TÉCNICAS DE HISTOLOGÍA VEGETAL

Transcripción

1 TÉCNICAS DE HISTOLOGÍA VEGETAL por José Reig Armiñana Francisco García Breijo Laboratorio de Histología Vegetal Julio Iranzo. Jardín Botánico de Valencia Departamento de Ecosistemas Agroforestales. Universidad Politécnica de Valencia

2 CONTENIDO INTRODUCCIÓN... 1 FIJACIÓN... 1 INTRODUCCIÓN... 1 EXAMEN EN FRESCO... 1 CONCEPTO DE FIJACIÓN... 2 FIJADORES FÍSICOS... 3 EL CALOR... 3 EL FRÍO... 3 LA CRIODESECACIÓN (LIOFILIZACIÓN)... 3 FIJADORES QUÍMICOS... 4 ACLARAMIENTO, HIDRATACION Y MACERACIÓN... 7 ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO... 7 HIDRATACIÓN... 8 ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO... 8 INCLUSIÓN... 9 INCLUSIÓN EN HIELO INCLUSIÓN EN PARAFINA CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES...13 REALIZACION DE LOS CORTES...13 DESPARAFINACIÓN E HIDRATADO...13 INCLUSIÓN EN RESINAS CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES DE RESINA TINCIONES Y RECONOCIMIENTOS HISTOQUIMICOS AZUL DE ANILINA (AZUL ALGODÓN) AZUL DE LACTOFENOL AZUL DE METILENO AZUL DE METILENO-ALUMBRE-ROJO DE RUTENIO

3 CARMÍN ACÉTICO CARMÍN-VERDE IODO FLOROGLUCINA FUCSINA BÁSICA-VERDE DE METILO FUCSINA BÁSICA-VERDE LUZ HEMALUM DE MAYER HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN LUGOL ORCEÍNA ACÉTICA SAFRANINA-VERDE RÁPIDO SUDÁN III TIONINA FENICADA VESUVINA PREPARACIÓN DE COLORANTES Y OTROS REACTIVOS ADHESIVOS Y MEDIOS DE MONTAJE ACETATO MERCÚRICO...23 ALBUMINA DE MAYER...23 COLORANTES AZUL DE ANILINA...23 AZUL DE LACTOFENOL...23 AZUL DE METILENO...24 AZUL DE METILENO-ALUMBRE...24 AZUL DE METILENO DE LOEFFLER...24 CARMIN ACETICO...25 CARMIN ALUMBRE DE GRENACHER...25 CARMIN ALUMBRE...25 FABRIL...25 FLOROGLUCINA...26 FUCSINA BASICA DE ZIEHL...26 GLICEROGELATINA

4 HEMALUN DE MAYER...27 HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN...27 LUGOL...28 ORCEINA ACETICA...28 PICROFUCSINA...28 ROJO DE RUTENIO...28 SAFRANINA...29 SUDAN III...29 TIONINA FENICADA...29 VERDE YODO...29 VERDE LUZ...30 VERDE RAPIDO...30 VESUVINA O PARDO BISMARK...30 CARMÍN-ACÉTICO-HIDRATO DE CLORAL PARA FIJACIÓN Y TINCIÓN DE PRÓTALOS...30 TINCIONES TEMPORALES PANORÁMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIÓN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS Y RAÍCES CLORO-IODURO DE ZINC:...31 ESPECÍFICAS ALMIDÓN...31 CROMOSOMAS...31 TINCIONES Y PREPARACIONES PERMANENTES PANORÁMICAS, RECOMENDADAS PARA LA TINCIÓN DE TALLOS, DE HOJAS, TALLOS Y RAÍCES FABIL:...32 MÉTODO DE VAN GIESON O TINCIÓN CON PICROFUCSINA...32 HEMATOXILINA PICROFUCSINA...33 RELACIÓN Y USO DE LOS COLORANTES MÁS FRECUENTES ESTRUCTURAS VEGETALES DE LAS CUALES, PARA SU ESTUDIO, NO ES NECESARIO OBTENER CORTES OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN PERMANENTE DE DIVERSOS TIPOS DE MATERIAL DIATOMEAS...34 ESPORANGIOS DE HELECHO

5 ESPORAS DE HONGOS...35 POLEN...35 TRICOMAS...35 ESTOMAS...36 MATERIALES VEGETALES A LOS QUE RECURRIR EPIDERMIS CUTINIZADA...36 EPIDERMIS CERIFICADA...36 EPIDERMIS MINERALIZADA...36 EPIDERMIS SUBERIFICADA...37 PARÉNQUIMA CLOROFÍLICO...37 COLÉNQUIMA...37 ESCLERÉNQUIMA...37 CÉLULAS PÉTREAS VASOS CONDUCTORES CONDUCTOS RESINÍFEROS...38 CONDUCTOS ESENCIALES...38 BOLSAS DE ESENCIA...38 GLÁNDULAS PELTADAS...38 GLÁNDULAS SÉSILES...38 CÁMARAS ESTOMÁTICAS...38 LENTICELAS...38 ALMIDÓN...38 ALEURONA...38 INCLUSIONES CRISTALINAS...38 PUNTEADURAS...39 BIBLIOGRAFÍA

6 INTRODUCCIÓN Este manual expone en forma clara, sencilla e inmediata las técnicas que se siguen en el procesamiento histológico para la elaboración de preparaciones anatómicas, la observación y el registro de los tejidos vegetales. Las preparaciones permanentes para estudios microscópicos son indispensables como fuente de información básica, tanto en cualquier investigación botánica formal como en la enseñanza, en un curso básico de botánica o en cursos más especializados o avanzados. Todas las plantas están formadas por los mismos tejidos -dérmico, fundamental y vascular-, sin embargo, la manera cómo están organizadas sus células dentro de cada uno es muy variable, haciendo que las diferencias estructurales entre las plantas sean notables y, por lo tanto, los métodos histológicos para procesarlas sean variados. FIJACIÓN INTRODUCCIÓN Antes de entrar en los detalles más significativos sobre los distintos métodos que existen para la fijación de tejidos vegetales, es necesario resaltar que los métodos más sencillos y más prácticos son los que no necesitan de la fijación, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras se encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo también es limitada y por tanto hay que recurrir a los métodos de fijación con mayor frecuencia de la que sería deseable. EXAMEN EN FRESCO Este método tiene la ventaja de una gran simplicidad y por otra parte no produce alteración alguna en las muestras; en histología animal se presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que sólo puede utilizarse, bien para organismos vivos de pequeño tamaño o bien para piezas sumergidas durante un tiempo limitado en líquidos fisiológicos (solución de Ringer, solución de Locke, solución de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los animales, ya que se pueden fácilmente cultivar en el laboratorio o bien llevarlos desde el campo al mismo sin que los procesos de lisis se presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales. Aun teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia debe recurrirse en histología vegetal al uso de fijadores, bien porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante campañas botánicas más o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido a largos tratamientos, por lo que es necesario recurrir a la fijación de las muestras a estudiar. También queremos llamar la atención sobre las técnicas de fijación que se van a emplear y describir, ya que se refieren únicamente a técnicas para microscopía óptica, obviando las de microscopía electrónica, tanto de barrido como de transmisión. 1

7 CONCEPTO DE FIJACIÓN Se entiende por fijación toda manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. Es claro que la mayoría de la estructura celular se debe a la presencia de proteínas y, por tanto, todo proceso de fijación debe tener en cuenta la naturaleza química de éstas, de forma que el fijador no reaccione con las mismas. Es cierto que existen componentes muy distintos, más o menos lábiles, que también se encuentran formando parte de la estructura celular, pero son las proteínas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es o no bueno. Por otra parte, un fijador prepara también de alguna forma el tejido o la célula para la posterior manipulación, bien en el proceso de inclusión, actuando como mordiente o como fijador del colorante dependiendo de su naturaleza, por eso es importante la elección del fijador. Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con frecuencia, y sobre todo en histología vegetal, se tienen conceptos erróneos al respecto. Un conservador es aquella sustancia, o bien fenómeno físico, que evita la autolisis cadavérica, pero que una vez eliminada su acción, la muestra o la célula, quedan a merced de sus propios enzimas lisógenos y son, por tanto, susceptibles a la autodestrucción. Son conservadores: el frío, y ciertos líquidos como los de Petit, de Ripert, etc. Así pues, una pieza que se ha mantenido durante un tiempo en un conservador debe ser fijada rápidamente antes de cualquier estudio o manipulación, ya que de no hacerse se corre el peligro de que sufra graves alteraciones. Un fijador, por el contrario, inmoviliza y estabiliza los elementos celulares, bien sea por precipitación de las proteínas y demás sustancias celulares activas, ya sea mediante un bloqueo químico de su actividad, siendo estos fenómenos permanentes. En resumen, un fijador tiene como misión: Evitar la autolisis debida a los propios enzimas. Proteger el corte o la pieza del ataque bacteriano. Insolubilizar los componentes celulares que se desean estudiar. Preparar a las distintas estructuras para posteriores tratamientos. Evitar la disolución de determinados compuestos en el fijador. Conservar o provocar determinadas reacciones químicas. Mantener las propiedades físicas. Para la elección de un fijador hay que tener en cuenta, además de lo señalado anteriormente, unas características que son intrínsecas al mismo, como son la velocidad de penetración, la velocidad de fijación y el coeficiente de endurecimiento, así como el efecto de retracción. Estos factores son de gran importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histología vegetal. Es muy importante el coeficiente de endurecimiento y el efecto de retracción, ya que de por sí los tejidos vegetales son frecuentemente duros y estos dos fenómenos contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con el consiguiente posible perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menos importancia tienen quizás el poder de penetración y la velocidad de fijación, ya que como se ha indicado anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son más lentos en términos generales que 2

8 en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad de penetración y de fijación, son muy distintas, ya que un fijador puede tener una gran velocidad de fijación y un bajo poder o velocidad de penetración o viceversa. Por tanto la elección de un fijador es un problema de suma importancia en histología vegetal. Un fijador ideal sería aquel que tuviera una gran velocidad de penetración y fijación y unos coeficientes de retracción y endurecimiento lo más bajos posibles. Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son prácticamente los mismos que se utilizan en histología animal; las células vegetales presentan, sobre todo en la pared celular, una estructura celulósica o bien una impregnación o sustitución de ésta por compuestos distintos como la lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales. El comportamiento de los fijadores al menos a este nivel es muy distinto; si a ello unimos que los estudios de los efectos sobre las estructuras celulares vegetales son prácticamente nulos, nos encontramos con un problema serio a la hora de elegir un fijador. En histología animal se saben la mayoría de los efectos de retracción, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores utilizados, cosa que no se conoce cuando se trata de tejidos vegetales. Únicamente la experiencia y los ligeros conocimientos de química permiten al histólogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas garantías; desgraciadamente, estos conocimientos no están reflejados en los textos de técnicas histológicas ni en los de histología vegetal. Vamos a dar un listado de los fijadores más frecuentes y a discutir brevemente sus distintas características. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores físicos y fijadores químicos. FIJADORES FÍSICOS Son varios los fijadores físicos que usualmente se utilizan en histología, sobre todo por su simplicidad, pero la mayoría de ellos debemos desecharlos, porque alteran gravemente la estructura de los vegetales. EL CALOR Es el más antiguo y más utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiología, como en frotis de células animales, la fijación se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulación rápida de las proteínas y por tanto su estabilización. Esta técnica no es recomendable cuando de se trata de tejidos vegetales, puesto que produce retracciones importantes y muy desiguales en la paredes celulares. EL FRÍO Como anteriormente hemos mencionado, el frío (congelación), se ha tenido y se tiene como agente de fijación, pero es realmente un agente conservador y por tanto no debe utilizarse como tal. LA CRIODESECACIÓN (LIOFILIZACIÓN): Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50º C y eliminar el agua a una presión baja. Este método puede ser muy efectivo, si después la pieza se incluye en parafina o plástico, pero es bastante complejo y excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni tampoco endurecimientos de las muestras. 3

9 Su inconveniente es el precio y lo engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehidrate posteriormente. FIJADORES QUÍMICOS Existen numerosos fijadores químicos, unos simples, y otros que son mezclas de varias sustancias. Los más reseñados en la bibliografía son: ACETATO MERCÚRICO Acetato mercúrico Ácido acético Ácido crómico. Etanol Etanol-Glicerina-Agua (G.A.W.) Formaldehido Formaldehido-Alcohol Formaldehido-Propiónico-Alcohol (F.P.A.) Formol-Acético-Alcohol (F.A.A.) Mezcla Cromo-Acético-Formaldehido (C.R.A.F.) Mezcla Cromo-Acético. Produce mejor fijación que el ácido acético. ÁCIDO ACÉTICO Conserva la cromatina. Retrae los tejidos Es más un conservante que un fijador. ÁCIDO CRÓMICO Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaución al usarlo, puesto que disuelve las láminas medias y las celulosas. Después de una fijación de 1-2 horas, se debe sacar la muestra del mismo y pasarla a un conservador. Es buen fijador si se toman las precauciones debidas. ETANOL El único alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96º. Se debe usar junto con otros fijadores para potenciar la acción de los mismos, o como solución de otros fijadores, pero no solo, ya que tiene poco poder de penetración, es un mal fijador de núcleos y mediocre de citoplasma, y retrae excesivamente los tejidos. Más que un verdadero fijador, el etanol a baja concentración puede ser un buen conservador. ETANOL-GLICERINA-AGUA O ALCOHOL-GLICERINA-AGUA. (G.A.W.) Alcohol 96º 1/3 Glicerina 1/3 Agua destilada 1/3 4

10 Fijador lento y conservador perecedero, máximo dos años de permanencia en la solución. No endurece; para cortar por congelación debe lavarse la muestra en agua destilada un mínimo de cuatro horas. FORMALDEHIDO El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. Es un fijador regular, práctico y fácil de manejar; tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy frecuentes en los vegetales y que una fijación prolongada los endurece excesivamente. No debe ser usado o se debe usar con ciertas precauciones en tejidos muy lignificados. FORMOL-ACÉTICO-ALCOHOL (F.A.A.) Alcohol etílico de 50-70º 90 ml Ácido acético glacial 5 ml Formaldehido 40% 5 ml Buen fijador general para tallos, raíces y hojas. Sirve como conservador. Endurece las muestras. FORMALDEHIDO-ALCOHOL. Alcohol etílico 96º Agua destilada Formaldehido 40% 15 ml 10 ml 1 ml Fijador general y conservador para estudios anatómicos de material leñoso. Endurece las muestras. FORMALDEHIDO-PROPIÓNICO-ALCOHOL (F.P.A.) La misma fórmula del F.A.A. sustituyendo el ácido acético por propiónico. Mezcla recomendada para briófitos y pteridófitos. Produce endurecimiento de los tejidos. MEZCLA CROMO-ACÉTICA. a) Débil: Anhídrido crómico, solución acuosa al l0 % Ácido acético al 10% Agua destilada hasta 2.5 ml 5 ml Fijador para algas filamentosas, hongos y briofitos. b) Media: Anhídrido crómico al 10% Ácido acético al 10% Agua destilada hasta 7 ml 10 ml Se recomienda añadir 0.5% de saponina para aumentar el poder de penetración del fijador. Tras fijar el material durante 24 horas, debe lavarse abundantemente en agua corriente y pasar a un conservador. Es un buen fijador para ápices. 5

11 MEZCLA CROMO-ACÉTICO-FORMALDEHIDO (C.R.A.F.) Solución a): Ácido crómico Ácido acético glacial Agua destilada 1 g 7 ml 92 ml Solución b): Formaldehido 40% Agua destilada 30 ml 70 ml Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales inmediatamente antes de su uso y, tras una fijación de horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70º. GLUTARALDEHIDO-PARAFORMALDEHIDO AL 5%. Se trata de una variación del fijador de Karnovsky, ya que este es una mezcla de ambos componentes a una concentración del 2.5%. En primer lugar hay que preparar el paraformaldehido disolviendo en agua la cantidad suficiente para que resulte una concentración del 10%, ello ha de hacerse en caliente y en agitación continua mediante un agitador magnético, procurando que la temperatura no sobrepase los 70ºC; para la correcta disolución hay que añadir unas gotas de KOH 1N. Al llegar a los 70ºC. Se observará que la disolución, que antes era turbia, se torna rápidamente transparente. Se realizará el proceso en campana de extracción para no respirar los vapores que resultan tóxicos. Una vez frío el paraformaldehido se mezcla a un volumen igual de glutaraldehido al 10% en tampón, con lo que la mezcla tendrá una concentración de ambos fijadores del 5%. La mezcla ha de guardarse en nevera y puede mantenerse durante mucho tiempo. Preparación de 100 ml de fijador 1. Disolver 4 g de paraformaldehido en 50 ml de agua destilada, agitando y calentando a 60-70ºC. Se han de añadir 3-4 gotas de KOH 1N para aclarar la solución. 2. Añadir 10 ml de glutaraldehido 50% 3. Verter a la solución, hasta alcanzar los 100 ml tampón fosfato 0.1 M y ph 7.2 El fijador se lleva al campo también en nevera portátil para asegurarnos que no se sobrepasen los 4ºC. Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observación de cortes en microscopía electrónica de transmisión. Ello se debe a que el contenido hídrico de las vacuolas es alto y al penetrar el fijador, su concentración intracelular desciende considerablemente. De este modo estructuras que rápidamente degeneran, como las membranas, no se aprecian con nitidez, por una deficiente fijación. Hay otras razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales. Muchas veces las plantas están cubiertas de sustancias céreas en sus cutículas que son hidrófobas e impiden la penetración del fijador. Por otra parte el bajo contenido proteico de las células vegetales, en comparación con las animales, 6

12 vuelve al glutaraldehido menos efectivo en sus enlaces cruzados con la proteína. Asimismo, la pared de las células vegetales supone una barrera parcial a la penetración del mismo. El tiempo de fijación en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que nosotros manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador hasta pasadas 20 horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo referente a la dificultad de penetración por la naturaleza de las flores y los pelos hidrófobos; es recomendable, sobre todo para las flores con un grado de madurez elevado fijar al vacío, esto supone una dificultad añadida al tener que mantener las muestras a baja temperatura en nevera; utilizamos para ello recipientes herméticos en los que se hace el vacío con una bomba de vacío manual y luego pasamos a nevera. Hay que lavar el fijador, como máximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. El lavado se lleva a cabo en tampón fosfato 1 molar a ph 7.2. Se pasan las muestras a un frasco con abundante tampón y se hacen 5 cambios de ½ hora cada uno. En el tampón y en nevera podemos mantener las muestras durante varios días sin que se aprecie ninguna alteración. Sobre todo, si pretendemos hacer preparaciones para microscopía electrónica de transmisión, llevaremos a cabo una post-fijación con tetróxido de osmio al 2% en tampón fosfato durante dos horas a temperatura ambiente y en oscuridad total. Una de las características de la completa fijación es la de que el líquido adquiere una coloración parecida al vino tinto, y el material está negro. El osmio torna de un color negro todo contenido lipídico celular, resultando, además de fijador, un elemento de contraste que delata la presencia de lípidos. Procedemos a lavar, tras la post-fijación, de nuevo con tampón fosfato, de modo análogo al caso anterior. Conviene pasar las muestras cuanto antes a alcohol de 70º y proceder lo más pronto posible a la confección de bloques. ACLARAMIENTO, HIDRATACION Y MACERACIÓN ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO En histología vegetal y sobre todo cuando se trata de estudiar la anatomía, es preciso destruir el contenido celular para dejar únicamente la arquitectura de las paredes. Este tratamiento es conocido con el nombre de aclaramiento y se realiza pasando los cortes por un baño de hipoclorito sódico o potásico. Con frecuencia se utiliza lejía comercial concentrada. El uso de lejía debe descartarse si querernos realizar un trabajo fino, ya que ésta contiene gran cantidad de impurezas que puede más tarde interferir en los procesos de tinción. El tiempo que el corte debe permanecer en hipoclorito dependerá de la naturaleza del mismo: cuando los tejidos sean delicados (meristemos, hojas jóvenes, etc.) el tiempo debe ser menor que cuando estos tejidos sean adultos y por tanto más resistentes. Nuestra experiencia nos dice que 20 minutos es un tiempo medio excelente para la realización del aclaramiento. La técnica a seguir será: 1. Aclarar en hipoclorito sódico 20 minutos. 7

13 2. Lavar con agua. 3. Neutralizar con ácido acético al 20% durante 10 minutos. 4. Lavar varias veces con agua destilada. Los cortes después de aclarados están ya en disposición de ser teñidos por cualquier método. HIDRATACIÓN Siempre recomendamos que, a ser posible, se trabaje con material fresco o bien fijado, pero con demasiada frecuencia hay que recurrir a material seco de herbario para trabajar. Es claro que una vez prensado, el material vegetal sufre deformaciones que son irrecuperables, pero se puede estudiar rehidratándolo. Para rehidratar una muestra vegetal se coloca esta en una disolución de hipoclorito sódico o potásico al 10 % a una temperatura ambiente o bien, si se desea una hidratación más rápida, puede realizarse en la estufa a una temperatura de 60º C; el tiempo de hidratación será muy variable dependiendo fundamentalmente de la naturaleza y tamaño de la muestra. Es muy importante controlar el tiempo para que los tejidos no se degraden por la acción del hipoclorito. Otro método de rehidratación de muestras es utilizar una solución saturada de hidrato de cloral, a temperatura ambiente y durante un tiempo aproximado de 12 horas, aunque este tiempo también es orientativo y dependerá como siempre del tamaño y naturaleza de la muestra. El hidrato de cloral tiene la ventaja de ser menos corrosivo que la lejía y además aclara muy bien los tejidos. ACLARAMIENTO Y BLANQUEADO Para poder estudiar los distintos elementos de los tejidos vegetales como cutícula, vasos conductores y también la morfología de los elementos esqueléticos de los vegetales, se puede recurrir a una maceración de los mismos, lo que nos permite su estudio aisladamente, esto unido al estudio anatómico de los cortes, tanto longitudinal como transversal, nos da una visión mucho más real y completa de los constituyentes celulares de un vegetal determinado. Para realizar dichas maceraciones podemos recurrir a varios métodos. Uno de los más usados es el: MÉTODO DE JEFFREY: Se trata de someter el material de la muestra previamente troceado en una solución a partes iguales de: Modo de empleo: Ácido nítrico al 10% Ácido crómico al 10% 1. Se trocea el material; si es leñoso se reduce a virutas de un grosor aproximado de 1-2 mm. 2. Calentar y enfriar varias veces el material para eliminar el aire que pueda contener. 3. Macerar en la mezcla de Jeffrey durante un tiempo variable: desde una noche hasta varios días, según la naturaleza de la muestra. 4. Lavar con abundante agua para eliminar las trazas de ácido que pudieran enmascarar la 8

14 INCLUSIÓN tinción posterior. 5. Sobre un tamiz muy fino se disgrega la muestra para individualizar los elementos, tomando la precaución de sumergir éste en agua. 6. Recoger el agua del tamizado en un tubo de centrífuga. 7. Centrifugar la suspensión para sedimentar el material y decantar el agua sobrante. 8. Tinción. 9. Lavados sucesivos, centrifugando y decantando cada vez. 10. Montar. La observación de los distintos tejidos, tanto vegetales como animales, con microscopio óptico viene limitada por la opacidad de los mismos; para poder ver la estructura celular de un tejido y los componentes de las mismas células es necesario por tanto obtener cortes que sean translúcidos. Por muy habilidosa que sea una persona, jamás puede obtener a mano secciones tan finas como las que se obtienen mediante aparatos especiales como son los microtomos. La histología vegetal se ha nutrido esencialmente de las experiencias realizadas en los tejidos animales y frecuentemente no se ha tenido en cuenta la distinta naturaleza de estos tejidos. La presencia de una pared celular rígida y la concatenación general que ello supone, da a los tejidos vegetales una particularidad a tener en cuenta a la hora de elegir un proceso de inclusión. Se utilizan en general las mismas técnicas en un caso y en otro, por lo que muchas veces los resultados no son, ni con mucho, los deseables, puesto que la respuesta frente a un mismo tratamiento en uno u otro tipo de tejido es muy diferente. Para poder manejar los tejidos fácilmente y poder cortar con los distintos tipos de microtomos que existen, es necesario que el tejido o la muestra a cortar tenga un soporte, y que éste sea homogéneo, por tanto es necesario no sólo que dicho soporte envuelva a la muestra, sino que penetre en su interior y que además dicho soporte no obstaculice o interfiera lo mínimo posible en la arquitectura de la célula y en la naturaleza química de la misma. Los soportes que se utilizan están en función de los distintos microtomos y pueden ser simples y no interferir en absoluto en la muestra, como ocurre al utilizar el microtomo de mano o de Ranvier (Figura 1), donde se utiliza como soporte de la muestra médula de saúco, zanahoria o plásticos como el polispan, pero no se trata en este caso de una verdadera inclusión, pues como ya se ha mencionado anteriormente una verdadera inclusión es aquella en la cual el soporte penetra en el interior del tejido. Figura 1. Microtomo de mano (de Ranvier). Los distintos medios y procesos de inclusión están descritos sobradamente en todos los manuales de técnicas histológicas por lo que nos limitaremos 9

15 aquí únicamente a mencionarlos y comentar algunas variantes a los métodos ya citados, así como a una crítica de los mismos en lo referente a la histología vegetal. Existen varios métodos de uso común, pero los que se utilizan con más frecuencia son: Inclusión en hielo (Microtomo de congelación) Inclusión en parafinas o sustancias similares (Histosec, Paraplast, etc.) Inclusión en resinas y plásticos (Microscopía de cortes semifinos) Cada una de estas técnicas presenta ventajas e inconvenientes. Por este motivo discutiremos cada una de ellas. INCLUSIÓN EN HIELO Es la técnica más fácil y natural que podemos utilizar es histología vegetal (Figura 2); permite la observación de las células y de los tejidos sin que éstos sufran prácticamente alteración alguna. Para ello, cuanto más rápida sea la inclusión, mejores resultados se obtienen, puesto que la formación de cristales microscópicos altera mínimamente la estructura celular. Hay que tener en cuenta, antes de congelar un tejido, que la cantidad de agua que existe en el interior de los tejidos es siempre menor que la que va a rodear externamente a dicho tejido en el bloque, lo que crea una diferencia muy importante de textura a la hora de cortar; mientras el bloque de hielo es externamente homogéneo, los tejidos presentan una menor resistencia a la cuchilla y, por tanto, se corre el riesgo de que al cortar la muestra, se desgarren los mismos. Se puede evitar esta diferencia en el contenido de agua si previamente sometemos las muestras (hojas, tallos, raíces, etc.) a una hidratación, manteniéndolos en Figura 2. Microtomo de congelación agua durante algún tiempo antes de cortar, dependiendo de la naturaleza y tamaño de la muestra. Un inconveniente que presentan los cortes por congelación, es la variabilidad en el grosor de los mismos, si no se dispone de un criotomo de precisión motorizado. El grosor de los cortes, por otra parte, no es un obstáculo en la histología vegetal, por lo menos en un principio, ya que el tamaño de las células, mucho mayor que las animales, puede suplir esta desventaja. Otra posible dificultad que puede surgir es la manipulación posterior de los cortes, ya que obligatoriamente se deben recoger sobre agua. Se ha recomendado el uso de pequeños pinceles para manipular los cortes. Nosotros desaconsejamos la utilización de los mismos, puesto que por mucha delicadeza que se tenga, la naturaleza de la estructura vegetal (tramas de paredes) puede ser destruida fácilmente al manipularla con el pincel. Es preferible, para el mejor manejo de los cortes, el uso, de pequeños tamices sobre los que se recogen los cortes, utilizándose los mismos para todo proceso de tinción o tratamiento que a los mismos se quiera dar, así la manipulación de los mismos 10

16 es mínima y, por tanto, también disminuye el riesgo de destrucción. Los cortes realizados por congelación tienen una gran importancia, sobre todo por la posibilidad de observar el tejido in vivo. Por tanto, las dimensiones, disposición, morfología, etc. de las células y de los tejidos son las reales, cosa que no ocurre después de un proceso de inclusión en parafina, plástico u otro medio. No obstante, para el estudio de un tejido es necesario utilizar más de una técnica. Por otra parte, los orgánulos celulares, normalmente por rotura de la célula, se pierden; así difícilmente se pueden observar núcleos o vacuolas en células que se han cortado mediante congelación, y mucho menos si los cortes son finos. Por otra parte la inclusión en hielo y los cortes realizados por congelación nos dan la posibilidad de estudiar aquellos productos metabólicos solubles en los líquidos polares y apolares que son eliminados de los tejidos cuando se utilizan otras técnicas de inclusión, como son los lípidos, las clorofilas, etc. Cuando se requiere información de tipo histoquímico el mejor método es la obtención de cortes por congelación. INCLUSIÓN EN PARAFINA Las parafinas son mezclas hidrocarburos saturados de cadenas que oscilan entre 22 y 28 átomos de carbono. El punto de fusión depende del número de átomos de carbono y se encuentra entre 45 y 60 grados. Las mezclas de parafinas comerciales tienen un punto de fusión entre 54º y 56º C. La técnica de inclusión en parafina es una perfusión de la misma en los tejidos para crear un medio homogéneo, que permita la realización de los cortes de menor grosor con gran facilidad y una precisión mayor que cuando los mismos se realizan por congelación. Como toda técnica, presenta ventajas e inconvenientes; sobre todo es en esta modalidad de inclusión donde se pueden discutir ciertos procesos que son válidos en histología animal pero que al aplicarlos a los tejidos vegetales pueden originar alteraciones, a veces profundas, en las estructuras anatómicas e histológicas; el primer problema que nos encontramos al incluir en parafina un tejido es la apolaridad de la misma; para poder incluir el tejido se han descrito varios métodos de deshidratación, pero en general se sigue, como en histología animal, la deshidratación por alcohol etílico en graduaciones crecientes hasta llegar a alcohol absoluto. La parafina y el alcohol etílico absoluto tampoco son miscibles, por lo que hay que sustituir éste por un líquido apolar miscible con aquélla. Hay varios líquidos apolares como benceno, cloroformo, xileno, etc., que se han descrito en todas las técnicas histológicas, pero que deben usarse con muchas reservas, por las grandes retracciones y deformaciones que producen en los tejidos vegetales, alteraciones que no son homogéneas, puesto que cada uno de los distintos tejidos de una muestra a cortar, reaccionan de forma muy distinta a la retracción debido al distinto grosor y naturaleza de la pared celular. Nosotros sustituimos el benceno, xileno, etc., por acetato de isoamilo o bien miristato de isopropilo; más frecuentemente el primero. Si la deshidratación se ha realizado correctamente, la pieza a incluir se hundirá en el acetato. Si flotase sobre el mismo, hay que esperar 15 minutos y si sigue flotando es que la deshidratación no se ha realizado correctamente, debiendo ser introducida la muestra de nuevo en alcohol absoluto. 11

17 Los tiempos de deshidratación más habituales para una muestra que se va a incluir en parafina son: 1. Alcohol etílico 96º 1/2 hora 2. Alcohol etílico 96º 1/2 hora 3. Alcohol etílico absoluto 1/2 hora 4. Alcohol etílico absoluto 1/2 hora 5. Alcohol etílico absoluto 1/2 hora 6. Acetato de isoamilo 1/2 hora 7. Acetato de isoamilo 1/2 hora 8. Acetato de isoamilo 1/2 hora 9. Parafina a 56-58º estufa el tiempo necesario en función del tipo de muestra Después de tres baños de acetato de isoamilo, la muestra puede ser incluida en parafina, Histosec, Paraplast, etc. Este proceso es quizá el que merezca mayor atención junto con el anteriormente explicado. Los manuales de técnicas y los distintos trabajos sobre histología vegetal nos dan tiempos muy dilatados de inclusión: mínimo de 6 horas. Los tejidos vegetales tienen una naturaleza muy distinta a la de los animales, pero las técnicas de inclusión que se describen en los distintos manuales han sido aplicadas a partir de las experiencias sobre tejidos animales; en algún caso, esta experiencia es útil y sirve para el proceso de inclusión de vegetales, pero en la mayoría de los casos no lo es, y a cada muestra vegetal hay que darle un tratamiento muy distinto dependiendo de los tejidos que presente y de la disposición de los mismos. No se puede tratar de igual manera una muestra que contenga tejidos lignificados o suberificados que otra que contenga grandes parénquimas o grandes conductos aeríferos. Por tanto, lo más importante antes de realizar una inclusión es conocer la naturaleza y la organización de la muestra a incluir, o por lo menos presuponerla. Los cortes realizados con el microtomo de congelación nos pueden dar la pauta a seguir en el caso de que se desconozca la organización de un vegetal determinado. El calor es uno de los enemigos más importantes de los tejidos vegetales. La presencia de pared celular y la distinta naturaleza que ésta puede presentar es la causa de que el calor, los fijadores, los compuestos hidratantes y deshidratantes, el xileno, benceno, etc., produzcan en las paredes celulares retracciones muy importantes y no constantes, que pueden distorsionar en gran manera la estructura anatómica de un vegetal. Ante los mismos agentes, en una sección, no todos los tejidos responden igual: las deformaciones dependen entre otras cosas del grosor de la pared celular, naturaleza de la misma, disposición de los diferentes tejidos, tiempo de actuación de los distintos agentes, etc. Por tanto, si las deformaciones son variables, las interpretaciones que se dan son, con frecuencia, erróneas. Por tanto, para incluir una muestra vegetal en parafina, o bien en sucedáneos de la misma (Paraplast, Histosec, etc.), es necesario calcular los tiempos mínimos, que pueden oscilar desde 35 minutos a varias horas. Los tiempos de deshidratación pueden ser más o menos constantes para todos los tejidos, pero varían mucho los tiempos de parafinación. Un tallo macizo, con mucho tejido esquelético (esclerénquima), o de protección (peridermis), puede necesitar varias horas. La práctica nos irá diciendo cuales son los tiempos más idóneos para los órganos o partes de órganos que estemos utilizando. 12

18 Lo más importante es comprender que no existen dos muestras vegetales o tejidos iguales y, por ello, cada una se comportará de distinta forma. Con experiencia se calcula fácilmente los tiempos que necesitan los distintos tejidos. CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES Se realiza de la misma forma que en histología animal: existen pinzas (Leukart) y recipientes especiales para realizar bloques, pero lo más barato es confeccionar recipientes, de papel satinado o de aluminio, más o menos cúbicos o en forma de paralelepípedo, dependiendo de las características de la muestra a incluir. Lo más importante en la confección del bloque es la orientación que se da a la muestra, porque de ello va a depender que el corte sea bueno o malo. REALIZACION DE LOS CORTES Para obtener los cortes o secciones a partir de bloque de parafina, se pueden utilizar dos tipos de microtomos muy distintos. Microtomos tipo Minot, (Figura 3) que se caracteriza por ser móvil el bloque y fija la cuchilla, o bien microtomos de deslizamiento, en los cuales la cuchilla es móvil y orientable, mientras que el bloque es fijo. Los microtomos tipo Minot son prácticos únicamente cuando se trata de realizar cortes en tejidos blandos y sin grandes complicaciones, pero estos microtomos tipo guillotina no son muy efectivos cuando se trata de tejidos duros, pues se suelen romper al intentar cortarlos; esto no sólo ocurre en histología vegetal: ciertos tejidos duros, como los tejidos óseos de los animales, se cortan igualmente mal en este tipo de microtomos. Para los tejidos duros o para aquellas muestras que presenten gran variedad en los mismos, es mucho más recomendable y práctico el microtomo de deslizamiento aunque sea algo engorroso su manejo. El grosor de los cortes que se obtienen con estos tipos de microtomos oscila entre 10 y 20 micras, lo que se puede considerar fino, comparándolo con la magnitud de las células. Los cortes se recogen sobre agua a 36-40º C, en un baño de María, de aquí se pescan" sobre los portaobjetos que, previamente, se han Figura 3. Microtomo de parafina impregnado con una ligera capa de albúmina de Mayer, y se llevan a la estufa, durante media hora a unos 58º C. De esta forma se logra el pegado de los cortes sobre el porta y la mejor manipulación de éstos en los procesos de desparafinación y tinción. DESPARAFINACIÓN E HIDRATADO: Una vez pegados los cortes pueden, o bien almacenarse indefinidamente, o bien pasar a la desparafinación y posterior hidratación y teñido de los mismos; para ello se utiliza el proceso inverso al realizado para la inclusión con la variante de utilizar el xileno o el benceno para eliminar la parafina. En este punto del proceso la utilización de xileno o benceno en los cortes no es tan importante como cuando se incluye en parafina, ya que el corte se encuentra pegado sobre el porta. 13

19 El proceso a seguir será el siguiente. 1. Xileno 1/2 hora 2. Xileno 1/2 hora 3. Alcohol etílico absoluto 1/2 hora 4. Alcohol etílico absoluto 1/2 hora 5. Alcohol etílico de 96º 1/2 hora 6. Agua Si los colorantes se encuentran en disolución acuosa se realizarán todos los pasos. Es obvio que si los colorantes a utilizar se hallan en disolución alcohólica o en disolventes apolares (esencia de clavo, etc.) no se llegará a la hidratación. Una vez hidratados, si conviene, se procederá con los cortes a la coloración más oportuna y de nuevo se deshidratará para realizar el montaje permanente. Los pasos a seguir son: 1. Tinción 2. Lavado con agua destilada 3. Deshidratación mediante goteo de etílico absoluto 4. Aclarado con creosota, aceite de clavo, xilol, etc. 5. Montaje permanente con Bálsamo de Canadá, Entellán, Euparal, etc. En algunas ocasiones puede darse la circunstancia de que no se desee pasar las secciones realizadas por disolvente alguno como alcohol, xileno, etc., bien por la tinción o bien porque histoquímicamente no es aconsejable, y se quiera montar de forma permanente o semipermanente un corte, para ello es necesario recurrir a la utilización la glicerogelatina o glicogelatina. INCLUSIÓN EN RESINAS CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES DE RESINA En el mercado existen muchas resinas pero, para incluir tejidos vegetales, no todas dan buenos resultados; nosotros, después de probar varias, hemos constatado que las más adecuadas para nuestros intereses son la LR White y la Spurr Se trata de resinas que penetran muy bien, son miscibles con el etanol y no totalmente hidrófobas en el caso de la LR White. Pero lo que las hacen idóneas es la gran facilidad con que penetran los colorantes una vez polimerizadas. El proceso de inclusión en resina varía ligeramente según se elija una u otra. LR White : ver Spurr : ver Este proceso de inclusión puede hacerse al vacío, lo que permite, sobre todo en las muestras de tamaño grande, una infiltración más rápida y completa. Los bloques se etiquetan y se guardan en un frasco de vidrio cerrado. 14

20 PARA LOS BLOQUES DE LR WHITE. Con los bloques incluidos en plástico hay que utilizar un ultramicrotomo, con el que se consiguen tanto cortes semi-finos (de 0.5 a 3 µm de grosor) como cortes ultra-finos (de 30 a 100 nm de espesor). Los primeros para microscopía óptica y los segundos para microscopía electrónica. Para los cortes se deben utilizar cuchillas de vidrio o de diamante, las primeras son mucho más económicas que las segundas, pero tienen una corta duración (30 a 40 cortes). Bajo el filo de la cuchillas se fija, con parafina fundida, una balsita plástica que se llena hasta el borde con agua destilada y un tensioactivo (una o dos gotas de detergente por litro de agua) que sirve para recoger los cortes que flotan sobre ella extendidos. Haremos los cortes de 1 o 2 µm de grosor, lo que nos permite tener una sola capa de células cortada y ver su estructura y contenido con nitidez. De aquí se toman con una fina varilla de vidrio (Figura 4) de borde romo y se pasan a una gota de agua destilada con tensioactivo que hemos dejado sobre un porta. El agua que se coloca en el porta o en la balsita se hace mediante una jeringuilla con filtro Millipore. Si la operación se efectúa cuidadosamente el corte debe quedar flotando sin arrugarse. En un mismo porta, convenientemente ordenados, podemos situar de 10 a 15 cortes seriados. Figura 4. Ultramicrotomo. Detalle de la cuchilla de vidrio. Una vez colocados los cortes pasamos el porta a una plancha de calor a 65º, con ello logramos que se evapore el agua y que los cortes queden pegados sobre el vidrio y puedan manipularse en la tinción. Si el agua evapora a temperatura ambiente o a temperaturas inferiores a la indicada los cortes no quedan bien pegados, y al manipularlos se desprenden. De igual modo, cortes de grosor superior a los 3 µm no suelen pegarse bien. El material incluido en plástico no debe sufrir más manipulación. Normalmente las resinas que se utilizan no interfieren en la visión microscópica de los tejidos, por lo que no hay que eliminarlas como ocurre con la parafina. TINCIONES Y RECONOCIMIENTOS HISTOQUIMICOS A continuación comentaremos algunas características de los colorantes más usados en histología vegetal. AZUL DE ANILINA (AZUL ALGODÓN) Este colorante se utiliza, como el azul de lactofenol, para poner de manifiesto las cribas de los elementos de los tubos del floema, ya que tiene afinidad por la calosa. Nuestra experiencia nos hace inclinamos más por este procedimiento que por aquel por varias razones: en primer lugar admite una doble coloración de contraste, que puede ser la safranina; en segundo lugar se puede 15

21 deshidratar y montar de forma permanente y los inconvenientes no son mayores que los que presenta la coloración del azul de lactofenol. Es más fácil de manejar que aquel. Modo de empleo: 1. Deshidratar el corte con unas gotas de alcohol de 96º. 2. Teñir durante 5 minutos con azul de anilina 3. Diferenciar durante 1 minuto con esencia de clavo, una o dos gotas sobre el corte. 4. Deshidratar haciendo gotear alcohol absoluto sobre el corte. 5. Aclarar. 6. Montar en bálsamo de Canadá o similar. Se colorean en azul tanto la celulosa como la calosa, aunque el citoplasma de los tubos cribosos puede también aparecer teñido si nos excedemos en el tiempo de permanencia en azul de anilina. AZUL DE LACTOFENOL Este colorante tiene afinidad por la calosa, y se usa por tanto para poner de manifiesto aquellas paredes celulares en las que se deposita la misma: placas cribosas del floema y paredes celulares de ciertos hongos. No es una coloración de resultados espectaculares ni mucho menos y es necesario que la calosa se encuentre en cierta cantidad para que se ponga de manifiesto, por tanto será difícil poner de manifiesto cribas jóvenes. Por otra parte se usa este colorante para preparaciones extemporáneas que se desechan una vez observadas al microscopio. Modo de empleo: 1. Cubrir con el colorante el corte durante 5-10 minutos. 2. Depositar sobre el colorante y el corte un cubreobjetos y observar al microscopio. Si se desea una preparación permanente añadir al cubre una gota de glicerogelatina y sellar con laca o parafina. AZUL DE METILENO El azul de metileno en soluciones del 1% y 0.1% se utiliza con frecuencia para poner de manifiesto las paredes celulares de naturaleza celulósica. Se utiliza sobre todo en preparaciones extemporáneas. Es un colorante poco limpio y tiñe muy desigualmente, por esto se recomiendan las soluciones más diluidas. Modo de empleo. 1. Colorear durante 5 minutos con la solución de azul de metileno. 2. Lavar abundantemente para eliminar los precipitados. 3. Observar al microscopio. Si se desea conservar, esta tinción acepta la deshidratación y el montaje permanente. También se 16

22 puede realizar una coloración de contraste. AZUL DE METILENO-ALUMBRE-ROJO DE RUTENIO Es una de las coloraciones más espectaculares, pues con tan solo dos colorantes aparecen cuatro colores distintos en los cortes y se pueden apreciar diferencialmente distintos tejidos. Tiene el inconveniente de que el rojo de rutenio es un colorante no permanente; hay que prepararlo en el momento de usarlo, dura pocos días y es relativamente caro. Modo de empleo: 1. Tinción con azul de metileno-alumbre durante 5-10 minutos. 2. Lavar con agua abundante para eliminar el resto de colorante y los precipitados. 3. Tinción con rojo de rutenio 5-10 minutos. 4. Lavar ligeramente con agua. 5. Deshidratar con alcohol absoluto. 6. Aclarar. 7. Montar en bálsamo de Canadá o similar. Con esta doble coloración, el floema aparece teñido de verde, el esclerénquima en violeta, el xilema en azul y los parénquimas más o menos rosados. CARMÍN ACÉTICO Este colorante se utiliza sobre todo para la observación de mitosis. Modo de empleo: 1. Hidrólisis enzimática o bien ácida de las láminas medias y paredes celulares de los meristemos, anteras, etc. a) La hidrólisis enzimática se realiza utilizando hemicelulasa y celulasas a una temperatura de 27-30º C durante un tiempo variable, dependiendo de la concentración del enzima y de la naturaleza del órgano. b) La hidrólisis mediante ácidos inorgánicos diluidos, se realiza mediante ácido clorhídrico 0.1 N en caliente (60º C) durante una hora. 2. Lavar abundantemente con agua destilada. 3. Teñir con carmín acético las raíces durante media hora en un crisol a la estufa (a 60º C). 4. Aplastar las raíces sobre un porta mediante una presión realizada con el cubre, hasta lograr una capa lo más fina y homogénea posible. 5. Si se quiere conservar durante un cierto período, levantar con mucho cuidado el porta y poner sobre él una o dos gotas de glicerogelatina y volverlo a dejar sobre la preparación. 6. Sellar con laca. 17

23 CARMÍN-VERDE IODO Una coloración clásica de histología vegetal, que da también buenos resultados, aunque su preparación es más engorrosa y los resultados comparables a los que se han reseñado para la safraninaverde rápido; tiene la ventaja de que la tinción es permanente. Modo de empleo: 1. Teñir, al menos durante 1 hora en carmín de Grenacher. 2. Lavar rápida y abundantemente en agua. 3. Teñir con verde iodo previamente diluido en agua destilada. 4. Lavar ligeramente. 5. Deshidratar con alcohol absoluto. 6. Aclarar. 7. Montar en bálsamo de Canadá o similar. Los elementos lignificados se colorean en un azul verdoso y el resto de los tejidos en rojo carmín. FLOROGLUCINA La floroglucina es un método de reconocimiento para la lignina, por tanto se utilizará en aquellos tejidos que la presentan: el xilema y el esclerénquima. Se conoce esta coloración con el nombre de test de la lignina y se realiza de manera extemporánea. Existen dos formas de hacerlo. Modo de empleo: a) Sistema 1 b) Sistema 2 1. Poner sobre el corte uno o dos cristalitos de floroglucina. 2. Cubrir el corte con unas gotas de alcohol de 96º y dejar que se disuelva la floroglucina. 3. Añadir unas gotas de ácido clorhídrico a una concentración del 50% 4. Observar al microscopio. 1. Cubrir el corte con una solución alcohólica de floroglucina previamente preparada. 2. Añadir unas gotas de ácido clorhídrico al 50% 3. Observar al microscopio. Los tejidos lignificados toman una coloración rojo cereza. FUCSINA BÁSICA-VERDE DE METILO Verde de metilo, sol. acuosa al 0.5% 4 partes Fucsina básica, sol. acuosa al 5% 1 parte 18

24 Modo de empleo: 1. Tinción de los cortes en la mezcla, durante 8-10 min. 2. Lavar alternativamente varias veces con agua y alcohol de 96º hasta que las paredes lignificadas tomen color violáceo y las otras azul verdoso. 3. Deshidratar y montar. FUCSINA BÁSICA-VERDE LUZ Esta doble tinción, que es menos usada en histología vegetal; tiene la ventaja de colorear bien la cutícula y los pelos de la epidermis. Modo de empleo: 1. Colorear 10 minutos con fucsina básica de Ziehl. 2. Lavar con agua abundantemente para eliminar el exceso de colorante y los precipitados. 3. Colorear con verde luz; si la disolución es alcohólica, tomar la precaución de poner sobre el corte antes de la coloración unas gotas de alcohol de 96º. 4. Lavar con agua. 5. Deshidratar con alcohol etílico absoluto. 6. Aclarar. 7. Montar en bálsamo de Canadá o similar. HEMALUM DE MAYER Es un colorante clásico; se ha utilizado con frecuencia para teñir en histología vegetal. Colorea la celulosa y los núcleos, debe utilizarse sobre todo en tejidos jóvenes y como coloración de contraste la safranina. Modo de empleo: 1. Teñir durante 20 minutos en Hemalum de Mayer. 2. Virar mediante carbonato de litio; si el agua del laboratorio es suficientemente dura puede virar en agua corriente. 3. Si la coloración es muy intensa, se diferencia con alcohol ácido, virando de nuevo, como anteriormente, hasta conseguir la intensidad de color deseada. 4. Dar coloración de contraste. 5. Deshidratar. 6. Aclarar. 7. Montar en bálsamo de Canadá o similar. El Hemalum de Mayer colorea de azul-morado la celulosa. 19