Martha Guerra de Muñoz MSc

Transcripción

1 JORNADA DE CAPACITACIÓN Y ACTUALIZACIÓN LABCARE. COLOMBIA PORQUÉ ESTANDARIZAR EL URUANÁLISIS? Martha Guerra de Muñoz Bacterióloga MSc. Pontificia Universidad Javeriana 2010

2 Porqué estandarizar el Uroanálisis? Introducción El Uroanálisis es el examen de laboratorio más utilizado pero a su vez el menos estandarizado, al que se le dedica menor tiempo en su procesamiento y sobre el que no se realiza Garantía de Calidad. Sin embargo, hoy en día se reconoce que el análisis cuidadoso del examen físico, del químico y de los componentes del sedimento puede proporcionar información temprana sobre el estado metabólico, endocrino, integridad anatómica del riñón y la existencia y grado de la lesión renal; por ello se puede definir como "Biopsia Renal Indolora". Dos características únicas explican la importancia de practicar el Uroanálisis: es una muestra fácilmente disponible de recolectar además de que proporciona información rápida y segura sobre muchas de las funciones metabólicas del organismo. La selección del personal que labora en el laboratorio, el Aseguramiento de la Calidad, la preparación cuidadosa del paciente, la obtención y el manejo escrupuloso de las muestras, así como la limpieza del material y la supervisión del adecuado funcionamiento del instrumental, son los primeros pasos que garantizan resultados válidos, que son frecuentemente obviados. Es importante resaltar, que la orina es un producto biológico y puede afectarse por el ejercicio, algunos medicamentos, además del tipo de alimentación. El examen de la orina cualitativo/semicuantitativo con tiras reactivas y el microscópico (sedimento) son los más populares y ensayos básicos del laboratorio clínico. Sin embargo, la exactitud y la precisión de las pruebas no han sido tan fiable como el de la Química Clínica o la Hematología, debido fundamentalmente, a la inestabilidad de la muestra de orina y a los procedimiento de análisis subjetivos. Aunque se han hecho avances significativos en la metodología, sensibilidad y especificidad de las pruebas químicas, al examen del sedimento le falta, en ocasiones, estandarización, control de calidad adecuado y automatización. El valor del examen microscópico depende de dos factores fundamentales: el análisis de una muestra adecuada y del entrenamiento del profesional que realiza el estudio. En 1926, Addis desarrolló un procedimiento para cuantificar los elementos formes en el análisis microscópico en muestras de orinas recolectadas durante 12 horas. Sin embargo, en la actualidad este método no es recomendable, por que muestras que 2

3 contengan microorganismos ureasa positiva hidrolizan la urea presente originando bióxido de carbono (CO 2 ) y amoniaco (NH 3 ) el cual alcaliniza la orina induciendo lisis de los elementos formes. Se hacen esfuerzos para mejorar la confiabilidad mediante técnicas estandarizadas, control de calidad adecuado y educación continuada del profesional. Por lo anterior, cada día surgen nuevos métodos que permiten estandarización del procedimiento microscópico. Las normatividades internacionales establecen directrices para la organización y funcionamiento correcto del laboratorio y del área de Uroanálisis respectivamente, con el fin de obtener resultados de utilidad clínica. Dentro de los componentes del Uroanálisis, el examen microscópico es la parte más dependiente de error humano y la que consume mayor tiempo en el análisis de rutina; está sujeto a numerosas variaciones, incluyendo el método de obtención del sedimento, la cantidad examinada, la metodología, instrumentos y equipos empleados para obtener mejor visualización y la forma en que se interpretan los resultados, es por ello, que el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute) antes Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS: National Committee on Clinical Laboratory Standards), recomienda utilizar un sistema estandarizado para el examen microscópico, o bien, un sistema automatizado. La estandarización pretende eliminar las posibles causas de variación, como son: el tiempo y velocidad de centrifugación, la decantación, el volumen de orina y del sedimento, la superficie de conteo, la microscopía y la interpretación de los resultados por los profesionales involucrados, sin olvidar, que se debe implementar un sistema de control de calidad interno y externo. Actualmente se cuenta con sistemas estandarizados que cumplen los lineamientos de la norma, uno de ellos es el sistema Kova, metodología eficiente para cuantificar los elementos del sedimento, con él, se puede reportar el número de células por campo o por microlitros (μl). Como complemento, el examen químico sirve de parámetro de comparación para detectar falsos positivos y negativos, sin embargo, está sujeto a algunas variaciones obteniendo una interpretación subjetiva esencialmente cuando se realiza lectura visual. 3

4 PARÁMETROS EVALUADOS EN EL UROANÁLISIS El Uroanálisis lo conforman cuatro partes: valoración de la muestra, pruebas físicas, examen químico y del sedimento. Obtención, conservación y transporte de la muestra Existen riesgos en la fase preanalítica del Uroanálisis que pueden invalidar los hallazgos posteriores cuando no se siguen estrictamente las reglas de la preparación del paciente, y el cuidado extremo en la recolección y en la conservación de la muestra. Para conseguir una muestra que represente en forma fidedigna el estado metabólico del paciente, con frecuencia es necesario regular algunos aspectos de su obtención. Estas condiciones especiales pueden incluir el momento de la obtención, el consumo dietario y de medicamentos, y el método de obtención. Los métodos para recolectar la orina difieren de acuerdo a la edad, condición del paciente y/o del tipo de muestra que se desea obtener. Se pueden agrupar en: no invasores (espontánea, con bolsa recolectora y catéter vesical) e invasores (punción suprapúbica, cateterización vesical). Tabla 1. Métodos de recolección de orina Micción voluntaria Bolsa adhesiva Método Cateterismo transuretral Punción suprapúbica (PSP) Complicaciones Hematuria macroscópica (0,6%) Micción reciente (< 1 h) Perforación intestinal Peritonitis (excepcional) Hematomas de la pared abdominal Bacteriemia anaerobia Fiabilidad de la muestra Método de elección en pacientes mayores de 3 años. Fiable para el seguimiento rutinario. La negatividad de la muestra estudiada descarta infección, pero la positividad no la confirma No se debe emplear si se precisa utilizar antibioticoterapia inmediata Fiable si se realiza con técnica adecuada, fácil de efectuar en niñas. En varones se debe evitar traumatismo uretral extremando el cuidado al aplicar la técnica Muy fiable Contraindicaciones Deshidratación Distensión abdominal Anomalías mal definidas del TU Diatésis hemorrágica urinario De acuerdo con la Guía Europea para el Uroanálisis (European Urinalysis Guidelines del European Urinalysis Group 2), de las diferentes muestras de orina, con la que se 4

5 obtienen mejores resultados, es la primera de la mañana, inmediatamente se levante el paciente, antes de desayunar o realizar actividad, porque tiende a ser uniforme y concentrada, asegurando así, la detección de sustancias que quizá no estén presentes en una muestra al azar y diluida (particularmente para valoración de proteinuria, en especial la ortostática, y la densidad), revela prontamente el deterioro, la habilidad de concentración del riñón, y es la que probablemente, contendrá leucocituria en presencia de infecciones. Otra ventaja que ofrece la primera orina de la mañana es que está sometida, en menor medida, a desviaciones debidas a la dieta, actividad física y posturales. Se recomienda evitar utilizar recipientes desechables, irrompibles, químicamente limpios, secos y provistos de tapa (deben cerrar herméticamente), de boca ancha y etiquetas estables, abrirlos sólo en el momento del empleo; lavarse la región genital con jabón (en el caso del varón, el glande deberá exponerse adecuadamente; las mujeres deberán separar los labios de la vulva), y enjuagar bien con agua, no secar. Dejar caer la fracción inicial de la orina en el sanitario recogiendo la muestra de la porción intermedia de la micción en el recipiente sin que este llegue a estar en contacto con el cuerpo; además, debe evitarse contaminación. Por ejemplo, si se está en periodo menstrual debe realizarse el examen 3 días después. Cerrar el recipiente y llevarlo inmediatamente al laboratorio para el análisis. En lactantes y niños pequeños pueden recolectarse las muestras en colectores pediátricos que se fijan a los genitales, y en casos especiales, se utiliza cateterismo transuretral y punción suprapúbica. El transporte debe realizarse colocando hielo natural en un recipiente hermético y el frasco con la muestra dentro del mismo. En caso en que amerite refrigeración más prolongada debe emplearse hielo seco. Es de vital importancia impartir instrucciones claras y concisas, en forma oral y escrita a los pacientes, sobre la toma y conservación de las muestras. El análisis de la orina debe realizarse sin tardanza, máximo dos horas. Tiempos prolongados entre la recolección y el análisis pueden causar entre otras cosas las siguientes alteraciones: cambios en el color por oxidación o reducción de metabolitos; turbidez secundaria a multiplicación bacteriana y a la posible precipitación del material amorfo; utilización de la glucosa (glucólisis) por células y bacterias. Sin embrago, si hay glucosuria elevada, las bacterias y levaduras la convertirán en alcohol y ácidos y el ph descenderá. Por su parte, puede ocurrir la síntesis o catabolismo de nitritos; disminución de las cetonas que pueden ser utilizadas debido a la volatización de la acetona y al desdoblamiento del ácido acetoacético por bacterias; aumento del ph por amoníaco que se forma por el catabolismo bacteriano de la urea por enterobacterias, con pérdida de CO 2 ; sangre falsamente positiva, por actividad de peroxidasas de las bacterias; lisis de leucocitos, eritrocitos y cilindros en orina hipotónica y alcalina, (si el ph de la muestra es bajo y la densidad es elevada, > 1,015, el deterioro tarda más tiempo en ocurrir), oxidación de la bilirrubina y del urobilinógeno, los cuales pueden 5

6 disminuir su concentración, fundamentalmente, si existe exposición a la luz. Estos procesos pueden retardarse si la orina es conservada en el refrigerador. Identificación de la muestra En pacientes hospitalizados antes de obtener la muestra es indispensable identificarlo teniendo en cuenta el número de cama, de habitación o de historia clínica y confirmar personalmente con el paciente mismo (si esto es posible) sus nombres y apellidos. Las muestras de orina deben ser etiquetadas y rotuladas con la información siguiente: Nombre completo del paciente Número de historia clínica. Además, deben acompañarse de una solicitud médica, la cual debe contener los datos adicionales de identificación del paciente tales como: Género Edad Tipo de paciente (hospitalizado o ambulatorio) Fecha Hora de la recolección Tipo de muestra Medicamentos Posible diagnóstico Evaluación de la muestra Antes de proceder a cualquier prueba, es preciso evaluar en la muestra de orina su aceptabilidad. Las diversas consideraciones incluyen: etiquetado apropiado, una muestra óptima para la prueba solicitada y una buena conservación. Cada laboratorio debe tener y hacer cumplir unas normas escritas para la aceptación o rechazo de las muestras. En una muestra apropiadamente etiquetada debe constar el nombre completo del paciente, la fecha y el momento de la recolección. Adicionalmente cada institución tendrá sus criterios. 6

7 Comprende: volumen, aspecto, color, olor, densidad urinaria y espuma. EXAMEN FÍSICO Volumen El volumen de la orina no hace parte del Uroanálisis, sin embargo, es indispensable en aquellos exámenes que se realizan en orina de 12 y 24 horas (orina minutada) los cuales pueden resultar útil para el diagnóstico clínico. El volumen diario en un adulto sano es aproximadamente de 800 a 1500 ml y oscila entre 600 a 2000 ml. La orina nocturna no supera en general los 400 ml. Los niños de corta edad eliminan una cantidad de orina por kilogramo de peso 3 a 4 veces superior a la de los adultos. Durante la gestación la variación diurna normal, se invierte originando nicturia y orina diluida. Un volumen superior a 2000 ml en 24 horas recibe el nombre de poliuria. La disminución del volumen urinario se denomina oliguria y corresponde a una excreción menor de 500 ml al día. La anuria es la virtual suspensión completa de la formación de orina o volúmenes inferiores a 100 ml/ día. Aspecto La orina normal, limpia y reciente es usualmente transparente pero puede modificarse debido a la presencia de cristales provenientes de la dieta o metabolismos intermediarios, mucoproteínas, proteínas, bilirrubina o gérmenes infectantes. La tabla 1 muestra algunos cambios que puede exhibir la orina. Tabla 2. Cambios en el aspecto de la orina Cambio Causas Color y transparencia Incoloro Muy diluida debido a la incapacidad para concentrar la orina (lactantes, diabetes insípida, ADH inadecuada con algunos diuréticos), ingestión aumentada de líquidos Turbia Con frecuencia por precipitación de fosfatos en orina alcalina. Presencia de carbonatos, uratos, ácido úrico. Leucocitos dispersos y en acúmulo (piocitos), bacterias, levaduras, cristales, cálculos 7

8 Ahumada Hematuria microscópica, pocos eritrocitos, líquido prostático, espermatozoides; mucina, filamentos mucoso. Lechosa Abundantes leucocitos polimorfonucleares (PMN) (piuria). Quiluria (filariasis). Opalescente Grasa en la nefrosis; traumatismos por aplastamiento, en especial de huesos largos. Bacterias. Color El color de la orina normalmente es amarillo, sin embargo, puede exhibir una amplia gama de colores. Puede variar de amarillo pálido a ámbar oscuro según la concentración de los pigmentos urocrómicos (sulfuro que contiene sustancias de naturaleza desconocida producto de la oxidación del urocromógeno incoloro) y en menor cuantía, la urobilina (producto de degradación de la hemoglobina) y la uroeritrina. Se considera que la excreción de urocromo es proporcional al metabolismo basal y aumenta durante la fiebre, tirotoxicosis y la caquexia. El pigmento rosado (uroeritrina) puede depositarse en los cristales de ácido úrico o en los uratos (en sedimento como polvo de ladrillo) que no debe confundirse con los hematíes. Cuanto más pigmento tenga mayor será la intensidad del color. Aún dentro de la normalidad el color puede variar dependiendo de la ingesta de líquidos, alimentos o medicamentos. Cuando se abandona la muestra a temperatura ambiente, suele adquirir un color más profundo como consecuencia del viraje de cromógenos incoloros a compuestos coloreados. Las orinas patológicas presentan diferentes coloraciones, frecuentemente debidas a sangre, pigmentos biliares o metabolitos producidos por desórdenes metabólicos. Algunas de las sustancias que pueden influir en el color de las orinas se resumen en la tabla 3 Tabla 3. Causas de modificaciones del color de la orina Color Patológicas Alimentos o medicamentos Incolora o amarillo claro Nublado Diabetes insípida Fosfatúria, piuria, quiluria, lipiduria, hiperoxaluria Abundante ingesta de líquidos diluídos Dietas ricas en purina (hiperuricosuria) 8

9 Castaño Negroparduzco Azulverdoso Naranja Pigmentos biliares, mioglobina Pigmentos biliares, melanina, metahemoglobina Pseudomonas spp, ITU, biliverdina Pigmentos biliares Orina concentrada por hipermetabolismo (fiebre o hipertiroidismo), poca ingesta o pérdidas excesivas de agua (deshidratación). Urobilina en exceso por trastornos en el hígado o en la vesícula biliar (sin color hasta que se expone a la luz). Bilirrubinuria debida a trastornos del hígado o de la vesícula biliar Frijoles Levodopa, metronidazol, nitrofurantoína, algunos agentes antimalaria Levodopa, metildopa, metronidazol, imipenem, fenoles Amitriptilina, azul de metileno, riboflavina, clorofila (dentríficos), cimetidina (intravenoso) Fenotiazinas, fenazopiridina (Pyridium ) Roja Amarillo verdoso Hemoglobina (rojo brillante cuando es fresca) que resulta de hemólisis intravascular mayor a la que la haptoglobina puede fijar. Eritrocitos (traumatismos de las vías urinarias o del riñón o por contaminación menstrual). Porfirinas debidas a enfermedad genética (sin color hasta que se expone a la luz). Biliverdina por oxidación de la bilirrubina, posible hemólisis Remolachas, caramelos,ruibarbo y algunos que contienen tintura de fucsina Fenolftaleína, rifampicina, teofilina Fenindiona anticoagulante similar a la cumarina (Hedulin) Algunos fármacos: cáscara de sen; algunos alimentos: ruibarbo Olor Normalmente, la orina tiene un olor característico sui generis y se describe como urinoide, debido a la presencia de ácidos orgánicos volátiles o ser más fuerte en muestras concentradas sin que esto implique infección; puede modificarse como consecuencia de fármacos, alimentos, por la presencia de bacterias, metabolitos tales como la acetona, amoníaco o elevaciones de compuestos característicos de diversos errores innatos metabólicos. Algunos cambios fisiológicos y patológicos en el olor de la orina se describen en la tabla 4. 9

10 Tabla 4. Cambios en el olor de la orina Fisiológicos Fuerte, picante, vitamina B. Semejante a penicilina. Ingestión de multivitamínicos Penetrante, como a hierva. Espárragos Penetrante, amoniacal. Orina en descomposición. Patológicos Dulce, fuerte, denso (en ocasiones es descrito como placente Infección por Pseudomonas. o afrutado). Rancio, amoniacal. Acidosis urémica. A acetona, fuerte, nauseabundo, dulce. Cetonuria con acidosis diabética; ligera o sin olor, de En inanición. Picante, ácido, "a pescado" Desagradable incluso en orina fresca; cuando envejece es marcadamente amoniacal. A "ratón", a "caballo", olor a hongos en lactantes. A espárragos Infección bacteriana de vías urinarias. Fenilcetonuria. Insuficiencia hepática. Fecal. Fétido Urinoide Habitualmente por contaminación con heces; fístula rectal o con Escherichia coli Enfermedades supurativas del tracto genitourinario. Descomposición de la orina que contenga cistina o pus debido al desprendimiento de H 2 S Cantidad elevada de ácidos orgánicos volátiles 10

11 Espuma La orina normal promueve una ligera cantidad de espuma al ser agitada levemente. Cuando es abundante y permanente, indica existencia de sustancias tensoactivas que actúan como detergentes y disminuyen la tensión superficial (bilirrubina y proteínas). La coloración amarilla suele indicar la presencia de pigmentos biliares, no obstante, también puede ser debida a la ingesta de fenilazodiaminpiridina (Pyridium ). Si existe albúmina incrementada la orina será incolora y con espuma abundante. PESO ESPECÍFICO Los métodos empleados para determinar el peso específico son: densidad urinaria, refractometría, tiras reactivas y osmolaridad. Densidad urinaria (gravedad específica) Relación masa / volumen (peso de la orina al del agua destilada por debajo de las condiciones estándares). Refleja el peso de los solutos en la orina. En la actualidad la metodología más utilizada para evaluar la densidad urinaria es el empleo de tiras reactivas. El principio en el cual se fundamenta es el cambio de pk de algunos polielectrolitos en relación con la concentración iónica de la orina. Estos polielectrolitos contienen grupos ácidos que se disgregan de acuerdo con la concentración iónica. Al aumentar los iones aumentan los H + y estos se disocian, lo cual modificará el ph del indicador, que mide el cambio. A mayor acidez más densidad. Las orinas que presenten un ph de 6,5 se les debe realizar corrección de la densidad para lo cual es pertinente sumar 0,005 a la densidad obtenida. Los valores usuales de la densidad están influenciados por la edad y la ingesta de líquidos. La tabla 5 resume las cifras de referencia de la densidad relacionados con la edad y con la hidratación de los pacientes Tabla 5. Valores de referencia de la densidad urinaria, relacionados con la edad y con la hidratación de los pacientes Neonato (primeros días) 1,012 Lactantes 1,001-1,035 Adultos con una ingestión normal de líquidos 1,016-1,022 Hospitalizados con líquidos controlados 1,010-1,020 11

12 EXAMEN QUÍMICO El examen químico se practica mediante la utilización de química seca (tiras reactivas) para lo cual debe observarse cuidado especial en su uso. Deben ser almacenadas con un desecante en el recipiente original, ámbar, bien cerrado, a temperatura ambiente en un sitio fresco (no refrigerar), no usarlas después de la fecha de caducidad, no utilizarlas si están decoloradas, no cortarlas y cerrar bien el frasco inmediatamente después de extraerlas. La técnica a seguir incluye: mezclar bien la muestra (no agitarla), equilibrada con la temperatura ambiente, introducirla por completo en forma breve, eliminar el exceso de orina al extraer la tira de la muestra, colocándola en contacto por el borde con una superficie limpia y plana, comparando la reacción con los patrones del fabricante; realizarse bajo luz edecuada, en tiempo especificado y relacionar los hallazgos químicos unos con otros, además, con los exámenes físicos y microscópicos del Uroanálisis, finalmente practicar pruebas confirmatorias cuando esté indicado. Muchos estudios se han realizado para determinar si una marca comercial causa menos errores que otra, siendo los resultados no concluyentes. Sin embargo, han mostrado que la mayor variabilidad reside en el cuidado del bacteriólogo en las interpretaciones de las reacciones practicadas por comparación de patrones. Esta subjetividad, junto con la discriminación visual entre los colores, se ha corregido mediante el desarrollo de la automatización para la lectura de las tiras reactivas. Los instrumentos diseñados para este fin, miden la luz reflejada de una tira reactiva que se ha introducido de una forma manual en orina y luego colocada en el autoanalizador. La reflectancia de la luz de las tiras disminuye en proporción a la intensidad del color producido por la concentración de la sustancia en estudio. Por lo tanto, el instrumento compara la cantidad de reflexión de la luz con las concentraciones conocidas de los analitos y los reporta. La automatización no mejora la metodología química de las tiras, solo su reproducibilidad y la objetividad del resultado. El incremento del número de muestras para analizar en el mismo tiempo disponible a nivel laboral y la pobre calidad de las muestras resultado de largos tiempos entre la recolección y el análisis impide obtener precisión, confiabilidad y reproducibilidad en la realización del Uroanálisis. Esta situación ha impulsado nuevos enfoques y replanteamientos en las técnicas a seguir para mejorar la evaluación, mediante las pruebas químicas, de los elementos relevantes del sedimento en forma directa o por parámetros asociados. De estos planteamientos nace el concepto del Tamiz de tiras reactivas (Tabla 6) 12

13 Tabla 6. Protocolo rutinario del Uroanálisis UROANÁLISIS Screening químico negativo Tira reactiva Orina turbia. Síntomas clínicos Screening químico positivo No exámenes complementarios Análisis microscópico y/o cultivos Análisis microscópico y/o cultivos Tabla 7. Fundamentos de las pruebas químicas con química seca e interferencias con la reacción. Prueba Fundamento Falsos positivos Falsos negativos Leucocitos Las esterasas presentes en los granulocitos catalizan la hidrólisis de un éster aminoácido-derivado pirrólico liberando idroxi-5-fenilpirrol, el que a su vez, reacciona con una sal de diazonio, para generar un color púrpura. Detergentes oxidantes. Leucocitos vaginales. densidad. glucosa. proteína. Ácido oxálico. Gentamicina. Tetraciclina. Cefalexina. Cefalotina. Sangre La hemoglobina al igual que la peroxidasa, actúa catalizando la reacción entre el peróxido de hidrógeno y el 3, 3, 5, 5 tetrametilbencidina para generar un cromógeno oxidado con una gamma de colores que varia desde anaranjado, pasando por verde, hasta azul oscuro. Agentes oxidantes. Hipoclorito. Peroxidasa vegetal. Enzimas bacterianas. Contaminación menstrual densidad. ácido ascórbico. nitritos. proteínas. ph < 5. Captopril. 13

14 Proteína Error por proteína de los indicadores. Esta prueba es más sensible para albúmina. Densidad. ph Compuestos de amonio cuaternario. Detergentes. Cefalotina. concentraciones de sal. Nitritos Los nitratos de la dieta son reducidos a nitritos por las bacterias Gram negativas presentes en la orina. El principio de la prueba es la reacción de Griess, en que el nitrito a ph ácido, reacciona con una amina aromática para formar un compuesto de diazonio que luego reacciona con 3-hidroxi-1,2,3,4-tetra hidrobenceno-quinolina para generar un color rosa. ácido ascórbico Orina no retenida en vejiga durante 4 horas Abstención de nitratos Antibioticoterapia. Bacterias Gram (+). Levaduras. Estudios realizados por Winkel y col. (1974), Catertt y col (1981), Kutter y col (1982), entre otros, concluyen que leucocitos, eritrocitos, bacterias, cilindros, junto a la observación macroscópica de una orina recién emitida, pueden evaluarse indirectamente mediante el empleo de pruebas de química seca (Tabla 8 ). Tabla 8. Componentes del sedimento urinario detectables directa e indirectamente por el Tamiz de tiras reactivas Componentes del sedimento urinario detectado Parámetros en la tira reactiva Directamente Indirectamente Leucocitos Leucocitos Leucocitos lisados. Cilindros leucocitarios. Trychomonas. Sangre Eritrocitos Eritrocitos lisados. Hemoglobina libre. Mioglobina. Cilindros eritocitarios. Cilindros de hemoglobina. Cilindros de mioglobina. Proteína Cilindros granulosos Cilindros céreos 14

15 Nitritos Bacterias La mayoría de los leucocitos detectados en la orina son polimorfonucleares. Debido a que factores tales como ph alcalino o cambios en la densidad los lisan, su evaluación se hace mediante la reacción de las esterasas presentes en los granulocitos, con derivados pirroles y sales de diazonio. Como esta prueba no depende de las células intactas, resulta útil para evaluarlos. En algunas situaciones son atrapados en la matriz de cilindros, por lo tanto, es posible detectar también su presencia. En ocasiones, pueden asociarse con Trichomonas. La región de las tiras impregnadas con ortotoluidina y peróxido orgánico neutralizado desarrolla una coloración en presencia de hematuria (glóbulos rojos), hemoglobina (hemólisis), o mioglobina (proteína que almacena el oxígeno en músculo estriado y facilita su movimiento), o aspecto punteado cuando los hematíes están intactos. También cuando existen cilindros eritrocíticos, de hemoglobina, o de mioglobina. La evaluación de nitritos se hace mediante el método de Griess, en el cual las bacterias reducen los nitratos a nitritos, para la cual el paciente debe haber ingerido alimentos que los contengan. Su positividad ayuda a un diagnóstico temprano de bacteriuria significativa y asintomática, habitualmente, Gram negativos. Sin embargo, en estos casos, la leucocituria ayuda a sospechar infección. En ningún caso remplaza el urocultivo. Si se asocia la presencia de cilindros con proteínas de Tamm Horsfall o de origen glomerular denaturalizadas en moldes de la luz tubular, incluso las reacciones débiles en la zona de proteínas deberían considerarse como indicativo de un examen microscópico subsiguiente. El aspecto turbio de la orina, recién emitida, debe hacer sospechar aumento de leucocitos, eritrocitos, células epiteliales, bacterias y cristales. El examen macroscópico de la orina junto con el Tamiz de tiras reactivas ayuda a seleccionar aquellas muestras que requieren un análisis excautivo del sedimento, lo cual permitirá obtener resultados precisos, confiables y reproducibles en la realización del Uroanálisis. 15

16 EXAMEN MICROSCÓPICO El examen microscópico constituye una parte vital del análisis de orina de rutina. Es herramienta diagnóstica valiosa para la detección y evaluación de trastornos renales y del tracto urinario, así como de las enfermedades sistémicas. El valor del examen microscópico depende de dos factores fundamentales: del examen de una muestra adecuada y del entrenamiento del profesional que lo realiza. La importancia del análisis del sedimento no es materia en discusión. Su realización, sin embargo, exige estandarización, la cual comprende volumen inicial y final en la centrifugación, volumen de la gota a examinar, tamaño de la capa e igualdad en los campos visuales de un microscopio a otro. Preparación del sedimento y uso del microscopio Métodos recomendados Manuales Porta y cubreobjetos Cámara de recuento de Neubauer Sistema recomendado por el CLSI antes NCCLS Celda de Lectura Rápida de Precisión (Quick-Read ) Sistema MD Kova Semiautomatizados o automatizados Instrumentación diversa. Porta y cubreobjetos Utilizar volumen constante (10 a 12 ml), lo que proporciona cantidad conveniente para obtener una muestra representativa de los elementos formes. En casos de que no se cuente con estos volúmenes, debe realizarse dilución de la muestra con solución salina fisiológica hasta alcanzar la cantidad estandarizada. Esta solución es seleccionada, porque mantiene la integridad de la muestra. El ajuste de la dilución es principalmente importante en pacientes con condiciones patológicas que afecten la diuresis porque el factor de dilución proporciona la consistencia requerida para la evaluación cuantitativa de la enfermedad y de los cambios que ocurren a medida que se incrementa la diuresis. También en niños o adultos mayores. Centrifugar la orina (temperatura ambiente) en un tubo plástico o de vidrio (idealmente de centrífuga graduado) y con tapa de rosca (evita aerosoles) 16

17 adecuadamente limpio. Es fundamental observar el principio del equilibrio ; para ello se colocarán tubos de igual peso, forma y tamaño que los de la muestra en posiciones opuestas en la cabeza de la centrífuga, buscando una disposición geométricamente simétrica (utilizando tubos llenos de agua en caso necesario). La velocidad y el tiempo de centrifugación de la muestra deben ser constantes con una fuerza centrífuga relativa (FCR) de 400 durante 5 a 6 minutos. La FCR es la medida de la fuerza aplicada a una muestra dentro de una centrifuga. Permite comparar la fuerza a la que está sometida una partícula centrifugada en diferentes rotores. Esto se puede calcular a partir de la velocidad (rpm) y del radio rotatorio (cm), lo cual promoverá la cantidad óptima de sedimento con probabilidad menor de lesionar los elementos formes. Para corregir las diferencias en el diámetro de la cabeza de la centrífuga, se emplea la FCR [(fuerza relativa de centrifugación (gravedades)] en lugar de revoluciones por minuto (rpm). Es necesario conocer el radio de la cabeza de la centrífuga y aplicar una fórmula ó basarse en un nomograma ya establecido lo que permite relacionar condiciones de centrifugación en diferentes rotores. El valor de rpm mostrado en el tacómetro de la centrífuga se puede convertir a FCR empleando las fórmulas siguientes: Cálculo FCR 28,38 (N/1000) 2 Siendo R: radio del rotor en pulgadas N: revoluciones por minuto Otros cálculos utilizados son los siguientes: FCR = 1,118 x 10-5 x radio en centímetros x rpm 2 Nomograma Este nomograma consta de tres escalas: (A) radio de rotación, (B) revoluciones por minuto y (C) fuerza centrífuga relativa. Se traza una recta entre dos puntos conocidos (radio, RCF o RPM) en dos de las columnas. El tercer valor corresponde a la intersección de la recta con la tercera columna. 17

18 Ejemplo Para encontrar la fuerza relativa centrifugación a una distancia radial de 10 cm desde el centro de rotación al funcionamiento cuando la centrífuga opera a una velocidad de 3000 rpm, se debe colocar una regla en la carta y hacer coincidir los 10 cm del punto de la escala del radio giratorio con el número de revoluciones de 3000 en el punto la escala de velocidad (B). la fuerza centrífuga relativa (Escala, en este caso, 1000x gravedad. Similarmente, si el rcf deseado es conocido, la velocidad necesaria para un determinado radio de rotación puede ser valorada mediante la conexión de los dos puntos conocidos y la lectura de la intersección de la regla con la velocidad de la escala. C B A Figura 1. Nomograma para el cálculo de la Fuerza Centrífuga Relativa (RCF) Fuente: Comité Internacional Electrotécnico (IEC: International Electrotechnical Commission) Observar el aspecto del sobrenadante y del sedimento. Decantar el sobrenadante por inversión rápida. Una cantidad uniforme de orina, aproximadamente 0,5 a 1,0 ml, debe permanecer en el tubo para usarse en la resuspensión del sedimento. Resuspender el sedimento en la orina restante dando golpecitos suaves en la parte inferior del tubo para mezclarlo. Si éste es muy abundante, pueden añadirse 0,5 ml de orina. Los sistemas comerciales (por ejemplo, Kova ) proporcionan elementos para este propósito, como también, para obtener una suspensión del sedimento. Si se utiliza colorante, se debe añadir antes de agitar la muestra. 18

19 Usar un volumen constante de sedimento (50 μl), el cual se coloca en el centro de un portaobjeto con pipeta automática; ubicar suavemente una laminilla (22 x 22) cuidando que no queden burbujas. Si la cantidad de orina es excesiva puede empujar el sedimento fuera del área de visión al aplicar el cubreobjeto. Examinar después de 1 minuto de reposo. Cuantificar el número de elementos observados e informarlos por campo de alto poder (AP) o de bajo poder (BP). La forma de practicar el examen microscópico del sedimento debe ser constante, e incluir la observación de la totalidad de los campos de bajo (BP: 10x) y de alto poder (AP: 40x). Examinar primero la muestra en BP para valorar la composición general del sedimento y detectar cilindros y elementos de índice de refracción bajo. Cuando se amerite identificación precisa, cambiar al objetivo AP. Los cilindros tienden a ubicarse cerca de los márgenes del cubreobjeto, por ello, es recomendable explorar el perímetro de éste. Cuando se utilice microscopía de campo brillante, se debe tener cuidado de reducir la cantidad de luz para dar contraste adecuado (cerrar parcialmente el iris del diafragma y ajustar el condensador hacia abajo hasta lograr el contraste óptimo), porque algunos elementos tienen un índice de refracción similar al de la orina y no se observan bajo luz brillante. El enfoque continuo con el ajuste fino (tornillo micrométrico) ayuda a la detección de estos elementos. Los resultados se informan como un promedio de los campos examinados. La terminología exacta varía de acuerdo al método empleado, pero debe ser consistente en cada laboratorio. Las células epiteliales (renales, transicionales o bajas), eritrocitos (altos o dismórficos, bajos y fantasmas), leucocitos (dispersos y en acúmulo), cuerpos ovales, grasa libre, se informan en número por AP, y los cilindros en BP; los cristales, bacterias, levaduras, entre otros, en cruces por campo de alto poder. El término muy numeroso para contarse (TNTC: Too numerous to count) o incontables se puede emplear cuando se observen cantidades muy elevadas de elementos formes. En este caso, para descartar o confirmar la presencia de elementos formes es conveniente realizar dilución del sedimento. Cuando el número de ellos es bajo, se informará: número de elementos en todos los campos (TC). Para asegurar la exactitud del informe, los resultados del sedimento se deben correlacionar con los hallazgos físicos y químicos. Las muestras cuyo resultado no se correlacionen se deben revisar de nuevo en busca de errores técnicos y/o de trascripción. Después de realizar el examen químico, la muestra restante debe ser conservada hasta que el procedimiento se complete, de manera que las pruebas químicas o microscópicas puedan repetirse si fuese necesario, o poder efectuarse otros procedimientos, si así se considere. 19

20 Recuento con cámara de Neubauer Para efectuar el recuento con esta metodología colocar una gota de sedimento entre la cámara y la laminilla de cuarzo y ejecutar el recuento de los elementos figurados similarmente al de sangre periférica. Para dar el resultado numérico se emplea la fórmula universal de la cámara (FUC). Cálculos N de células contadas x Factor de dilución FUC= Profundidad de la cámara x cuadrados grandes de 1mm 3 de área Donde N de células contadas N total de células observadas en los cuadrados (no promediar) Factor de dilución Factor de dilución técnico empleado Profundidad de la cámara Cuadrados grandes de 1 mm 3 Constante: 0,1 mm Cuadrados utilizados en los 9 cuadrados grandes Ejemplo Suponga que realizó un recuento en los 25 cuadrados del cuadrado central de la cámara y observó 20 leucocitos y empleó una dilución 1:200. Cuántos leucocitos hay? Remplazando en la formula: 20 x 200 = leucocitos /mm 3 0,1 x 1 Procedimiento recomendado por el CLSI (ANTES NCCLS) El CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute antes NCCLS: National Committee on Clinical Laboratory Standards en el documento HS2-A: Proveedor realizado microscopia ( Provider-Performed Microscopy Testing : PPM); impartió las siguientes directrices para realizar el examen y el informe microscópico de la orina (2003). 20

21 Protocolo Medir el volumen de orina bien mezclado. Estandarizar la centrifugación (tiempo y velocidad). Medir el volumen del sedimento. Medir la cantidad de sedimento colocado en el portaobjetos. Emplear un cubreobjetos estándar (22 x 22 mm). Registrar la amplificación y el diámetro de AP del microscopio. Calcular y reportar elementos /ml. de orina. Ejemplo Usando 15 ml de orina: Diámetro del campo de alto poder: 0,35 mm. Área del campo de alto poder: 0,096 mm 2 (π D 2 /4). Área del cubreobjetos (22 mm x 22 mm) = 484 mm 2 o 484/0,096 = 5040 campos de AP. Desechar el sobrenadante y dejar en el tubo 0,25 ml. de sedimento. Resuspender la orina y medir 20 μl (0,02 ml) de sedimento. Colocar la orina en el portaobjetos y cubrir con el cubreobjetos o 5040 campos de AP 1,2 ml de orina 4000 c AP / ml Cálculos (recuento / campo de Ap ) x 4000 conteo / ml. Ejemplo (10 leucocitos / c AP ) x 4000 c AP /ml leucocitos / ml. MÉTODOS ESTANDARIZADOS COMERCIALES Algunos métodos de estandarización comerciales disponibles, son el de la lectura rápida de precisión (Quick-Read ) y MD Kova los cuales ofrecen exactitud, uniformidad y seguridad en el examen microscópico del sedimento. 21

22 Celda de Lectura Rápida de Precisión (Quick-Read ) Esta metodología utiliza láminas múltiples Quick-Read las cuales están diseñadas para ofrecer exactitud, uniformidad y seguridad en el examen microscópica del sedimento. El sistema está constituido fundamentalmente por: Láminas acrílicas de calidad óptica alta lo cual permite visualización perfecta; cada una con diez cámaras individuales marcadas para el montaje de diez muestras, cada una contiene 18 círculos, los cuales están premedidos y permiten albergar volúmenes específicos del sedimento. Tubos de centrífuga graduados con volumen hasta de 12 ml. Pipetas desechables que permiten retener 1 ml de muestra después de la decantación. Colorante de Sternheimer-Malbin. Tabla 9. Características de la cámara Área 63 mm 2 Área total 1 mm 2 Área 0,111 mm 2 Volumen 6,3 μl. Volumen total 0,1μL. Volumen 0,011 μl. Protocolo Recolectar la muestra de manera tradicional. Transferir 10 o 12 ml. de la muestra previamente mezclada a los tubos de centrífuga graduados. Realizar el análisis químico de la orina empleando las tiras reactivas según sus propias instrucciones. 22

23 Centrifugar la muestra durante 5 minutos con una fuerza centrífuga relativa (rcf) de 400 que corresponden a 1500 rpm. Introducir la pipeta de sedimentación dentro del tubo. Decantar el sobrenadante. La pipeta permite retener 1 ml de la muestra para resuspender el sedimento. Adicionar 1 gota del colorante de Sternheimer-Malbin, si lo prefiere, que facilita la visualización de los elementos formes. Resuspender el sedimento hasta tener una suspensión homogénea. Empleando la pipeta y por capilaridad transferir la muestra a la cámara. Realizar la lectura microscópica empleando el objetivo de 10x para cilindros y 40x para los otros elementos formes. Un círculo será visto en un campo completo. Determinar el promedio de elementos por círculo. Reportar los resultados como células/μl empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto. Para establecer el número promedio, contar los elementos en uno o más círculos y dividir el total contado por el número de círculos observados. Los mejores resultados son los obtenidos por el número del conteo total en todos los 18 círculos. Para muestras con volumen inferior a 12 ml. centrifugar sólo 6 ml. y multiplicar el número de células obtenido por dos antes de hacer los cálculos. En la cámara cada campo de AP equivale a 1 círculo. El valor de cada círculo equivale 0,0111μL. Ejemplo Si se utiliza 10 ml de orina, realizar promedio por campo de alto poder. Si el recuento fue de 30 en 10 campos el número de elementos será 3/ AP Si el volumen es de 12 ml, multiplicar el promedio de las células contadas por 0,8333 (10/12). Por ejemplo, si observó 40 células epiteliales en 10 círculos contados el número de células en AP será 3. Reportar los resultados como células/μl empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto. Cálculos Promedio x 0,

24 Valoración calculada del recuento Si se tomó un volumen de orina de 10 ml, del sedimento 1 ml y se realizó un recuento en 9 círculos, el número de elementos es 27. Utilizando los cálculos siguientes se comprueba el resultado. Cálculos Células/ μl de orina = 27 elementos X 1 círculo X 1000μL X 1μL = 27,27 9 círculos 0,011μL 1000μL Tabla 10. Valores de referencia (AP) Leucocitos 3-5/ μl Hematíes 0-2/ μl Sistema MD KOVA Procedimiento normalizado con las ventajas que ofrece la orina centrifugada, las cuales permiten obtener recuentos celulares con excelentes resultados, si se compara con otros métodos. Utiliza tubos de centrífuga graduados, pipetas y portaobjetos desechables. El recuento se realiza con una cámara desechable y un volumen constante. Esta técnica soluciona el inconveniente de los métodos no estandarizados utilizados de rutina en donde el vertido del sobrenadante no permite obtener un volumen constante de sedimento; además, las diferencias entre profesionales al ejecutarlo, hacen que la cantidad para resuspender sea extremadamente variable. Por ello, la variación del material celular cambiará por el volumen dejado para la resuspensión. Componentes del sistema Kova El sistema está constituido fundamentalmente por tres elementos: láminas (cada una con diez cámaras individuales marcadas para el montaje de diez muestras); tubos de centrífuga graduados para 12 ml de volumen y pipetas desechables que permiten retener 1 ml de muestra después de la decantación. Existen otros accesorios tales como, gradilla para diez tubos, colorante de Sternheimer-Malbin y controles (KOVA- TROL ) de tres niveles (normal, bajo y alto), los cuales deben ser tratados como una muestra. 24

25 Tabla 11. Características de la cámara Volumen total 6,6 μl. Profundidad 0,1 mm. Dimensiones 333 mm x 333 mm. Volumen cuadro 0,9 μl. Área cuadro pequeño Dimensiones: 0,333 mm x 0,333 mm= 0,111 Volumen cuadrado pequeño. 0,1 x 0,011= 0,0111. Protocolo 0,33 Recolectar la muestra de manera tradicional empleando preferiblemente recipientes de orina KOVA CUP con capacidad para 3½ oz. Transferir 12 ml de la muestra previamente mezclada a los tubos KOVA graduados. Realizar el análisis químico de la orina empleando tiras reactivas y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los controles deben ser tratados como una muestra de orina. Centrifugar 12 ml de orina en los tubos graduados KOVA con una fuerza centrífuga relativa (rcf) de 400 por 5 minutos que corresponden a 1500 rpm aproximadamente. Retirar los tubos de la centrífuga Kova teniendo cuidado de no resuspender el sedimento. Colocar los tubos en la gradilla KOVA Inserte una pipeta del sistema KOVA dentro del tubo Kova 25

26 Empujar la pipeta al fondo del tubo hasta que se asiente firmemente (en la graduación de 1 ml). Decantar el sobrenadante. La pipeta permite retener 1 ml de la muestra para resuspender el sedimento. Adicionar 1 gota del colorante de Sternheimer-Malbin, que facilita la visualización de los elementos formes. Resuspender el sedimento hasta obtener una mezcla homogénea. Transferir una pequeña cantidad de muestra en la cámara, apretando la pera de la pipeta. La muestra ingresará por capilaridad a la cámara. Retirar el exceso de espécimen con material absorbente. Realizar la lectura microscópica empleando el objetivo de 10x para cilindros y de 40x para los otros elementos formes. Reportar los resultados como células / μl empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto. Cálculo Para células/μl # elementos contados x Factor # cuadritos observados Factor = 1000 microlitros (s) x 1 microlitro (o). = 7,5 0,0111 microlitros (s) 1200 microlitros (o) Para muestras con volumen inferior a 12 ml centrifugar sólo 6 ml y multiplicar el número de células obtenido por dos, antes de hacer los cálculos. Cálculo del factor ml d e orina total ml de sedimento Volúmen cuadrado pequeño ul de orina total en el cuadro pequeño N de células Reporte / ul Factor ,0111 0, / ul 7, ,0111 0, / ul 9,0 10 0,5 0,0111 0, / ul 4,5 Orina sin diluir 1 1/ ul 90,0 26

27 Ejemplo Si 12 ml de orina total están contenidos en 1 ml de sedimento, cuantos ul de orina total hay en 0,0111 ul de sedimento que hay en un cuadro pequeño ml de orina total x volumen en cuadrado pequeño (μl) ml de sedimento Si hay 1 célula en 0,1332 ul (cuadro pequeño) cuántas células hay en 1 ul? 1 celula x 1uL μl de orina en el cuadro pequeño Tabla 12. Valores de referencia Tipo de célula Normal Límite Patológico Leucocitos 0-4 /μl 4-6 /μl > 6 /μl Eritrocitos 0-2 /μl 2-3 /μl > 3 /μl Recuentos celulares bajos Contar el total de un tipo específico de células contenidas en 10 círculos pequeños utilizando 10 ml de orina y 1 ml de sedimento. Cálculos Total de células Células/ μl 10 ml

28 Recuentos de celulares altos Contar el total de un tipo específico de células contenidas en 5 círculos pequeños utilizando 12 ml de orina y 1 ml de sedimento Total de células Células/ μl 12 ml

29 Cálculo alternativo Determinar el promedio de células por cuadrícula pequeña y luego utilizar los siguientes factores multiplicadores para calcular las células/ μl. Para el cálculo de las células / μl con el sistema Kova utilizando 10 cuadrículas: Para muestras no centrifugadas o homogenizadas, multiplicar el promedio de las células obtenido por cada cuadrícula por 90. Utilizando 10 ml y 1 ml de sedimento, multiplicar el promedio de las células obtenido por cada cuadrícula por 9. Utilizando 10 ml y 0,5 ml de sedimento, multiplicar el promedio de las células obtenido por cada cuadrícula por 4,5. Para 12 ml de orina y 1 ml de sedimento (sistema Kova), multiplicar el promedio de las células por cuadrícula x 7,5. Ejemplo de cálculo utilizando 12 ml de orina y 1 ml de sedimento Células Círculos Células totales Promedio de células Multiplicar por factor (7,5) Células /μl Leucocitos ,5 0,5 x 7,5 3,8 Eritrocitos ,4 1,4 x 7,5 10,5 Orina nativa (sin diluir ni centrifugar) Recuentos celulares bajos Contar el total de un tipo específico de células contenidos en 36 círculos pequeños o en cuatro cuadrantes completos. 29

30 Cálculos Total de células Células/ μl Células/ ml Recuentos celulares altos Contar el total de un tipo específico de células contenidos en 10 círculos pequeños Total de células Células/ μl Células/mL

31 Cálculo alternativo Células/ μl Multiplicar el promedio de células por 90 Células/ ml Multiplicar el promedio de células por Métodos automatizados Existen dos sistemas para automatizar la microscopía basados en diferentes tecnologías: Análisis de imágenes tomadas por una videocámara y lámpara strobe, que detiene el movimiento del fluido para detectar los elementos presentes y a continuación realiza comparación clasificándolos en doce categorías. Se requiere revisión para células epiteliales y cilindros patológicos. Un sistema basado en el principio de citometría de flujo, en donde se procesa orina no centrifugada. Dismorfismos Los eritrocitos pueden experimentar alteraciones morfológicas permanentes e irreversibles, lo cual se conoce con el nombre de dismorfismo y surgen en el sedimento de pacientes con afecciones renales glomerulares (Fairley y Birch 1982). Los hematíes dismórficos experimentan las más variadas deformaciones en el riñón tales como formación de vesículas, defecto y ruptura de la membrana en uno o varios puntos que permiten la salida del contenido celular el cual queda incluido en una especie de burbuja; en ocasiones auténticos agujeros celulares que dan lugar a restos de membranas arrugadas, divertículos, trozos de hematíes que recuerdan los poiquilocitos, células en rodete como dianocitos, hematíes planos con bordes festoneados, hasta formas totalmente amorfas (gránulos), si bien los más frecuentes son los hematíes en forma de donut. El cambio continuo de ph y de la osmolalidad en el sistema tubular es considerado responsable de las modificaciones en la forma 31