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1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 5. GLICÓSIDOS Objetivos - Conocer y ensayar las reacciones básicas generales que permiten identificar rápidamente los diferentes núcleos químicos de los glicósidos en el laboratorio. - Interpretar las reacciones de reconocimiento y los métodos de cuantificación de modo de obtener suficientes elementos para poder resolver la identidad y concentración en muestras incógnitas. abilidades - Capacidad para el manejo del equipo de laboratorio útil para la extracción de los principales componentes químicos de importancia en Farmacognosia. - Capacidad para la identificación cualitativa de los diferentes grupos químicos de importancia en Farmacognosia. Actitudes. - Disposición al trabajo en equipo. - Responsabilidad durante el trabajo en equipo dentro y fuera del laboratorio. - Tolerancia. - Apertura al diálogo y a la crítica. Introducción Los glicósidos son compuestos que resultan de la combinación del grupo reductor de un azúcar con una sustancia de naturaleza distinta, con eliminación de una molécula de agua. Clasificación según la naturaleza de la unión: 1) O-Glicósidos R - 2 O R - C - O + - OR R - C - OR 2) S-Glicósidos: Ej: rutina en la ruda - 2 O R - C - O + S - R R - C - SR Ej: glicósidos de la mostaza negra 80

2 3) N-Glicósidos: - 2 O R - C - O + N - R R - C - NR 4) C-Glicósidos: Ej: bases púricas - 2 O R - C - O + C - R R - C - CR Ej: glicósidos del aloe Nomenclatura: se los denomina como glicósidos. Si el grupo azucarado es glucosa sólo en ese caso se hablará de glucósidos. Generalmente el nombre del glicósido se basa en la planta de origen. Ej.: el glicósido de Ruta graveolens (ruda) se denomina "rutósido". Clasificación según su estructura química: 1) O-Glicósidos: a- Alcoholes simples: Ej.: cianoglicósidos (amigdalina en almendras amargas). b- Fenoles simples o derivados: Ej.: arbutina en Uva ursi. c- Antraquinonas: formados por polifenoles con núcleo antracénico (antraquinonas propiamente dichas, antronas, antranoles). Ej.: sen. d- Lactonas: glicósidos de la cumarina como la esculina. Ej.: castaño de Indias. e- Flavonoides: derivados de la fenilbenzopirona. Ej.: rutina. f- Esteroides: cardenólidos: Ej.: digital, estrofanto, laurel rosa (butenólidos) Cardiotónicos bufadienólidos: Ej.: escila (pentadienólidos) Saponósidos esteroides: Ej.: digital, ágave triterpénicos: Ej.: polígala, regaliz Glicoalcaloides alcaloides de algunas Solanaceae. Ej.: solanidina 2) S-Glicósidos: Ej.: glucosinolatos en las Brassicaceae. 81

3 3) N-Glicósidos: a- Bases púricas: Ej.: adenina, guanina. b- Bases pirimídicas: Ej.: citocina, uracilo. 4) C-Glicósidos: resistentes por la unión C-C, estable a la hidrólisis, como las aloínas. Caracterización y dosaje de los Glicósidos Para la caracterización y dosaje de los glicósidos, una vez extraídos se procede primero a hidrolizarlos a través de un procedimiento ácido o enzimático y luego se analizan el azúcar y el aglicón por separado. Los hidratos de carbono se identifican cuali y cuantitativamente a través de métodos cromatográficos (en papel, en placa, cromatografía gaseosa), electroforesis, colorimetría. Los aglicones se pueden identificar por reacciones características de acuerdo al grupo químico, por cromatografía y, al igual que los carbohidratos, recurriendo a métodos espectroscópicos (UV-Vis, MS, IR, RMN). A continuación se detalla los principales núcleos químicos que estudiaremos y sus reacciones características: GLICOSIDO NUCLEO QUÍMICO REACCIÓN de IDENTIFICACION FUNDAMENTO CIANO GUIGNARD Autohidrólisis enzimática con liberación de CN, el cual reacciona con el reactivo de Guignard (picrato de sodio, amarillo) reduciéndolo a isopurpurato (rojo). QUNONAS FLAVONOIDES BORNTRÄGER SINODA (Zn / Cl cc) Las antraquinonas dan color rojo en 1/2 acuoso alcalino merced a la disolución debida al estado de resonancia de los O fenólicos. Requiere que el núcleo antraquinona esté libre. En el caso de los glicósidos, es necesario una hidrólisis previa y la posterior extracción de las agliconas en medio orgánico (generalmente benceno o tolueno), previo a la reacción. En presencia de zinc y medio ácido fuerte dado por Cl cc, se genera hidrógeno, produciendo por reducción, el ión flavilio de color rojo escarlata (varía desde rosa muy débil hasta rojo escarlata). 82

4 Todos los flavonoides, excepto chalconas, auronas, e isoflavonas, dan positivo. TANINOS - Reacción c/gelatina o con alcaloides Los taninos precipitan las proteínas o los alcaloides en solución. Originan desde opalescencia hasta precipitado. CARDIO- TONICOS - Liebermann - Burchard (L-B) - Kedde (K) - L-B: los requerimientos estructurales que debe tener el núcleo esteroide para dar la reacción son: 1 sustituyente O en posición 3 (libre o glicosilado) y además un doble enlace en el anillo A ó B, o bien debe poder formar un doble enlace en A ó B por deshidratación generada por el 2 SO 4 (principalmente en C5 C6 ó en C4-C5). La aparición de un color verde que varía hasta el azul petróleo indica reacción positiva. - K: en presencia de ácido 3,5-dinitrobenzoico y medio alcalino en solución alcohólica, la aparición de color azulado, rosa hasta violáceo indica reacción positiva debido a la presencia de una lactona butenólida (α-insaturada). SAPONINAS Por hidrólisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona, llamada genéricamente SAPOGENINA, la cual puede tener un núcleo esteroide o triterpeno. - Poder tensioactivo - Poder emulsificante - Liebermann Burchard (para el núcleo químico) Poder tensioactivo: se disuelven en agua caliente y disminuyen la tensión superficial de ésta; por lo tanto, al agitar sus soluciones, se formará una espuma abundante y relativamente estable. Se considera positiva cuando la espuma es > o = a 0,5 cm, es estable hasta 5 min y perdura 15 min o más con poca disminución de la altura. P. emulsificante: por su 83

5 AzO O OAz propiedad tensioactiva, al estar en contacto con un solvente orgánico forma emulsiones. Núcleo químico: si la reacción de L-B da verde que varía hasta azul petróleo, indica reacción positiva para esteroide. Si L-B da desde amarillo naranja hasta pardo amarronado, es positiva para triterpenos. GLICOSIDOS I. CIANOGLICOSIDOS Y QUINONAS OBJETIVOS - Desarrollar destrezas en el estudio y control de drogas vegetales medicinales que contienen cianoglicósidos y de aquellas que contienen quinonas. - Aplicar conocimientos fitoquímicos al estudio de fitoterápicos enriquecidos en quinonas. INTRODUCCION 1- CIANOGLICOSIDOS Existe una variedad de almendras, llamada Prunus amygdalus var. Amara (Prunaceae), conocida como almendras amargas que resulta tóxica para el organismo, por lo que no se deben consumir. A diferencia de las almendras dulces, poseen una sustancia llamada amigdalina. Cuando se mastica una de estas almendras se ponen en contacto dicha sustancia con la saliva y la emulsina; esta última es una enzima β-glucosidasa que actúa fraccionando la amigdalina en β-d-glucosa (hidrato de carbono), benzaldehído (responsable del sabor amargo) y ácido cianhídrico (CN). El ácido cianhídrico es el responsable de la toxicidad, siendo la dosis mortal de unas 20 almendras para los adultos y 10 para los niños. En la siguiente Figura se esquematizan las rupturas que se producen en la molécula de amigdalina por acción de la emulsina y la saliva al ingerir almendras amargas. 2- QUINONAS Las quinonas son un grupo de metabolitos secundarios naturales que poseen un núcleo dicarbonilo con una funcionalidad o- o p-quinoide, principalmente esta última. A continuación se presentan algunos de los principales tipos de quinonas: 84

6 De todas las quinonas, las antraquinonas y compuestos relacionados, son las de mayor distribución en los recursos naturales, siendo además de amplia utilización en Salud. Varios glicósidos relacionados con el antraceno se hallan presentes en drogas como la cáscara sagrada, frángula, aloe, ruibarbo, sen. La mayoría de estas drogas se usan como laxantes y/o catárticos. Por hidrólisis estos glicósidos dan agliconas que son en general di, tri, o tetra hidroxiantraquinonas, o modificaciones de estos compuestos. En los materiales vegetales también existen glicósidos de antranoles y antronas, derivados reducidos de las antraquinonas. Estos contribuyen mucho a la acción terapéutica de estos productos naturales. Las agliconas antraquinónicas libres exhiben menor actividad terapéutica. Nomenclatura. Se les denomina comúnmente con nombres vulgares con la terminación "INA" en el caso de las agliconas, u "OSIDO" en el caso de los glicósidos. La IUPAC establece que para nombrar estas sustancias se debe asignar la palabra terminal "ANTRAQUINONA", precedida de los correspondientes substituyentes y siguiendo la enumeración mostrada en las fórmulas que se presentan más abajo. De acuerdo con esto, el nombre IUPAC por ejemplo para la aloe-emodina será: 1,8- dihidroxi-3-hidroximetilénantraquinona. Para el glucofrangulósido-a, el nombre IUPAC es: 6-O-ramnosil-8-O-glucosil-1-hidroxi-3-metilantraquinona. Clasificación de los compuestos antracénicos. Pueden clasificarse según su estado de oxidación en siete grupos estructurales: a. Antraquinonas b. Antronas c. Diantronas d. Antranoles e. Oxantronas f. Naftodiantronas g. Antrahidroquinonas Núcleo fundamental: 85

7 antraceno antraquinona Algunas fórmulas importantes: PARTE PRÁCTICA 1- Ensayar las siguientes reacciones sobre el patrón y la planta en estudio (Fracción A, Fracción B, Infuso o droga seca y molida, según corresponda). a) Reacción de GUIGNARD: reacción con papel picrosódico de Guignard. Colocar el material vegetal a estudiar triturado (droga seca) en un tubo de ensayo. Añadir 4 gotas de CCl 3 (para estimular la degradación de amigdalina en ácido cianhídrico), y en la parte superior colocar un papel de filtro previamente embebido en la solución de picrato de sodio y secado, sosteniéndolo con un tapón, evitando que el papel toque las paredes del tubo. Dejar a 35 ºC durante 3 h. El papel debe pasar de amarillo a rojo para que la prueba se considere positiva. Antes de informar resultado negativo, se deberá dejar la reacción durante al menos 24 h. Reactivo: picrato de sodio, que se prepara mezclando 10 ml de NaO al 10 % con 0,5 g de ácido pícrico. Con este reactivo se embeben tiras de papel de filtro y se secan al abrigo de la luz. Se puede utilizar hasta 4 meses. 86

8 b) Reacción de BORNTRÄGER: se trabajará con la Fracción B de la planta en estudio y con el patrón. Se tomarán 3 alícuotas de 1 ml c/u y se procederá de la siguiente forma: En la primera alícuota se agregará directamente 1 ml del reactivo de BORNTRÄGER (NaO al 5 %). Observar el color en la fase acuosa. Detecta la presencia de antraquinonas libres y oxidadas. Resultado (+): fase acuosa roja, amarilla o amarilla anaranjada con fluorescencia roja. En la segunda alícuota agregar unas gotas de ácido nítrico fumante y a continuación, añadir 1 ml del reactivo de BORNTRÄGER (NaO al 5 %) y dejar unos mintuos para que se mezclen gradualmente. La aparición de color rojo en un tiempo no mayor a 30 min indica resultado positivo. Detecta la presencia de derivados de antraquinonas reducidos. En la tercer alícuota agregar 1 ml de Cl y 1 ml FeCl 3 al 2 %, calentar a Baño María durante media hora. Posteriormente agregar 1 ml de solución de NaO al 5 %. Observar la aparición de color rojo en la fase acuosa alcalina. Detecta la presencia de dímeros (y de C- glicósidos si se tratara de un extracto o fracción de mayor polaridad). Para informar un resultado negativo dejar en reposo hasta 48 h. 2- Estudio particular de una droga vegetal conteniendo quinonas. Cada grupo trabajará con un extracto preparado de muestras vegetales conteniendo derivados de antraquinonas (acíbar), de benzoquinonas (uva ursi) o de naftoquinonas (lapacho). Además se analizarán fitoterápicos conteniendo alguna de estas sustancias Extracciones: analizar en la bibliografía que se indica, las metodologías que se emplearon para las muestras a utilizar en el T.P. acíbar extracto preparado según Wagner Bladt (1996), pág (VER CD) uva ursi extracto preparado según Wagner Bladt (1996), pág (VER CD) lapacho extracto preparado según Wagner Bladt (1996), pág (VER CD) 2.2- Análisis cromatográfico: los extractos se analizarán mediante la determinación del perfil cromatográfico utilizando los siguientes sistemas cromatográficos: acíbar - según Wagner Bladt (1996), pág (VER CD, COMPARAR LOS RESULTADOS) Cromatofolio con las medidas adecuadas. Fase estacionaria: sílicagel 60 F (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:13,5:10). Marcador: quercetina. Muestras: acíbar purificado (Ap); Fracción B de la planta en estudio (B). Procedimiento: siembra en banda de 2-3 mm, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: 1- se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante luz visible, luz UV-365 nm y luz UV-254 nm. 87

9 2- A continuación el cromatograma será rociado con el reactivo KO metanólico al 10 %, seguido de observación al visible y al UV-365 nm. Informe de los resultados: calcular los Rf en cada revelado y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía. uva ursi - según Wagner Bladt (1996), pág (VER CD, COMPARAR LOS RESULTADOS) Cromatofolio con las medidas adecuadas. Fase estacionaria: sílicagel 60 F (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:13,5:10). Marcador: quercetina. Muestras: extracto de uva ursi (Euv); Fracción B de la planta en estudio (B). Procedimiento: siembra en banda de 2-3 mm, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: 1- se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante luz visible, luz UV-365 nm y luz UV-254 nm. 2- A continuación el cromatograma será rociado con el reactivo de Millon (g disuelto en NO 3 fumante, 1:9, seguido de una dilución en 10 ml de agua destilada), seguido de observación al visible y al UV-365 nm. Informe de los resultados: calcular los Rf en cada revelado y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía. lapacho se utilizará el sistema indicado para drosera en Wagner Bladt (1996), pág (VER CD, COMPARAR LOS RESULTADOS) Cromatofolio con las medidas adecuadas. Fase estacionaria: sílicagel 60 F (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: tolueno-ácido fórmico (99:1). Marcador: quercetina. Muestras: extracto de uva ursi (Euv); Fracción B de la planta en estudio (B). Procedimiento: siembra en banda de 2-3 mm, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: 1- se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante luz visible, luz UV-365 nm y luz UV-254 nm. 2- A continuación el cromatograma será rociado con el reactivo KO metanólico al 10 %, seguido de observación al visible y al UV-365 nm. Informe de los resultados: calcular los Rf en cada revelado y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía. 3- APLICACIÓN EN LA OFICINA DE FARMACIA 3.1- Concurre a su farmacia una mujer embarazada de 6 meses de gestación y le consulta sobre la cáscara sagrada para tratar su problema de constipación. a- Cómo actuaría ante esta situación? b- Qué consejos le daría? 88

10 3.2- El medicamento Medilaxan granulado contiene entre sus componentes: mucílago de llantén, sennósidos A y B. a- Cómo actúa c/u de sus componentes? b- Qué cuidados, contraindicaciones y/o efectos adversos poseen? c- Complete el origen botánico de las drogas componentes. INFORME DE LAS ACTIVIDADES PRÁCTICAS Para cada uno de los grupos de Glicósidos se deberá confeccionar un informe en el que constarán: * drogas investigadas (nomenclatura y parte usada); * metodologías de extracción; * reacciones, fundamento de las mismas, resultados obtenidos; * resultados de cromatografías cuando corresponda; * conclusiones a las que se arribó. BIBLIOGRAFIA - Domínguez, X.A., Métodos en Investigación Fitoquímica. México, arborne, J.B., Phytochemical Methods. 2º Ed. Editorial Chapman and all, Wagner - Bladt - Zgainski, Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Springer -Verlag, N. Y., Wagner - Bladt, Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. 2 Ed. Springer - Verlag, Berlín, Alemania,