UNIVERSIDAD DE BELGRANO

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE BELGRANO Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Licenciatura en Tecnología de Alimentos Licenciatura en Química Laboratorio IV Métodos Enzimáticos Profesora: Carmen E. Peralta Sanhueza

2

3 LICENCIATURA EN TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS UNIVERSIDAD DE BELGRANO ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS MÉTODOS ENZIMÁTICOS ÍNDICE DE CONTENIDOS Algunas Consideraciones Teóricas pág. 2 Guía de Laboratorio Métodos Enzimáticos I: Cuantificación de analitos por vía enzimática pág. 15 Métodos Enzimáticos II: Determinación de actividad enzimática; termorresistencia pág. 19 Guía de Problemas pág. 25 1/29

4 ALGUNAS CONSIDERACIONES TEÓRICAS * 1.- Introducción Las enzimas son catalizadores complejos, constituidos por proteínas globulares, que a temperatura en torno a 37 C, aceleran las velocidades de las reacciones químicas por un factor de a respecto de las reacciones no catalizadas. Los catalizadores industriales no enzimáticos tienen eficiencias de órdenes de magnitud inferiores. Es la eficacia catalítica de las enzimas a baja temperatura lo que las hace importantes para el tecnólogo de los alimentos. Esto representa que los alimentos pueden ser procesados o modificados mediante enzimas a una temperatura moderada, C, a la que de otro modo los alimentos sufrirían cambio sólo lentamente. La tremenda capacidad catalítica de las enzimas es consecuencia de la reducción de la energía de activación de las reacciones en que intervienen. Las bajas energías de activación de las reacciones enzimáticas indican que la velocidad de reacción tiene poca dependencia con la temperatura, por lo tanto una reducción de la temperatura tiene relativamente poco efecto sobre la velocidad de la reacción. En consecuencia, las enzimas pueden ser bastante activas incluso a temperaturas de congelación y resultar, por ello, importantes estimulantes de las reacciones degradativas en los alimentos refrigerados o congelados. Uno de los fines del tratamiento térmico es desnaturalizar e inactivar de tal modo que los alimentos no se encuentren sujetos a su continua actividad. Otra característica importante de las enzimas, además de su poder catalítico, es su especificidad. Los catalizadores industriales no poseen esta especificidad de reacción. La especificidad de las enzimas permite a los expertos en la ciencia de alimentos modificar selectivamente determinados componentes individuales y no afectar a otros. Su especificidad también permite utilizarlas como reactivos analíticos sensibles. El análisis de los componentes de los alimentos puede, en muchos casos, simplificarse utilizando las técnicas enzimáticas. 2.- Métodos enzimáticos en el análisis de alimentos Desde el punto de vista de la tecnología de los alimentos puede quererse determinar: - sustancias por medio de reacciones catalizadas por enzimas o - la actividad de una enzima presente en un dado alimento Determinación de sustancias por medio de enzimas: En este caso las enzimas son usadas como reactivos para catálisis específicas de reacciones químicas. De manera que es una forma especial de análisis químico, en que se dosa el sustrato de una determinada enzima. Las determinaciones enzimáticas de sustratos se emplean en la actualidad como método de rutina, en laboratorios de investigación y desarrollo para la determinación precisa de ingredientes de los alimentos, como así también * Este material, con mínimas modificaciones, fue preparado sobre la base del Apunte Teórico de Métodos Enzimáticos de la materia Análisis Avanzado de los Alimentos-UBA /29

5 en la evaluación de productos del metabolismo de microorganismos (como por ejemplo piruvato, lactato y amonio en leche, o succinato en huevo). Requerimientos: - disponibilidad de la enzima - detección sencilla, usualmente por formación de un producto coloreado o con absorbancia al UV - transformación cuantitativa del sustrato. Para ello es necesario estandarizar condiciones o parámetros de control tales como temperatura, tiempo de reacción, ph, concentración de enzima, etc. Ventajas de este tipo de método: -rapidez (en general requiere pocos pasos de preparación de la muestra) - alta especificidad - sensibilidad - precisión - instrumental sencillo - pocas interferencias - condiciones suaves de reacción Desventajas/limitaciones del método: - no todas las sustancias a analizar son posibles sustratos enzimáticos. - disponibilidad de la enzima Determinación de actividad enzimática: En este caso, el análisis se realiza para: - chequear o evaluar tratamientos térmicos durante el procesado. Ej: fosfatasa alcalina en leche pasteurizada, polifenoloxidasa en vegetales escaldados, papaína (enzima utilizada en la clarificación de cervezas) - detectar tratamientos térmicos en exceso prohibidos. Ej: actividad diastásica en mieles - evaluar aptitud para un fin dado. Ej: actividad diastásica en harinas 3.- Cinética de las reacciones enzimáticas La reacción puede interpretarse como la unión de la enzima con el sustrato a través del sitio activo, que es el responsable de la especificidad de la reacción. La teoría cinética de Michaelis-Menten de la acción enzimática propone la combinación reversible de la enzima (E) con el sustrato (S), formando un complejo intermediario ES, el cual se descompone irreversiblemente para producir productos (P) y la E libre. k 1 k 3 E + S ES P + E k 2 3/29

6 donde k 1, k 2, k 3 son las constantes de velocidad de cada una de las etapas de la reacción global. La velocidad de formación del producto está dada por: [ P] dt k [ ES] v d = 3 = (1) donde v es la velocidad de formación del producto. La concentración del complejo enzima-sustrato es inicialmente cero pero rápidamente alcanza un nivel máximo, si la concentración inicial de sustrato es mucho mayor que la de la enzima y luego declina lentamente. Entonces, en un instante dado la [ES] es aproximadamente constante, por lo que podemos aceptar que existen condiciones de estado estacionario (Fig. 1). Por lo tanto: d [ ES] = k [ E][ S] k [ ES] k [ ES] 0 dt (2) Reordenando esta ecuación se obtiene: [ E][ S] ( k + k ) [ ] ES = 2 3 = K k m (3) donde K m es la constante de Michaelis. 1 4/29

7 Por otro lado, la concentración total de enzima [E 0 ] esta dada por: [ E ] = [ E] + [ ES] 0 (4) y si combinamos las ecuaciones (3) y (4), obtenemos: [ ] [ E ][ S] ES ( K [ S] ) = 0 (5) m + y si reemplazamos los hallado para [ES] en la expresión (1), obtendremos para la velocidad de formación de producto, v, lo siguiente: v [ E ][ S] ( K [ S] ) k3 (6) = 0 m + Si recordamos la expresión (1), v = d [P] /dt queda claro que el valor de v puede estimarse través de la pendiente de una curva de progreso, es decir, de la pendiente de una representación de [P] en función del tiempo de reacción (Fig. 2). A medida que transcurre una reacción enzimática, la línea de progreso va Queda claro, a partir de (6), que para cada [E] s e obtendrá un gráfico de [P] vs tiempo distinto (ver Fig.4). 5/29

8 haciéndose curvilínea. Esto significa que la velocidad de formación de producto desciende durante el curso de la reacción a causa de la depleción del sustrato. En la ecuación (6) se observa que v se hace cada vez más pequeña a medida que disminuye la [S]: v = k 3 [E 0 ] / (K m /[S] + 1) Existen otras razones para que v disminuya a lo largo del tiempo. Si la reacción es reversible su funcionamiento en el sentido inverso va creciendo en importancia al progresar la reacción e irse acumulando el producto. Por otra parte, el producto de la reacción puede inhibir a la enzima. Se acostumbra a tomar como valor de v la pendiente inicial de la curva de progreso (Fig. 2). Si se obtienen valores de v o (velocidad inicial) a diferentes concentraciones de sustrato y se representan luego frente a [S] se obtiene tal como predice la ecuación (6) y lo muestra la Fig. 3, una hipérbola rectangular, Ahora bien, si volvemos sobre la ecuación (6) se observamos que a medida que aumenta [S] lo hace también v, significativamente a concentraciones de sustrato bajas y lentamente cuanto más altas sean éstas. Se deduce además que si: k E = (7) K [S] <<< K m [ ] v ( 3 0 ).[ S] [S] >>> K m v = k 3 [E 0 ] = V máx (8) m 6/29

9 Cuando [S] <<< Km o lo que es lo mismo a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción es de orden 1 tanto [S] como para la [E]. Cuando [S] >> K m, manteniendo constantes las condiciones de reacción (ph, temperatura, concentración de cofactores, de enzima, etc.) la velocidad de formación de producto, v, alcanza un valor máximo, al que se denomina V máx. En este caso, se dice que la E se encuentra saturada de S. Como norma general, se puede asumir que [S] >> K m si se verifica que [S] = 20 K m. Así si: [S] = 20 K m [S] >>> K m v = V máx = k 3 [E 0 ] Se comprueba en esta ecuación que V máx es independiente de [S], es decir, la reacción es de orden cero con respecto al sustrato. Por otra parte, V máx es de primer orden con respecto a la enzima y, por lo tanto, en un sistema enzimático dado puede lograrse aumentar V máx incrementando la [E 0 ] pero no aumentando [S 0 ]. Cuando [S] = K m, se verifica a partir de (6) que v = k 3 [E 0 ] / 2 = V máx / 2 La constante de Michaelis-Menten (K m ) constituye una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato (a menor K m, mayor afinidad, mayor velocidad de reacción). Esta constante expresa, por tanto, la concentración de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima. Si K m es grande, se precisa una gran cantidad de S para saturar a la E; si K m es pequeña, basta una pequeña cantidad de S para saturarla. La mayoría de las reacciones enzimáticas que utilizan sustratos no muy complejos presentan valores de K m entre 10-5 y 10-2 M. Los dos parámetros más importantes en la teoría de Michaelis-Menten son K m y V máx. Suelen determinarse por la representación de Lineweaver-Burk. Si tomamos la inversa de la ecuación (6), obtenemos K = 1 (9) 1 ( m ). 1 + v Vmáx [ S] Vmáx Así, la representación gráfica de 1/v en función de 1/[S], corresponde a la ecuación de una recta en la que el punto de intersección en el eje vertical vale 1/V máx y la intersección con el eje horizontal es -1/K m. Las representaciones de Lineweaver-Burk permiten obtener fácilmente K m y V máx. Estos parámetros también pueden ser obtenidos representando v vs. [S] (Fig. 3), pero con menor precisión. 4.- Factores que influyen en la velocidad de la reacción Influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas los siguientes factores: - temperatura - ph y composición del buffer - activadores e inhibidores - coenzimas 7/29

10 Temperatura: En toda reacción química al aumentar la temperatura se incremento la velocidad de la reacción. En las reacciones enzimáticas se debe tener en cuenta que al aumentar la temperatura se desnaturaliza la enzima, y por lo tanto se inactiva disminuyendo la velocidad. Por lo tanto, existe una temperatura óptima de reacción que permite que la velocidad sea la máxima posible. La temperatura influye en forma directa sobre la velocidad de la reacción y a través de su influencia sobre otros factores (el ph de las soluciones buffer, las curvas de absorción, la concentración óptima de los reactivos y la constante K m dependen de la temperatura). Por ejemplo un aumento de temperatura en 1 C conduce a un incremento de aproximadamente el 20% de la actividad. Por lo tanto para comparar datos es fundamental la estandarización de las condiciones. ph y composición del buffer: Análogamente debe establecerse una relación de compromiso entre el valor de ph óptimo y la inhibición de la enzima. Al modificar el ph se modifica el estado de ionización de la molécula de enzima, y por lo tanto se modifica la intensidad de las interacciones enzima-sustrato, pero también se modifican las interacciones de la cadena proteica cambiando la conformación de la enzima, lo que conduce a su inactivación. La concentración y la naturaleza del buffer también son importantes ya que éste puede inhibir a la enzima y la actividad enzimática puede modificarse con su concentración. Activadores e inhibidores: Se los denomina efectores. Las determinaciones deben realizarse en ausencia de inhibidores (detergentes, metales pesados) y deben contener concentraciones suficientes de los activadores que requiera la enzima (ATPasas requieren Mg ++, amilasas requieren Cl - ). Coenzimas: Las coenzimas son sustancias que cuando se unen con la enzima la transforman en una enzima activa: coenzima + enzima inactiva enzima activa Las coenzimas representan el centro activo o parte del centro activo de la enzima, de manera que participan directamente en la catálisis pero no se regeneran sino que se transforman estequiométricamente. Las coenzimas más utilizadas (en sus formas oxidadas o reducidas) son:: - NAD + / NADH : nicotinamida adenina dinucleótido, - NADP + /NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. 8/29

11 5.- Determinación de la actividad enzimática Cuando quiere determinarse el nivel enzimático en un alimento de una dada enzima, no se mide la concentración enzimática porque lo que interesa es la cantidad de enzima útil como catalizador, es decir interesa determinar la actividad catalítica o actividad enzimática. Por otro lado, las cantidades de enzimas presentes son generalmente muy pequeñas, por lo que serán difíciles de determinar. La actividad catalítica de una enzima se mide en U/l o U/g o en mu/ml o mu/mg (unidades enzimáticas por litro o gramo, miliunidades enzimáticas por mililitro o miligramo). La unidad enzimática U es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato por minuto (en las condiciones determinadas de la prueba: T, ph, concentración de sustrato, etc.), es decir, U = µmol/min. La determinación de la actividad enzimática puede hacerse a través de: - una vía directa o por medio de - un análisis de tiempo fijo - un análisis con enzimas acopladas Determinación directa Cuando la determinación de la actividad enzimática se implementa por esta vía, lo que se puede hacer es seguir el: - descenso de la concentración de sustrato. - aumento de uno de los productos - cambio de concentración de coenzimas. Las determinaciones de actividad enzimática se realizan con condiciones de sustrato saturante, es decir en condiciones en las que [S] >>> K m y que en la práctica dijimos valían siempre que [S] > 20 K m. De esta manera la reacción será de orden cero, y la velocidad inicial de reacción será proporcional a la concentración enzimática: v = k 3 [E 0 ] Cuando se consigue estar en esta zona de orden cero, la velocidad de aparición del producto es lineal con el tiempo. Es conveniente registrar la aparición de producto y no la disminución de sustrato, ya que éste se encuentra en altas concentraciones iniciales para asegurar saturación, y será menos sensible determinar la variación de su concentración que la del producto. Se trabajará siempre a ph, T, y [buffer] óptimos. En la Fig. 4 se muestran las curvas de progreso a diferentes valores de [E 0 ] Tales curvas son lineales al principio pero finalmente y, por las razones que se explicaron anteriormente, se vuelven curvilíneas. La pendiente inicial de la curva de progreso, para cada [E 0 ], equivale a la V máx ya que se está trabajando siempre a saturación de la enzima ([S 0 ] >> K m ). 9/29

12 Las pendientes iniciales de cada curva de progreso pueden ser representadas frente a los correspondientes valores de [Eo] para obtener una curva patrón para la determinación de actividad enzimática, (Fig. 5). Las curvas que relacionan la velocidad de formación del producto con la concentración de enzima son especialmente útiles en su tramo lineal. En éste la pendiente es: 0 [ P] dv0 = cons tan te = (10) de t 1 donde v o es la velocidad inicial de formación de producto. La ecuación (10) indica que v 0 es proporcional a [E 0 ] 10/29

13 Al determinarse la actividad catalítica de una enzima, deben observarse las siguientes normas: - Es preferible medir las velocidades iniciales empleando técnicas de seguimiento continuo. - Las determinaciones de enzimas suelen efectuarse con [S] = 20 K m. Esto asegura la máxima velocidad de reacción. - Las condiciones de reacción deben ser constantes y han de ser descriptas al informar los resultados. - Debe determinarse la velocidad de la reacción en ausencia de enzima, empleando una preparación enzimática inactivada por calentamiento. - Debe determinarse también la cantidad de enzima utilizada, de forma que pueda calcularse la actividad específica, ya que la enzima puede constituir sólo una pequeña parte del total. Análisis a tiempo fijo: Tiene la ventaja que ahorra tiempo y dinero. Pero se debe tener la precaución de tomar el tiempo fijo cuando se está seguro de que la curva de progreso es lineal durante cierto período de tiempo. Si dentro de ese período medimos [P] en un momento dado, t 1, el cociente [P]/t 1 = v o (velocidad inicial de formación de producto) Esto es lo que simplifica el análisis. No es necesario medir una serie de valores de [P] a lo largo del tiempo. Pero es preciso reiterar que la curva de progreso debe ser lineal durante el tiempo elegido, t 1. Si es curvilínea, [P]/t 1 no será igual a v o. Análisis con enzimas acopladas A veces no es conveniente o resulta imposible determinar directamente el producto de una reacción enzimática. Sin embargo, el citado producto puede servir como sustrato para una segunda enzima, de forma que se obtiene un segundo compuesto que puede ser medido convenientemente. En este caso, puede llevarse a cabo un análisis con enzimas 11/29

14 acopladas. El sistema enzimático a ensayar se acopla con una sequnda enzima, que sirve como indicadora para la primera. En esta situación tendremos: E 1 E 2 A B C donde: A: sustrato para E 1 cuya actividad se desea medir B: producto de la acción de E 1 sobre A y también sustrato de E 2, enzima acoplada o indicadora. C: producto de E 2. El objetivo es seguir la velocidad de formación de C para determinar la actividad enzimática de E 1. La velocidad de la reacción de la enzima indicadora E 2 debe ser, por lo menos, 100 veces mayor que la de aquella cuya actividad se quiere medir. Para poder emplear este método es necesario que se cumplan dos condiciones básicas: - la velocidad de desaparición de A debe ser de orden cero respecto de A y la reacción debe ser irreversible. - la velocidad de formación de C debe ser de primer orden respecto de B y esta reacción también debe ser irreversible. Si la velocidad de desaparición de A es de orden cero respecto de A e irreversible, ésta es función solamente de [E 1 ]. Se cumplirá esta condición si [A 0 ] >> K ma o si durante el período de análisis sólo se consume una pequeña cantidad de A. Puede aceptarse que la reacción será irreversible, puesto que B es retirado del sistema por la actividad de la enzima acoplada. Podemos estar seguros que la velocidad de aparición de C es de primer orden con respecto a B si [B] << K mb. Esto puede lograrse efectuando el análisis con un exceso de E 2. Podremos asegurar que esta segunda etapa será esencialmente irreversible si el análisis se efectúa en un corto período de tiempo, para evitar la acumulación de C. Si se cumplen todas éstas condiciones básicas, tras un corto período de latencia, la velocidad de aparición de C será constante y proporcional a [E 1 ]; dado que las reacciones ocurren en estado estacionario. 6.- Determinación de la cantidad de sustrato vía el empleo de enzimas Por su gran especificidad las enzimas pueden ser utilizadas para el análisis de componentes de los alimentos sin necesidad de purificarlos previamente. Además muchas de las reacciones enzimáticas son muy sensibles y permiten determinar incluso g de material. Cuando se utilizan enzimas para la determinación de sustratos, es importante controlar estrictamente las condiciones en que tiene lugar la reacción. Dado que lo que se desea analizar es el sustrato, éste debe ser el componente limitante del sistema. Por lo tanto, los activadores y cofactores, por ejemplo, deben encontrarse en cantidad suficiente para saturar a la enzima. La concentración de sustrato puede ser determinada de dos modos: 12/29

15 - método de equilibrio o de conversión total. - método cinético. En el primer caso, lo que se hace es permitir que la reacción se complete y se mide la cantidad de producto formado por métodos físicos o químicos específicos. En el segundo se trabaja a concentración fija de enzima en condiciones tales que la velocidad de reacción sea proporcional a la concentración de sustrato (o de un activador o inhibidor, si es éste el que se desea determinar). Cuando [S] es muy baja ( [S 0 ] < 0.2 K m ) las curvas de progreso deben ser lineales. Por la ecuación (7), sabemos que obtendremos un gráfico de la forma: [ E ] v = pendiente [S] y pendiente = k 3 0 Para obtener una gráfica patrón que relacione la velocidad de formación de producto con la concentración de sustrato, se construyen curvas de progreso a diferentes valores de [S 0 ] y sus pendientes se representan en función de la concentración de sustrato correspondiente. K m 7.- Seguimiento de las reacciones enzimáticas Si el producto de la reacción es coloreado, su concentración puede determinarse por métodos colorimétricos, es decir midiendo la absorbancia en el espectro visible. Ejemplos de este tipo de situaciones son: - mediciones con oxidasas: - acoplamiento NADH-diaforasa En el caso de las oxidasas, hay transferencia de H desde el sustrato al 0 y se forma H como intermediario. Luego éste reacciona con una leucobase en presencia de peroxidasa y se forma un colorante que se mide en el visible. Alternativamente el H puede reaccionar con NADH en presencia de NADH-POD (peroxidasa) como en la determinación de sulfito). En el caso del acoplamiento NADH-diaforasa, las reacciones de formación se acoplan a la reacción catalizada por diaforasa que transfiere H al iodonitrotetrazolio (INT). Se forma un colorante formazán que se mide en el visible. Si en la reacción intervienen coenzimas puede determinarse la formación (o el consumo) de la especie reducida de la coenzima por espectrometría en el UV. La medición de analitos con deshidrogenasa o reductasas vía la formación o consumo de NAD(P)H es ventajosa, ya que los coeficientes de extinción que se usan para los cálculos son perfectamente conocidos y las reacciones están libres de interferencias. Las formas reducidas de las coenzimas NAD y NADP absorben a 334, 340 y 365 nm, por lo tanto se puede medir su formación o consumo. En la Fig.6 se muestra el espectro de absorción del NAD(P) y NAD(P)H. 13/29

16 8.- Kits enzimátícos El primer paso en el desarrollo de kits enzimáticos en alimentos fue adaptar los métodos enzimáticos de análisis clínicos al análisis de alimentos. Luego se desarrollaron kits especiales para alimentos. Estos kits contienen reactivos, seleccionados y probados, que se encuentran en las calidades adecuadas para los ensayos en alimentos. Las ventajas que proporcionan dichos métodos son: - considerable ahorro de tiempo, - seguridad analítica, - fácil chequeo y - muchos de ellos han sido publicados como métodos de referencia o como parte de leyes nacionales, y fueron estandarizados por comités internacionales. Así por ejemplo, el AOAC consta por ejemplo con los siguientes métodos: - L málico en jugo de manzana. - glucosa / fructosa en vino. - ácido cítrico en vino. - CO 2 en vino. - almidón en cereales βd glucanos en cebada y avena, cereales listos para comer. - fibra - lactosa en leche 14/29

17 GUÍA DE LABORATORIO Métodos Enzimáticos I Cuantificación de un analito por vía enzimática Objetivo: determinar (i) la cinética de hidrólisis enzimática de la lactosa y (ii) los factores (temperatura, sales) que la modifican. Fundamento del método: La hidrólisis de lactosa se llevará a cabo empleando una enzima comercial: lactasa (β-galactosidasa. El seguimiento de la hidrólisis se realizará a través de la determinación de la glucosa obtenida mediante un método enzimático. Hidrólisis enzimática de la lactosa: Reactivos: - suero de queso lácteo deshidratado, leche en polvo o suero deshidratado - lactasa concentración??? - KOH 20% - NaCl 0.05 M - CaCl M - MgCl M (i) Diluir convenientemente la muestra de modo tal que la concentración de lactosa inicial sea de alrededor de 5-10%. Preparar un volumen de 30 ml de esta dilución. Por ejemplo, para suero de queso en polvo 3g/30mL de agua destilada, mientras que para leche o suero 30 ml de muestra tal cual. (iia) Ajustar la mezcla de reacción a ph 6.0 con KOH 20%. Distribuir en tubos de ensayo y preincubar a la temperatura de reacción correspondiente durante 10 min (4º, 37º o 50ºC). (iib) Para estudiar la influencia de cationes monovalentes (Na + ) y divalentes (Ca 2+ y Mg 2+ ) se agregan a 8 ml de la solución de suero 2 ml de NaCl 0.05 M o 2 ml de CaCl M o 2 ml de MgCl 2. Incubar a 37 ºC. (iii) Agregar 20 µl de enzima y agitar. (iv) Colocar en baño de agua a 37º o 50ºC o en heladera a 4ºC. (v) Retirar alícuotas de 0.5 ml (por duplicado) en tubos de ensayo cada 20 min e inactivar la enzima colocando los tubos a 90ºC durante 3 min. (vi) Luego de inactivar la enzima, agregar 4.5 ml de agua destilada. (vii) Para el tiempo "0" realizar la inactivación inmediatamente después de agregada la enzima, en 0.5 ml de muestra y agregar 4.5 ml de agua destilada. (viii) En las distintas alícuotas determinar glucosa por un método enzimático. (ix) Registrar % lactosa vs. tiempo. Este material fue elaborado sobre la base los TP de métodos enzimáticos de la Guía de TP de Análisis Avanzado de los Alimentos-UBA /29

18 Esquemáticamente: Na + Ca 2+ T incubación T incubación T incubación T incubación 4ºC 50ºC 37ºC 37ºC T incubación Mg 2+ T incubación 37ºC 37ºC muestra a ph = 6 10 ml 10 ml 10 ml 8 ml 8 ml 8 ml NaCl 0.05 M ml - - CaCl M ml - MgCl M ml pre-incubar x 10 37ºC 4ºC 50ºC 37ºC 37ºC 37ºC lactasa 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl homogeneizar sí sí sí sí sí sí 0 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí incubar a 37ºC a 4ºC a 50ºC a 37ºC a 37ºC a 37ºC 10 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí 20 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí 40 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí 60 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí 80 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí 100 (x duplicado) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml baño 90ºC x 3 sí sí sí sí sí sí agua destilada 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml homogeneizar sí sí sí sí sí sí determinar glu sí sí sí sí sí sí 16/29

19 Determinación de glucosa Reactivos : - GOD/POD: solución de glucosa oxidasa (1000 U/mL) y peroxidasa (120U/mL) - 4-AF: solución de 4-aminofenazona 25mmol/L en buffer tris 0.92 mol/l - fenol: solución de fenol 55 mmol/l - reactivo de trabajo preparado: mezclar en el orden en que se indica: 500 partes de agua destilada, 50 partes de 4-AF, 50 partes de fenol y llevar a 1000 con agua destilada; agregar 3 partes de GOD/POD. Mezclar por inversión, sin agitación. Almacenar refrigerado (2-10 ºC). Estabilidad: 1 mes **. - solución estándar de glucosa: glucosa 0.1% Procedimiento: Extraer 20 µl de cada tubo y agregar 2 ml del reactivo de trabajo preparado. Colocar en baño de agua a 37ºC durante 10 min. Realizar el mismo procedimiento con una solución estándar de glucosa 0.1%. Correr un blanco de reactivos. Medir A (λ = 505 nm), dentro de la primera hora de largada la reacción, en cubetas de vidrio o plástico. Informe: (i) Calcular: A muestra x 0.1 x 5 % glucosa muestra = A estándar x 0.5 % lactosa muestra = % glucosa muestra x 1.9 % lactosa hidrolizada al tiempo t = L t / L o x 100, donde L t : (lactosa) hidrolizada al tiempo t L o : (lactosa) inicial = 5% P/V (ii) Con los cálculos efectuados, complete la siguiente tabla: v máx % Hidrólisis de Lactosa Na + Ca 2+ T incubación 4ºC T incubación T incubación T incubación 50ºC 37ºC 37ºC T incubación 37ºC Mg 2+ T incubación 37ºC Glicemia enzimática Wiener lab ** El reactivo de trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no afecta su funcionamiento siempre que se procese un blanco. 17/29

20 (iii) Graficar %hidrólisis vs. tiempo (iv) Estimar velocidad máxima (v máx ) (v) Concluir sobre las condiciones óptimas de actividad enzimática de la lactasa. 18/29

21 Métodos Enzimáticos II Determinación de actividad enzimática en alimentos y su termorresistencia Objetivo: determinar la actividad de distintas enzimas (ureasas, diatasas, fosfatasa alcalina) presentes en alimentos y observar su resistencia térmica. I.- Determinación de actividad ureásica en harina de soja El calentamiento o tostado de la harina de soja es esencial para eliminar factores biológicamente activos tales como inhibidor de tripsina, hemoaglutinación, inhibidor de lipasa, antivitamínicos, goitrogénicos. Las condiciones óptimas de calentamiento se logran a través del control de: humedad, temperatura y tiempo. Uno de los mejores indicadores in vitro para controlar si el tratamiento térmico fue el adecuado es la medición de la actividad ureásica. Altos valores de actividad ureásica indicarían que el producto ha sido calentado suavemente. Bajos valores, sugieren que pudo haber habido sobrecalentamiento. Poder controlar la intensidad del tratamiento térmico aplicado es importante ya que un calentamiento inadecuado, tanto por exceso como por defecto, conduciría a la obtención de harinas de soja con un menor valor nutritivo. En el caso de sobrecalentamiento, habría pérdida de aminoácidos esenciales (lisina y arginina ); en el caso de un calentamiento insuficiente, la eliminación de factores biológicamente activos no sería completa. I.1.- Preparación del extracto enzimático - Método de Natelson (modificado): Mezclar 30 g de harina de soja (recién molida) con 50 ml de ácido sulfúrico M. Agitar en un agitador de Khan durante 20 min. Añadir 150 ml de agua destilada y continuar la agitación durante 15 min más. Filtrar por papel y sobre el filtrado (F) así obtenido, realizar el tratamiento térmico según se indica más adelante. Finalmente, sobre el filtrado tratado térmicamente determinar actividad ureásica. I.2.- Tratamiento térmico: Sobre el filtrado (F) obtenido de la extracción sólido líquido del paso anterior aplicar los siguientes tratamientos térmicos: - autoclave: 0 y 30 min - 90ºC: 0 y 30 min Algunos autores consideran que a la arginina, y también a la histidina, como esencial para niños pero no para adultos. 19/29

22 I.3- Medición actividad enzimática Usando urea como sustrato, se determinará la actividad ureásica en la harina de soja. Para ello se practicará, con agua destilada, una dilución del extracto de soja tratado térmicamente en proporción 1:8. I Fundamento del método: La ureasa actúa sobre la urea hidrolizándola y dando lugar a la formación de anhídrido carbónico y amoníaco. La cantidad de amoníaco generada puede medirse de distintas maneras. En la actualidad se usa la reacción de Berthelot, muy sensible, en la que el amoníaco reacciona con fenol e hipoclorito en presencia de un catalizador (nitroprusiato de sodio ) para dar indofenol. La coloración azul del indofenol es proporcional a la cantidad de urea hidrolizada. I Reactivos: - solución de sustrato estándar: 0.6 g urea/l - reactivo 1: fenol, nitroprusiato de sodio y etilen-bis-ditiocarbamato manganoso - reactivo 2: hipoclorito de sodio y p-toluen sulfocloramida en hidróxido de sodio I Procedimiento: Se mezcla por agitación suave 50 µl de extracto de dilución adecuada y 20 µl de sustrato. Juntamente realizar un blanco. Incubar durante 5 min a 37ºC. Agregar 1 ml del reactivo 1 y 1 ml del reactivo 2. Mezclar por agitación suave e incubar 5 min a 37ºC. Luego agregar 8 ml de agua destilada y mezclar por inversión. Medir A (540 nm). El color es estable durante 12 h. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua destilada. Esquemáticamente: muestra blanco muestra (µl) 50 - agua destilada (µl) - 50 sustrato (µl) incubar a 37ºC x 5 min reactivo 1 (ml) 1 1 reactivo 2 (ml) 1 1 mezclar x agitación suave incubar a 37ºC x 5 min agua destilada (ml) 8 8 mezclar x inversión leer A (540 nm) Las diluciones adecuadas pueden variar dependiendo de cada partida de harina y del estado de conservación de las muestras. Na 2 [Fe(CN) 5 NO] 20/29

23 II.- Determinación de actividad α-amilásica en miel La actividad diastásica de la miel ha recibido considerable atención por años como indicador de "frescura". El tratamiento térmico (63ºC/30 min o 77ºC/pocos seg), ha sido rutinariamente usado para destruir levaduras y retardar la granulación en mieles. El Codex Alimentarius y el CAA exigen valores mínimos de diastasa como control de la exposición de la miel al calentamiento. II.1.- Tratamiento térmico de las muestras: Pesar *** 1 g de miel en tubo de ensayo común y efectuar los siguientes tratamientos térmicos: - 63 ºC a 0, 15, 30, 45 y 60 min ºC a 0, 10, 15, 30 y 45 min. Luego del calentamiento, enfriar las muestras en baño de hielo. Diluir según corresponda. Realizar las determinaciones de actividad enzimática por duplicado. II.2.- Medición actividad enzimática II Fundamento del método: El sustrato, almidón tamponado, al ser incubado con la muestra se hidroliza enzimáticamente. El agregado de reactivo de iodo detiene hidrólisis y al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en UA (unidad amilolítica: la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min). UA = A control - A muestra x 1000 A control II Reactivos:,**** - solución de sustrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a ph 7 con buffer fosfatos 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l. Almacenar en heladera. - reactivo de iodo: solución 0.01 eq/l de I 2 en ácido clorhídrico 0.02 mol/l. Almacenar en heladera. *** Tendrá que preparar tantas muestras como combinaciones de (temperatura, tiempo) necesite estudiar. Según la miel de que se trate la dilución a efectuar. Podría ser necesario diluir al 1/2, 1/4, 1/8 o al 1/10. Consulte con los docentes. El color de la reacción del Amilokit no es azul debido a un exceso de yodo. El exceso de iodo y el HCl presentes en el reactivo de yodo son necesarios para asegurar (i1) la completa inhibición de la reacción enzimática y (i2) la estabilidad del color y para (ii) eliminar la influencia que pudiera haber de las proteínas en la reacción de color. Amilokit Wiener lab **** Debido a la alta actividad amilásica de la saliva, hay que evitar toda contaminación donde ésta esté involucrada. El sustrato debe medirse con pipeta de 5 ml o con pipeta de 1 ml de doble aforo. No debe soplarse por la pipeta ya que la mínima contaminación con saliva deteriora definitivamente al sustrato. 21/29

24 II Procedimiento: Atemperar sustrato y muestra a 37 ºC. Incubar 500 µl de sustrato con 500 µl de muestra en baño de agua a 37 C. Realizar paralelamente un control. A los 7 min y medio exactos (medir con cronómetro), agregar 500 µl de reactivo de iodo. Mezclar por agitación suave y retirar los tubos del baño. Inmediatamente agregar 4 ml de agua destilada, tapar con un film plástico y homogeneizar por inversión. Medir A (640 nm), dentro de 1h. Si la temperatura ambiente es superior a 25ºC, leer antes de los 20 min. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua destilada. Esquemáticamente: muestra control atemperar muestra, agua destilada y sustrato en baño de agua a 37ºC x unos minutos muestra (µl) a 37 ºC agua destilada (µl) a 37 ºC sustrato (µl) a 37 ºC incubar a 37ºC x 7 min 30 seg exactos (cronómetro) y homogeneizar (vortex) iodo (µl) mezclar x agitación suave y retirar del baño agua destilada (ml) 4 4 tapar con film plástico y homogeneizar por inversión leer A (640 nm) III.- Determinación de la actividad de fosfatasa alcalina en productos lácteos La determinación de fosfatasa alcalina está destinada a decidir si un producto lácteo ha sido pasteurizado en condiciones de tiempo y temperatura adecuados. El CAA y las Normas Mercosur exigen que la prueba de fosfatasa alcalina en productos lácteos dé negativa. III.1.- Preparación de muestra: - leche en polvo: reconstituir aprox. 1g en 10 ml de agua (mantener la temperatura por debajo de 35ºC). - leche fluida: tal cual - manteca: pesar aprox. 1 g de muestra, extraerla por debajo de la superficie con un cuchillo limpio. - crema de leche: tal cual Nota: si las muestras quedaran turbias, filtrar por papel. La centrifugación no da buenos resultados. III.2.- Medición actividad enzimática III Fundamento del método: La determinación de actividad fosfatasa se basa en la hidrólisis enzimática, en medio alcalino, del fenilfosfato disódico (NaFF) a fenol y posterior determinación colorimétrica del fenol liberado con 4-aminoantipirina (4-aminofenazona) y ferricianuro como agente oxidante. 22/29

25 III Reactivos: - solución sustrato: NaFF (1.4 mm) en buffer de ph 10 de aminometilpropanol (3 M) y 4-aminoantipirina (29 mm). Conservar en heladera durante no más de 5 meses. - reactivo de color: ferricianuro de K (10 mm). Estable durante 5 meses a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. - estándar: solución de fenol (200 UI/L) III Procedimiento: Preincubar 0.5 ml de solución de sustrato unos minutos a 37 C. Luego, agregar 50 µl de muestra, mezclar e incubar exactamente 10 min. Realizar paralelamente el estándar y un blanco de reactivos. Agregar 2.5 ml de reactivo de color y retirar los tubos del baño. Medir A (520 nm), dentro de los 30 min. Ajustar el cero del espectrofotómetro con agua destilada. Esquemáticamente: blanco estándar muestra sustrato (ml) incubar a 37ºC en baño de agua x unos minutos (4 min) muestra (µl) estándar (µl) H 2 O destilada (µl) mezclar bien (vortex) incubar a 37ºC x 10 min exactos react. de color (ml) mezclar inmediatamente (vortex) leer a A (520 nm) IV.- Informe La cantidad de producto formado luego del tratamiento, U, está relacionada con la cantidad de producto formado en el tiempo cero (sin tratamiento térmico), Uo. La actividad remanente (RA) se puede expresar como: RA = 100 U/Uo Nota: En trabajos prácticos tomaremos U = A al tiempo correspondiente U 0 = A al tiempo 0 El tiempo y la temperatura de reacción son críticos. Un min o 1ºC en exceso o defecto pueden producir un error de ± 10%. En función de los requerimientos del CAA, en los TP no se efectuará la lectura espectrofotométrica. La lectura de los resultados se hará por simple inspección visual. 23/29

26 Construir el gráfico de RA en función de las condiciones de tratamiento. Para cada una de las enzimas ensayadas, concluir sobre la cinética de inactivación. Comparar la estabilidad relativa de las distintas enzimas estudiadas. 24/29

27 GUÍA DE PROBLEMAS 1.- Compare el método químico de determinación de fibra cruda, con el método enzimático del AOAC. Describa las ventajas y desventajas de cada uno, bajo los siguientes aspectos: i.- masa de muestra. ii.- tiempo de operación (estime el tiempo de cada etapa y el tiempo total). iii.- practicidad del análisis. iv.- contacto con drogas peligrosas 2.- Enumere los métodos enzimáticos que figuran como métodos oficiales de análisis del AOAC. 3a.- Qué métodos enzimáticos de determinación de azúcares conoce? Señale cuáles son las reacciones involucradas en cada uno de ellos. 3b.- Qué otros métodos de determinación de azúcares conoce? Cuál es el fundamento de cada uno de ellos? Mencione ventajas y desventajas. 4.- Nombre algunas enzimas cuya determinación de actividad es útil en tecnología de alimentos en el control del procesado. Señale el alimento en dónde se determina y la información que aporta. Cuáles de estas determinaciones son métodos oficiales de control? 5.- Algunos de vegetales se comercializan actualmente troceados, listos casi para consumir como ensaladas u otras preparaciones. Entre estos vegetales se encuentras champiñones, papas, lechuga, coliflor y zanahoria, por mencionar algunos, que están sujetos a sufrir pardeo o cambios de color. 5a.- Qué reacción enzimática es responsable del cambio de color? 5b.- Qué inhibe la reacción en los vegetales enteros? 5c.- Qué componentes son esenciales para que ocurra la reacción? 5d.- Cómo se puede controlar esta reacción? 6.- En el suero concentrado de queserías, indique cómo varían los parámetros que se indican a continuación al producirse la hidrólisis de la lactosa Nota: Emplee la siguiente notación: (+) aumenta (-) baja (0) no hay cambio (continúa) Algunos de estos problemas fueron tomados de la Guía de Problemas de Análisis Avanzado de los Alimentos-UBA /29

28 energía necesaria para el bombeo tendencia al pardeo digestibilidad-tolerancia flavor aroma dulzura punto de congelación aw 7a.- El método oficial de determinación de glucosa del AOAC recurre a la utilización de las siguientes dos reacciones: ADH D-glu + ATP G-6-P + ADP G6PDH G-6-P + NADP + gluconato-6-p + NADPH + H + Por qué hay que acoplar a la primera, la segunda reacción? 7b.- Justifique la necesidad de recurrir a una segunda reacción en la determinación enzimática del etanol: ADH etanol + NAD + acetaldehído + NADH + H + ALDH acetaldehído + NAD + ácido acético + NADH + H + 7c.- Qué característica deben reunir las segundas reacciones mencionadas en los ítems 7a y 7b? 7d.- Por qué es necesario diluir vinos y jugos de manzana cuando lo que se quiere dosar respectivamente es etanol y glucosa por vía enzimática? 8a.- El contenido de glucosa, fructosa y sacarosa de una miel pueden ser evaluado por métodos enzimáticos a través, por ejemplo, de la cuantificación NADPH. Si se quisiera dosar estos azúcares por esta vía en una miel de flores, cómo procedería? Asuma que dispone de todos los insumos necesarios (buffers, enzimas, vortex, matraces, pipetas, micropipetas, etc.). En su respuesta, conteste a las siguientes preguntas: 8ai.- Habrá algún requerimiento instrumental en particular? 8aii.- Indique claramente el protocolo de análisis que plantearía. Evalúe la necesidad o no de correr un blanco de reactivos y estándares. 8aiii.- Señale de qué manera haría, a partir de las señales medidas, los cálculos. 8aiv.- Será necesario preparar la muestra para el análisis? Explique. 8b.- Es la vía enzimática la única alternativa para realizar esta valoración de azúcares? Explique brevemente. (continúa) 26/29

29 Datos: HK PGI β-fructosidasa fru + ATP fru-6-p + ADP fru-6-p glu-6-p sac+ H 2 O glu + fru ph = 7.6 ph = 7.6 ph = 4.6 PGI: fosfogluco-isomerasa 9.- Usted está a cargo de un laboratorio de control. Dicho laboratorio emplea para determinar glucosa el método enzimático oficial del AOAC. Un analista nuevo a su cargo analizó jugos concentrados y sus resultados dieron por defecto. Luego de revisar con él los distintos pasos del análisis observó que este empleado realizaba la dilución luego de la reacción y no inicialmente. Por qué sus resultados dieron por defecto? 10.- Usted tiene que determinar 10a.- la actividad de invertasa en una muestra incógnita 10b.- la resistencia térmica de una invertasa. Indiqué cómo lo haría. Esquematice los pasos a seguir De un análisis de actividad ureásica en harina de soja recién molida, usted obtiene los siguientes datos experimentales. Considerando que (i) la determinación espectrofotométrica final fue efectuada por triplicado y (ii) las absorbancias aquí informadas han sido corregidas por las diluciones efectuadas, 11a.- calcule la actividad remanente de la enzima. 11b.- Qué se puede concluir a partir de estos resultados? 11c.- Para realizar esta medición de actividad enzimática, se puede trabajar en cualquier rango de concentraciones de enzima y de sustrato? 11d.- Escriba la reacciones involucradas en este ensayo. Señale claramente cuál es el sustrato de la enzima. 11e.- Cuál es la utilidad de realizar una medición de actividad ureásica en soja? A 1 (540 nm) A 2 (540 nm) A 3 (540 nm) blanco ºC, ºC, a.- Se desea determinar la actividad de una invertasa. En condiciones óptimas de reacción, a qué concentración de sacarosa expresada en µg/l trabajaría? 12b.- Si se quisiera usar la enzima del ítem anterior para cuantificar sacarosa en un jarabe cuya concentración aproximada es 50 g sac/100 ml, qué dilución efectuaría? Datos: M sac = 342 K m = 10-8 M 27/29

30 13.- La limonina es un compuesto amargo común en frutas cítricas. Son niveles de limonina habituales, valores de 2-5 mg/l. En aras de mejorar el sabor de los jugos cítricos que elaboran, el área de I&D de una compañía productora de este tipo de bebidas analchólicas ha aislado una limoninasa (enzima que específicamente degrada limonina a un compuesto insaboro). Observaron que al alimentar una columna con la enzima inmovilizada, a mayor concentración de limonina en el jugo, mayor era la velocidad de degradación. Así por ejemplo cuando para una alimentación con (limonina) jugo = 2 mg/l, se degradaban 0.2 unidades arbitrarias/min y (limonina) jugo = 5 mg/l, se degradaban 0.5 unidades arbitrarias/min Debido a que la evolución del proyecto no ha sido suficientemente satisfactoria, la empresa lo contrata a usted como asesor. 13a.- C6mo se explica usted que a mayor concentraci6n de limonina mayor de la degradación lograda? 13b.- Usted sugiere que agregar limonina a varias concentraciones conocidas a jugos, libres de limonina, y determinar la velocidad de reacci6n por lo que a las tres semanas le traen los siguientes resultados: limonina (mg/l) velocidad (UA/min) Por qué pidió usted este experimento? Cómo interpreta los resultados? 13c.- Cuál es el K m y V máx para la enzima? 13d.- Mejorar esas jugos significará un gran beneficio económico para la empresa. Sugiera una solución ingenieril y una solución biol6gica que pueda hacer que este sistema de enzima inmovilizada trabaje adecuadamente Para qué sustancias y en qué alimentos el AOAC propone como uno de los métodos de análisis un ELISA? 15.- Las sulfonamidas son derivados del ácido sulfanílico con actividad antimicrobiana, que se administran tanto a ganado como a colonias de abejas. Esto puede resultar en residuos ilegales en alimentos. Se han propuesto métodos de ELISA para la determinación de sulfonamidas. Explique en que consisten Cuáles serían las ventajas de la aplicación de estos métodos? Y las desventajas? 16.- La ingesta de proteínas (fundamentalmente gliadinas) de trigo, cebada centeno y, probablemente, avena (TACC) produce en individuos susceptibles (celíacos) cambios a nivel de la mucosa del intestino delgado que conducen al desarrollo de un síndrome de mala absorción. En individuos susceptibles, 100 mg de gliadinas pueden causar la aparición de síntomas clínicos. Se estima que 1 de cada 200 personas padece esta enfermedad. Como laboratorista de un organismo de control, usted debe evaluar si unas galletas marca XXX, en cuyo rótulo se lee libre de TACC, son realmente aptas para celíacos. Para ello dispone de los siguientes reactivos: - soporte cubierto con PAb conejo - MAb PN3 - IgG rata conjugada a HRP rábano - TMB 16a.- Cómo haría la determinación de gliadinas? Señale paso a paso, esquemática y claramente las etapas a seguir. Además de la muestra, considere al blanco y al testigo. Para armar esta secuencia necesitó hacer alguna suposición? 16b.- Grafique cómo varía la señal en función de la concentración de analito. 16c.- Si las señales obtenidas al correr blanco, testigo y muestra son S B, S T y S M respectivamente, cómo haría los cálculos para informar sus datos experimentales? 28/29

31 16d.- El método de análisis empleado por usted es conocido por algún nombre en particular? Puede tipificar ese método con algo más de detalle? 16e.- Si en vez del soporte PAb conejo usted dispusiera de uno recubierto con gliadina, podría hacer la determinación en cuestión? Nota: Salvo la modificación recién indicada, usted dispone del resto de los reactivos citados. 16f.- Qué ventajas ofrece el empleo de TMB como reactivo de un ELISA? 16g.- Podría usted determinadas gliadinas por los métodos más habitualmente usados en el análisis de proteínas? En su respuesta no deje de mencionar: (i) los métodos de determinación de proteínas que usted conoce; (ii) el fundamento de cada uno de ellos y (iii) ventajas y desventajas. HRP Datos: TMB producto (λ = 660 nm) - HRP rábano : peroxidasa de rábano - TMB: 3,3,5,5 -tetrametilbencidina - PAb conejo : (anticuerpo policlonal de conejo): anticuerpo anti-gladina - MAb PN3 (anticuerpo monoclonal PN3): anticuerpo anti-gladina - IgG rata : inmunoglobulina G de rata 29/29