Uso del pez cebra como animal modelo para estudios de nanotoxicidad

Transcripción

1 Uso del pez cebra como animal modelo para estudios de nanotoxicidad Sandra Rainieri JORNADA NANOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN 1 Junio 2015 AZTI 6/2/2015 1

2 Toxicidad NP metálicas In vitro Estrés oxidativo Inflamación Apoptosis Mecanismo de acción no siempre claro Faltan protocolos estandarizados y resultados uniformes Pocos estudios in vivo y a largo plazo AZTI 6/2/2015 2

3 Modelos animales para estudios de toxicidad Los ensayos de toxicidad son obligatorios para cada aditivo / nuevo ingrediente Los procedimiento estándar incluyen ensayo in vitro e in vivo Los estudios con animales son caro, complicados, low-throughput y éticamente problemáticos Solución: utilizar sistemas alternativos para llevar a cabo ensayos iniciales. Invertebrados Embriones AZTI 6/2/2015 3

4 Pez cebra (Danio rerio) Fácil y económico de mantener Reproducción externa Embriones transparente Herramientas genética Test alternativos MODELO RECONOCIDO Biología del desarrollo Enfermedades humanas Desarrollo de medicamentos Eco-toxicología Investigación alimentaria Acuicultura 5 hpf 48 hpf Zebrafish Alimentación espontanea (ANIMAL) 5 hpf 120 hpf AZTI 6/2/ AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados. AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.

5 Estudios in vivo alternativos al uso de animales Inflamación- cepa transgénica que expresa mieloperoxidasa (mpx). Estrés oxidativo tinción con fluoróforo que detecta producción de ROS. Además, estimación daño oxidativo (peroxidación lipidica, daño proteinas, ADN.). Apoptosis tinción con fluoróforo que detecta muerte celular programada. AZTI 6/2/2015 5

6 Estudios in vivo alternativos al uso de animales Absorción / Bioacumulación Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 López-Serrano et al., Nanotoxicology., 2014 Espresión genica genes individuales o mediante array. AZTI 6/2/2015 6

7 Fases de un estudio de nanotoxicidad Caracterización físico química de las NPs con diferentes técnicas (a T0 y durante el experimento). Definición de un protocolo de exposición adecuado. Evaluación del absorción y distribución en el sistema biológico utilizado (durante el experimento). Evaluación de end-points de toxicidad específicos. AZTI 6/2/2015 7

8 Estudio sobre la toxicidad de AgNPs comerciales Objetivos del trabajo: 1) Definir un protocolo adecuado para la evaluación de la toxicidad de NPs metálicas con embriones de pez cebra. 2) Clarificar si la toxicidad se debe a NPs o a liberación de Ag +. 3) Verificar si existen biomarcadores de toxicidad comunes entre diferentes tipos de AgNPs. AZTI 6/2/2015 8

9 Fase 1: definición protocolo exposición OECD 236 (FET test) 96h Protocolo 1 4hpf-48hpf Protocolo 2 72hpf-120hpf Protocolo 3 96hpf-120hpf nag coloidal 48h 48h 24h Absorción y distribución Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 AZTI 6/2/2015 9

10 Embryo water Fase 2: NPs vs Ag + nag coloidal Polytech & Net y AgNO 3 Agua desionizada Toxicidad aguda Expresión génica Ag + (complejos con aniones) = NO efecto Ag + (NO complejos) = efecto 100 % Mortality nag deionized water nag embryo water ppm 1 ppm 5 ppm nag concentration Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 AZTI 6/2/

11 NP vs Ag + AgNPs vs AgNO 3 (agua desionizada) Análisis transcriptómico Genes inducidos/ reprimidos Procesos biológicos Rutas metabólicas!! NO genes comunes!! Mecanismo diferente 1 proceso común: cellular macromolecule metabolic process Mecanismo diferente 1 en común Metabolismo lipídico Mecanismo diferente AZTI 6/2/

12 NP vs Ag + Toxicidad de las AgNPs debida al tamaño nano y a la liberación de iones. El mecanismo de acción de las AgNPs depende del medio y de la concentración. AZTI 6/2/

13 Fase 3: Comparación efectos diferentes AgNPs Nanoplata coloidal Polytech & Net nm % Mortality LC ppm AgNPs SIGMA + citrato ppm 1 ppm 5 ppm 7 ppm 11 ppm 15 ppm % Mortality LC ppm nm ,093 ppm 0,1875 ppm 0,375 ppm 0,75 ppm 1,5 ppm 3 ppm Suplemento alimentario nm Mortality % Más toxico! LC ppm 0 AZTI 6/2/ ,05625 ppm 0,1125 ppm 0,225 ppm 0,45 ppm 0,9 ppm

14 Comparación efectos diferentes AgNPs Expresión diferencial de genes seleccionados Products NPs Ag mt il1β slc16a9a opn1mw2 ucp3 nag colloidal Polytech & Net NPs Ag Sigma Supplement nag up-regulated (p<0.01) down-regulated AZTI 6/2/

15 Comparación efectos diferentes AgNPs El nivel de toxicidad y las rutas metabólicas afectadas dependen del tipo de AgNPs AZTI 6/2/

16 Conclusiones En estudios de nanotoxicidad es fundamental definir un protocolo de exposición adecuado. El medio de disolución influye en la toxicidad de las AgNPs. La toxicidad de las AgNPs es debida en parte al tamaño nano y en parte a la liberación de Ag +. No se han detectado biomarcadores específicos para la detección de toxicidad de los tres tipos de las AgNPs estudiadas. AZTI 6/2/

17 Equipo toxicidad y pez cebra AZTI Alex Barranco Nadia Conlledo Monica Martinez Santos Maider Olasagasti Sandra Rainieri Nagore Egurrola M. Jose Sierra Amaia Mendizabal Miguel Ángel Pardo AZTI 6/2/

18 Gracias!! Colaboradores Departamento de química analítica Universidad Complutense de Madrid Financiación Analítica, transcriptómica y proteómica para la evaluación de la toxicidad mecanismos y bioacumilacion de contaminantes alimentarios y ambientales (ATP-ToxBio). CTQ C Evaluación de los efectos tóxicos de la presencia de nanopartículas, medicamentos y compuestos orgánicos persistentes en alimentos (SAFEFOOD) DaReTest-El pez cebra como modelo animal en investigación alimentaria: evaluación de la seguridad y de la efectividad de ingredientes y modelo de acuicultura SEGURFISH: Nuevas metodologías para garantizar la seguridad alimentaria de productos pesqueros AZTI 6/2/

19 T Txatxarramendi ugartea z/g Sukarrieta, Bizkaia (SPAIN) Herrera Kaia, Portualdea z/g Pasaia, Gipuzkoa (SPAIN) Astondo Bidea, Edificio 609 Parque Tecnológico de Bizkaia Derio, Bizkaia (SPAIN) AZTI 6/2/