Micotoxinas. Infección del hongo 20/09/2018. Condiciones que favorecen el crecimiento de los hongos

Transcripción

1 Micotoxinas I. Hongos Productores de Micotoxinas y Principales Micotoxinas II. Modo de acción de las micotoxinas: efectos sobre animales III. Micotoxinas como Factores de Virulencia en Fusarium spp. IV. Fusarium graminearum y deoxinivalenol Son metabolitos secundarios producidos por hongos que tienen un efecto deletéreo en otro organismo. Efectos citotóxicos: Afectan estructuras celulares como las membranas e interfieren con la síntesis de DNA, RNA, proteínas y lípidos. Aunque el moho no sea visible, las micotoxinas pueden estar presentes. Son secretadas por el hongo, así que permanecen aun cuando el microorganismo no esté presente. Su toxicidad no es selectiva pero algunas especies son más susceptibles que otras. Alta estabilidad a procesos térmicos. Infección del hongo Puede ocurrir en cualquier etapa de la producción del cultivo. En el campo Durante la cosecha. Durante el almacenamiento. Las esporas pueden permanecer viables y dormantes por meses hasta que las condiciones ambientales sean propicias para su germinación. Condiciones que favorecen el crecimiento de los hongos Humedad relativa mayor al 70%. Temperaturas sobre 30 C por un periodo de días. Estrés en la planta hospedera, como sequía, inundación o infestación por insectos. Alto contenido de humedad en el tejido (mayor al 20%). 1

2 Factores que afectan la incidencia de micotoxinas Ergotismo: Causado por el hongo Claviceps purpurea Cornezuelo del centeno Fuego de San Antonio Factores Biológicos Factores Ambientales Cosecha Planta hospedera susceptible Presencia de cepas toxigénicas Temperatura Humedad Daño mecánico (insectos, aves) Madurez del cultivo Temperatura Humedad Daño mecánico Almacenamiento Temperatura Humedad Infección en las espigas de trigo. Consumo Humano Distribución y Procesamiento Usos Procesos térmicos, mecánicos, químicos Consumo Animal Los esclerocios contienen alcaloides (ácido lisérgico y ergotamina). Estables y activos aún en el pan horneado. Alucinaciones, convulsiones, hemorragias. Aspergillus y Aflatoxinas 1961, Inglaterra. Enfermedad X de los pavos. Más de 100,000 muertas. La toxina responsible se rastreó a alimento elaborado con pasta de cacahuate. Descubrimiento de las aflatoxinas. Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. También se encuentran en maíz, pistaches, nueces y semillas oleaginosas. Aspergillus sp. Mas de 100 especies de las cuales, se conoce que 50 de ellas producen micotoxinas. Aflatoxina, ocratoxina A, esterignmatocistina, ácido ciclopiazónico, citrinina, patulina Hay especies de Aspergillus que se emplean en la industria alimentaria: Aspergillus niger para la producción de ácido cítrico. A. oryzae en la producción de salsa de soya y miso. 2

3 Ciclo de Aspergillus Diversidad estructural de las aflatoxinas Las AFLATOXINAS son potentes mutágenos. Formación de aductos covalentes con el DNA Niveles regulatorios para aflatoxinas. Norma Oficial Mexicana Aflatoxinas Tabla 6. Especificaciones de Aflatoxinas Producto Masa Tortillas de maíz nixtamalizado Tostadas de maíz nixtamalizado Harinas de maíz nixtamalizado para preparar tortillas y tostadas Tortillas de trigo Tortillas integrales Harinas para preparar tortillas de trigo Harinas integrales para preparar tortillas Límite máximo (µg/kg)

4 Toxinas depenicillium sp. Más de 150 especies en este género. Producción de metabolitos secundarios con actividad bactericida: Penicilina. Unas 100 especies producen micotoxinas. Las micotoxinas más importantes son: citreoviridina, citrinina, ác. ciclopiazonico, ocratoxina A, patulina, toxina PR, roquefortina C, y ác. secalonico. Ocratoxina A y Citrinina Afectan la función renal en humanos: Nefropatía y Fiebre del arroz amarillo. Las aves (pollos, pavo, patos) son susceptibles a ocratoxicosis pues se reduce el peso, producción de huevos, y la calidad de éstos. La ocratoxina se encuentra en cacahuates, nueces, café, y otras semillas oleaginosas. La citrinina se encuentra en trigo, arroz, maíz y harinas. Ocratoxina A Citrinina Fusarium sp. y sus toxinas Fusarium spp. incluye más de 100 especies. Muchas son agentes fitopatógenos de muchos cultivos, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Relevancia clínica por infecciones en pacientes inmunosuprimidos. Ascomycetos: Algunas especies tienen reproducción sexual Fusarium graminearum La infección inicia en antésis y se dispersa a otras espigas. F. graminearum infecta las espigas de trigo Necrósis y decoloración de las espigas. Peritecio con ascoesporas Esporas asexuales: macroconidias F. graminearum sintetiza varias micotoxinas que son los tricotecenos: Deoxinivalenol Nivalenol Toxina T-2 4

5 La producción de toxinas es muy variable entre distintas cepas de una especie de Fusarium. Su síntesis está influenciada por muchos factores ambientales y por la interacción con la planta hospedera. El deoxynivalenol se une a los ribosomas e induce estrés ribotóxico que conduce a la activación de varias cascadas de señalización; MAP cinasas, arresto del ciclo cellular y apoptosis. La descripción del genoma de F. graminearum ha permitido estudiar factores que regulan la producción de deoxinivalenol. Tanto células de mamíferos como de plantas son susceptibles a esta acción del DON. Fusarium gramineraum causa tizón de la espiga del trigo (Fusarium Head Blight /FHB). La biosíntesis de DON comienza a partir de farnesil pirofosfato y depende de locus TRI Produce deoxinivalenol (DON), que es una micotoxina, tipo tricoteceno, que es un factor de virulencia del hongo. DON 5

6 La síntesis de DON es afectada por varios factores ambientales. Por otro lado, especies reactivas de oxígeno (EROs), inducen la producción de DON. Peróxido de hidrógeno Los EROs se producen endógenamente en la célula y es la mitocondria la principal fuente de estos compuestos (95%). El ácido ferúlico inhibe la síntesis de tricotecenos y reprime la expresión de los genes TRI. En mamíferos, la proteína LETM1 (Leucine-Zipper-EF-hand-containing transmembrane 1) reside en la mitocondria. Su función exacta no está claramente descrita pero se sabe que se asocia a los ribosomas mitocondriales, se requiere para el metabolismo del DNA mitocondrial y regula la actividad de la piruvato deshidrogenasa. La piruvato deshidrogenasa es una enzima mitocondrial que participa en la conversión del piruvato (glucólisis) a Acetil-CoA, que participa en el ciclo de Krebs. La deficiencia del gen en humanos causa el síndrome de Wolf- Hirschhorn, caracterizado por afectar el crecimiento y el desarrollo muscular, entre otros síntomas. El gen LETM1 está conservado filogenéticamente y también se encuentra en hongos. Estudios en S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster sugieren que esta proteína participa en la homeostasis de K + y en la producción de EROs. 6

7 El genoma de F. graminearum contiene un gene (FgLETM1) que codifica una proteína de 550 aminoácidos con 47% de identidad con la proteína de S. cerevisiae. Un segundo gen (FgLETM2) codifica una proteína con una identidad mucho menor (10%) y además es más corta en el C-terminal. El gen LETM1 se encuentra en el genoma de 32 hongos. En 25 de las 32 especies, también hay un gen LETM2. Las proteínas LETM de hongos se pueden clasificar en dos grupos. FgLETM1 se expresa en niveles más elevados que FgLETM2 en todas las etapas de crecimiento y condiciones probadas. 7

8 Evaluación de la expresión génica: Determinación de los niveles de RNAm específicos por RT-PCR cuantitativa qrt-pcr Para estudiar la función del gen, se construyeron mutantes sencillas para FgLetm1, FgLetm2 y una doble mutante. RNAm poliadenilado Síntesis de cdna Oligo-dT hibrida al poli-a Reacción de PCR en presencia de un fluoróforo. Captura de la fluorescencia y cuantificación de la señal Se generó una cepa complementada sobre el fondo mutante en la que se introdujo el gen LETM fusionado a GFP. Estudio de la función de un gen por mutagénesis. Se interrumpe el gen que se pretende estudiar. FgLetm1 participa en el crecimiento de las hifas. Se introduce una secuencia quimérica que contiene un gen marcador de resistencia a algún antibiótico (higromicina) flanqueado por las secuencias del gen que se quiere interrumpir. Esto facilita la recombinación y el gen de resistencia a higromicina se inserta en el genoma e interrumpe (muta) el gen de interés. 8

9 Las macroconidias de la mutante FgLetm1 son más chicas y tienen menos septos Las conidias mutantes FgLetm1 germinan más lentamente. La mutante FgLetm1 es más sensible a estrés por NaCl y KCl que la cepa silvestre y la mutante FgLetm2 La mutante FgLetm1 es más sensible a estrés por calor y se reprime la transcripción de genes de choque térmico (HSP). 9

10 La mutante FgLetm1 es más sensible a fungicidas y a estrés por iones. Tanto FgLETM1 como FgLETM2 tienen localización mitocondrial La mutante FgLetm1 fue incapaz de crecer en presencia de Fe 2+, lo que sugiere que LETM1 participa en la homeostasis de este metal. Cepas que expresan la fusión LETM-GFP La proteína verde fluorescente (GFP) proviene de medusas. Permite hacer una secuencia quimérica en la que se une el gen de GFP al gen de la proteína de interés y esta proteína de fusión se expresa. Permite visualizar la localización celular de la proteína. La carencia del gen FgLETM1 causó incremento en el volumen mitocondrial y pérdida de la estructura tubular de las crestas mitocondriales Las mitocondrias en la mutante FgLETM2 son normales. 10

11 En levadura, Mdm38, el homólogo de FgLETM1 es esencial para la biosíntesis de componentes de la cadena respiratoria. Para evaluar si en F. graminearum, LETM1 tiene la misma función, determinaron los niveles de citocromo b en las mutantes por Western blot. El Western blot permite la detección específica de una proteína en un extracto de proteínas. A) Separación por electroforesis en geles de poliacrilamida B) Transferencia a una membrana para inmovilizar a la proteína C) Reacción antígeno anticuerpo. Anticuerpo marcado o uso de un segundo anticuerpo D) Detección del complejo antígeno anticuerpo En la mutante Letm1, hay menores niveles de Cyt b. Letm1 se requiere para la integridad de la estructura mitocondrial y la producción de componentes de la cadena respiratoria. La mitocondria es la principal generadora de EROs. La mutante Letm1 tiene una muy baja capacidad de producir EROs. La mitocondria es la principal generadora de EROs. La mutante Letm1 tiene una muy baja capacidad de producir EROs (H 2 O 2 ) Tinción con 11

12 Los niveles de transcrito de los genes de catalasas (CAT) y súperóxido dismutasas (SOD) son muy bajos en la mutante Letm1 y en la doble mutante. La mutante FgLETM1 muestra tolerancia a estrés oxidativo. En la mutante Letm1 y doble mutante hay una reducción ( 30%) en la producción de ATP La mutante FgLetm1 y la doble mutante causaron síntomas muy tenues en las espigas de trigo (15 dpi). Las semillas de trigo de espigas inoculadas con la mutante FgLetm1 y la doble mutante no mostraron los síntomas de blanqueamiento de las otras semillas. 12

13 La incapacidad de inducir síntomas por parte de los mutantes no se debe a deficiencia del crecimiento pues éstos son capaces de crecer en wheat head tissue media La mutante FgLetm1 y la doble mutante son incapaces de producir estructuras de infección en la espiga del trigo. En la mutante FgLETM1 está reprimida la expresión de los genes TRI y no se forman los toxisomas La mutante produce muy bajos niveles de deoxinivalenol (DON) 13

14 La hipoxia (1% oxígeno) puede inducir varios fenotipos en la cepa silvestre similares a la mutante FgLETM1 (Fenocopiar) La hipoxia (1% oxígeno) puede inducir varios fenotipos en la cepa silvestre similares a la mutante FgLETM1 (Fenocopiar) No hay diferencias en el crecimiento pero se reprime la formación de toxisomas. La hipoxia causa represión de los genes TRI y de la producción de DON. Bajo condiciones de hipoxia, la cepa silvestre es incapaz de infectar y colonizar las espigas de trigo. En resumen La proteína LETM1 es una proteína integral de la mitocondria. Interactúa con múltiples proteínas ribosomales. Regulador de la traducción en mitocondrias. Afecta el metabolismo mitocondrial, incluyendo la generación de EROs Los EROs son moléculas de señalización que participan en la regulación de la biosíntesis de la micotoxina DON. 14