo ISH Pre-Treatment Solution) se pueden almacenar a 2-8 C durante 30 días. No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad impresa en el envase del reactivo. Durante el almacenamiento, debe cerrarse el tapón (incluida la tapa superior). Si los reactivos se almacenan en condiciones diferentes a las especificadas, el usuario deberá validar el rendimiento del reactivo (15). No existen signos evidentes que indiquen inestabilidad de este producto. Por lo tanto, es importante evaluar células normales presentes en el corte de tejido analizado. Si observa un patrón de fluorescencia inesperado que no pueda explicarse y sospecha que existe un problema con HER2 IQFISH pharmdx, póngase en contacto con el servicio técnico de Dako. Estabilidad en el instrumento Dako Omnis La estabilidad de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) y de los reactivos accesorios: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) es de 80 horas. La estabilidad de ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluida y de ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) es de 7 días. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo. Si se usan reactivos caducados, el instrumento Dako Omnis emitirá una advertencia; se cambiará el estado de todos los portaobjetos teñidos con el reactivo caducado a sospechoso y en el registro de portaobjetos de la estación de trabajo se indicará que se ha utilizado un reactivo caducado. Preparación de las muestras - Gástrico Las muestras de adenocarcinoma gástrico o de la unión gastroesofágica provenientes de biopsias, excisiones o resecciones deben manipularse de tal forma que se conserve el tejido para el análisis FISH. Deben utilizarse con todas las muestras los métodos estándar de procesamiento de tejidos para su tinción inmunohistoquímica (16). Cuando se analicen muestras pequeñas de biopsia, se determinará con precisión la morfología intacta del tumor y la presencia de núcleos suficientes para realizar la enumeración. Si el análisis de HER2 FISH se realiza en una muestra de biopsia, para garantizar una determinación fiable del estado en cuanto a HER2 se deberán analizar varias (7-8) biopsias evaluables de diferentes regiones del tumor. Cortes de tejido en parafina ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 33/57

34 Cáncer gástrico Solo debe utilizarse tejido conservado en formol tamponado neutro e incluido en parafina. Las muestras deben cortarse en bloques de, por ejemplo, 3 o 4 mm de espesor, y fijarse durante horas con formol tamponado neutro. Las muestras de biopsia se fijaron durante 6-8 horas en el ToGA Trial [para obtener información sobre el estudio, consulte el punto (28)]. Después, se deshidratan los tejidos en una serie graduada de etanol y xileno, seguido de una infiltración con parafina fundida a una temperatura no superior a 60 C. Los tejidos correctamente fijados e incluidos se conservarán indefinidamente antes de su seccionamiento y montaje en portaobjetos si se almacenan en un sitio fresco (15-25 C) (16-17). No es adecuado ningún otro fijador. Las muestras tisulares deben cortarse en secciones de 3-6 µm. Los portaobjetos requeridos para el análisis de la amplificación del gen HER2 y la verificación de la presencia de tumores deben prepararse a la vez. Se recomienda realizar un mínimo de dos secciones en serie, una sección para la verificación de la presencia de tumores teñida con hematoxilina y eosina (tinción H&E), y una sección para el análisis de la amplificación del gen HER2. Se recomienda montar los cortes de tejido en los portaobjetos Dako FLEX IHC Microscope Slides, n.º de catálogo K8020. Los portaobjetos Superfrost Plus Slides (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) también son apropiados. Asegúrese de que los portaobjetos de vidrio no han pasado la fecha de caducidad. Las muestras deben analizarse dentro de un período inferior a 6 meses tras el seccionamiento, siempre que se almacenen a 2-25 C. NOTA: Las muestras tisulares deben colocarse en el portaobjetos de vidrio dentro del área de tinción definida del portaobjetos. Consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis si desea información sobre las dimensiones del área de tinción del portaobjetos. INSTRUCCIONES DE USO - Gástrico A. Preparación de los reactivos - Gástrico A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) El vial HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene una bola metálica recubierta de oro que se utiliza para mezclar. Antes de cargar el vial en Dako Omnis, debe descongelarse el reactivo y mezclarse a conciencia, ya que se separa en fases durante la refrigeración. Utilice el dispositivo de mezcla Dako Omnis para mezclar la sonda. Siga el procedimiento que se indica a continuación para mezclar la sonda en el dispositivo de mezcla Dako Omnis y consulte el Manual del usuario del dispositivo de mezcla si desea más información. 1. Saque el vial de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) del congelador. 2. Cargue el vial en el dispositivo de mezcla Dako Omnis. 3. Conecte el dispositivo de mezcla y asegúrese de que esté encendida la luz de estado verde. 4. Seleccione el programa "descongelar + mezclar". Importante: Los viales almacenados por debajo de -25 C deben descongelarse (justo) antes de cargar el vial en el dispositivo de mezcla Dako Omnis y se debe utilizar el programa de "mezcla". 5. Retire el vial del dispositivo de mezcla. 6. Levante hacia atrás la tapa superior y colóquela en la posición de corte (consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis si desea más información). 7. Cargue inmediatamente el vial en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) del instrumento Dako Omnis. Si se utiliza la función de carga continua de reactivos durante la sesión de tinción, asegúrese de que el tiempo desde la mezcla a la aspiración del vial en Dako Omnis es de al menos de 10 minutos. La sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se puede volver a descongelar y utilizar hasta un máximo de 10 veces. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 34/57

35 Cáncer gástrico Mezcle siempre la HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Probe Mix justo antes de cargarla en el instrumento. No se debe agitar. La estabilidad total en el instrumento de ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) será transferido inmediatamente tras el tiempo en carga en Dako Omnis a < -18 C (se recomienda de -18 C a -25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Prepare una solución de trabajo diluyendo el concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 de la siguiente forma: 1. Llene una garrafa de 3,5 l del sistema Dako Omnis, marcada como PTB (etiqueta azul), con agua desionizada hasta la línea de llenado (3,325 l). Antes de proceder al llenado, asegúrese de que la garrafa esté colocada en una superficie horizontal. 2. Vacíe un frasco con 175 ml de concentrado de ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) en la garrafa. 3. Quite la etiqueta del frasco de concentrado y péguela en la garrafa. Cierre la tapa de la garrafa e invierta la garrafa con cuidado 2-3 veces. 4. Utilice el lector de códigos de barras de mano Dako Omnis para identificar el reactivo (escanee la etiqueta despegable y la garrafa). 5. Cargue inmediatamente la garrafa en el instrumento Dako Omnis. La solución diluida puede utilizarse durante un periodo de 7 días si se almacena en el instrumento Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). La solución diluida no utilizada puede almacenarse a 2-8 C durante 30 días. Tras el almacenamiento en frío, asegúrese de que la solución diluida se ha estabilizado al menos a 18 C antes de cargarla en Dako Omnis. NOTA: Deseche la solución diluida si está turbia. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Prepare una solución de trabajo diluyendo el concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 de la siguiente forma: 1. Llene una garrafa de 3,5 l del sistema Dako Omnis, marcada como PTB (etiqueta azul), con agua desionizada hasta la línea de llenado (3,325 l). Antes de proceder al llenado, asegúrese de que la garrafa esté colocada en una superficie horizontal. 2. Vacíe un frasco con 175 ml de concentrado de ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) en la garrafa. 3. Quite la etiqueta del frasco de concentrado y péguela en la garrafa. Cierre la tapa de la garrafa e invierta la garrafa con cuidado 2-3 veces. 4. Utilice el lector de códigos de barras de mano Dako Omnis para identificar el reactivo (escanee la etiqueta despegable y, a continuación, la garrafa). 5. Cargue inmediatamente la garrafa en el instrumento Dako Omnis. La solución diluida puede utilizarse durante un periodo de 7 días si se almacena en el instrumento Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). La solución diluida no utilizada puede almacenarse a 2-8 C durante un máximo de 30 días. Tras el almace namiento en frío, asegúrese de que la solución diluida está estabilizada al menos a 18 C antes de cargarla en Dako Omnis. NOTA: Deseche la solución diluida si está turbia A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) es un reactivo listo para su uso. Antes de cargarlo en Dako Omnis, levante hacia atrás la tapa superior del tapón y colóquela en la posición de corte. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 35/57

36 Cáncer gástrico La estabilidad total en el instrumento de ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). Tras la finalización de una sesión, ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) se puede transferir a temperatura de almacenamiento (2-8 C) para conservar el tiempo de estabilidad en el instrumento. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) es un reactivo listo para su uso. Antes de cargarlo en Dako Omnis, asegúrese de que el reactivo se ha descongelado y levante hacia atrás la tapa superior del tapón y colóquela en la posición de corte. La estabilidad total en el instrumento de ISH Pepsin (Dako Omnis) es de 80 horas cuando se almacena en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos) en Dako Omnis. El software Dako Omnis controla la estabilidad restante en el equipo (vea el apartado anterior). Tras la finalización de una sesión, ISH Pepsin (Dako Omnis) debe transferirse a temperatura de almacenamiento, entre -18 y 8 C par a conservar el tiempo de estabilidad en el instrumento. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) es un medio de montaje listo para su uso que se utiliza fuera del instrumento Dako Omnis. Transfiera Fluorescence Mounting Medium a temperatura de almacenamiento (2-8 C) inmediatamen te después de utilizarlo. A.7 Accesorios adicionales Se deben cargar además los siguientes accesorios en el instrumento Dako Omnis: agua desionizada; Wash Buffer diluido 20x (Dako Omnis), n.º de catálogo GC807; Clearify (Dako Omnis), n.º de catálogo GC810; ISH Cleaning Solution n.º de catálogo GC207, y tapas ISH Lid (Dako Omnis), n.º de catálogo GC102, tal como se especifica en los Manuales del usuario de Dako Omnis. B. Procedimiento de tinción - Gástrico B.1 Notas sobre el procedimiento HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) es la sonda de hibridación para el ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH) directo automatizado del instrumento Dako Omnis y que, junto con los reactivos accesorios GM300, GM301, GM302, GM303 y GM304 (GM304 fuera del instrumento), se ha diseñado para la determinación cuantitativa de la amplificación del gen HER2. Antes de su uso, el usuario debe leer todas estas instrucciones atentamente y familiarizarse con todos los componentes y las distintas precauciones. El procedimiento automatizado en Dako Omnis incluye la desparafinización de cortes de tejido, la recuperación diana, la digestión con pepsina, la hibridación y el lavado astringente. Los portaobjetos se descargan en la estación de descarga seca. Todos los pasos del protocolo están preprogramados en el software Dako Omnis. Consulte los Manuales del usuario de Dako Omnis para ver instrucciones sobre la carga de portaobjetos, tapas ISH Lid, reactivos, etc. Tres protocolos HER2 IQFISH validados: corto HER2 IQFISH con pepsina, medio HER2 IQFISH con pepsina y largo HER2 IQFISH con pepsina, que solo difieren en el tiempo de digestión con pepsina, están preprogramados en el software Dako Omnis y se pueden seleccionar para cada uno de los cinco portaobjetos de la gradilla de portaobjetos. De esta manera se optimiza la digestión del tejido que puede depender de las condiciones anteriores del análisis. El protocolo medio HER2 IQFISH con pepsina se considera el protocolo estándar. Los diferentes protocolos de tinción se pueden ver en la estación de trabajo Dako Link Omnis. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 36/57

37 Cáncer gástrico B.2. Procedimiento previo a la tinción 1. Seleccione el protocolo HER2 IQFISH que desea aplicar en cada portaobjetos en el software de la estación de trabajo Dako Link Omnis, en los protocolos IQFISH. 2. Imprima las etiquetas para portaobjetos y adjúntelas a los portaobjetos de vidrio. 3. Coloque los portaobjetos en la gradilla de portaobjetos. Para obtener más información, consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis. Una gradilla de portaobjetos puede incluir hasta cinco portaobjetos. Se recomienda que al menos dos portaobjetos se tiñan en una sesión de tinción HER2 IQFISH. 4. Cargue la gradilla de portaobjetos en el instrumento Dako Omnis. 5. Cargue las tapas ISH Lid (una tapa ISH Lid por gradilla de portaobjetos) en Dako Omnis. 6. Asegúrese de que las garrafas con líquido se encuentran en el instrumento y se registran en Dako Omnis. Garrafas con líquido: Clearify (agente depurador), ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluida, ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluido y Wash Buffer (Dako Omnis) diluido. 7. Cargue ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Pepsin (Dako Omnis), la HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) mezclada recientemente y ISH Cleaning Solution en el Reagent Storage Module (Módulo de almacenamiento de reactivos). Asegúrese de que las tapas superiores de los tapones están abiertas. 8. Siga las instrucciones de la pantalla táctil y toque en "Done" (Finalizado) para iniciar el procedimiento de tinción. B.3. Procedimiento de tinción El procedimiento de tinción HER2 IQFISH en el instrumento Dako Omnis (resumido en la Tabla 11) se puede controlar en la estación de trabajo Dako Link Omnis: Tabla 11. Descripción simplificada de los pasos del protocolo de tinción HER2 IQFISH. Paso Reactivo Tiempo y temperatura Descerado Clearify (agente depurador) 10 minutos, 38 C Recuperación ISH Pre-Treatment Solution 15 minutos, 97 C antigénica (Dako Omnis) Lavado ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 minutos, 32 C (Dako Omnis) Digestión* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10, 15 o 20 minutos Secado 15 minutos, 45 C Desnaturalización 10 minutos, 66 C Hibridación HER2 IQFISH pharmdx 75 minutos, 45 C (Dako Omnis) Lavado astringente ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minutos, 61 C *Se pueden seleccionar tres tiempos de digestión con pepsina validados con los protocolos HER2 IQFISH anteriormente especificados. Si no se va a realizar ninguna tinción ISH inminente, transfiera todos los reactivos a las temperaturas de almacenamiento recomendadas. B.4. Procedimiento posterior a la tinción Descargue los portaobjetos y aplique hasta 30 µl de Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) con DAPI al área diana del portaobjetos. El corte de tejido debe cubrirse completamente con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Aplique un cubreobjetos de vidrio. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 37/57

38 Cáncer gástrico NOTA: Puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. No obstante, tenga en cuenta que si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. A fin de minimizar el desvanecimiento, almacene los portaobjetos en la oscuridad entre -18 y 8 C. Control de calidad - Gástrico 1. Las señales deben ser brillantes, bien diferenciadas y fáciles de evaluar. 2. Las células normales son un control interno de la sesión de tinción. Las células normales deberían presentar 1-2 señales verdes claramente visibles que indican que la sonda de ANP CEN-17 se ha hibridado satisfactoriamente con la región centromérica del cromosoma 17. Las células normales deberían presentar también 1-2 señales rojas claramente visibles que indican que la sonda de ADN HER2 se ha hibridado satisfactoriamente con el gen o genes HER2. Debido al seccionamiento del tejido, algunas células normales presentarán menos de las dos señales de cada color esperadas. Si no se pueden detectar señales en las células normales, el ensayo ha fracasado y los resultados deben considerarse no válidos. 3. La morfología del núcleo debe estar intacta al evaluarla utilizando un filtro para DAPI. Numerosas células fantasma y una morfología nuclear general pobre indican una sobredigestión de la muestra, que tiene como resultado la pérdida o fragmentación de las señales. Tales muestras deben considerarse no válidas. 4. Un mínimo de 20 células tumorales debe ser evaluable. 5. Las diferencias en la fijación, el procesado y la inclusión del tejido en el laboratorio del usuario pueden generar variabilidad en los resultados, por lo que es necesario que el usuario lleve a cabo una evaluación regular de sus propios controles. Interpretación de la tinción - Gástrico Tejidos evaluables Localice el tumor dentro del contexto del portaobjetos teñido con H&E y evalúe la misma área en el portaobjetos teñido mediante FISH (en el filtro para DAPI). Solo deben evaluarse las muestras de pacientes con adenocarcinoma gástrico o de la unión gastroesofágica. En los casos con metaplasia intestinal y adenocarcinoma en la misma muestra, solo debe puntuarse el componente de carcinoma gástrico. Evite las áreas de fuerte inflamación, necrosis y las áreas en las que los bordes de los núcleos sean ambiguos. No incluya los núcleos que requieran una valoración subjetiva. No incluya núcleos que presenten una intensidad de señal débil y no específica o tinción de fondo alta. Comience con una evaluación microscópica de toda la sección FISH teñida y del área asignada en la sección H&E, respectivamente. Antes de enumerar la sección FISH teñida, anote la distribución general de la señal (homogénea o heterogénea) en la hoja de enumeración de la señal. Si la distribución es heterogénea, anote si hay amplificación focal o amplificación de célula única (mosaico). 1) Distribución homogénea de la señal Si la distribución de la señal es homogénea, enumere el número de centrómeros del cromosoma (señales verdes) y el número de genes HER2 (señales rojas) respectivamente, desde 20 células en 1-2 áreas tumorales representativas. 2) Distribución heterogénea de la señal Si la distribución de la señal es heterogénea, enumere un total de 20 células de las áreas seleccionadas como se especifica a continuación: A) Si existe amplificación focal, se deberán seleccionar las áreas con células amplificadas. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 38/57

39 Cáncer gástrico B) Si hay distribución en mosaico o células amplificadas polisómicas y disómicas, se contarán las áreas con células amplificadas. Dentro de estas áreas, no solo deben contarse las células amplificadas, sino también las células no amplificadas adyacentes para el total de 20 células. Si es posible, no seleccione áreas que se superpongan. Ignorar la tinción de ADN bacteriano Una serie de células especializadas (mastocitos y macrófagos), presentes y entremezcladas en el tejido gástrico, muestran un alto grado de tinción mediante la sonda de HER2 debido a la presencia de ADN bacteriano. Como consecuencia aparecen células fluorescentes muy rojas que se distinguen claramente de las células tumorales con una alta amplificación del gen HER2. Enumeración de la señal Cuando se ha seleccionado un área para la evaluación de señales, empiece el análisis en uno de los 20 núcleos adyacentes elegidos y cuente célula por célula omitiendo los núcleos que no cumplan los criterios de calidad. Localice el tumor dentro del contexto del portaobjetos teñido con H&E y evalúe la misma área en el portaobjetos teñido mediante FISH. Examine todo el portaobjetos teñido para tener en cuenta la posible heterogeneidad. Seleccione un área que tenga una distribución óptima de núcleos. Comience el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada y, examinando de izquierda a derecha, cuente el número de señales comprendidas dentro del borde nuclear de cada núcleo evaluado, con arreglo a las pautas siguientes (consulte también el Apéndice 5). - Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales. - Cuando dos señales sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de la señal, cuéntelas como una sola señal. La distancia tiene que ser al menos igual al diámetro de una señal de tamaño normal con el fin de contar dos señales individuales. Cuando la distancia entre dos señales es menor que el diámetro de una señal se tendrá que contar como una sola. - En los núcleos con altos niveles de amplificación del gen HER2, las señales de HER2 pueden estar muy cerca unas de las otras, formando un grupo de señales. En esos casos no es posible contar el número de señales de HER2; en vez de contarlo, debe calcularlo (realizar una estimación). Debe prestar especial atención a las señales verdes, ya que los grupos de señales de HER2 rojas pueden cubrir las señales verdes, haciéndolas imposibles de ver. En caso de duda, compruebe las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC. No puntúe los núcleos que no presenten señales o que presenten señales de un solo color. Puntúe solo los núcleos que presenten una o más señales FISH de cada color. Pautas para el recuento de señales 1 No contar. Los núcleos se superponen; no todas las áreas de los núcleos son visibles. 2 Dos señales verdes; no puntúe los núcleos que presenten señales de un solo color. 3 Contar como 3 señales verdes y 12 señales rojas (estimación del grupo). 4 Contar como 1 señal verde y 1 señal roja. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 5 No contar (núcleos sobre o infradigeridos). o Ausencia de señales en el centro del núcleo (núcleo en forma de donut). ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 39/57

40 Cáncer gástrico 6 Contar como 2 señales verdes y 3 señales rojas. Dos señales que sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una señal se cuentan como una sola señal. 7 Contar como 1 señal verde y 5 señales rojas. 8 Contar como 3 señales verdes (1 señal verde está fuera de foco) y 3 señales rojas. 9 Grupo de señales rojas que están tapando a señales verdes; comprobar las señales verdes utilizando un filtro específico para FITC, o no contar. Registre los recuentos en una tabla como la que se indica en los Apéndices 3 y 4. Cuente 20 núcleos por muestra tisular, y si es posible, de áreas tumorales bien definidas. Calcule la proporción HER2/CEN-17 dividiendo el número total de señales rojas de HER2 entre el número total de señales verdes de CEN-17. Las muestras que presenten una proporción HER2/CEN-17 igual o superior a 2 deben considerarse como amplificadas en cuanto al gen HER2 (29). Los resultados que estén en el punto de corte (1,8-2,2) o cerca de él deben interpretarse con precaución. Si la proporción es dudosa (1,8-2,2), cuente 40 núcleos diferentes y calcule la proporción para los 40 núcleos. Si la enumeración todavía es dudosa, el resultado válido será el de la segunda evaluación. Si está disponible, se deberá incluir la tinción inmunohistoquímica de HER2 para conseguir una mejor orientación durante la segunda enumeración. En caso de duda, vuelva a puntuar con la muestra. En los casos de proporción dudosa, el anatomopatólogo debe consultar con el médico a cargo de los tratamientos. Limitaciones - Gástrico 1. Para uso automatizado solo en instrumentos Dako Omnis. 2. Se requiere formación especializada en la preparación de tejidos y portaobjetos y en la interpretación de la tinción IQFISH. Las interpretaciones de las tinciones con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) no deben realizarlas personas con deficiencias de la visión cromática. 3. Los resultados de FISH dependen de la manipulación y el procesamiento del tejido antes de su tinción. Una fijación, lavado, secado, calentamiento o seccionamiento incorrectos, o la contaminación con otros tejidos o líquidos, pueden afectar a la hibridación de las sondas. Los resultados incoherentes pueden deberse a variaciones en los métodos de fijación e inclusión, o a irregularidades inherentes al tejido. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 40/57

41 Cáncer gástrico Características de resultados - Gástrico Eficiencia de la hibridación La eficiencia de la hibridación de HER2 IQFISH pharmdx se investigó con 180 cortes de tejido en parafina y fijados con formol analizados en tres centros de estudio. Los 180 cortes de tejido pudieron enumerarse de acuerdo con las directrices de enumeración del producto. La eficiencia de la hibridación fue del 100%. Las proporciones HER2/CEN-17 calculadas y utilizadas en los estudios de características de resultados se basan en el recuento de señales en 20 núcleos realizado según las pautas de puntuación proporcionadas en la sección Interpretación de la tinción de estas instrucciones de uso. Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se investigó con 20 muestras diferentes de adenocarcinoma de cáncer gástrico (10 muestras con el estado del gen HER2 amplificado y 10 muestras sin amplificar). La proporción entre el número de señales de HER2 y de señales de CEN-17 se calculó en función del recuento realizado en 20 núcleos de células normales de la muestra tisular. La proporción HER2/CEN-17 para las 20 muestras tisulares de adenocarcinoma de cáncer gástrico fue de entre 0,94 y 1,19. Especificidad analítica Las sondas de ADN HER2 de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se han secuenciado en los extremos y mapeado para confirmar una cobertura total de 218 kb, incluido el gen HER2. Las sondas de ANP CEN-17 contenidas en HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se han evaluado individualmente y de forma combinada, y se ha confirmado su hibridación específica con la región centromérica del cromosoma 17. A fin de excluir la hibridación cruzada con cromosomas que no son el cromosoma 17, se llevaron a cabo estudios de alineaciones metafásicas con arreglo a los procedimientos de control de calidad estándar de Dako. Se evaluó la hibridación específica de las mezclas de sondas de ADN para HER2 y de ANP para CEN-17 con un total de 275 alineaciones metafásicas con señales distintas. En la totalidad de los 275 casos, la hibridación fue específica del cromosoma 17. No se observó hibridación cruzada con loci de otros cromosomas en ninguno de los 275 casos. De este modo, la especificidad de las sondas fue del 100% (275 de 275). Para medir la capacidad del ensayo IQFISH para identificar exclusivamente las sustancias diana HER2 y CEN-17 sin interferencias con otras sustancias, se llevaron a cabo estudios con muestras de adenocarcinoma gástrico en los que se omitieron las sondas de HER2 y CEN-17 en la mezcla de hibridación y en los que únicamente se utilizó el tampón de hibridación. Se evaluó un total de 20 muestras en busca de señales no relacionadas con la mezcla de sondas. No se observó detección alguna de otras dianas de cromosomas o interferencia con sustancias estrechamente relacionadas en ninguna de las 20 muestras. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 41/57

42 Cáncer gástrico Estudios de robustez La robustez del ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó variando la concentración de las sondas de ANP, el tiempo de recuperación diana, el tiempo de incubación con pepsina, el tiempo de desnaturalización, el tiempo de hibridación y el tiempo y la temperatura del lavado astringente. Los diferentes parámetros se evaluaron en tres muestras tisulares FFPE diferentes de adenocarcinoma gástrico y en dos muestras tisulares FFPE de la unión gastroesofágica (UGE). En cada grupo se incluyeron tanto muestras tisulares amplificadas como sin amplificar. Todos los parámetros se analizaron con ajustes inferiores y superiores a los del protocolo estándar, a excepción de la concentración de las sondas de ANP y la temperatura del lavado astringente, para los que el ajuste del protocolo estándar se incluyó en la configuración. Los parámetros de evaluación fueron: Concentración de las sondas de ANP: se evaluó al 100% y al +/-17%. Tiempo de recuperación diana: se evaluó a 13 min 45 s y a 16 min 15 s. Tiempo de incubación con pepsina: se evaluó a 14 min 45 s y a 16 min 15 s. Tiempo de desnaturalización: se evaluó a 9 min 45 s y a 10 min 45 s. Tiempo de hibridación: se evaluó a 70 min y a 80 min. Tiempo de lavado astringente: se evaluó a 8 min 45 s y 11 min 15 s. Temp. de lavado astringente: se evaluó a 59 C, 61 C y 63 C. Las tres concentraciones de las sondas de ANP se valoraron en un diseño de experimento fraccionado (herramienta JMP, SAS) que se realizó con 12 protocolos de tinción diferentes tal y como se indica en la Tabla 12. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 42/57

43 Cáncer gástrico Tabla 12. Se utilizaron doce protocolos de tinción diferentes en el estudio de robustez. N.º de protocolo de robustez Tiempo de recuperación diana (min) Tiempo con pepsina (min) Tiempo de desnaturalización (min) Parámetro de evaluación Tiempo de hibridación (min) Tiempo de lavado astringente (min) Temp. de lavado astringente ( 0 C) Conc. de ANP en mezcla de sondas 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % El total de las cinco muestras tisulares se tiñeron con los 12 protocolos. La lectura del estudio de robustez incluía los resultados relacionados con la intensidad de las señales y la calidad morfológica. Todos los protocolos produjeron tinciones en todas las muestras tisulares (60 en total) con señales que fueron brillantes, diferenciadas, fáciles de evaluar y, por consiguiente, aptas para la enumeración de señales. Además, el efecto del grosor del tejido en los resultados del ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó variando el grosor del corte de las muestras tisulares FFPE de cáncer de gástrico. Se evaluó un total de cinco cortes consecutivos de muestras de adenocarcinoma con diferentes grosores (2, 3, 4, 5, 6 y 7 µm) mediante el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). El coeficiente promedio de la varianza de la proporción HER2/CEN-17 fue del 3,9% (con una oscilación de entre el 3,2% y el 5,0%). Reproducibilidad Se evaluó la reproducibilidad intralaboratorio día a día y lote a lote con el ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). El estudio se diseñó como un estudio interno, ciego y aleatorizado de proporciones HER2/CEN-17 con cortes de ocho muestras diferentes de cáncer gástrico y de la unión gastroesofágica (UGE) incluidas en parafina y fijadas con formol con diversos niveles de amplificación del gen HER2. Las ocho muestras se habían evaluado con HercepTest y entre ellas se incluyeron dos muestras con HER2 IHC 0/1+, dos muestras con HER2 IHC 2+, dos muestras con HER2 IHC 3+, y dos muestras con proporción HER2/CEN-17 FISH predeterminada entre 1,5 y 2,5, y se obtuvieron con HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731). Cada muestra se tiñó con tres lotes diferentes de HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) en cinco días no consecutivos. Se procesó un total de 240 tinciones de tejido en todo el estudio, ya que cada combinación se tiñó por duplicado. En la Figura 8 se ilustran las variaciones en la proporción en función de los días y los lotes. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox a través de un modelo de efectos aleatorios para obtener la homogeneidad de la varianza de los datos. Se estimó que el coeficiente total de variación fue del 6,5% y se halló que la variación entre días y lotes contribuyó con un 0,7% y un 0,8%, respectivamente. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 43/57

44 Cáncer gástrico Figura 8. Proporciones HER2/CEN-17 obtenidas en un estudio de reproducibilidad intralaboratorio con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), incluidos los criterios de valoración de reproducibilidad lote a lote y día a día. El valor promedio de cada muestra tisular se representa mediante una línea horizontal. Además, se evaluó la reproducibilidad día a día y centro a centro de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) en un estudio estratificado, ciego y llevado a cabo en tres centros (un centro en los Estados Unidos y dos centros en Europa), en el que se utilizaron cortes de tejido de 12 muestras diferentes de adenocarcinoma gástrico y de la unión gastroesofágica (UGE) incluidas en parafina y fijadas con formol. Tres muestras fueron HER2 IHC 0/1+; otras tres, HER2 IHC 2+; otras tres HER2 IHC 3+, y tres muestras tuvieron una proporción HER2/CEN-17 FISH predeterminada entre 1,5 y 2,5, y se obtuvieron con HercepTest TM y HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731), respectivamente. Las muestras se tiñeron y analizaron en los centros de estudio. Cada muestra se tiñó un mínimo de siete veces en siete días no consecutivos y fue puntuada por un observador en cada centro. Se tiñeron 314 cortes y se incluyeron en el análisis estadístico. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox y se calcularon los componentes de la varianza. El coeficiente total de la varianza, basado en el límite de confianza superior del 95%, fue del 24%. La variación de la proporción HER2/CEN-17 por día y centro queda reflejada en la Figura 9. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 44/57

45 Cáncer gástrico Figura 9. Gráfico en el que se representa la variabilidad de las proporciones HER2/CEN-17 en unidades no transformadas obtenidas en el estudio de reproducibilidad día a día y centro a centro de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) en muestras tisulares de cáncer gástrico. El ensayo HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) se evaluó para obtener la reproducibilidad observador a observador como parte del estudio de comparación de métodos realizado de forma interna, utilizando tres observadores para puntuar las muestras teñidas por separado. Se evaluó la reproducibilidad en 139 muestras diferentes de adenocarcinoma gástrico con el estado del gen HER2 amplificado o sin amplificar. Los datos se analizaron con la transformación Box-Cox. El coeficiente promedio de variación de observador a observador fue del 18%. El 96,4% de las muestras de adenocarcinoma gástrico procedían de extirpaciones y el 5,6% eran muestras de biopsia. El 81,3% de las muestras se extrajeron del estómago, mientras que el 18,7% se obtuvieron de la unión gastroesofágica. Repetibilidad Se evaluó la repetibilidad intralaboratorio de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) con cortes consecutivos de ocho muestras de adenocarcinoma gástrico con el estado del gen HER2 amplificado o sin amplificar. Los tejidos se evaluaron por duplicado en cinco días no consecutivos con tres lotes diferentes en un total de 240 portaobjetos (120 cortes duplicados). Se utilizó el modelo de efectos aleatorios para analizar los datos que arrojaron una varianza atribuible a los días y los lotes (consulte el estudio de reproducibilidad interno mencionado con anterioridad). La varianza residual representa la varianza entre réplicas y, por consiguiente, indica repetibilidad. El límite de confianza superior del 95% para el coeficiente de repetibilidad de variación fue del 7,1%. Estudios de comparación de métodos Comparación de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) con HER2 IQFISH pharmdx (K5731) En el estudio se incluyeron 140 muestras de cáncer gástrico compuestas por diferentes tipos de tejido de adenocarcinoma gástrico, del estómago o de la unión gastroesofágica (UGE), y procedentes de extirpaciones o biopsias con una distribución homogénea o heterogénea (focal o mosaico) de la señal, tal y como se muestra en la Tabla 13. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 45/57

46 Cáncer gástrico Tabla 13. Distribución de las muestras en función del tipo de cáncer gástrico (estómago o de la UGE), la categoría de la distribución de la señal (homogénea o heterogénea) y el tipo de tejido (extirpación o biopsia). Tipo de cáncer gástrico Número de muestras Distribución de la señal Número de muestras Tipo de tejido Número de muestras Estómago 113 Homogénea 58 Extirpación 134 Unión gastroesofágica (UGE) 27 Heterogénea: focal Heterogénea: mosaico Biopsia 6 Total 140 Total 140 Total 140 Entre las muestras se incluyeron 76 casos con el gen HER2 no amplificado y 64 casos con el gen HER2 amplificado con la puntuación conocida de HercepTest, tal y como se muestra en la Tabla 14. Tabla 14. Distribución de las muestras basada en la puntuación de HercepTest y la puntuación de HER2 FISH obtenida con el kit HER2 FISH pharmdx (K5731). Puntuación de tinción de Total HercepTest n Estados de HER2 FISH Amplificado No amplificado N.º total de muestras evaluadas con FISH En la Tabla 15 se recogen los resultados de la tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos mediante los dos ensayos con cálculo de tanto por ciento de concordancia general (OPA), tanto por ciento de concordancia positiva (PPA) y tanto por ciento de concordancia negativa (NPA). La correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 con los dos ensayos se muestra en la Figura 10. Tabla 15. Tabulación cruzada de los estados del gen HER2 obtenidos con HER2 IQFISH pharmdx (K5731) y HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Estados del gen HER2 (Dako Omnis) No amplificado Estados del gen HER2 (K5731) No amplificado Amplificado Total Amplificado Total OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 46/57

47 Cáncer gástrico Figura 10. Correlación entre las proporciones HER2/CEN-17 de los ensayos HER2 FISH pharmdx (Dako Omnis) y HER2 IQFISH pharmdx (n.º de catálogo K5731) en 140 muestras de cáncer gástrico (modelo lineal: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. Ponderado con la varianza inversa para permitir el modelo lineal). Se halló que el intervalo de confianza del 95% para la diferencia promedio entre los dos métodos de tinción con una proporción de HER2/CEN-17 = 2 fue de [0,007; 0,022]. Por tanto, no se espera una diferencia superior al 2%. Datos clínicos La eficacia y seguridad clínicas de trastuzumab (Herceptin ) se han demostrado en el estudio BO18255 (el ensayo ToGA "estudio multicéntrico de fase III, abierto, aleatorizado de trastuzumab en combinación con fluoropirimidina y cisplatino (capecitabina o 5-fluorouracilo) (FC+H) frente a exclusivamente quimioterapia (FC) como tratamiento de primera línea en pacientes con cáncer gástrico avanzado con positivo para HER2") (28). Se trata de un estudio multicéntrico de fase III, abierto, aleatorizado y realizado en pacientes con resultados de HER2 positivos con adenocarcinomas avanzados gástricos o gastroesofágicos. En el estudio BO18255 la positividad para HER2 se definió como IHC-positivo (3+) con HercepTest (Dako) o como FISH positivo (HER2/CEN-17 2,0) con el kit HER2 FISH pharmdx (Dako). Después de la inclusión en el estudio, los pacientes fueron aleatorizados para que recibieran quimioterapia (5-FU o capecitabina y cisplatino) o quimioterapia más trastuzumab. El criterio de valoración de eficacia principal fue la supervivencia global (SG) analizada mediante la prueba de rangos logarítmicos estratificada. El análisis definitivo de SG, basado en 351 fallecimientos, fue estadísticamente significativo (nivel de significancia nominal de 0,0193). También se realizó un análisis de la SG actualizada un año después del análisis definitivo. La supervivencia global mediana de 13,5 meses del grupo al que se administró Herceptin y quimioterapia fue significativamente mayor en comparación con la supervivencia global mediana de 11,0 meses del grupo que solo recibió quimioterapia. Los resultados de eficacia de los análisis definitivo y actualizado se resumen en la Tabla 16 y en la Figura 11. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 47/57

48 Tabla 16. Supervivencia global en la población a la que se pretende tratar (ITT). Supervivencia global definitiva N.º de fallecimientos (%) Mediana IC del 95% (meses) Cociente de riesgos instantáneos IC del 95% valor p*, bilateral Supervivencia global actualizada N.º de fallecimientos (%) Mediana IC del 95% (meses) Cociente de riesgos instantáneos IC del 95% Grupo de FC N= (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) *En comparación con el nivel de significancia nominal de 0,0193 Grupo de FC + H N=298 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) 167 (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9, 15,1) Cáncer gástrico Figura 11. Supervivencia global actualizada en pacientes con cáncer gástrico metastásico En la Tabla 17 se resume un análisis exploratorio de la SG basado en la evaluación de la amplificación del gen (FISH) y la sobreexpresión de la proteína (IHC). ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 48/57

49 Tabla 17. Análisis exploratorio en función del estado de HER2 con los resultados de la supervivencia global actualizada. Subgrupo FISH+/IHC 0, 1+ (N=133) N.º de fallecimientos/n (%) Duración de la SG mediana (meses) IC del 95% (meses) Cociente de riesgos instantáneos (IC del 95%) Subgrupo FISH+/IHC2+ (N=160) N.º de fallecimientos/n (%) Duración de la SG mediana (meses) IC del 95% (meses) Cociente de riesgos instantáneos (IC del 95%) Subgrupo FISH+ o FISH-/IHC3+ c (N=294) N.º de fallecimientos/n (%) Duración de la SG mediana (meses) IC del 95% (meses) Cociente de riesgos instantáneos (IC del 95%) FC N=296 a FC+H N=298 b 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) 65/80 (81%) 10,8 (6,8, 12,8) 104/143 (73%) 13,2 (11,5, 15,2) 1,33 (0,92, 1,92) 0,78 (0,55, 1,10) 0,66 (0,5, 0,87) 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) 64/80 (80%) 12,3 (9,5, 15,7) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Cáncer gástrico La supervivencia mediana se estimó a partir de las curvas de Kaplan-Meier. a Se excluyó de los análisis a dos pacientes del grupo de FC con un resultado FISH+ y con un estado IHC desconocido. b Se excluyó de los análisis a cinco pacientes del grupo de Herceptin con un resultado FISH+ y con un estado IHC desconocido. c Incluye a 6 pacientes del grupo de quimioterapia y 10 pacientes del grupo de Herceptin con FISH-, IHC3+, y a 8 pacientes del grupo de quimioterapia y 8 pacientes del grupo de Herceptin con un estado FISH desconocido y IHC3+. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 49/57

50 Cáncer gástrico Solución de problemas - Gástrico Problema Causa probable Acción recomendada 1. No hay señales o son débiles. 1a. Los reactivos se han expuesto a altas temperaturas durante su transporte o almacenamiento. 1b. El microscopio no funciona correctamente. - Juego de filtros inapropiado - Lámpara incorrecta - Lámpara de mercurio demasiado vieja - Objetivos colectores sucios y/o con fisuras - Aceite de inmersión inadecuado 1a. Compruebe las condiciones de almacenamiento. Asegúrese de que había hielo seco en los envíos de IQISH Probe Mix y pepsina cuando los recibió. Asegúrese de que los reactivos se han almacenado según lo especificado. 1b. Compruebe el microscopio y asegúrese de que los filtros que se están utilizando son adecuados para su uso con los fluorocromos de la Probe Mix; asegúrese también de que la lámpara de mercurio es la correcta y que no se haya utilizado más allá de su vida útil esperada (consulte el Apéndice 5). En caso de duda, contacte con el vendedor del microscopio. 1c. Señales desvanecidas 1c. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición de las muestras a fuentes de luz intensa. 1d. Tampones identificados incorrectamente 1d. Sustituya los tampones a granel y asegure el registro correcto (en la estación de trabajo) y la identificación (en la pantalla táctil) de los tampones a granel. Para obtener más información, consulte el Manual básico del usuario de Dako Omnis. Atención: ISH Pre- Treatment Solution es verde e ISH Stringent Wash Buffer es amarillo. 2. Áreas sin señal 2. Burbujas de aire atrapadas durante el montaje 2. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan, elimínelas suavemente con la ayuda de unas pinzas. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 50/57

51 Problema Causa probable Acción recomendada 3. Excesiva tinción de fondo 3a. Fijación inadecuada del tejido 3b. Exposición prolongada de la sección hibridada a una luz intensa Cáncer gástrico 3a. Asegúrese de que solo se usen cortes de tejido incluidos en parafina y fijados con formol. 3b. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición a fuentes de luz intensa. 4. Mala morfología del tejido 5. Alto nivel de autofluorescencia verde en portaobjetos, incluidas áreas sin tejido FFPE 4a. Tratamiento incorrecto con pepsina 4b. Un tratamiento con pepsina excesivamente largo, o un grosor muy fino de las secciones, puede hacer que aparezcan células fantasma o células en forma de anillo. 5. Uso de portaobjetos de vidrio caducados o no recomendados 4a. Cambie a alguno de los tres protocolos de tinción diferentes. Asegúrese de que ISH Pepsin se almacene a la temperatura correcta. 4b. Pruebe con un protocolo de tinción de menor tiempo de incubación con pepsina. Asegúrese de que el grosor del corte sea de 3-6 µm. 5. Elija el portaobjetos de vidrio según se ha especificado. Asegúrese de que los portaobjetos de vidrio no han pasado la fecha de caducidad. NOTA: Si no puede atribuirse el problema a ninguna de las circunstancias anteriores, o si la acción correctiva sugerida no lo soluciona, póngase en contacto con el Servicio Técnico de Dako para solicitar más ayuda. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 51/57

52 Cáncer gástrico Apéndice 3 - Gástrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), n.º de catálogo GM333 Sistema de puntuación Fecha de la sesión: Lote de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ID del registro de sesión de tinción: ID de muestra: Caracterización de la distribución de la señal en el tejido: Homogéneo: Heterogéneo Focal: o Heterogéneo Mosaico: N.º núcleo Puntuación HER2 (roja) Recuento de señales en 20 núcleos Puntuación CEN-17 (verde) N.º núcleo Total (1-10) Total (11-20) Puntuación HER2 (roja) Puntuación CEN-17 (verde) Para determinar la proporción HER2/CEN-17, cuente el número de señales de HER2 y el número de señales de CEN-17 en los mismos 20 núcleos y divida el número total de señales de HER2 entre el número total de señales de CEN-17. Si la proporción HER2/CEN-17 es dudosa (1,8-2,2), cuente 40 núcleos diferentes y vuelva a calcular la proporción para los 40 núcleos (consulte el esquema de puntuación del recuento, Apéndice 4). Una relación que esté en el punto de corte (1,8-2,2) o cerca de él debe interpretarse con precaución (consulte las pautas para el recuento). Puntuación total (1-20) HER2 CEN-17 Proporción HER2/CEN-17 Proporción < 2: no se observó amplificación del gen HER2. Proporción 2: se observó amplificación del gen HER2. Fecha y firma del técnico: Fecha y firma del anatomopatólogo: Para conocer las pautas de puntuación: consulte el apartado Interpretación de la tinción. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 52/57

53 Cáncer gástrico Apéndice 4 - Gástrico HER2 IQFISH pharmdx, n.º de catálogo GM333 Esquema de puntuación del recuento Fecha de la sesión: Lote de HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ID del registro de sesión de tinción: ID de muestra: Señales en 40 núcleos adicionales (1-40) N.º núcleo HER2 (rojo) CEN17 (verde) N.º núcleo HER2 (rojo) CEN-17 (verde) N.º núcleo HER2 (rojo) CEN-17 (verde) N.º núcleo HER2 (rojo) CEN-17 (verde) Total (1-10) Total (11-20) Total (21-30) Total (31-40) Para determinar la proporción HER2/CEN-17, cuente el número de señales de HER2 y el número de señales de CEN-17 en los mismos 40 núcleos y divida el número total de señales de HER2 entre el número total de señales de CEN-17. Incluya la puntuación total de los núcleos 1-40 en la siguiente tabla. Puntuación total (1-40) HER2 CEN-17 Proporción HER2/CEN-17 Proporción < 2: no se observó amplificación del gen HER2. Proporción 2: se observó amplificación del gen HER2. Fecha y firma del técnico: Fecha y firma del anatomopatólogo: Para conocer las pautas de puntuación: consulte el apartado Interpretación de la tinción. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 53/57

54 Cáncer gástrico Apéndice 5 - Gástrico HER2 IQFISH pharmdx, n.º de catálogo GM333 Especificaciones del microscopio de fluorescencia Dako recomienda el siguiente equipo para usar con HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Tipo de microscopio Microscopio de epifluorescencia 2. Lámpara Lámpara de mercurio de 100 vatios (mantenga un registro del tiempo de combustión) 3. Objetivos Para el cribaje del tejido, puede aplicar objetivos de inmersión de aceite de 16X o 20X. Para un aumento de alta potencia y para la enumeración de las señales, le recomendamos que utilice exclusivamente objetivos de inmersión de aceite, por ejemplo, 100x. 4. Filtros Los filtros están diseñados individualmente para cada fluorocromo concreto, y debe elegirlos en consonancia. Dako recomienda el uso de un filtro específico para DAPI en combinación con un doble filtro de alta calidad específico para Texas Red/FITC. Filtro para DAPI, por ejemplo, filtro Chroma n.º Filtro doble Texas Red/FITC, por ejemplo, filtro óptico Omega n.º XF53 o filtro Chroma n.º Puede utilizar un filtro sencillo para Texas Red y otro filtro sencillo para FITC con fines de confirmación y enumeración Fluorocromo Longitud de onda de excitación FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Longitud de onda de emisión Los filtros son específicos de cada tipo de microscopio y el uso de los filtros adecuados es crucial para la interpretación. Si desea obtener información detallada al respecto, contacte con el proveedor de su microscopio o con el representante de Dako. 5. Aceite Aceite no fluorescente Precauciones No se recomienda utilizar una lámpara de mercurio de 50 vatios. No se pueden utilizar filtros para rodamina. No se recomienda utilizar filtros triples. Un microscopio no optimizado puede causar problemas al leer las señales fluorescentes. Es importante que la fuente de luz no haya caducado y que esté correctamente alineada y enfocada. Los clientes deben monitorizar y seguir las recomendaciones del fabricante de la lámpara de mercurio. Antes de interpretar los resultados, debe haberse realizado el mantenimiento del microscopio, y la lámpara de mercurio debe estar alineada. Debe esforzarse por exponer la muestra a la menor cantidad de luz de excitación posible a fin de minimizar el desvanecimiento de la fluorescencia. Le recomendamos que estudie la configuración de su microscopio concreto con el fabricante de éste antes de empezar la hibridación in situ fluorescente, o que consulte la literatura. ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 54/57

55 Referencias 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 55/57

56 17. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 56/57

57 Explicación de símbolos Número de catálogo Limitación de temperatura Fecha de caducidad Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Manténgase alejado de la luz solar (consulte el apartado de almacenamiento) Fabricante Consulte las instrucciones de uso Código de lote Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Fabricado por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tel Fax Distribuido en EE. UU. por: Dako North America Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, EE. UU. Tel. 805/ , Gratuito: 800/ Información para pedidos: Tel. 800/ Fax: Tel. servicio técnico: 800/ ( ) P04125ES_01_GM333/ p. 57/57