Estructura cromosómica

Transcripción

1 Estructura cromosómica

2 ADN y nucleosomas el nucleosoma está compuesto por un octámero de proteínas histónicas existe una zona de ADN libre entre los nucleosomas llamada ( linker )

3 Nucleosomas, segmento linker e histona H1 sitio de corte de las nucleasas en el ADN

4 Estructura del nucleosoma: colas de histonas H3 H4 H2B H3 H4 H2A H2B DNA H2A

5 Compactación de la cromatina ADN cromosoma metafásico

6 El ADN de Homo sapiens (Proyecto Genoma Humano) 46 moléculas lineales de ADN en otros tantos cromosomas 3 x 109 pares de bases (3 mil millones de pares de bases) 0.1 % de variación en el genoma de dos seres humanos tomados al azar lo que corresponde a 3x 106 (3 millones de pares de bases) La mayor parte de esta variación consiste en simples cambios de un nucleótido por otro El 90% de las variantes se encuentra distribuida en todos los continentes; sólo 10% de la misma prepondera en determinadas regiones geográficas Las escasas diferencias observadas restan sustento al concepto de razas humanas desde el punto de vista biológico

7 Scaffold cromosómico (extracción de histonas)

8 Cariotipo humano normal 46,XY

9 Cromosomas humanos: Bandas Q (Quinacrina)

10 Cromosomas humanos: Bandas C

11 Detección de heterocromatina constitutiva en cromosomas en metafase

12 Cromosomas humanos: Bandas G

13 46,XX

14 Cromosomas humanos: Bandas R

15 Bandas cromosómicas G- y R-

16 Cromosomas humanos: Bandas T

17 Cromosomas humanos: Bandas NOR

18 Tipos de bandas Bandas C- ADN altamente repetido (>1x106 copias), sin genes Bandas G- Ricas en A-T, replicación tardía, LINEs, genes Bandas R- Ricas en G-C, replicación temprana, SINEs, genes Bandas T- Muy ricas en G-C, alta densidad génica, teloméricas Bandas NOR Organizadores nucleolares, síntesis de ARN ribosómico, cromosomas acrocéntricos (grupos D y G)

19 Idiograma de cromosomas humanos: bandas G-, R-, C- y regiones NOR

20 Modelo de Saitoh y Laemmli (1994)

21 A C Clasificación B cromosómica D

22 Tipos de sondas Se emplean diferentes tipos de sondas para unirse a las metafases (M), núcleos interfásicos (I) o ADN fibrilar (F) en estudio: Locus específicas (secuencias de copia única) (M, I, F) Cromosomas enteros (WCP) (secuencias de copia única y repetidas) (M, I) Secuencias repetidas (M, I) Centroméricas (ADN satélite alfa) Teloméricas (repetido TTAGGG) SINEs, LINEs, etc. (Alu, L1, etc.)

23 Origen de las sondas WCP Clasificación cromosómica por citometría en flujo Microdisección cromosómica (láser) + DOP-PCR WACP Región/banda Microdisección cromosómica + DOP-PCR (m-bands) Locus específico Secuencias clonadas en diferentes vectores + PCR: YAC Vectores Tamaño máximo del inserto 1000kb BAC 300 kb PAC (P1) 100 kb Cósmidos 45 kb

24 Microdisección de HSA 7p

25 FISH: áreas de aplicación Identificación de AC numéricas y estructurales en citogenética clínica Identificación de microdelecciones y microduplicaciones Diagnóstico prenatal (WCPs de cromosomas 13, 18, 21, X e Y) Análisis citogenético/molecular de tumores incluyendo: AC, genes de fusión (BCR/ABL) y amplificación génica (Her2/NEU) Mapeo génico Estudios cariotípicos evolutivos Radiobiología, dosimetría biológica (3 WCPs + extrapolación) Mutagénesis experimental Si bien el FISH se empleó inicialmente a nivel metafásico, su aplicación en núcleos interfásicos es cada día más importante.

26 cromosomas humanos FISH con sonda pancentromérica y contratinción con yoduro de propidio

27 SONDAS TELOMERICAS EN CROMOSOMAS HUMANOS

28 mband mband is based on region-specific partial chromosome paints (PCP) combined with quantitative colour ratio analysis. Each PCP is labelled using a unique fluorochrome combination and partly overlaps with its neighbouring one. The resulting fluorescence intensity pattern along the chromosome axis shows a continuous change of colour ratios. Metasystems GmbH, Germany

30 Mapa comparativo humano - ratón X Ratón Hudson et al. (2001) Nature Genetics 29:

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32 Cromatina Eucromatina: se compacta solamente durante la mitosis o meiosis. Rica en genes, alta expresión, replicación temprana y riqueza en pares de bases G-C. Heterocromatina facultativa: posee genes que se inactivan en forma facultativa de acuerdo al tipo celular (genes tejido-específicos) o por compensación de dosis (X inactivo o cuerpo de Barr). Replica tardíamente y es rica en A-T. Heterocromatina constitutiva: siempre inactiva y muy compacta, no posee genes (salvo la β heterocromatina) y replica al final de la fase S. En general se localiza a nivel centromérico en los cromosomas.

33 Cromatina Eucromatina Heterocromatina Alta densidad génica Baja o nula densidad génica Escasa compactación Elevada compactación Bandas R/T Bandas G/C Rica en G-C Rica en A-T Histonas H3 y H4 acetiladas Histonas H3 y H4 desacetiladas Islas CpG no metiladas Islas CpG metiladas Sensible a DNasa I Poco sensible a DNasa Transcripción activa Transcripción inactiva Replicación temprana Replicación tardía Nucleosomas: orden laxo Nucleosomas: orden regular me H3Lys4 me H3Lys9, meh3lys27, HP1, HP2

34 Acetilación de histonas La acetilación de lisinas en la región terminal ( colas ) de las histonas reduce la afinidad con el ADN facilitando el acceso de la maquinaria transcripcional. El proceso de acetilación de histonas se halla regulado por la acción combinada de acetiltransferasas (HATs) y deacetilasas (DACs). Cumple un rol fundamental en la regulación de la actividad génica y probablemente como mecanismo epigenético de memoria celular para la expresión génica. La metilación de lisinas puede influir en la compactación del ADN e inducir inactivación génica.

35 Detección de la histona H4 acetilada (verde) en cromosomas durante la metafase mitótica empleando anticuerpos específicos antih4ac unido a un fluorocromo

36 El ciclo celular S/G2 G1/S

37 Micrografía electrónica de linfocito estimulado (A) y granulocito (B) humanos heterocromatina N c nu nu c N eucromatina FIG. 3. Electron microg raph of a s timulated lymphocyte (A) and a human g ranulocyte (B ). (A) The nucleus (N) has many decondens ed chromatin fibers throug hout its volume. C ondens ed fibers are found at the nuclear periphery. (B ) The hig hly lobed nucleus has a thin filament of chromatin connecting the lobes (g reen arrow). Larg e amounts of condens ed chromatin are found clos e to the nuclear envelope and in clumps or chromocenters (c) internal to the nucleus. Mag nification, 35,000. Leitch AR (2000) Microbiol Mol Biol Rev 64 (1):

38 Modelo de cromatina interfásica Heterocromatina facultativa Eucromatina Compartimento interior Nucleolo Eucromatina Replicación temprana Activa transcripción H4+a, G-C Dominio cromosómico N N Cromocentros Bandas RBandas GBandas C- Heterocromati na constitutiva Compartimento periférico Heterocromatina constitutiva y facultativa Replicación tardía Baja o nula transcripción H4+a, A-T Sadoni et al. (1999) JCB 146: (modificado)

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40 Dominios cromosómicos nu Célula de jacinto de Sudáfrica (Strasburger 1905) Dominio o territorio cromosómico detectado por hibridación in situ fluorescente Cremer T, Cremer C (2006) European J Histochemistry 50 (3):

41 Arquitectura nuclear En el núcleo celular los cromosomas ocupan territorios (TCs) o dominios definidos rodeados de un compartimento intercromosómico (CI). La distribución pueder ser radial (vertebrados) o tipo Rabl (plantas, levaduras, Drosophila) en la cual los telómeros y centrómeros ocupan regiones opuestas del núcleo. Los cromosomas ricos en genes ocupan el centro nuclear; los pobres en genes se ubican a nivel periférico. A su vez, los cromosomas pequeños tienden a ser centrales y los de mayor tamaño periféricos. Los loops con genes activos se localizan en la superficie de los TCs y los inactivos en regiones más profundas. En el CI se encuentran los cuerpos nucleares (PML, Cajal, OPT, splicing speckles, etc.) complejos enzimáticos y factores necesarios para la replicación o reparación del ADN y la transcripción y splicing del ARN.

42 Distribución de los cromosomas humanos 18 (pobre en genes) y 19 (rico en genes) Y Z X X 5 µm Cremer y Cremer (2001) Nat Rev Genet 2:

43 Conservación evolutiva de la posición de TCs La posición periférica del cromosoma 18 ( genes) y central del 19 ( genes) se observa en otros primates b c Human (HSA) d Chimpanzee (PTR) e Orangutan (PPY) White-handed gibbon Tanabe et al. (2002) PNAS 99 (7): (modificado)

44 Tamaño cromosómico y posición de TCs Se hibridó la metafase con un pool de sonda para cromosomas grandes (1-5+X) C o r t e s y otro pool para los pequeños (17-20) Fibroblastos humanos Microscopía confocal Cremer et al. (2001) Chrom Res 9:

45 TCs de macrocromosomas de pollo (hibridación in situ fluorescente multicolor) m Cada macrocromosoma ocupa un territorio o dominio definido en el núcleo M MACs MICs Los macrocromosomas homólogos residen en distintas regiones del núcleo Disposición radial de los TCs Cremer y Cremer (2001) Nat Rev Genet 2:

46 TCs Fibroblastos humanos (G0) Bolzer et al. (2005) PLoS Biology 3 (5):

47 Detección de los TCs de HSA 6p y 6q mediante sondas específicas de brazo cromosómico A B C q p p q p p q q p p p p q q Células amnióticas Dietzel et al. (1998) Chrom Res 6:

48 TCs y subdominios del X activo e inactivo Metafase A C E ANT2 ANT3 Xa X ANT3 Xi Interfase B D F TC TC H S A Xa Xi Cremer y Cremer (2001) Nat Rev Genet 2:

49 Linfocitos G0 Fibroblastos G0 Localization of Alu Sequences in Nuclei of Fibroblasts and Lymphocytes (A) Karyotype from a female human lymphocyte (46, XX). Chromosomes were hybridized with a probe for Alu sequences (green) and counterstained with TOPRO-3 (red). Alu sequences were used as a marker for chromosomes and chromosome bands rich in genes. (B and C) Confocal serial sections were obtained from a human G0 fibroblast nucleus (B) and a G0 lymphocyte nucleus from peripheral blood (C) after 3D FISH with the Alu probe (green) and TOPRO-3 counterstaining (red). As examples, sections made at the top, middle, and bottom of the nuclei (separated by about 1 lm) are shown from left to right. Scale bars, 5 µm. (D) Enlarged confocal mid-section through the human G0 fibroblast nucleus. Scale bar, 5 lm. (E) Enlargement of the boxed sector in (D). The color image in the middle reflects the merged images left (TOPRO-3 counterstaining, red) and right (Alu staining, green). Arrows indicate chromatin rich in Alu sequences expanding into the TOPRO-3-stained, Alu-poor nuclear rim. Scale bar, 2 µm. Fibroblastos G0 Localización cromosómica y nuclear de secuencias Alu (Homo sapiens) Bolzer et al. (2005) PLoS Biology 3 (5): Alu TOPRO-3

50 Localización de la cromatina hiperacetilada H4+a en el núcleo Superposición Replicación H4+a temprana Células CHO tardía final Sadoni et al. (1999) J Cell Biology 146 (6):

51 Intermingling of CTs Branco and Pombo (2006) PLoS Biology 4:

52 CTs/IC Dynamics Nuclear pore transcription Barr body Xi * (inactive Xchromosome) IC h SubDomain intermingling C CTa IC h Heterochromatin h CTc CTb N IC Chromosome domains h Nucleolus (high throughput transcription) CTd h * Folle GA (2007) Mutation Research Reviews (in press) Chromocenter (heterochromatin) IC Interchromatin Compartment (nuclear bodies)

53 CTs and the interchromatin (IC) compartment CI + CN active chromatin loop protruding into the IC p inactive genes arm domains active genes q h h Position effect Genes Genes Cremer and Cremer (2001) Nat Rev Genet 2: (modified)

54 Dominios nucleares Spector DL (2003) Annu Rev Biochem 72:

55 FIN

56 Hyperacetylated (H4+a) chromatin is preferentially damaged by clastogenic agents H4+a A G-bands B Folle GA (2007) Mutation Research Reviews (in press)

57 46,XY

58 Territorios cromosómicos (TCs) La técnica de FISH utilizando sondas para cromosomas enteros (WCP probes) ha demostrado que cada cromosoma se halla compactado en un territorio (TC) o dominio definido a nivel nuclear. Empleando sondas para varios cromosomas se ha observado que, en general, estos territorios no se superponen entre sí. 10µm