Exocitosis, Endocitosis y Reciclado Vesicular

Transcripción

1 Exocitosis, Endocitosis y Reciclado Vesicular

2 Exocitosis: proceso por el cual uno o más compuestos sintetizados dentro de la célula y transportados en vesículas son liberados o expuestos al medio extracelular luego de la fusión de la membrana vesicular con la plasmática. Exocitosis Secreción

3 Endocitosis Exocitosis endosoma

4 Funciones de la exocitosis (constitutiva o activada por Ca 2+ ) Excreción de un producto de desecho metabólico (exocitosis lisosomal) Formación de una interfase de comunicación y/o protección (glicocálix, proteínas matriz extracelular, mucus) Reciclado de Proteínas de membrana (por exocitosis) Secreción de sustancias mensajeras al medio extracelular (activada por calcio)

5 Exocitosis Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). CONSTITUTIVA (Formación SNARE) INESTABLE Se libera en reposo a baja [Ca 2+ ]i Sorensen, Pflugers Arch

6 Exocitosis Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). DISPARADA POR Ca 2+ NSF, SNAP ESTABLE Velocidad baja en reposo Y muy alta cuando Ca2+ Sorensen, Pflugers Arch

7 EXOCITOSIS ASOCIADA A SECRECION HORMONAL O DE NEUROTRANSMISORES: DOS TIPOS DE VESÍCULAS Las hormonas hidrofílicas son almacenadas en vesículas Vesículas sinápticas Pequeñas (40 nm) y claras Sinapsis convencionales Neurotransmisores clásicos Vesículas Secretorias grandes (200 nm) y densas al ME células neurosecretoras y ciertas terminales nerviosas catecolaminas, neuropéptidos

8 Tipo de vesícula vesículas secretorias o gránulos densos nm Altas concentraciones de proteína soluble muy condensada nm vesículas sinápticas Bajas concentraciones de proteína soluble

9 Dos modelos diferentes: sinapsis células neuroendócrinas (cromafines) - Observar distribución vesicular

10 Ciclo de las vesículas sinápticas en terminales presinápticas Kiss-and-run Ready Releasable Pool

11 Ciclo de las vesículas secretorias en células endócrinas Docking Priming (SNAREs) Ca 2+ Kiss-and-Run

12 MODOS DE FUSION Colapso completo vs. Kiss-and-Run K&R C.C. Ceccarelli, 1973 (2 Hz) neurotransmisor Heuser and Reese, 1973 (10 Hz)

13 Colapso completo, Kiss-and-Run, Exocitosis Compuesta

14 Características Generales de la Secreción regulada de NTs y Hormonas - Dependencia del calcio - Sensor de calcio - Mecanismo acoplado a cambios del potencial de membrana o algún otro activador (un mesajero químico) que induce el incremento citosólico de calcio - Maquinaria exocítica

15 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Microscopía Electrónica Terminales Presinápticas Célula Cromafín

16 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Sinapsis (placa neuromuscular) Se utiliza a la célula postsináptica como sensor 50 mv presinapsis 5 mv postsinapsis Latencia 2-5 ms EPP (PPT) Bernard Katz 16

17 Liberación evocada Liberación espontánea EPPs minis 17

18 PLACA NEUROMUSCULAR Liberación cuántica QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. 18

19 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Técnica de patch-clamp / whole-cell para medición de corrientes de Ca 2+ y capacitancia C = ε. A d

20 Técnica de patch clamp-whole cell para medición de corrientes de Ca 2+ y capacitancia ΔV

21 Diálisis de Ca 2+ Inducción de Corriente de Ca 2+ Augustine and Neher. 1992

22 Tren de estímulos en voltage clamp Tenemos un claro acople de la exocitosis con la entrada de Ca 2+

23 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Amperometría Red Ox + ne - E = E o RT ln [Ox] nf [Red]

24

25 Aplicación de trenes de APs a frecuencia alta (fight or flight) y basal (breed and feed). 40 mv 80 mv 20 ms Colapso completo kiss and run Fulop, Radabaugh y Smith, 2005

26 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Utilización de fluoróforos e imaging: marcadores de fase fluida, de membrana y anticuerpos Controles positivos (no estimuladas) (Sulforhodamine B) Correlación entre marcas verde y roja A proposed mechanism for activitydependent differential transmitter release in adrenal chromaffin cells.. Fulop, Radabaugh y Smith, 2005

27 Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular Utilización de fluoróforos e imaging: marcadores de fase fluida y de membrana STED: microscopía de superresolución verde: GFP dominio proteico de membrana rojo: Atto 532 (fluoróforo soluble extracelular) Shin,., and Ling-Gang Wu; Cell 173: , 2018

28 Proteínas de la maquinaria de fusión La maquinaria de fusión es universal para exocitosis regulada y constitutiva SNAREs (soluble NSF attachment protein receptors): Sintaxina y SNAP-25 (tsnare) y sinaptobrevina o VAMP (vsnare). Membrana plasmática vesícula

29 Utilización de capacitancia, amperometría y toxinas específicas para el estudio de las proteínas involucradas en la exocitosis Liberación de Ca por flash fotólisis vesícula Cliva SNAP-25 Cliva SNAP-25 Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998

30 vesícula vesícula vesícula Cliva Sintaxina+SNAP-25 Cliva Sinaptobrevina Cliva Sinaptobrevina Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998

31 Fusión y ciclado de proteínas SNARE A partir de experimentos de FRET, Lin y Scheller, 1997 trans-snare (Munc-18) cis-snare N terminal C terminal

32 Dependencia de la Exocitosis con el Ca del Castillo y Stark: los cambios en la concentración de Ca 2+ del medio externo se correlacionan con el tamaño de los EPPs, y que removiendo completamente a este catíón los EPPs desaparecían Katz y Miledi: partiendo de una preparación en solución libre de Ca 2+, logran recuperar la generación de EPPs al aplicar Ca 2+ en la región de la placa motora por iontoforesis Dodge y Rahamimoff : demuestran que la transmisión sináptica en la placa motora depende de manera sigmoidea con la concentración externa de Ca 2+, sugiriendo la existencia de un receptor que unía varios iones Ca 2+ de manera cooperativa Ricardo Miledi: inyecta Ca 2+ por iontoforesis en el interior de la terminal sináptica del axón gigante de calamar, lo cual inducía claros aumentos transitorios de potencial en la célula 32 postsináptica.

33 Katz y Miledi, J Physiol 1965 estímulo Ca 2+ ΔVm Sn externa sin calcio No Ca 2+ + Ca Ca 2+ No Ca 2+

34 R. Miledi, J Physiol 1973 Ca 2+ ΔVm Sn externa sin calcio Inyeccion Ca2+ Potencial postsináptico

35 Dependencia de la Exocitosis con el Ca 2+ Dependencia sigmoidea: implica varios sitios de unión a Ca 2+. (Kd ~ 20 μm) (Kd ~ 100 μm)

36 Si Ca 2+ es el disparador SENSOR de Ca 2+ Clásico: sinaptotagmina 2 dominios citosólicos C2A une 3 Ca 2+ C2B une 2 Ca 2+ En Rta a Ca: une membranas (en ms) une SNAREs Bai y Chapman, 2004 Tokuoka y Goda, 2003

37 H1: La sinaptotagmina al unir Ca 2+ se une a lípidos de membrana y favorece fusión Bai y Chapman, 2004

38 H2: La sinaptotagmina al unir Ca 2+ desplaza a la complexina y favorece fusión Anton Maximov, Jiong Tang, Xiaofei Yang, Zhiping P. Pang1y Thomas C. Südhof Science Vol. 323, Issue 5913, pp , 2009

39 Pools vesiculares organización espacial organización espacial?

40 Pools vesiculares Experimentos flash photolysis + capacitancia (UV) Exocytotic Burst

41 Pool de reserva UP (>400) (docking pero no priming) priming SRP RRP Extracelular Fusión (en respuesta a Ca)

42 Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas por un paso irreversible (la fusión). Munc13 CAPS Ca 2 + Ca 2 + ESTABLE Velocidad baja en reposo Y muy alta cuando Ca2+ Sorensen, Pflugers Arch

43 ENDOCITOSIS Internalización de componentes de la membrana plasmática, ligandos y fluído. Saheki, De Camilli, 2012

44 Neuronas corticales en cultivo cáliz de Held synaptophluorin: phluorin + synaptobrevin + ph + fluorescencia Nicholson-Tomishima and Ryan 2004 Lou et al. 2008

45 Células cromafines

46 Clasificación por Morfología Clásica No Clásicas 80 nm Cubierta Electrodensa Requiere clatrina, Dinamina,AP2, actina, etc 60 nm Flask-shape Sin cubierta. Requiere caveolin 1, actina, dinamina Estructuras Tubulares (~500 nm) Sin cubierta Glicolípidos B-Shiga toxin (STB) Hasta 5 μm de diámetro Sin cubierta. Independiente de actina Endocitosis Clásica (multiples funciones +Estables que coated pits Transcitosis en endotelios Internalizacion de glicolípidos. Fase fliuida Respuesta a pliegues en la membrana Incorporación de fase fluída.

47 FUNCIONES DE LA ENDOCITOSIS Mantenimiento de la homeostasis de la membrana plasmática - Superficie - Proteínas (turnover) via lisosomal Incorporación de nutrientes: ej. transferrina (mediada por receptor) Regulación de receptores de membrana (internalización receptores) Reciclado de pools vesiculares asociados a señalización Fagocitosis Pinocitosis (incorporación de fases líquidas)

48 Reciclado de vesículas sinápticas o secretorias Endocitosis Exocitosis endosoma

49 Luego de exocitosis disparada por Ca2+ estímulos breves PA a baja frecuencia estímulos más fuertes. PA a alta frecuencia estímulos muy fuertes. suprafisiológicos?

50 Endocitosis Clásica o Mediada por Clatrina Freeze-fracture electron microscopic (EM) images of frog neuromuscular junctions

51 Clathrin: clathratus (enrejado) Estructura poliédrica triskelion

52 ENDOCITOSIS AP2 dinamina

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54 Dinamina