Aplicación de la técnica FISH para el diagnóstico molecular de las enfermedades de origen genético. Dr. C. Luis A. Méndez Rosado Investigador Titular

Transcripción

1 Aplicación de la técnica FISH para el diagnóstico molecular de las enfermedades de origen genético. Dr. C. Luis A. Méndez Rosado Investigador Titular

2 Métodos inmunohistoquímicos

3 Análisis Detecta cromosómico hasta 5 Mb

4 FISH Fluorescence In Situ Hybridization

5 La hibridación in situ (ISH) es una tecnología para el examen y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos (< 5 mb) ya sea en células en interfase, cromosomas o tejidos. En 1969 Joe Gall and Mary Lou usaron la hibridación DNA-RNA para localizar los genes que codifican para el RNA ribosomal en los cromosomas acrocéntricos. Primer paso importante. En un principio el marcaje fue radioactivo, pero en los años 80, se fueron desarrollando técnicas mas inocuas basadas en el marcaje con fluorocromos y surgen comercialmente las sondas

6 Que es una sonda? Secuencia de nucleótidos marcada con fluorocromos que se unen a un sitio del ADN, que necesitamos identificar.

7 PRINCIPIO DE FISH Muestra Desnaturalización de DNA y de sonda complementaria DNA T A C T T A T G A A T A C T T A T G A A U A C U U A T G A A U A C U U A T G A A Hibridación Sonda Fluorocromo U A C U U A U G A A U A C U U A T G A A Sonda U A C U U A U G A A

8 Microscopio y software adecuado Microscopio con lámpara de mercurio y un sistema de filtros que permiten pasar diferentes longitudes de onda de la luz. Software para el procesamiento de las imágenes captadas ( Cytovision, Metasystem)

9 Filtro barrera o de emisión Espejo dicroico Refleja una longitud de onda selectivamente y deja pasar la luz emitida por la excitación del fluorocromo 100x PlanApo Filtro de excitación Muestra

10

11 Proceso de captura de la imagen Usando un filtro específico para cada fluorocromo, se van capturando imágenes crudas, que el software superpone una sobre otra,para al final obtener una única imagen coloreada y ya procesada.

12 Filtro DAPI

13 Filtro Aqua (Crom 18)

14 Spectrum green (crom X)

15 Imagen procesada por la unión de las 3 anteriores

16 Las sondas de FISH son altamente específicas para su secuencia blanco en el ADN y por tal motivo se clasifican en: Sondas de secuencias repetitivas del ADN. Sondas de secuencias únicas. Sondas para tinción completa cromosoma.

17 Cada sonda debe ser utilizada para cumplir objetivos diferentes Sondas de secuencias repetitivas Es utilizada para el marcaje de los centrómeros, zonas teloméricas, regiones de heterocromatina constitutiva. Es de utilidad tanto en cromosomas como en células en interfase, para la detección de aneuploidias, translocaciones, deleciones o duplicaciones de estas regiones, que involucran la heterocromatina.

18 Sondas de secuencias repetitivas 9 21 Y Secuencias Repetitivas DNA a-satélite Centrómeros DNA b-satélite Acrocéntricos R. pericentromérica 1, 3 y 9 Satélite III Telomérico 1q12, 15p11.2, Yq12 pter y qter

19 18 Y X 18

20

21 Caso con duda diagnóstica

22 Se detectan 2 centrómeros del 18

23 Sondas locus específicas Son utilizadas para la identificación de las regiones dianas en el cromosoma. Cada secuencia de nucleótidos de estas sondas hibrida para un gen o grupo de genes. Son de utilidad en la identificación de aneuploidías, duplicaciones, deleciones y translocaciones que impliquen la región diana. Se utilizan mayormente en cromosomas.

24 Sondas de secuencia única LSI TTAGGG 3 a 20 kb Secuencia Subtelomérica Secuencia Única 21 q22.13-q22.2

25

26

27

28

29 Sondas LSI utilizadas en oncohematológia Tomando en cuenta secuencias del ADN implicadas frecuentemente en eventos de ruptura-reunión (en enfermedades malignas), se han diseñado diferentes sondas que llevan implícitas los genes cercanos a los puntos de ruptura Ej: la fusión de los genes BCR-ABL en la t(9;22) frecuentemente hallada en leucemias

30 Color Dual, Fusión Unica 2R2V 1R1V1A Normal Anormal Color Dual, Break-apart 2A 1R1V1A Normal Anormal inv(16)(p13q22)

31 Sondas LSI que detectan amplificación o poliploidías de genes Útiles en la detección de la progresión de las enfermedades malignas Amplificación Poliploidia

32 Tinción completa del cromosoma.. Sky o M- FISH Hibridizan el cromosoma entero, son útiles en el estudio de cromosomas marcadores, translocaciones y aneuploidias en células en metafase. No se deben usar en células en interfase, donde la cromatina esta dispersa en el núcleo.

33 Multi-FISH o SKY Y Fluorocromo X Se mezclan 5 fluorocromos en proporciones diferentes, obteniéndose diferentes matices de grises, que el software le otorga diferentes coloraciones.

34 An example of a normal M-FISH analysis of a human metaphase is shown in the figure below.

35

36 Rx- FISH Provee una mejor resolución por set haploide en los cromosomas humanos. Cada segmento del cromosoma se colorea con una tonalidad diferente, lo que permite detectar aberraciones no solo intercromosomas, si no también intracromosómicas.

37

38 CGH (Hibridación comparativa de genomas)

39 Se emplea cuando se desconoce la secuencia diana de ADN que está afectada y se sospecha que esta es de pequeño tamaño, solo es útil para detectar deleciones o ganancias de ADN.

40 Su empleo comenzó con el estudio de células tumorales, los resultados obtenidos pueden identificar previamente regiones desconocidas involucradas en la progresión del cáncer y el estudio de genes candidatos. Se pueden identificar duplicaciones o deleciones crípticas, no visibles para el ojo humano.

41 every test sample.

42 A B C Ganancia Pérdida p q n=12

43 Para detectar pequeñas regiones de ganancias o de pérdidas de ADN es utilizado un programa computarizado medidor de la intensidad relativa de fluorescencia, detecta la variación sistemática del patrón de colores entre el rojo y el verde creando un modelo estadístico, el cual es empleado como referencia para detectar posibles ganancias o pérdidas en el ADN.

44

45 Casos interesantes diagnosticados en nuestro laboratorio

46

47

48

49

50

51

52

53 La sonda PW-A Marcaje del cromosoma 15 Centrómero q12 q 11 q 13 q25

54 Diagrama del marcador INV DUP 15 q11-q13 cen q12 q12 cen Hasta el 2008 existían 160 casos reportados en la literatura

55 Aplicaciones del FISH Detección de diferentes aneuploidias cromosómicas en diagnóstico prenatal o el diagnóstico preimplantación Determinar el origen de un cromosoma marcador o en anillo. Diagnóstico e investigaciones de enfermedades malignas. Estudios de retraso mental asociados a regiones cripticas Mapeo genético

56 CONCLUSIONES Con la aplicación de todas estas técnicas la citogenética ha avanzado, no tan solo en el diagnóstico de aberraciones cromosómicas si no también en el campo de las investigaciones básicas, ampliándose mucho mas su espectro de acción.

57 Impacto La mayor revolución que se produce al introducir el FISH en nuestro medio es que da la posibilidad de realizar el diagnóstico de la enfermedad o alteración genética en cualquier fase del ciclo celular y en múltiples tejidos.

58 Muchas Gracias