72538 Técnicas de Microscopía

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1 72538 Técnicas de Microscopía Número de créditos Plan 2001: 4,5 Número de créditos ECTS: Carácter (troncal T, obligatoria Ob, optativa Op): OP Titulación: totes Departamento: PVCF Cuatrimestre: SEGUNDO Idioma: Página Web: Dossier electrónico (Si/No): SI Profesor coordinador: Ana Maria Jauset Berrocal Otros profesores: Pilar Muños Odina PROGRAMA DE CLASES TEÓRICAS I. MICROSCOPÍA ÓPTICA. Tema 1. Introducción. Historia y evolución del microscopio. Características y diferencias entre los diferentes tipos de microscopios. Tema 2. Fundamentos ópticos. La naturaleza de la luz. Lentes: concepto y tipos. Formación de la imagen a través de las lentes. Tipos de aberraciones de las lentes y su corrección. Elementos que lo constituyen. Tipos de microscopio compuesto: elementos que los caracterizan y diferencias entre ellos. El microscopio láser confocal: características generales y aplicaciones. Tema 3. El microscopio óptico. Partes del microscopio. Objetivos: tipos y características. Ocular: tipos y características. El condensador: tipos y características. Formación de la imagen en el microscopio compuesto. Diferentes tipos de microscopios ópticos: características diferenciales y aplicaciones. El microscopio láser confocal: características generales y aplicaciones. Tema 4. Métodos histológicos (1) Características y obtención del material para ser observado a través del microscopio óptico. Técnicas para la realización de preparaciones temporales de material procedencia diversa.

2 Tema 5. Métodos histológicos (2) Métodos para la obtención de preparaciones permanentes. Tipos, características e importancia de las diversas técnicas de fijación e inclusión del material. Obtención de cortes: tipos de micrótomos. Tipos de colorantes y métodos de tinción más usuales. Montaje: materiales que se utilizan y finalidad del mismo. II. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Tema 6. Introducción a la microscopía electrónica. Iluminación con electrones. Interacciones de los electrones con la muestra. Óptica electrónica: lentes electromagnéticas. Aberraciones de las lentes para electrones. Microscopios electrónicos: tipos y características. Tema 7. El microscopio electrónico de transmisión. Componentes del TEM. Cañón de electrones. Lentes condensadoras. Porta muestras. Lente objetivo. Sistema de aumento. Sistema de visualización de la imagen. Mecanismos responsables del contraste. Modos de formación de la imagen. Tema 8. El microscopio electrónico de barrido. Componentes del SEM. Cañón de electrones. Lentes condensadoras. El sistema de deflexión. Porta muestras. Sistema de detección de las distintas emisiones. Sistema de visualización de la imagen. Modos de operación. Tema 9. Procesamiento de muestras para microscopía electrónica de transmisión. Características generales de la Fijación. Tipos de fijadores. Métodos de fijación. Tipos de fijación. Características generales de la Deshidratación. Métodos de deshidratación. Características generales de la Infiltración. Tipos de resinas. Esquema general de inclusión. Ultramicrotomía. Métodos de contraste. Montaje. Microfotografía. Tema 10. Procesamiento de muestras para microscopía electrónica de barrido. Características generales de la Fijación. Tipos de fijación. Características generales de la Deshidratación. Métodos de desecación de las muestras. Montaje de las muestras. Métodos para hacer las muestras conductoras a la electricidad.

3 Tema 11. Introducción a la microscopiá electrónica analítica. Microanálisis de rayos X. Espectroscopía por pérdida de energía de los electrones (EELS). Microdifracción o difracción por haz convergente. Tema 12. Introducción a las técnicas de inmunocitoquímica en microscopía electrónica. Estrategias generales. Trazadores electrodensos. Procesamiento de los tejidos. Inmunomarcaje y alternativas de procesamiento tisular. Procedimientos de inmunomarcaje. PROGRAMA DE CLASES PRÁCTICAS Práctica nº 1. Inclusión de material y obtención de cortes. Objetivo: realizar inclusiones en parafina y manejar el microtomo rotatorio. Para realizar las inclusiones se utilizará tanto material vegetal como animal. Previamente éste se tendrá que fijar, y deshidratar. Una vez realizada la inclusión, se deben obtener los cortes del material incluido y para ello se utiliza el microtomo rotatorio. Posteriormente estos cortes se desparafinaran y se realizará una tinción simple o combinada, dependiendo del material y de las estructuras que se pretendan poner de relieve. Práctica nº 2. Utilización de los diferentes tipos de microscopía óptica. Objetivo: Ver las diferencias que existen en las observaciones realizadas al utilizar: campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y luz polarizada. Se realizaran preparaciones temporales, y cada una de ellas se observará mediante campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y luz polarizada, de forma que se pueda comparar las observaciones realizadas y determinar la más idónea. Práctica nº 3. Utilización de un soporte informático acoplado al microscopio óptico. Objetivo: Aprender a utilizar un programa informático específico para microscopía.

4 En ésta práctica, y con las preparaciones realizadas en la práctica nº 1, se realizaran tomarán una serie de datos: distancias entre estructuras, tamaño, etc. y captación de imágenes, utilizando el programa informático del equipo multimedia del Departamento. Práctica nº 4. Inclusión en resina y manejo del ultramicrotomo. Objetivo: Aprender a manipular el material para ser observado con el microscopio electrónico de transmisión. En esta práctica se realizarán inclusiones en resina LR-White. Para ello se utilizarán distintos medios de encapsulación, con el objeto de que se pueda comparar entre ellos y posteriormente se utilizará el ultramicrotomo, del SUIC de Microscopía de la Universidad, para la obtención de cortes. Práctica nº 5. Preparación de muestras para el SEM. Objetivo: Conocer el proceso que se debe seguir para poder visualizar distinto tipo de material en el microscopio electrónico de barrido. La práctica consiste en utilizar los procesos de secado crítico y metalización, para preparar el material que será observado en el microscopio de barrido. Práctica nº 6. Observación de muestras al microscopio electrónico. Objetivo: Manejar el TEM y el SEM. En está práctica (que se realizará en el SUIC de Microscopía), se observará el material preparado en las prácticas 5 y 6. También se verá el funcionamiento y las aplicaciones del microscopio láser confocal. BIBLIOGRAFIA Bibliografía básica AGAR,A.W Future developments of the electron microscope. En Glauert, A.M. Practical methods in electron microscopy, N.H.P.C. Amsterdam. BARGALLÓ, R El microscopi electrònic de transmissió aplicat a la biologia, introducció, descripció, maneig i optimització. Barcelona PPU. CASARTELLI, J.D Microscopia teórico-pràctica - Urmo. Bilbao

5 d AMBROGIO de ARGÜESO, A Manual de técnicas en histología vegetal - Hemisferio Sur. Buenos Aires CURTIS, J microtecnia VEGETAL. Editorial Trillas, Mexico. GONZALEZ, R.: PAREJA,R.: BALLESTEROS, C Micoscopía Electrónica. EUDEMA UNIVERSIDAD, Madrid. HARRIS,N.: OPARKA, K.J Plant Cell Biology. A Practical Approach. Oxford University Press. LOCQUIN, M Manual de microscopía - Labor. Barcelona MARTOJA, R.: MARTOJA, M Histologie animal - Masson. París SHEPPARD, C.J.R., SHOTTON, D.M Confocal laser scanning microcopy. BIOS Scientific Publishers, Oxford. Bibliografía complementaria BERLYN, G.P.: MIKSCHE, J.P Botanical Microtechnique and Cytochemistry. The Iowa State University Press. Ames, Iowa. DYKSTRA, MICHAEL J A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum Press cop. HALL, J.L.: HAWES, C Electron Microscopy of Plant Cells. Academic Press Limited, London. ISENBERG, G Modern Optics, Electronics, and High Precision Techniques in Cell Biology. Spinger-Verlag Berlin Heidelberg, KUMAR, A.: ARCHANA, S Chomosome techniques theory and practice - Butterworths MULVEY, T.: SHEPPARD, C.J.R Advances in optical and electron microscopy - Academic press ROBARDS, A.W.: WILSON, A.J Procedures in electron microscopy - John Wiley and sons SAMPEDRO, A Técnicas de fluorescencia en microscopía y citometría - Servicio de Publicaciones de la Universidad de Oviedo