Predicción de Promotores y Elementos Reguladores
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- Susana Andrea Torregrosa Soriano
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1 Pedro Eduardo TORRES JIMÉNEZ CINVESTAV-Zacatenco 09 de julio del 2013 Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
2 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
3 Introducción 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
4 Introducción Introducción Un problema relacionado con la predicción de genes es la predicción de promotores Los promotores son elementos de ADN localizados en los sitios donde inician los genes Funcionan como sitios de unión en el proceso de transcripción de genes Consisten en ARN Polimerasa y Factores de Transcripción Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
5 Introducción Introducción Estos elementos de ADN regulan directamente la expresión de los genes Los promotores y los elementos reguladores son determinados tradicionalmente por análisis experimental Este proceso es extremadamente laborioso y tardado La predicción computacional de promotores y elementos reguladores es útil para sustituir este proceso Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
6 Introducción Introducción Sin embargo sigue siendo una tarea difícil: Los promotores y los elementos reguladores no están claramente definidos y son muy diversos. Cada gen parece tener una única combinación de motivos reguladores que determinan una única expresión temporal y espacial. Los promotores y los elementos reguladores no pueden ser traducidos en secuencias de proteinas para incrementar la sensibilidad de su detección Los sitios de los promotes y elementos reguladores que se predicen son por lo general cortos (6 a 8 nucleótidos) y pueden ser encontrados fácilmente debido al azar, lo que resulta en altos índices de falsos positivos Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
7 Promotores y elementos reguladores en procariotas 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
8 Promotores y elementos reguladores en procariotas Promotores y elementos reguladores en procariotas En bacterias la transcripción es iniciada por una ARN polimerasa la cual es una enzima multi-subunidad La subunidad e.g σ 70 de la ARN polimerasa es la proteina que reconoce las secuencias específicas hacia arriba del gen y permite al resto de la enzima unirse La secuencia hacia arriba donde la proteina σ se une constituye la secuencia del promotor Esta incluye los segmentos de secuencia ubicados a 35 y 10 bp hacia arriba desde el sitio de inicio de la transcripción, también conocidos como 35 box y 10 box respectivamente Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
9 Promotores y elementos reguladores en procariotas Promotores y elementos reguladores en procariotas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
10 Promotores y elementos reguladores en procariotas Promotores y elementos reguladores en procariotas Por ej. Para la subunidad σ en Escherichia coli, la -35 box tiene una secuencia consenso de TTGACA y la -10 box tiene una secuencia consenso de TATAAT En adición a la ARN polimerasa también hay un número de proteinas que facilitan el proceso de transcripción conocidas como factores de transcripción Estas se unen a secuencias específicas de ADN para mejorar o inhibir las funciones de la ARN polimerasa Las secuencias de ADN específicas a las cuales los factores de transcripción son unidos se llaman elementos reguladores Estos elementos reguladores pueden unirse en la cercanía del promotor o unirse a centenas de bp del promotor Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
11 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
12 La transcripción tiene una capa extra de complejidad, un conjuntno de tres distintos tipos de ARN polimerasa Cada tipo de polimerasa transcribe diferentes conjuntos de genes RNA polimerasa I y III son responsables de la transcripción de RNA ribosomal y ARNt respectivamente RNA polimerasa II es responsable exclusivamente de transcribir genes de proteinas codificantes (o síntesis de ARNm) Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
13 A diferencia de los procariotas, donde los genes forman un operón con un promotor compartido, cada gen eucariótico tiene su propio promotor El núcleo de varios promotores eucarióticos es la llamada TATA-box, ubicada a 30 bp hacia arriba desde el sitio de inicio de transcripción, teniendo un motivo consenso TATA(A/T)A(A/T) Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
14 Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
15 Sin embargo, no todos los promotores eucarióticos contienen la TATA-box Las TATA-boxes son usadas como un indicador de existencia de algún promotor Varios genes tienen una secuencia iniciadora única, la cual es rica en piridiminas con un consenso (C/T)(C/T)CA(C/T)(C/T). Este sitio coincide con el sitio de inicio de transcripción Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
16 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Algoritmos para predicción Algoritmos ab-initio Predicciones para procariotas Predicciones para eucariotas Métodos basado en huelas filogenéticas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
17 Algoritmos para predicción Pueden ser categorizados en: Basados en ab-initio: Hacen predicciones escaneando secuencias individuales Basados en similitud: Hacen predicciones basadas en alineamiento de secuencias homólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
18 Algoritmos para predicción Basados en perfiles de expresión: Usan perfiles construidos de un número de secuencias de genes coexpresadas del mismo organismo Las predicciones por similitud son también conocidas como huellas filogenéticas Debido a que la ARN polimerasa II transcribe los ARNm, la mayoría de estos algoritmos se basan en la predicción de promotores en ARN polimerasa tipo II Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
19 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Algoritmos para predicción Algoritmos ab-initio Predicciones para procariotas Predicciones para eucariotas Métodos basado en huelas filogenéticas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
20 Algoritmos ab-initio Este tipo de algoritmos predice promotores y elementos reguladores procarióticos y eucarióticos, basados en patrones de secuencias características Algunos son basados en señales, dependiendo del tipo de promotores tales como las TATA-boxes, otros dependen de información, por ejemplo en frecuencias de hexámeros Las ventaja de este tipo de algoritmos es que la secuencia puede ser aplicada como tal sin la necesidad de obtener información experimental. Una limitante es la necesidad de entrenamiento, la cual hace la predicción específica para ciertas especies Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
21 Algoritmos ab-initio Además este tipo de método tiene dificultad en descubrir nuevos motivos La manera convencional de detectar promotores o elementos reguladores es a través de patrones de secuencias representados por expresiones regulares o con PSSM Puntajes de coincidencia o no coincidencia en todas las posiciones de la matriz son sumados. Este simple método tiene dificultades para detectar entre promotores reales y aleatorios, y por lo tanto genera altos índices de falsos positivos Una nueva generación de algoritmos han sido diseñados para tomar en cuenta el orden de correlación de múltiples características usando funciones discriminantes, redes neuronales o HMMs. Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
22 Algoritmos ab-initio Para mejorar la especificidad, algunos algoritmos excluyen regiones de búsqueda y se centran en regiones de subida (0.5 a 2.0 kbp) donde comunmente se localizan promotores De esta manera la predicción de promotores y la predicción de genes están acopladas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
23 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Algoritmos para predicción Algoritmos ab-initio Predicciones para procariotas Predicciones para eucariotas Métodos basado en huelas filogenéticas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
24 Un esquema de puntaje fue desarrollado para asignar operones Pedro Eduardo con Torres distintos Jiménez (CINVESTAV) niveles Predicción de confianza de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Predicciones para procariotas Un aspecto único de los promotores en procariotas es la determinación de operones, debido a que los genes que contienen un operón comparten un promotor común Es por esto que la predicción de operones es la llave para la predicción de promotores procarióticos Hay métodos disponibles para la predicción de operones. El más acertado es un conjunto de reglas simples desarrolladas por Wang et al (2004) Este método depende de dos tipos de información: Orientación de los genes y distancia intergénica entre un par de genes y vínculos conservados entre genes basados en análisis genómico comparativo
25 Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
26 Predicciones para procariotas Este método identifica operones acertadamente, lo que facilita a la predicción de promotores BPROM FindTerm Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
27 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Algoritmos para predicción Algoritmos ab-initio Predicciones para procariotas Predicciones para eucariotas Métodos basado en huelas filogenéticas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
28 Predicciones para eucariotas El método de ab-initio para predecir promotores y elementos reguladores en eucariotas depende de buscar las secuencias de entrada para hacer un matching con los patrones consenso de promotores conocidos. Los patrones consenso son determinados experimentalmente, posteriormente compilados en perfiles y almacenados en una base de datos para escanear secuencias desconocidas y encontrar patrones similares conservados Este método tiende a generar altos índices de falsos positivos Para incrementar la especificidad de la predicción, se ocupa una característica unica de los eucariotas, la cual es la presencia de islas CpG Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
29 Predicciones para eucariotas Se sabe que varios genes de vertebrados se caracterizan por una alta densidad de dinucleótidos CG cerca de la región del promotor, traslapándose con el sitio donde la transcripción es iniciada Combinando el enfoque de islas CpG con otras señales del promotor la confiabilidad de la predicción es mejorada Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
30 Predicciones para eucariotas CpGProd Epopine Cluster-Buster FirstEF McPromoter TSSW CONPRO Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
31 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Algoritmos para predicción Algoritmos ab-initio Predicciones para procariotas Predicciones para eucariotas Métodos basado en huelas filogenéticas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
32 Métodos basado en huelas filogenéticas Se ha observado que los promotores y elementos reguladores de organismos estrechamente relacionados como los del humano y el ratón son altamente conservados. La conservación es tanto a nivel de secuencia y a nivel de organización de los elementos La identificación de elementos de ADN conservados no codificantes que tienen roles funcionales se conocen como huellas filogenéticas Este método puede ser aplicado tanto a procariotas como eucariotas La selección de organismos para comparación es una importante consideración para este tipo de análisis Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
33 Métodos basado en huelas filogenéticas Si el par de organismos seleccionados son estrechamente relacionados, como el del humano y el chimpancé la diferencia entre las secuencias puede no ser suficiente para filtrar elementos funcionales De otra manera, si los organismos tienen una distancia evolutiva larga como el humano y el pez, habrá divergencia evolutiva muy grande, los promotores y otros elementos funcionales serán indetectables La ventaja de este tipo de algoritmos es que no es necesario el entrenamiento de los modelos probabilísticos Potencial de descubrir nuevos motivos reguladores Una limitante es la restricción de las distancias evolutivas de secuencias ortólogas Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
34 Métodos basado en huelas filogenéticas ConSite rvista PromH Bayes aligner FootPrinter Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
35 Métodos basados en perfiles de expresión 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
36 Métodos basados en perfiles de expresión Métodos basados en perfiles de expresión Los genes con perfiles de expresión similares son considerados coexpresados. La coexpresión se refiere al hecho de tener en común promotores y elementos reguladores Si esto es válido, las secuencias de subida de los genes coexpresados pueden ser alineados para revelar elementos reguladores en común reconocibles por factores de transcripción específicos El problema es que los elementos reguladores de genes coexpresados son cortos y débiles Sus patrones son difíciles de discernir usando alineamiento múltiple de secuencias Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
37 Métodos basados en perfiles de expresión Métodos basados en perfiles de expresión Deben usarse métodos tales como EM y Gibbs EM es un algoritmo de extracción de motivos por medio de optimización repetida de una PSSM a través de comparaciones de secuencias Gibbs usa una optimización de matriz similar pero con una estrategia más flexible y con una probabilidad más alta de obtener el patrón óptimo Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
38 Métodos basados en perfiles de expresión Métodos basados en perfiles de expresión MEME AlignACE Melina INCLUSive PhyloCon Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
39 Regulación transcripcional 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
40 Regulación transcripcional Regulación transcripcional La regulación transcripcional es uno de los procesos más importantes a estudiar en la biología celular La caracterización de promotores y TFBS para genes específicos es un tema muy estudiado El modelo computacional estándar que describe las propiedades de unión de los factores de transcripción es la PFM (Position Frequency Matrix) Una PFM se construye contando las ocurrencias de los nucleótidos en las columnas de un alineamiento de TFBS colectados de experimentos La predicción es altamente correlacionada con propiedades de unión in vitro de los FT Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
41 Regulación transcripcional Regulación transcripcional Sin embargo el objetivo de la investigación en regulación de genes es la identificación de sitios de unión que son funcionalmente importantes in vivo, lo cual es un gran reto Los sitios funcionales pueden ser encontrados pero pueden ser indistinguibles en otras predicciones, se emplean ciertos métodos para aumentar la selectividad, por ejemplo la comparación de especies cruzadas como un filtro de selección (huellas filogenéticas) Existen dos partes importantes en el proceso de búsqueda de elementos reguladores: construir un modelo para un factor de transcripción de interés y la predicción de elementos reguladores Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
42 Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
43 Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico En la práctica, los sitios usados para construir modelos de TF son basados en sitios funcionales extraidos de artículos publicados o conjuntos de sitios identificados por una serie de rondas de selección in vitro Como mínimo cinco sitios o más son requeridos para un modelo improvisado, donde más de veinte en la mayoria de los casos es adecuado para un modelo representativo. Si la selección in vitro es usada, el número de sitios usualmente no es un problema Existe un peligro de sobreselección, esto es, los sitios seleccionados no son representativos in vivo Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
44 Alineamiento de sitios 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
45 Alineamiento de sitios Alineamiento de sitios Una vez que se tienen los sitios es necesario alinearlos para la construcción subsecuente del modelo, es necesario construir la matriz del modelo sin huecos Se usan algunas herramientas, los patternfinder como MEME Como un patternfinder es probabilístico, es recomendado aplicar el mismo conjunto de secuencias varias veces para obtener una solución estable Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
46 creando la PFM 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
47 creando la PFM creando la PFM Cada columna en el alineamiento es evaluada independientemente, contando las instancias de A,G,C y T Esto puede hacerse con una herramienta como EMBOSS Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
48 conversión a PSSM 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
49 conversión a PSSM conversión a PSSM Una PFM puede ser considerada como una representación primaria para los modelos de unión de los factores de transcripción, pero aun no está optimizada para el escaneo de secuencias de genomas La mayoría de los investigadores convierten estas matrices a PSSM, debemos calcular la probabilidad de agregar el nucleótido n es la posición c p n,c p n,c = fn,c+0,25 N N+ N dado p n,c podemos convertir los valores de la matriz a valores logit. La conversión está dada por: w n,c = log 2 ( pn,c 0,25 ) Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
50 conversión a PSSM conversión a PSSM Un puntaje cuantitativo S para un sitio potencial es calculado con la suma de los valores relevantes de W, y está dado por: S = d i=1 w l,c donde d es el número de columnas en W e i el nucleótido encontrado en la posición c en el sitio potencial como las matrices tienen distintos rangos de puntaje, se normalizan S norm = S S min S max Smin 100 Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
51 conversión a PSSM conversión a PSSM donde S es el puntaje obtenido de alguna subsecuencia usando la PSSM La manera más popular de representar estas secuencias es usando Logo Intuitivamente la información contenida en una columna de la PFM corresponde a qué tan restringidos están los requerimientos de unión en cierta posición La información contenida para una columna c en F está dada por I c = 2 + n=a,c,g,t P(f n,c)log 2 p(f n,c ) p(f n,c ) = fn,c N Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
52 Compartiendo motivos 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
53 Compartiendo motivos Compartiendo motivos Un problema en general es la falta de calidad en la mayoría de los factores de transcripción registrados Es por eso que se recomienda compartir nuestros modelos construidos Algunas herramientas que permiten esto son JASPAR y PAZAR Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
54 Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
55 Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Una vez que una región es seleccionada, es posible usar el navegador para extraer secuencias relevantes para los siguientes pasos No hay reglas simples para localizar regiones candidatas. En general se asume que la mayoría de las regiones reguladoras caen en las regiones de subida del inicio del sitio de transcripción Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
56 Localizando secuencias ortólogas 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
57 Localizando secuencias ortólogas Localizando secuencias ortólogas Alinear las dos secuencias usando un programa apropiado. Elegir un programa que sea ideal para alinear secuencias de baja similitud, por ej LAGAN, BLAST no es ideal para este tipo de análisis Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
58 Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento 1 Predicción de Promotores y Elementos Reguladores Introducción Promotores y elementos reguladores en procariotas Métodos basados en perfiles de expresión Regulación transcripcional Selección de sitios para construir un modelo para las propiedades de unión de un TF específico Alineamiento de sitios creando la PFM conversión a PSSM Compartiendo motivos Localizar genes y promotores de interés en especies de referencia Localizando secuencias ortólogas Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
59 Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento La forma más común de seleccionar las subsecuencias conservadas del genoma es usar una ventana deslizante Una ventana con tamaño fijo se desliza sobre los alineamientos, contando el número de nucleótidos alineados idénticos El nucleótido del centro de la ventana es etiquetado con el procentaje de identidad La ventana se desliza 1 bp a lo largo del alineamiento Todos los nucleótidos que tienen una etiqueta mayor a un umbral se consideran conservados Una elección típica es comparar humano-ratón en una ventana de 50 bp y un umbral del 70 por ciento Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
60 Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento Identificando subsecuencias conservadas en el alineamiento La interpretación de los resultados puede ser desalentadora, puesto que los modelos basados en matrices son propensos a producir algunas predicciones falsas, aunque el método de huellas filogenéticas pueda remover casi el 90 por ciento de las predicciones comparado con el análisis simple de secuencias. En general uno no debe esperar una única respuesta sin ambiguedad Sin embargo, en algunos casos el análisis puede acelerarse significativamente reduciendo el espacio de búsqueda a ciertas regiones reguladoras potenciales Pedro Eduardo Torres Jiménez (CINVESTAV) Predicción de Promotores y Elementos Reguladores 09 de julio del / 60
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