Trabajo Práctico Nº 1 Fisiología de las Membranas Biológicas y Potencial de Acción

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1 Trabajo Práctico Nº 1 Fisiología de las Membranas Biológicas y Potencial de Acción Contenidos Mecanismos de transporte a través de las membranas biológicas (transporte pasivo y activo). Conceptos de ósmosis y tonicidad. Fenómenos bioeléctricos: ecuación de Nernst, potencial electroquímico y equilibrio de Gibbs-Donnan. Potencial de membrana en reposo y potencial de acción Cálculo de potenciales y flujos iónicos. Objetivos El alumno deberá ser capaz de: Conocer y definir las características de los distintos tipos y subtipos de mecanismos de transporte a través de las membranas biológicas. Describir los mecanismos que subyacen la generación del potencial de membrana en reposo y del potencial de acción Diferenciar mediante la interpretación de experimentos simples los conceptos de osmolaridad y tonicidad. Predecir el movimiento de un soluto a través de la membrana biológica, teniendo en cuenta su carga eléctrica y la diferencia de concentración entre ambos lados. Guía de estudio para rendir exámenes regulatorios, promocionales y finales 1- Cuáles son las características del transporte pasivo? Qué tipo de sustancias son transportadas por difusión simple, difusión facilitada y difusión por canales? 2- Cuáles son las características del transporte activo? Distinga entre transporte activo primario y secundario. 3- Qué características tiene el transporte de membrana a través de canales? 4- Enumerar los tipos de canales según su mecanismo de activación, y explicar en qué situaciones se activa cada uno de ellos: Dependientes de voltaje, de rectificación interna, operados por ligando, controlados por segundos mensajeros, operados mecánicamente, regulados a nivel de la expresión en la membrana 5- Cuáles son las características de los transportes de tipo especializado, es decir, aquellos que utilizan transportadores de membrana? 6- Defina ósmosis. Defina y diferencie los conceptos de osmolaridad y tonicidad. 7- Defina el concepto de fragilidad osmótica del eritrocito. 8- Qué es la diferencia de potencial electroquímico a través de la membrana para una determinada sustancia? 9- Qué es y cómo se calcula el potencial de equilibrio para un ión? Qué sucede cuando, para un determinado ión, este potencial de equilibrio se iguala con la diferencia de potencial eléctrico de la membrana?

2 10- Qué significa que un ión haya alcanzado el equilibrio termodinámico? Qué sucede con el ión en estas circunstancias? 11- Explique el concepto de potencial de reposo de la membrana. Cuáles son los principales iones que determinan su valor? 12- Defina potencial de acción. Comente las diferencias entre los diferentes tipos de potenciales de acción. CONOCIMIENTOS QUE LOS ALUMNOS DEBEN TENER PARA ASISTIR A SEMINARIOS Y QUE SE DICTAN EN CLASES TEÓRICAS Fundamento del potencial de membrana en reposo Potencial de Acción. Definición, características y tipos Bibliografía Fisiología Humana. Cingolani-Houssay (7º edición) Fisiología. Tresguerres (3º edición) Tratado de Fisiología Médica. Guyton- Hall (11º edición) Elsevier España Biología Celular y Molecular. Lodish-Darnell y col (5º edición) Actividades para el seminario 1- En un modelo celular hipotético nos encontramos con la siguiente distribución iónica:

3 a) Considerando el potencial químico y el eléctrico para cada ión, obtenga la ecuación de Nerst. Qué información nos brinda ésta ecuación? Qué condiciones tuvo que plantear para llegar a ésta conclusión? b) Si esta célula fuera solamente permeable al potasio: - Por qué existe una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la célula? - Podría calcular su valor? c) Supongamos ahora que la célula es sólo permeable al potasio y al sodio, pero diez veces más al sodio: - Qué sucede con el potencial de membrana en reposo? Explique - Podría aproximar el valor del mismo? - Indique lo que ocurre con los gradientes químico, eléctrico y electroquímico de estos iones d) Explique qué significa que un ión esté en equilibrio electroquímico y explique la diferencia de esta situación a la de estado estacionario. e) Discuta el papel del ión cloruro en el potencial de membrana en reposo. Calcule el potencial de equilibrio electroquímico de este ión. f) Cuál es la importancia de que el ion calcio no se encuentre en equilibrio electroquímico en condiciones fisiológicas? 2- a) Cómo se clasifican las células respecto a sus propiedades eléctricas? De ejemplos b) Defina potencial de acción c) Complete el siguiente gráfico donde se esquematizan cambios sucesivos del potencial de membrana durante la generación y desarrollo en un potencial de acción típico registrado utilizando un microelectrodo:

4 d) Identifique las fases sucesivas que caracterizan a un potencial de acción típico uniendo con flechas: Los canales de potasio voltaje dependientes se encuentran abiertos, mientras que los de sodio se encuentran en estado inactivo La puerta de activación de los canales de sodio voltaje dependientes se encuentran abiertas La llegada de un estímulo ocasiona una despolarización local hasta el valor del potencial umbral Potencial de membrana en reposo: los canales de sodio voltaje dependientes están en estado de reposo y los canales de potasio voltaje dependientes se encuentran cerrados Los canales de potasio voltaje dependientes permanecen abiertos, mientras que los de sodio se encuentran en estado de reposo e) Qué entiende por período refractario relativo y absoluto? Identifique qué fases del punto d) corresponden a cada uno f) A continuación esquematice un potencial de acción típico y los cambios asociados en la conductancia de la membrana a los iones sodio y potasio

5 Conductancia (mmho/cm 2 ) Em (mv) Tiempo (mseg) g) Cómo se denomina la gráfica de este tipo de potencial de acción? En las membranas de qué tipo celular se desencadena? h) Existen otras gráficas que representen potenciales de acción? En las membranas de qué tipos celulares se desencadenan? Actividades para el trabajo práctico 1- Explicar los efectos sobre la célula, y las funciones de cada uno de los siguientes tipos de canales ( qué sucederá con el potencial de membrana de una célula al abrirse los canales?): I. Acuaporinas II. De potasio (dependientes de voltaje, dependientes de calcio, de rectificación interna, operados por ligando, sensibles al ATP) III. De sodio (dependientes de voltaje, epiteliales (ENaC)) IV. Catiónicos inespecíficos V. De calcio (dependientes de voltaje, operados por ligando (receptores para el ATP), sensibles al estiramiento) VI. De cloruro (dependientes de voltaje (ClC-1), operados por ligandos (receptores para GABA ó glicina), controlado por AMPc (CFTR))

6 2- Se establecen dos compartimientos separados por una membrana semipermeable como se muestra en la siguiente figura: = Proteinato I II Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - I II Cl - Cl - Cl - TIEMPO CERO EQUILIBRIO a) Cuáles son los iones difusibles? b) Cuáles son los iones no difusibles? c) Describa el movimiento de los iones hasta alcanzar el estado de equilibrio d) Cómo se denomina a dicho estado de equilibrio? e) Cómo es en el equilibrio la concentración total de solutos en el compartimiento I? (MAYOR, MENOR o IGUAL) f) Si la membrana es permeable al agua, se produce flujo osmótico? en qué sentido? g) Relacione lo explicado en la figura con lo que ocurre en la célula. Qué mecanismo contrarrestra la tendencia al flujo osmótico hacia las células? h) Con respecto a lo explicado en g, qué ocurre si se produce depleción de los pooles celulares de ATP? i) En qué situaciones fisiológicas se tiende a alcanzar este estado de equilibrio? j) Cuándo por cualquier circunstancia patológica disminuye la concentración de proteínas en el plasma (hipoproteinemia), existe una alteración en el flujo del agua, provocando lo que se denomina edema. i) Explique el mecanismo por el cual se produce la extravasación de líquido intravascular hacia los tejidos. ii) Qué entiende por efecto Donnan extracelular? 3- Teniendo en cuenta que el potencial de membrana en reposo para una célula muscular es de 90 mv: a) Calcule el potencial electroquímico para el Na +, el y el Cl -. b) Establezca una relación entre la magnitud del potencial y la fuerza del movimiento.

7 c) Ahora, conociendo los valores de potencial electroquímico para el Na + y el ; y sabiendo que el flujo pasivo para el Na + es mol/ cm 2 seg y el de mol/ cm 2 seg; explique a qué se debe la semejanza de los flujos. d) A qué se debe que las concentraciones iónicas son estables en el tiempo si los flujos pasivos netos de estos iones son distintos de cero? 4- Osmolaridad y Tonicidad. Efecto de soluciones hipo e hipertónicas sobre el volumen celular a) Defina y diferencie los conceptos de osmolaridad y tonicidad. b) En base a lo anterior explique lo que sucederá cuando un eritrocito es suspendido en soluciones de NaCl 0,45%, 0,9% y 1,2%. Indique para cada una de las soluciones si es hiper, iso o hipoosmolar y si es hiper, iso o hipotónica. c) Del punto anterior usted puede haber establecido una relación entre la osmolaridad y la tonicidad de una solución que no es correcto generalizar, ya que sólo se cumple para algunas sustancias como por ejemplo el NaCl. Dé ejemplos de sustancias cuyas soluciones no cumplan con esa relación. Parte Práctica Para demostrar los conceptos recién analizados se realizará el siguiente experimento: Con anterioridad, se obtuvo sangre con anticoagulante de una rata anestesiada. Por centrifugación, se separó el plasma del paquete globular. Este último se resuspendió en solución fisiológica y posteriormente se centrifugó y separó. Este procedimiento se realizó 2 veces más. Se obtuvo entonces, un paquete de glóbulos rojos lavados. PARTE A) En tres tubos de ensayo colocar 0,5 ml de estos glóbulos rojos. A uno de ellos agregar 0,5 ml de solución de NaCl 0,9% (TUBO A); al segundo 0,5 ml de solución de NaCl 0,6% (TUBO B) y al tercero el mismo volumen de solución de NaCl 1,2% (TUBO C). A cada una de las suspensiones preparadas, determinar el valor de hematocrito mediante centrifugación utilizando capilares heparinizados (microhematocrito): TÉCNICA: - Llenado Al llenar los tubos capilares hay que tener en cuenta que el extremo opuesto al orificio de llenado de estos permanezca seco. Para determinar el hematocrito se llenarán los tubos capilares hasta un 75 % aprox. de su capacidad. - Cierre Hay que cerrar el extremo seco de los tubos capilares con plastilina. Para ello, los tubos capilares deben pincharse en la plastilina de manera vertical hasta que el borde de los tubos capilares toque el fondo de la placa de plastilina. Incline ligeramente los tubos capilares hacia un lado y sáquelos de la plastilina. - Centrifugado Colóquelos con el extremo cerrado hacia afuera en el rotor de hematocrito y ponga la tapa del rotor. Centrifugue durante 10 minutos.

8 - Lectura del valor de hematocrito Determine el valor de hematocrito mediante un ábaco. 1) Defina hematocrito. 2) Indique a qué tubo pertenece cada microhematocrito realizado. PARTE B) Se preparó una batería de tubos conteniendo cada uno 1 ml de las soluciones indicadas en el siguiente cuadro y luego se les agregó dos gotas de glóbulos rojos. Luego de analizar los resultados obtenidos y teniendo en cuenta la permeabilidad de la membrana a los diferentes solutos utilizados, completar el cuadro, clasificando a cada una de las soluciones según su osmolaridad y tonicidad y correlacione ambos conceptos con el efecto observado. Qué ocurriría si luego del agregado de los glóbulos rojos se agrega 1 ml de NaCl 0.9 % al Tubo 8? Tubo Solución Osmolaridad Tonicidad Efecto 1 NaCl 0,9% 2 NaCl 0,45% 3 NaCl 1,2% 4 Etilenglicol (ETG) 1,86% 5 Urea 1,8% 6 Glucosa 5,4% 7 Urea 3,6% 8 Éter 9 NaCl 0,9% + ETG 1,86% LOS RESULTADOS DE ESTOS EXPERIMENTOS SE ENCUENTRAN EN LA CARPETA CORRESPONDIENTE A ESTE TP, QUE POSEEN LOS AYUDANTES 5- Prueba de fragilidad osmótica de los eritrocitos o determinación de la resistencia globular osmótica Se emplearon 9 diluciones decrecientes de solución cloruro de sodio 0.9 a 0% p/v (0.9%, 0.79%, 0.7%, 0.62%, 0.54%, 0.48%, 0.36%, 0.3%, 0%). Después de prepararlas, se les añadió 1 ml de sangre a cada tubo, se mezclaron por inversión y se dejaron a temperatura ambiente por 30 minutos para completar la hemólisis. El sobrenadante se transfirió a cubetas y se realizó la lectura en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 550 nm. El tubo número 1, el cual contenía la mayor concentración de cloruro de sodio, no produjo hemólisis y se empleó como blanco. El tubo 9, el cual no contenía cloruro de sodio representó el 100% de la hemólisis. Con los datos obtenidos se procedió al cálculo del % de hemólisis en cada tubo estudiado. Cálculo del % de hemólisis:

9 % Hemólisis = Densidad óptica del sobrenadante Densidad óptica del sobrenadante del tubo 9 X 100 1) Por qué la lectura en el espectrofotómetro se realiza a 550 nm? 2) Definir y determinar la resistencia globular mínima y resistencia globular máxima. 3) Cómo esperaría encontrar la prueba de fragilidad osmótica del eritrocito en un individuo con esferocitosis hereditaria? Grafique en un mismo par de ejes la curva que se obtiene en un individuo normal y la que se obtendría en un individuo con esta patología. LOS RESULTADOS DE ESTE EXPERIMENTO SE ENCUENTRAN EN LA CARPETA CORRESPONDIENTE A ESTE TP, QUE POSEEN LOS AYUDANTES