Recomendaciones para la estandarización del análisis de semen posvasectomía

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1 Recomendaciones para la estandarización del análisis de semen posvasectomía Documento Técnico (2012) Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular Comité Científico Comisión de Seminología y Técnicas de Reproducción Asistida M.C. Sánchez Pozo, I. Sánchez Prieto, M.I. Jiménez García mcristina.sanchez.sspa@juntadeandalucia.es 0. ÍNDICE 1. Introducción 2. Objetivo y ámbito de aplicación 3. Fase preanalítica 3.1. Cuándo debemos realizar el primer control? 3.2. Hoja informativa de normas de recogida Período de abstinencia sexual Medidas higiénicas Lugar de obtención 3.3. Recepción de la muestra 4. Análisis de semen con microscopio de contraste de fases 4.1. Evaluación de la concentración 4.2. Cálculo de la concentración 4.3. Sensibilidad del método y ejemplos 5. Análisis de semen con microscopio de fluorescencia 5.1. Evaluación de la concentración 5.2. Cálculo de la concentración 5.3. Sensibilidad del método 6. Detección de espermatozoides móviles 7. Cómo expresar los resultados 8. Recuperación de la fertilidad 8.1. Vasovasostomía 8.2. Inyección intracitoplasmática (ICSI) con espermatozoides procedentes del testículo Criopreservación seminal preventiva 9. Recomendaciones 10. Bibliografía 11. Anexo I: Argumentos en contra de la centrifugación de las muestras de semen posvasectomía. 12. Anexo II: Preparación del diluyente de Weigman 13. Anexo III: Hoja Informativa para los pacientes 14. Anexo IV Propuesta de competencias para los servicios implicados 1. INTRODUCCIÓN La vasectomía es uno de los métodos anticonceptivos definitivos más efectivo y popular. Su fundamento es la oclusión quirúrgica de los conductos deferentes. Es un método seguro con menos del 1% de fracaso y la técnica quirúrgica empleada junto con la experiencia del cirujano son factores determinantes del resultado de la vasectomía (1). El éxito de la vasectomía puede evaluarse por ausencia de embarazo, si valoramos su efectividad como método anticonceptivo o por el resultado del análisis de semen si estudiamos la eficacia de la técnica oclusiva (2). El fracaso de la vasectomía en función del resultado de embarazo puede estar infravalorado debido a varios factores, entre ellos: que la pareja o el hombre no lo comunique al centro donde se realizó la intervención, que algunas mujeres pueden abortar y ocultar el embarazo, y que los cirujanos no informen los fallos de la técnica oclusiva. En torno al 10% de los hombres que se van a someter a vasovasostomía tiene espermatozoides en el eyaculado lo que sugiere una tasa de recanalización mayor de la informada (3). La evidencia científica considera el análisis de semen como el mejor método para valorar la efectividad de la técnica quirúrgica, pero los protocolos utilizados no son universales; varían en el tiempo y número de eyaculaciones necesarias para realizar el primer aná- 38 Documentos de la SEQC - diciembre 2012

2 Recomendaciones para la estandarización del análisis de semen posvasectomía lisis de semen, en los criterios para considerar al paciente estéril, así como en el procedimiento analítico empleado para valorar la presencia o ausencia de espermatozoides. En la mayoría de los protocolos se requieren al menos dos espermiogramas con resultado de azoospermia, la presencia de espermatozoides aislados inmóviles se valora con precaución y si existen espermatozoides móviles en el eyaculado se considera fracaso de la técnica quirúrgica. 2. OBJETIVO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN El objeto de este documento es la estandarización de procedimientos en el análisis de muestras de semen posvasectomía. El ámbito de aplicación son las muestras de semen posvasectomía que se van a analizar en el Laboratorio. 3. FASE PREANALÍTICA 3.1. Cuándo debemos realizar el primer control? Quizás sea el punto menos unánime de los diferentes protocolos. Muchos trabajos intentan estudiar el tiempo que tardan en desaparecer los espermatozoides residuales de las vesículas seminales y los conductos deferentes, sin llegar a un grado de unanimidad en los diferentes protocolos existentes (4). Se sabe que los espermatozoides residuales tienen una vida muy corta, el test de penetración en ovocitos de hámster demuestra que los espermatozoides pierden la capacidad de fertilizar entre los 2-8 días de la vasectomía y que se inmovilizan después de 15 días. Debe existir un equilibrio entre la demostración de la eficacia de la vasectomía y el tiempo de espera para realizar el primer control. Diferentes trabajos demuestran que puede existir una recanalización precoz (entre la 2 y 6 semanas de la vasectomía), antes de que se haya realizado el primer control y que muchas de ellas son transitorias y se resuelven espontáneamente (5). El tiempo y el número de eyaculaciones necesario para que las vesículas seminales y los conductos deferentes queden libres de espermatozoides es muy variable e impredecible. Puede depender de diversos factores como la edad o el número de eyaculaciones. En una revisión sistemática de la literatura, se concluye que el 80% de los pacientes se vuelven azoospérmico a los tres meses, y cuando se evalúa el número de eyaculaciones, son necesarias al menos 20 para que el 80% de los pacientes sean azoospérmicos (4). La técnica quirúrgica empleada también es un factor determinante del tiempo que tardan en desaparecer los espermatozoides residuales. Se sabe que la azoospermia tarda más en alcanzarse con la escisión y ligadura que con la cauterización y la interposición facial, técnicas de alta eficacia oclusiva (6). El laboratorio debe asegurarse de que el paciente recibe la información necesaria para la recogida de la muestra, así como del tiempo que debe transcurrir y el número de eyaculaciones antes del primer control posvasectomía (7) Hoja informativa de normas de recogida La información al paciente sobre la técnica quirúrgica, las recomendaciones del posoperatorio, la utilización de anticonceptivos (la mayoría de los embarazos ocurren en los tres primeros meses después de la vasectomía) hasta el alta del paciente deben ser realizadas por el clínico. El laboratorio es el responsable de elaborar un impreso informativo normalizado. (Anexo III) Las instrucciones deben expresarse de forma sencilla, explicando las normas de recogida de la muestra y el porqué de las mismas, lugar y hora de recepción de las muestras. Así mismo, es responsabilidad del laboratorio asegurarse de que el paciente ha recibido la información adecuada, tanto de forma oral como escrita Período de abstinencia sexual Siguiendo las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), es importante la estandarización de la recogida de semen. Se recomienda una abstinencia sexual de al menos 48 horas y no más de 7 días Medidas higiénicas Debe lavarse el pene con jabón, aclarar bien con agua para evitar la contaminación de la muestra con detergente y no aplicar ningún tipo de pomada. La muestra se recoge por masturbación en un frasco estéril de boca ancha y debe asegurarse de que queda correctamente cerrado. También puede utilizarse un preservativo de poliuretano no tóxico diseñado especialmente para obtener la muestra Lugar de obtención Siempre que sea posible, la muestra se recogerá en un lugar próximo al laboratorio para evitar cambios de temperatura e intentar que el tiempo transcurrido desde la recogida hasta el comienzo del análisis sea mínimo; el tiempo máximo debe ser inferior a una hora. Debemos enfatizar la necesidad de que la muestra sea completa y rechazar aquellas en las que se haya perdido parte del eyaculado. Se han aislado seis fracciones de diferente composición celular y bioquímica en el eyaculado, por lo que una pequeña pérdida puede cambiar sustancialmente el resultado del análisis (8) Recepción de la muestra Es recomendable que el propio paciente entregue la muestra en el laboratorio para poder realizar una anamnesis correcta. El técnico que recoge la muestra debe asegurarse que los datos de filiación del paciente son correctos, identificar la muestra, el formulario de solicitud y la hoja de trabajo con el código identificativo del laboratorio en presencia del paciente. La anamnesis debe contemplar periodo de abstinencia, hora de recogida y entrega de muestra, si la muestra es completa, fecha de la vasectomía y número de controles previo (9). 4. ANÁLISIS DE SEMEN CON MICROSCO- PIO ÓPTICO DE CONTRASTE DE FASES 4.1. Evaluación de la concentración El número de espermatozoides presente en una muestra considerada azoospérmica depende del volumen de muestra examinado, cabe la posibilidad de que haya espermatozoides en muestras donde no se ha observado ninguno (el límite de confianza de cero en la distribución de Poisson es 3.7 por unidad de volumen). Por tanto la concentración de espermatozoides debe calcularse empleando cámaras de gran volumen para minimizar el error de recuento. Teóricamente, el examen de la cuadrícula central completa de la cámara Neubauer improved (nº 5 en la figura 1) cuando se rellena con una muestra de semen diluido (1:2) puede detectar Documentos de la SEQC - diciembre

3 Figura. 1. Cámara Neubauer Improved. Imagen tomada de WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen 5º Ed. Tabla I. Porcentaje de error en función de espermatozoides contados espermatozoides por ml con un error de recuento máximo del 20% (IC 95%), error aceptable para muestras sin espermatozoides. Cuando se examinan las 9 cuadrículas, se puede estimar una concentración de espermatozoides tan baja como por ml. (10). Antes de tomar una alícuota de semen para evaluar la concentración, se debe homogeneizar manualmente la muestra en el contenedor de recogida mediante suaves movimientos circulares evitando la formación de espuma. a) Diluir dos alícuotas de semen (1:2) con diluyente de Weigman (anexo II). b) Rellenar cada cámara del hemocitómetro Neubauer improved con una dilución, una alícuota para cada cámara. c) Conservar el hemocitómetro horizontalmente durante al menos 4 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda (por Ej. en una placa de Petri con papel de filtro humedecido) para prevenir el secado. Las células fijadas sedimentaran en la retícula durante este tiempo. d) Evaluar las dos cámaras del hemocitómetro. En caso de hallar espermatozoides, valorar la movilidad siguiendo las especificaciones del epígrafe 6 y si es necesario se realizará una dilución en función de la concentración estimada. e) Contar al menos 200 espermatozoides de cada dilución (si es posible), evaluando en cada replica el mismo número de cuadrículas completas (el mismo volumen evaluado). Calcular la suma y la diferencia de los dos recuentos y comparar los resultados con los de la tabla I para comprobar la validez del conteo (11) Cálculo de la concentración La concentración de espermatozoides en semen es su número dividido por el volumen en el que se han hallado, multiplicado por el factor de dilución. En la distribución de Poisson, el error estándar de un recuento (N) es su raíz cuadrada ( N) y el intervalo de confianza al 95% para el número de espermatozoides en el volumen de semen es aproximadamente N±1.96 x N ó redondeando N ±2 x N. Los errores deben expresarse como porcentaje del recuento (100 x ( N/N)) (tabla I) (figura. 2) (Ejemplo 1). Ejemplo 2: Si el resultado de la diferencia de las dos réplicas excede la diferencia esperada al azar, se descarta y se preparan nuevas diluciones (tabla II) (figura 3). Figura 2. Ejemplo 1. Cuando se evalúa un total inferior a 400 espermatozoides, es necesario informar el error estándar para el número de células contadas C= (N/ n) x (1 cuadrícula/100 nl) x factor de dilución El número total de espermatozoides contados (N), idealmente al menos 400 la suma de las dos diluciones de aproximadamente 200, se divide por (n) el número total de cuadrículas evaluadas en ambas cámaras (el volumen de una cuadrícula 100 nl) y multiplicado por el factor de dilución Sensibilidad del método y ejemplos Ejemplo 1: La precisión de la estimación del número de espermatozoides depende del número de espermatozoides contados. Cuando se observan menos de 400 espermatozoides en el total de las dos cámaras, hay que informar el error de recuento para el número de células contadas. 40 Documentos de la SEQC - diciembre 2012

4 Recomendaciones para la estandarización del análisis de semen posvasectomía Tabla II. Diferencias aceptables entre dos recuentos Figura 4. Ejemplo 3. El número de espermatozoides observados es inferior al límite bajo de cuantificación para un error máximo aceptable del 20% (IC 95%). La diferencia aceptable se basa en el intervalo de confianza al 95% y se calcula mediante la fórmula: IC=N+1.96 N Figura 5. Ejemplo 4. No se encuentran espermatozoides en el hemocitómetro Neubauer improved. La ausencia de espermatozoides en las alícuotas examinadas no excluye su presencia en el resto de la muestra. Figura 3. Ejemplo 2. Cálculo de la reproducibilidad de las diluciones Ejemplo 3: Si se cuentan menos de 25 espermatozoides en cada cámara, la concentración será < espermatozoides/ml ya que este es el límite bajo de cuantificación para un error de recuento del 20% cuando se evalúan las 9 cuadrículas de la cámara de Neubauer y se usa una dilución 1+1 (1:2). (3) Se debe informar el numero de espermatozoides (spz) observados con el comentario se observan pocos espermatozoides para realizar una estimación precisa de la concentración (< spz/ ml) (11) (figura 4). Ejemplo 4: En el caso de no hallar espermatozoides empleando una dilución 1:2 en ninguna de las dos réplicas, se informará no se observan espermatozoides en la muestra (< spz/ml) (11) (figura 5). 5. ANÁLISIS DE SEMEN CON MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA 5.1. Evaluación de la concentración en cámara desechable de gran volumen (100 µm de profundidad) Antes de tomar una alícuota de semen para evaluar la concentración, se debe homogeneizar manualmente la muestra en el contenedor de recogida mediante suaves movimientos circulares evitando la formación de espuma. a) Diluir dos alícuotas de semen 1+1 con fijador que contenga Hoeschst binbenzimida fluorocromo (1 mg/l). b) Rellenar cada cámara del portaobjetos con 25 µl de la dilución, una réplica por cada cámara (figura 6). c) Guardar la cámara horizontalmente durante minutos en la oscuridad a temperatura ambiente en una cámara húmeda, por ejemplo en una placa de Petri con papel de filtro humedecido. Documentos de la SEQC - diciembre

5 d) Examinar la preparación con óptica de fluorescencia a 250X aumentos empleando un espejo dicroico y un filtro de barrera. e) Examinar las dos cámaras sistemáticamente, en caso de hallar espermatozoides, valorar la movilidad siguiendo las especificaciones del párrafo 6 y si es necesario se realizará una dilución en función de la concentración estimada. f) Contar al menos 200 espermatozoides (si es posible) de cada dilución, evaluando en cada replica el mismo número de cuadrículas completas (el mismo volumen evaluado). Calcular la suma y la diferencia de los dos recuentos y comparar los resultados con los de la tabla 2 para comprobar la validez del conteo (11) Cálculo de la concentración Proceder igual que en apartado 4.2. Figura 6. Cámara para análisis de semen posvasectomía con microscopio de fluorescencia C = (nº espermatozoides/ nº campos) x (1 campo/volumen por campo) x factor de dilución. A 250X aumentos, el volumen de un campo es de 80 nl y para una dilución 1+1 (1:2), la concentración, C= ([N/n] x [1/80] x 2) espermatozoides por nl= ([N/n] x [1/40]) espermatozoides/nl. A 400x aumentos, el volumen del campo es de 20 nl y para una dilución 1+1 (1:2), la concentración, C= ([N/n] x [1/20] x 2) espermatozoides por nl= ([N/n] x [1/10]) espermatozoides/nl (tabla III) Sensibilidad del método Si hay menos de 200 espermatozoides en cada cámara (total inferior a 400), el error de conteo será superior al 5% (IC 95%). Se informa el error de recuento para el número de células contadas (tabla I). Si se observan menos de 25 espermatozoides en cada cámara, la concentración será <2.000 spz/ml ya que este es el límite inferior de cuantificación para un error de recuento del 20% cuando se evalúa la cámara entera (25 µl) y se usa una dilución 1+1 (1:2). Se informa el número de espermatozoides observados con el comentario se observan pocos espermatozoides para realizar una determinación precisa de la concentración (<2.000 spz/ml). Si no se observan espermatozoides en ninguna cámara, hay una probabilidad del 95% de que la concentración sea <3.7 (x factor de dilución) por el volumen total examinado, ya que 3.7 es el límite de confianza superior al 95% de 0 en la distribución de Poisson. Se informará como recomienda la 5ª ed. del Manual de la OMS de Tabla III. Cálculo de la concentración con cámara desechable de 100 µm de profundidad análisis de semen, No se observan espermatozoides en la muestra (<2.000 spz/ml). 6. DETECCIÓN DE ESPERMATOZOIDES MÓVILES Antes de tomar una alícuota de semen para evaluar la movilidad, se debe homogeneizar manualmente la muestra en el contenedor de recogida mediante suaves movimientos circulares evitando la formación de espuma. Se sitúan 40 µl de semen sin diluir en un portaobjetos atemperado a 37ºC bajo un cubreobjetos de 24 x 50 mm para obtener una preparación de 33 µm de profundidad con el objeto de evaluar mayor volumen de muestra. a) La preparación se examina con óptica de contraste de fases a 200X ó 250X aumentos b) Se debe examinar el cubreobjetos completo sistemáticamente, campo por campo, realizando un recorrido horizontal por el eje x de extremo a extremo y bajando sobre el eje y en pasos de un campo con un movimiento en zig-zag para realizar una búsqueda completa y sistemática de toda la alícuota. Esto implica el examen de aproximadamente 1200 campos a 250X aumentos en un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (11). Si se observan espermatozoides móviles debe anotarse el porcentaje. Si el número de espermatozoides observados es inferior a 200 (12), la movilidad se informará de manera cualitativa, por ejemplo: se observan espermatozoides con movilidad. 7. Cómo expresar los resultados Si se observan más de 25 espermatozoides en todo el hemocitómetro de Neubauer improved (Por Ej., suma de los dos recuentos = 587), si la diferencia entre los dos conteos es aceptable, se calcula la concentración y se informa el error entre paréntesis. Por ejemplo: Se observan espermatozoides/ml (error ~4%) Si se observan menos de 25 espermatozoides en todo el hemocitómetro, por ejemplo 3, se informa: Se observan 3 espermatozoides en las alícuotas examinadas, insuficientes para realizar una estimación precisa de la concentración (< spz/ml) Si no se observan espermatozoides en todo el hemocitómetro, se informa: No se observan espermatozoides en la muestra recibida (< spz/ml) La ausencia de espermatozoides en las alícuotas examinadas no excluye su presencia en el resto de la muestra 8. Recuperación de la fertilidad 8.1. Vasovasostomía La vasovasostomía es la canalización de los conductos deferentes previamente seccionados. Es una técnica compleja que requiere microcirugía y anestesia general. 42 Documentos de la SEQC - diciembre 2012

6 Recomendaciones para la estandarización del análisis de semen posvasectomía Entre el 1-3 por 1000 hombres vasectomizados solicitan la canalización de los conductos deferentes (3). La presencia intraoperatoria de espermatozoides en el extremo testicular del conducto deferente seccionado, es un índice de buen pronóstico. Es recomendable realizar un análisis de semen previo a la canalización, para confirmar la ausencia de espermatozoides y comprobar el volumen del eyaculado. El espermiograma para valorar la canalización no se realizará antes de seis meses de la cirugía. Se analizarán todos los parámetros básicos de un espermiograma y si es necesario se determinarán parámetros bioquímicos (12) Inyección intracitoplasmática (ICSI) con espermatozoides procedentes del testículo Los espermatozoides se obtienen del testículo mediante biopsias múltiples del testículo (TESE), a fin de conservar la vía seminal, y son utilizados para la realización de una fecundación in vitro con ICSI. Puede realizarse previa a la vasovasostomía o como alternativa al fracaso de ésta Criopreservación seminal preventiva Otra de las opciones para la recuperación de la fertilidad es la criopreservación seminal preventiva (CSP), previa a la intervención de vasectomía. La CSP consiste en la congelación y almacenamiento de espermatozoides que pueden permitir la obtención de descendencia en el futuro, mediante la aplicación de técnicas de reproducción asistida (inseminación artificial, fecundación in vitro convencional ó ICSI). El objetivo principal de la criopreservación de espermatozoides es mantener su viabilidad y funcionalidad a bajas temperaturas (-196ºC) durante largos periodos de tiempo, frenando los procesos de envejecimiento y degeneración celular. La CPS presenta ventajas sobre la vasovasostomía: a) es una técnica no invasiva b) de fácil realización c) de no alto coste económico d) permite mantener las muestras durante largos periodos de tiempo (se han logrado recién nacidos vivos con semen almacenado durante más de 28 años), con resultados en tasas de fecundación similares a las obtenidas con semen en fresco (14). e) su realización no es excluyente de la aplicación posterior de otras técnicas para la recuperación de la fertilidad del varón. Pero también presenta varios inconvenientes: a) Produce una notable disminución de la viabilidad y la movilidad de los espermatozoides, ya que, como promedio, sólo el 50% de los espermatozoides sobreviven a la congelación y posterior descongelación. b) La supervivencia post-descongelación no es predecible, ni está relacionada con los parámetros del análisis seminal (15). c) Existe una alta variabilidad en la supervivencia espermática tras descongelación, incluso intraindividual (entre muestras de un mismo individuo con parámetros seminales similares y usando el mismo protocolo de congelación). d) Implica el empleo de una técnica de reproducción asistida para la mujer, a veces invasiva y no exenta de posibles complicaciones. La eficiencia de la criopreservación de semen puede evaluarse calculando el factor de criosupervivencia (CSF): % espermatozoides móviles post-descongelación CSF= x 100 % espermatozoides móviles pre-congelación Se considera una eficiencia de criopreservación óptima un valor de CSF 50% junto con una movilidad total de 30% con 25% de movilidad progresiva (15). La realización de esta técnica requiere la formalización de un documento de consentimiento informado específico (Ley 14/2006 sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida) (16). 9. RECOMENDACIONES El primer control posvasectomía debería realizarse como mínimo a los tres meses de la intervención y cuando el paciente haya eyaculado al menos 20 veces. Los factores preanalíticos deben considerarse con la misma rigurosidad que cuando se realizan estudios de fertilidad. El tiempo de abstinencia sexual, el tiempo transcurrido desde la obtención de la muestra hasta su análisis en el laboratorio, la higiene previa a la masturbación y el lugar de obtención pueden repercutir en el resultado del análisis. Con el método propuesto por la OMS de análisis de concentración de muestras con pocos o ningún espermatozoide, se incrementa la probabilidad de encontrar espermatozoides en el eyaculado puesto que se examina un volumen mayor de muestra. La alternativa a sedimentar los espermatozoides es diluir menos el semen y examinar volúmenes más grandes (Anexo I). El examen de dos alícuotas diluidas de la muestra en el hemocitómetro Neubauer improved, ha demostrado ser más sensible que la metodología tradicional que combina examen en fresco con centrifugado de la muestra. Cuando se hallen espermatozoides en la cámara de Neubauer improved se debe investigar la movilidad. En el documento clínico más reciente de la Sociedad Canadiense de Urología (13) se contempla dar el alta a pacientes con menos de espermatozoides/ml inmóviles en un solo análisis siempre que se cumplan estrictamente las recomendaciones preanalíticas. Sólo en el caso de encontrar espermatozoides móviles, se recomendará la repetición del espermiograma posvasectomía. El primer análisis de semen tras una vasovasostomía se realizará a los seis meses de la intervención siguiendo la metodología del análisis de semen. 10. BIBLIOGRAFÍA 1. Schwing PJ, Guess HA. Safety and effectiveness of vasectomy. Fertil Steril 2000;73: Hancock P, McLaughlin E. British Andrology Society guidelines for the assessment of post vasectomy semen simples. J Clin Pathol 2002; 55 : Lemack G, Goldstein M. Presence of sperm in the pre-vasectomy reversal semen analysis: incidence and implications. J Urology 1996;155: Griffin T. How little is enough? The evidence for post-vasectomy testing. J Urol 2005;174(4): Labreque M, Hays M, Chen-Mok M, Barone M, Sokal D. Frequency and patterns of early recanalization after vasectomy. BCM Urol 2006;6:25 6. Sokal D, Labreque M. Effectiveness of vasectomy techniques. Urol Clin N Am 2009;36: Aulesa C, Mar C. Recomendaciones en la fase preanalítica para el análisis del semen. Química Clínica 2006; 25(5): Björndahl L, Kvist U. Sequence of ejaculation affects the spermatozoon as a carrier and its message. Reprod Biomed OnLine 2003; 7(4): Aulesa C, Castilla JA. Recomendaciones en el estudio del semen posvasectomía y vasovasostomía. Química Clínica 2007; 26(2): Documentos de la SEQC - diciembre

7 10. Cooper TG, Hellenkemper B, Jonckheere J, Callewaert N, Gootenhuis AJ, Kersemaekers WM, Leung A, Wang C. Azoospermia: virtual reality or possible to quantify? J Androl 2006; 27(4): World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge, UK: Cambridge University Press; Björndahl L., Mortimer D., Barratt C. L., Castilla J.A:, Menkveld R., Kvist U., Alvarez J., Haugen B. (2010) A Practical Guide to Basic Laboratory Andrology. Cambrigde University Press, Cambrigde, UK. 13. Zini A. Vasectomy update Can Urol Assoc J 2010; 4(5): Pellicer A, Ruiz M. Fertilization in vitro of human oocytes by spermatozoa collected in different stressful situations. Hum Reprod Oct; 4 (7): Campos I, Lopez D, Muñoz M, Ruzafa C, Miralles F, Magna R. Congelación de semen. En: Manual práctico de esterilidad y reproducción humana. Remohí J, Cobo A, Romero JL, Pellicer A, Simon C. 2ª ed. Madrid: McGraw-Hill/Interamericana de España, LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida. BOE núm. 126 de 27 de mayo de Anexo III. 11. Anexo I: Argumentos en contra de la centrifugación de las muestras de semen posvasectomía El Manual de análisis de semen de la OMS en su 5ª edición (11) esgrime los siguientes argumentos para no emplear la centrifugación en el análisis de semen posvasectomía: El que se encuentren o no espermatozoides en el sedimento depende del tiempo, de la velocidad de centrifugación y de con qué detalle se examine el sedimento. La centrifugación a 3000g durante 15 minutos no sedimenta todos los espermatozoides de una muestra. Después de centrifugar hay una infravaloración de la concentración y se puede perder movilidad 14. Anexo IV. Competencias de cada Servicio. Propuesta del trabajo del proceso de vasecotomía 12. Anexo II: Cómo preparar diluyente de Weigman Se añaden 50 g NaHCO 3 a 10 ml de formaldehído al 36-40% y se disuelven los constituyentes en agua destilada hasta completar 1000 ml. Filtrar y almacenar a 4ºC. La preparación es estable durante 12 meses a 4ºC. No debe contener partículas sólidas. 44 Documentos de la SEQC - diciembre 2012