La base molecular de la herencia Capítulo 16 Campbell y Reece, 2002 Sexta edición

Transcripción

1 La base molecular de la herencia Capítulo 16 Campbell y Reece, 2002 Sexta edición En la primera página de este capítulo hay una foto de James Watson y Francis Crick. En esta foto muestran el modelo de la doble hélice del DNA, que ellos lo propusieron en Este modelo de la doble hélice propuesto por Watson y Crick explicaba como el DNA controla su propia replicación. Recuerden que las unidades hereditarias de las que hablaba Gregor Mendel y los genes que Thomas Hunt Morgan localizó en los cromosomas están compuestos de DNA. Las semejanzas entre padres e hijos tiene su base en la replicación del DNA. El DNA es la molécula que dirige el desarrollo de las características bioquímicas, anatómicas, fisiológicas y de comportamiento. Aunque hoy día se habla del DNA en las escuelas y los científicos manipulan el DNA constantemente, a principios del siglo 20, la identificación de las moléculas de la herencia era un gran reto. Recuerden los siguientes eventos: Mendel comenzó su trabajo con guisantes se describió el proceso de mitosis se describió el proceso de meiosis se comenzó a ver el paralelismo entre el comportamiento de los cromosomas y los factores de Mendel comenzó la teoría de la herencia de los cromosomas La pregunta que se hacían los científicos de la época era la siguiente, cuál de los dos componentes del cromosoma (DNA o proteínas) es el material genético? Las proteínas eran el candidato más fuerte por lo siguiente: este grupo de moléculas tenían mayor heterogeneidad que el DNA se sabía que podían llevar a cabo diferentes funciones específicas se conocía al momento muy poco de la molécula de DNA Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 1

2 Una serie de experimentos que se hicieron en el siglo 20 permitieron que los científicos identificaran cuál de las dos moléculas (DNA o proteínas) era el material genético. Frederick Griffith (1928) hizo experimentos en una bacteria llamada Streptococcus pneumoniae y definió transformación: Esta bacteria causa pulmonía en mamíferos Existen dos variantes de la bacteria: cepa S y cepa R La cepa S tiene cápsula y es patógena, esto significa que tiene la capacidad para causar enfermedad Macroscópicamente tiene una apariencia suave (S) o lisa La otra variante, la cepa R, NO tiene cápsula y NO es patógena Macroscópica tiene apariencia rugosa (R) La cápsula es una cubierta pegajosa que rodea la bacteria, cuya función es protección contra el sistema inmune y adherencia a superficies Estudien el experimento que Griffith realizó utilizando estas bacterias. El mismo está descrito en la Figura 16.1: a) Inyectó bacterias vivas de la cepa S (cápsula) al ratón y el ratón se murió porque la cápsula le confiere protección a las bacterias b) Inyectó bacterias vivas de la cepa R (sin cápsula) al ratón y el ratón NO se murió porque al NO tener la cápsula, el sistema inmune del animal mata las bacterias c) Inyectó bacterias muertas de la cepa S (cápsula) al ratón y el ratón NO se murió d) Inyectó una mezcla de bacterias muertas de la cepa S (cápsula) y bacterias vivas de la cepa R (sin cápsula) y el ratón se murió. Durante la autopsia del animal, el investigador hizo cultivo de bacterias y encontró bacterias de la cepa S (cápsula) A este fenómeno que el observó le llamó transformación Las bacterias no patógenas fueron transformadas en patógenas Hoy en día la transformación se define como un cambio en genotipo y fenotipo debido a la incorporación de un DNA extraño por parte de una célula Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 2

3 Oswald Avery, Maclyn McCarty y Colin MacLeod (1944) anunciaron que el agente transformador era el DNA: Estos investigadores purificaron varios componentes de S. pneumoniae muertas y repitieron los experimentos de transformación que había hecho Griffith a) Purificaron proteínas de S. pneumoniae y repitieron el experimento de transformación. El resultado fue negativo, las proteínas no provocaban la transformación de las bacterias b) Purificaron RNA de S. pneumoniae y repitieron el experimento de transformación. El resultado fue negativo, el RNA no provocaba la transformación de las bacterias c) Purificaron DNA de S. pneumoniae y repitieron el experimento de transformación. El resultado fue positivo, el DNA era el responsable de la transformación de las bacterias La comunidad científica tomó este anuncio de que el DNA era el agente transformador con mucho escepticismo, todavía pensaban que las proteínas eran mejor candidato Alfred Hershey y Martha Chase (1952) demostraron que el material genético del fago T2 era el DNA Los virus son partículas simples que están compuestos por DNA y proteínas Los virus infectan las células y usan su maquinaria para reproducirse Los virus que infectan bacterias se conocen como fagos o bacteriofagos Estos investigadores sabían que el fago T2 infecta la bacteria Escherichia coli y la transforma Ellos querían saber qué molécula era responsable de la transformación, el DNA o las proteínas Estudien los experimentos que realizaron Hershey y Chase utilizando este fago y E. coli. El mismo está descrito en la Figura 16.2: La Figura 16.2 (a) muestra tres fagos pegándose a una célula. Éstos están usando la cola para pegarse a la célula hospedera e inyectar su DNA. La cabeza del fago esta hecha de proteínas y dentro de la cabeza es que se encuentra la molécula de DNA. Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 3

4 Los experimentos están descritos en la Figura 16.2 (b): Experimento 1: Crecieron el fago T2 en presencia de azufre radioactivo ( 35 S). Este isótopo se incorpora dentro de las proteínas y las marca radioactivamente: (1) Mezclaron el fago marcado radiactivamente ( 35 S) con E. coli, para que el fago infecte las bacterias (2) Agitaron para separar los fagos que se quedaron fuera de las bacterias (3) Centrifugaron para recolectar las bacterias en el fondo del tubo de ensayo (4) Midieron los niveles de radioactividad en las muestra, tanto en el sobrenadante como en la pastilla (pellet) que se forma en el fondo del tubo de ensayo (5) Los resultados de este experimento mostraron que las proteínas marcadas radiactivamente se encontraban en el sobrenadante, mientras que las bacterias trasformadas estaban en la pastilla (pellet) en el fondo del tubo de ensayo Experimento 2: Crecieron el fago T2 en presencia de fósforo radioactivo ( 32 P). Este isótopo se incorpora dentro del DNA y lo marca radiactivamente: 1) Mezclaron el fago marcado radiactivamente ( 32 P) con E. coli, para que el fago infecte las bacterias 2) Agitaron para separar los fagos que se quedaron fuera de las bacterias 3) Centrifugaron para recolectar las bacterias en el fondo del tubo de ensayo 4) Midieron los niveles de radioactividad en las muestra, tanto en el sobrenadante como en la pastilla (pellet) que se forma en el fondo del tubo de ensayo 5) Los resultados de este experimento mostraron que el DNA marcado radiactivamente se encontraba en la pastilla (pellet) en el fondo del tubo de ensayo, al igual que las bacterias trasformadas Con estos experimentos Hershey y Chase demostraron que el DNA y no las proteínas entran a las bacterias y las transforman, o sea que el DNA es el material genético del los virus. Erwin Chargaff (1947) proveyó evidencia adicional que sugería que el DNA era el material genético: Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 4

5 Al momento ya se conocía que el DNA se duplica y se divide en dos partes iguales (dos células hijas) durante la mitosis. Además se sabía que el DNA era un polímero de nucleótidos (polímero es una molécula grande compuesta por muchas unidades pequeñas llamadas monómero). La estructura de los nucleótidos está dada en la Figura Los nucleótidos consisten de: base nitrogenada azúcar desoxirribosa grupo fosfato (P) Las bases nitrogenadas son: Adenina (A) Timina (T) Guanina (G) Citosina (C) El fosfato de un nucleótido está enlazado a la azúcar del próximo nucleótido en línea, en un enlace conocido como fosfodiéster. Chargaff analizó la composición de DNA de diferentes organismos y encontró que: la composición de DNA varía de especie en especie las cuatro bases nitrogenadas están en una proporción característica, el número de T = A y el número G = C Por ejemplo, en los seres humanos las bases nitrogenadas se encuentran en la siguiente proporción: A = 30.9% T = 29.4% G = 19.9% C = 19.8% Hoy en día esto se conoce como la regla de Chargaff. Ya para esta época los biólogos estaban convencidos de que el DNA era el material genético, pero todavía no conocían cuál era su estructura tridimensional. Estaban trabajando para resolver el problema los siguientes investigadores: Linus Pauling en California Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en London James Watson (americano) y Francis Crick (inglés) en la Universidad de Cambridge, London, Inglaterra Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 5

6 Watson y Crick (1953) fueron los primeros en encontrar la respuesta correcta: Ellos dedujeron que la molécula de DNA tiene una doble hélice Se basaron en una cristalografía de rayos X que hizo Rosalind Franklin (Figura 16.4 b) Franklin murió de cáncer a los 38 años, como consecuencia de sus investigaciones James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el premio Nobel en 1963 por sus descubrimientos Los detalles de la doble hélice están dados en la Figura 16.5: La molécula de DNA es una doble hélice que gira hacia la derecha Las dos hebras están enlazadas por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas Una vuelta de la hélice mide ~3.4 nm y las distancia entre dos nucleótidos es ~0.34 nm Las bases nitrogenadas están pareadas de una forma específica (A-T y G- C), una purina (A y G) con una pirimidina (T y C) A y T forman dos puentes de hidrógeno mientras que G y C forman tres puentes de hidrógeno (Figura 16.6) Este modelo fue publicado en la revista Nature en 1953 y la estructura propuesta por los investigadores sugería el mecanismo básico mediante el cual el DNA se replicaba Replicación del DNA: El modelo de la replicación del DNA, según Watson y Crick, está dado en la Figura 16.7: Este diagrama ilustra un pedazo de DNA pequeño, el cual ha sido desenrollado y representado como una estructura que parece una escalera La barandillas de la escalera representan las cadenas de azúcares y fosfatos en las dos hebras de DNA Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 6

7 Los barrotes representan los pares de bases nitrogenadas Las formas simples en los barrotes simbolizan las cuatro bases nitrogenadas y su complementariedad El color azul oscuro representa la molécula de DNA original en la célula parental El color azul claro representa la molécula de DNA nueva, la que se sintetiza para la célula hija a) La molécula de DNA parental tiene dos hebras complementarias de DNA. Cada base está pareada con su base complementaria mediante puentes de hidrógeno, A = T, G = C b) El primer paso en la replicación es la separación de las dos hebras de DNA c) Cada hebra parental sirve como un molde que determina el orden de los nucleótidos en la hebra nueva que se forma y que es complementaria a la original d) Los nucleótidos se conectan para formar la cadena nueva de nucleótidos. Cada una de las moléculas de DNA en las células hijas contiene una hebra original (azul oscuro) y una hebra nueva (azul claro) Este modelo que ellos propusieron se conoce como el modelo de replicación (duplicación) semiconservativa porque cuando el DNA se replica, cada una de las dos moléculas hijas va a tener una hebra vieja (que viene de la molécula parental) y una hebra que se sintetiza nueva. En esta época también había un modelo de replicación (duplicación) conservativo y un modelo de replicación (duplicación) dispersa. Estos tres modelos de replicación están ilustrados en la Figura En este diagrama se ilustra un segmento pequeño de DNA dentro de una célula, se comienza con una célula y pasan dos generaciones de células, o sea dos rondas de replicación: El color azul oscuro representa la molécula de DNA original El color azul claro representa la molécula de DNA que se sintetiza nueva a) Modelo de replicación conservativo. En este modelo, la doble hebra de DNA parental permanece intacta y se hacen todas las copias nuevas de DNA b) Modelo de replicación semiconservativa. En este modelo, las dos hebras de DNA parental se separan y cada una funciona como un molde para sintetizar la otra hebra nueva que es complementaria Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 7

8 c) Modelo de replicación dispersa. En este modelo, cada hebra de DNA hija está formada por una mezcla de pedazos de DNA viejos y pedazo sintetizados nuevos Finalmente, a finales de los años cincuenta Matthew Meselson y Franklin Stahl diseñaron un experimento para evaluar las tres hipótesis. Este experimento está descrito en la Figura 16.9: Estos investigadores crecieron por varias generaciones la bacteria Escherichia coli en presencia de un isótopo pesado de nitrógeno ( 15 N) La bacteria incorpora el 15 N en sus nucleótidos y luego en su DNA Luego la bacteria fue transferida a otro medio conteniendo un isótopo de nitrógeno más liviano ( 14 N) De esta manera, cualquier DNA que se sintetice nuevo en la bacteria será más liviano que el DNA sintetizado en el medio conteniendo 15 N Luego, los investigadores centrifugaban las muestras para separar el DNA a base de su densidad El diagrama en la Figura 16.9 incluye un dibujo de los tubos de ensayo usados el experimento Las bandas azules dentro del tubo de ensayo representan los resultados que se esperarían en cada uno de los tres modelos de replicación descritos en la Figura 16.8 Después de la primera replicación, se obtuvo una sola banda de DNA Estos resultados descartaron el modelo de replicación conservativa Si la replicación fuese conservativa, se deberían observan dos bandas de DNA, una correspondiente al DNA conteniendo 15 N y otra correspondiente al 14 N Después de la segunda replicación, se produjeron dos bandas de DNA, uno correspondiente al DNA conteniendo 14 N y otra conteniendo un híbrido de DNA 14 N- 15 N Estos resultados descartaron el modelo de replicación dispersa. Si la replicación fuese dispersa, se debería observar una sola banda De esta manera, Meselson y Stahl probaron que el modelo de replicación semiconservativa es la manera en la que se replica el DNA Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 8

9 Qué moléculas son responsables de la replicación del DNA? E. coli tiene un solo cromosoma de 5 millones de pares de bases (pares de nucleótidos) La bacteria copia su DNA y se divide en dos en menos de una hora Cada una de nuestras células tiene 46 cromosomas Hay aproximadamente 6 billones de pares de bases en una célula humana Esto representa mil veces más DNA que una bacteria Si se imprimieran todos estos nucleótidos (A, T, G, C), saldrían aproximadamente 900 libros de texto Cómo una célula humana puede replicar todo ese DNA? La precisión de la replicación en bien alta, sólo se comete un error por cada billón de nucleótidos que se sintetiza En este proceso de replicación participan más de una docena de enzimas y otras proteínas Se conoce más del proceso de replicación en las bacterias que en los eucariotas, pero se cree que ambos procesos son bastante similares Cómo comienza la replicación del DNA? La respuesta a esta pregunta está dad en la Figura 16.10: 1) La replicación del DNA comienza en un lugar en específico que se conoce como el origen de replicación Las proteínas que inician la replicación, reconocen el origen de replicación, se pegan al DNA y lo separan formando una burbuja replicación 2) La burbuja de replicación se expande lateralmente mientras la replicación avanza en ambas direcciones 3) Eventualmente, las burbujas de replicación se fusionan y se completa la síntesis de la molécula nueva de DNA Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 9

10 a) En los eucariotas, cada cromosoma puede tener cientos o miles de orígenes replicación que se fusionan b) En bacterias, que tienen un solo cromosoma circular, hay un solo origen de replicación Al final de cada burbuja de replicación hay un tenedor de replicación, una región en forma de Y, en la cual ocurre elongación (síntesis o crecimiento) del DNA Elongación de la hebra nueva de DNA La elongación (síntesis) del DNA es catalizada por una enzima llamada polimerasa de DNA La Figura describe el proceso mediante el cual los nucleótidos son incorporados en la hebra nueva de DNA El color azul oscuro representa la hebra original que sirve de molde El color azul claro representa la hebra que se está sintetizando nueva Cuando el trifosfato de nucleósido se une al azúcar en la cadena creciente de DNA, éste pierdo dos fosfatos en una molécula de pirofosfato Trifosfato de nucleósido es una molécula que consiste de una base nitrogenada, una azúcar pentosa y tres grupos fosfatos, por ejemplo trifosfato de adenosina (ATP) La enzima que cataliza esta reacción es la polimerasa de DNA y utiliza la energía que se libera del rompimiento del pirofosfato a dos fosfatos inorgánicos (reacción exergónica) Las dos hebras de DNA son antiparalelas Las dos hebras de DNA son antiparalelas, esto significa que están en direcciones opuestas (Figura 16.12) Los carbonos de las bases nitrogenadas están enumerados con números 1, 2, 3 etc. Los carbonos de las azúcares están enumerados con números 1', 2', 3' etc. Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 10

11 El término ' se utiliza para distinguir los carbonos de las bases nitrogenadas de los carbonos de las azúcares Noten que los grupos fosfatos de la hebra de la izquierda están enlazados a los carbonos 5' de las azúcares Noten que los grupos fosfatos están enlazados al carbono 3' del próximo nucleótido En el terminal 5' hay un fosfato (P) En el terminal 3' hay un grupo hidroxilo (OH) Esto se conoce como la dirección 5' 3' de la hebra de DNA La hebra complementaria tiene la dirección contraria, es antiparalela (tiene dirección 3' 5') La polimerasa de DNA sólo añade nucleótidos en dirección 5 3' La síntesis del DNA en detalle está dada en la Figura 16.13: La enzima que sintetiza el DNA es la polimerasa de DNA, esta enzima sólo tiene actividad 5' 3' La enzima añade los nucleótidos en la región del tenedor de replicación En una hebra, llamada hebra líder o continua, la adición de nucleótidos y la síntesis de DNA es de forma ininterrumpida, mientras se mueve el tenedor de replicación En la otra hebra, llamada hebra rezagada o discontinua, la adición de nucleótidos es en la dirección contraria al movimiento del tenedor de replicación En esta hebra se sintetizan fragmentos cortos de DNA, la síntesis se hace pedazo a pedazo, en fragmentos de aproximadamente nucleótidos Estos pedazos se conocen como los fragmentos de Okazaki, en honor al científico Japonés que los descubrió Los fragmentos son unidos por la acción de otra enzima llamada ligasa de DNA La polimerasa de DNA tiene otra restricción (Figura 16.14): Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 11

12 Esta enzima sólo puede iniciar la síntesis al final de una región de hebra doble, no reconoce DNA de hebra sencilla Durante la replicación del DNA, una enzima llamada primasa sintetiza un fragmento pequeño de RNA (~10 nucleótidos) Este fragmento se conoce como "primer", iniciador o cebador Al final del "primer" es que la polimerasa de DNA comienza la síntesis del DNA El "primer" de RNA es posteriormente removido y sustituido por DNA, por la acción de otra polimerasa de DNA En la hebra líder hace falta un solo "primer" En la hebra rezago hace falta un "primer" por cada fragmento de Okazaki Hay otras proteínas que también participan en el proceso de replicación del DNA Helicasas son enzimas que desenrollan el DNA en la región del tenedor de replicación Otras proteínas llamadas "single strand binding proteins" (proteínas que enlazan DNA de hebra sencilla) se pegan al DNA de hebra sencilla y lo estabilizan En la Figura se muestra un resumen de las enzimas que participan del proceso de replicación del DNA y sus funciones En la Figura se muestra un resumen del proceso de replicación del DNA Dr. Iván Ferrer Rodríguez Chap 16 12