Detección por FISH de anomalías cromosómicas: el estado del arte en la Argentina. Nasazzi, N.B.; Marañon, D. y Muhlmann, M.C.

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1 Detección por FISH de anomalías cromosómicas: el estado del arte en la Argentina Nasazzi, N.B.; Marañon, D. y Muhlmann, M.C. Presentado en: VI Congreso Regional de Seguridad Radiológica y Nuclear. Lima, Perú, 9-13 noviembre 2003

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3 DETECCIÓN POR FISH DE ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS: EL ESTADO DEL ARTE EN LA ARGENTINA Nasazzi, N.B. 1 ; Marañon, D. 2 y Muhlmann, M.C. 2,3 1 Autoridad Regulatoria Nuclear 2 Comisión Nacional de Energía Atómica 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Argentina RESUMEN En los últimos 10 años se produjo una fructífera asociación entre la citogenética y la biología molecular que concluyó en el desarrollo de la técnica de Hibridación in situ por Fluorescencia (FISH) cuyo ámbito de aplicación excede el de la investigación básica, siendo de uso en aplicaciones de diagnóstico médico (genética constitutiva y somática) y en dosimetría citogenética. Hasta ahora en Argentina se implementa la técnica con distintos propósitos utilizando sondas de ADN marcadas con fluorocromos de procedencia comercial. Igual situación se plantea en el resto de América Latina. Como resultado del esfuerzo conjunto del CONICET (Consejo nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas), la CNEA (Comisión Nacional de Energía Atómica) y la colaboración de la ARN (Autoridad Regulatoria Nuclear), que cuenta con el único laboratorio de dosimetría citogenética del país, se ha puesto a punto y llevado a condición escalable a la demanda de los potenciales usuarios la síntesis de Sondas de ADN por medio de la técnica de Microdisección de cromosomas y marcadas con Fluorocromos, (SMF), adecuada para cualquier especie. De este modo se ha logrado obtener en el país sondas de ADN para FISH con distintos propósitos, con un costo del orden de 6 veces menor que las disponibles actualmente en el mercado, además de posibilitar la transferencia de tecnología a los restantes países de Latinoamérica que así lo requieran. En el presente trabajo, se describen los lineamientos generales de la técnica y se realizan tanto un análisis de costos de sondas nacionales vs. sondas comerciales como de requerimientos mínimos y factibilidad para desarrollar la técnica de FISH utilizando estas sondas en los países de la región. ABSTRACT The combined application of cytogenetics and molecular biology allows the identification, through Fluorescence in situ hybridization technique (FISH), of numerical and structural chromosomal in genetic alterations. The application fields are: the basic genetic research in man and other species, medical diagnosis and prognosis related to constitutive and somatic cell genetics and biological dosimetry. Up to now, in our country as in Latin America, FISH is performed using commercial DNA probes. In a joint effort between CONICET, CNEA and ARN, Argentina has concluded the project to develop at scale the Synthesis of fluorescent probes by Chromosome Microdissection (SMF), suitable for any species lowering costs to about one sixth of the equivalent commercial probes. In this work we present the general protocol, the cost analysis comparing with commercial probes and the minimum requirements for technology transfer and implementation of this technique in Latin American countries. Key words: molecular cytogenetics, FISH, DNA probes synthesis, microdissection. La citogenética molecular hoy Desde que en 1970 Pardue y Gall publicaron el atrayente trabajo sobre la topología del ADN satélite de ratón, consagrando así la técnica de Hibridación in situ e iniciando la era de la citogenética molecular, mucho camino se ha recorrido hasta nuestros días y, sin duda, la Hibridación in situ por Fluorescencia (FISH) (1) aventaja a cualquier otro tipo de marcación del ADN a hibridar. 361

4 Tanto la investigación básica como aplicada son ámbitos de uso tanto de FISH como otras técnicas relacionadas: Pintado de cromosomas (WCP), Hibridación genómica comparativa (CGH) (2), Regiones de tinción homogénea (HSR) (3). De esas múltiples aplicaciones, usando tanto suspensiones celulares como cortes de tejidos en estadíos de interfase y metafase, destacaremos algunas que se han puesto a punto y utilizado en Argentina en la última década. 1- Radiobiología: estudios básicos de radiosensibilidad a través de aberraciones cromosómicas y Dosimetría Citogenética (4) (Figura 1A) Se utilizan suspensiones celulares en metafase 2- Genética somática: Diagnóstico y pronóstico de alteraciones génicas (amplificaciones y deleciones, incluyendo CGH y HSR) y aneuploidías cromosómicas relacionadas con cáncer. En suspensiones celulares y tejidos en parafina; en metafase e interfase. 3- Genética constitutiva: Diagnóstico prenatal, postnatal y preimplantacional (5) (análisis de célula única). En suspensiones celulares y tejidos en parafina; en metafase e interfase.( Figura 1 B) 4- Caracterización citogenética de especies no humanas (6) y estudios evolutivos intra e interespecíficos (7) En suspensiones celulares en metafase. (Figura 1C-E) Para acceder a las ventajas que ofrece la aplicación de la técnica de FISH y aquéllas relacionadas sólo existen dos vías posibles: a) adquirir la sonda de interés comercialmente, si se encuentra disponible en el mercado b) sintetizar y marcar la sonda a partir de la secuencia de ADN que se requiere. El proceso de síntesis de una sonda puede iniciarse con dos fuentes de materia prima: 1- bibliotecas de secuencias de ADN, generalmente cedidas por cortesía por laboratorios de la especialidad; 2- Microdisección de cromosomas (parcial o total) (8) La Argentina encaró un Proyecto en citogenética molecular, en base a un Convenio CONICET- CNEA cuya primera fase, concluida con la colaboración de la ARN, consistió en el desarrollo e implementación a escala de la demanda potencial del mercado nacional y regional de Síntesis de Sondas mediante la técnica de Microdisección marcadas con Fluorocromos (SMF) a fin de adquirir independencia de la provisión comercial de sondas y extender el campo de investigación y aplicación a otras especies. El protocolo de SMF El siguiente esquema resume el proceso de síntesis y marcado de sondas de cromosomas: 362

5 En breve: 1- Metafases de cromosomas humanos son preparadas por técnicas citogenéticas estándar sobre cubreobjetos de tamaño 24 x 60 mm. 2- Se realiza bandeo G con el fin de identificar el cromosoma o región cromosómica requeridos. 3- Se disecta el cromosoma (total o parcialmente según el interés) mecánicamente por medio de un micromanipulador adosado al microscopio invertido, utilizando agujas de disección extendidas en el laboratorio con un estirador de pipetas. 4- Los fragmentos microdisectados se depositan en un tubo de PCR. 5- Una vez recogida la suficiente cantidad de fragmentos, se amplifica por medio de un método especial de PCR llamado rampa PCR, utilizando cebadores universales (DOP). De este modo se asegura que el método es utilizable para cualquier especie. 6- El producto de la primera PCR se verifica en una corrida electroforética en gel y si es aceptable se procede a su marcación con un fluorocromo (sonda directa) o un hapteno (sonda indirecta). En este caso se utilizó dutp marcado con el hapteno dioxigenina (DIG). La marcación también se realiza por PCR con amplificación regular sin rampa. 7- En la aplicación de esta sonda para FISH, la detección indirecta de la marcación se realiza mediante un Ac anti-dig de ratón y un segundo Ac anti-ratón conjugado, en este caso con el fluorocromo FITC Verificación de especificidad y eficiencia El producto obtenido se verifica en cuanto a su especificidad y eficiencia utilizándoselo en un FISH estándar. La especificidad consiste en chequear que la sonda marque solamente el fragmento o cromosoma seleccionado. La eficiencia se mide evaluando el brillo de la sonda y la ausencia de marcación de fondo, una vez terminada la hibridación de prueba. En el presente trabajo se procedió a verificar especificidad y eficiencia de la sonda sintetizada a partir del cromosoma 3 humano (Figura 3F) mediante su uso en la dosimetría citogenética por FISH-WCP de cultivos de linfocitos irradiados con 1 y 2 Gy de radiación γ de Co 60 en el Laboratorio de Patrones secundarios de la ARN. Los resultados obtenidos indican que no se observa diferencia significativa entre la frecuencia de translocaciones recíprocas y dicéntricos por célula para el cromosoma 3 (F P ) y la extrapolada al genoma completo (F G ) observadas y las esperadas a partir de las curvas de calibración propias para radiación γ de Co 60 realizadas con sondas comerciales y contrastadas con las curvas de calibración correspondientes para Bandeo G, desarrolladas por la ARN (9) Análisis de costos Se describen a continuación los requerimientos mínimos equipamiento e insumos para implementar el protocolo de SMF en un laboratorio equipado para FISH. Equipamiento Micromanipulador adosado a Microscopio invertido Termociclador Cuba de electroforesis Equipo para estirar pipetas Cámara de adquisición de imágenes (optativa) Insumos Los insumos se expresan en N de PCR posibles por unidad de compra de cada insumo. 363

6 Insumos N PCR Taq DNA polymerasa 50 Termosequenase 100 dntps 50 Cebadores DOP 50 COT 50 PCR OIL 200 dutp (spectrum green/ orange) 25 Microtubos 1,5 ml 1000 Microtubo pared delgada 0,5 ml 1000 Microtips ul/ 1000 unidades 100 Cubre y portaobjetos varios 100 La experiencia ha indicado que el análisis de costos debe dividirse en dos etapas: Desarrollo y Producción. En ambos casos se calcula el costo en número de PCRs, sin marcación (PCR) y con marcación (PCR m ). El análisis se realiza para la síntesis de sonda de 1 par cromosómico (en el presente trabajo el par Nª 3) en la moneda en que se adquieren los insumos no nacionales (U$S) con fines de normalización Desarrollo: partiendo de 10 sets de microdisección Primera línea 10 PCR Eficiencia 50% 5 PCR m Segunda línea 1 PCR y 1 PCR m Verificación de especificidad Tercera línea 1 PCR Marcación final 1 PCR m Subtotal 1 = 12 PCR + 7 PCR m Optimización concentración y marcación = 2 X Subtotal 1 Subtotal 2 = 24 PCR + 14 PCR m Producción: para obtener sonda suficiente para 100 ensayos, son necesarias aproximadamente 12 PCR m Subtotal 3 = 12 PCR m Costo PCR = U$S 15 Costo PCR m = U$S 45 TOTAL Desarrollo + Producción: U$S = 1,530 por 100 ensayos Considerando un valor aproximado de U$S 650 (FOB) por kit para 20 ensayos de sonda comercial de un par cromosómico, resulta clara la ventaja económica del método. Más aún, dado que la etapa de desarrollo sólo se realiza una vez, las SMF en la etapa de producción tienen un costo alrededor de seis veces menor que las sondas comerciales equivalentes. 364

7 En conclusión, la Argentina se encuentra en condiciones, no sólo de proveer sondas de cromosomas enteros o parciales de cualquier especie para satisfacer las demandas del mercado nacional y latinoamericano a menor costo que las actualmente disponibles en el mercado, sino de efectuar la transferencia de tecnología para la implementación del protocolo de SMF en los laboratorios de la región que así lo requieran. REFERENCIAS 1. Lucas, J.; Awa, A.; Straume, T.; Poggensee,M.; Kodama, Y.; Nakano, M.; Ohtaki, K.; Weier, H.; Pinkel, D.: Gray, J. and Littlefield, G. (1992) Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol. 62: Hermsen,M.; Meijer, G.; Baak, J.; Joenje, H. and Walboomers, J. (1996) Comparative genomic hybridization: A new tool in cancer pathology. Hum. Pathol. 27: Xu, J.; Tyian, T.; Cedrone, E.; Savaraj, N. and Wang, N. (1996) Detection of 11q13 amplification as the origin of a homogeneously staining region in small cell lung cancer by chromosome microdissection. Genes Chromosomes Cancer 17: IAEA, (2001) Cytogenetic analysis for Radiation dose assessment. A manual. Technical Report Series Nº Verlinsky, Y.; Ivakhnenko, V.; Evsikov, S.; Wolf, G.; White, M.; Lifchez, A.; Kaplan, B.; Moise, J.; Valle, J.; Ginsberg,N.; Strom, C. and Kuliev,A. (1999) Preimplantational diagnosis of common aneuploidies by the first and secons polar body FISH analysis J. Assist. Reprod. Genet. 15: Ulsh, B.; Muhlmann-Díaz, M.C.; Whicker, F.; Hinton, J.; Congdon, J. and Bedford, J. (2000) Chromosome translocation in turtles: a biomarker in a sentinel animal for ecological dosimetry Rad. Res. 153: Muhlmann - Díaz, M.C.; Ulsh, B.; Whicker, F.; Robinson, J. and Bedford, J. (2001) Conservation of chromosome 1 in turtles over 66 million years Cytogene. Cell Genet. 92: Meltzer, P.; Guan, X. and Trent, J. (1992) Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application Nature Genetics 1: Nasazzi, N.; Di Giorgio, M. and Taja, M.R. (2000) Retrospective dosimetry using chromosome painting Proceed. IRPA X Congress Vol. I

8 A B C D E F Figura 1. (A) Translocación en linfocito humano WCP con sonda comercial (Spectrum Orange, WCP 1,2,4) (B) FISH en tejido humano en parafina (60X) Disgenesia gonadal, sonda comercial centrómeros del X e Y (C) Plásmido introducido como nuevo cromosoma en célula de mosquito Aedes albopictus (D) FISH Telómeros humanos (sonda comercial) hibridados en metafase de tortuga T. Scripta (E) WCP con sonda SSM cromosoma 1 en pez Patí, cortesía Alejandro Laudicina (F) WCP con SSM cromosoma 3 humano. 366