Composición de almidón y proteínas asociadas al gránulo en maíces de razas típicas de Sinaloa

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2 Composición de almidón y proteínas asociadas al gránulo en maíces de razas típicas de Sinaloa Loranda Calderón Zamora 1*, Karen V. Pineda Hidalgo 1, Pedro Sánchez Peña 2, Jeanett Chávez Ontiveros 1, José Ángel López Valenzuela 1. 1 Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, C.P Culiacán, Sinaloa. 2 Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Sinaloa, Km.17.5 Carretera Culiacán-Eldorado, C.P * loris_cz@hotmail.com; jalopez@uas.uasnet.mx; Tel.: Ext 113; Fax: Ext 102. Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular, Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, C. P Culiacán, Sinaloa. Área del Conocimiento:.Agrobiotecnología Resumen en Español: Siente accesiones de diferentes razas en maices de Sinaloa fueron analizadas para composición de almidón, amilosa y proteínas asociadas al gránulo. El contenido de almidón y amilosa varió de 68.5 a 71.9% y 7.7 a 26.0%, respectivamente. La cantidad de proteínas asociadas al gránulo fueron entre a mg/100 mg de almidón. Cuatro de estas proteínas fueron identificadas como almidón sintasa unida al gránulo I (GBSSI), almidón sintasas solubles I y IIa (SSI y SSIIa) y enzima ramificadora IIb (BEIIb). La acumulación de GBSSI varió significativamente entre las accesiones. Palabras claves: almidón, amilosa, proteínas asociadas al gránulo Resumen en Ingles: Seven accessions of different maize races from Sinaloa were analyzed for starch composition, amylose and granule associated proteins. The starch and amylose contents varied from 68.5 to 71.9% and 7.7 to 26.0%, respectively. The amounts of starch granule-associated proteins were between and mg/100 mg of starch. Four of these proteins were identified as granule-bound starch synthase I (GBSSI), soluble starch synthase I and IIa (SSI and SSIIa) and branching enzyme IIb (BEIIb). The accumulation of GBSSI was significantly different among the accesions. Keywords: starch, amylose, granule-associated proteins

3 2 1. Introducción México cuenta con una gran diversidad de maíces criollos de los cuales se pueden elaborar diferentes platillos típicos dependiendo de las características del grano, las cuales a su vez dependen de la composición de almidón (amilosa/amilopectina) y acumulación en forma de gránulos. En la formación del granulo están involucrados cuatro grupos de enzimas, ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa), almidón sintasas (SS), enzimas ramificadoras (BE) y desramificadoras de almidón (DBE), las cuales se acumulan dependiendo del genotipo [1,2] Debido a que en Sinaloa se cultivan maíces criollos para elaborar una amplia variedad de alimentos que dependen principalmente de las características del almidón y la relación amilosa/amilopectina, en el presente trabajo se determinó la variación en la expresión de proteínas responsables de la biosíntesis de los componentes del gránulo de almidón con la finalidad de utilizar esta información en el mejoramiento de características de calidad del grano. 2. Materiales y Métodos Materiales Se utilizaron siete accesiones de maíz (5 individuos/accesión) pertenecientes a seis razas típicas del estado de Sinaloa y representativas de la variabilidad en usos y otras características de interés alimentario. Métodos 1.- Contenido de almidón total Se determinó utilizando un kit de análisis de almidón total (STA20, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) a partir de 50 mg de harina de endospermo. 2.- Contenido de amilosa Se determinó utilizando un kit de amilosa/amilopectina (K-AMYL 04/06, Megazyme, Irlanda).

4 3 3.- Aislamiento de gránulos de almidón y extracción de proteínas asociadas Se llevó a cabo a partir de 10 granos de cada población según lo reportado por Grimaud y colaboradores [3] con algunas modificaciones. 4.- Separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida-docecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) Se realizó de acuerdo con Laemmli [4] en geles de poliacriamida al 10%, a corriente constante (100 V), utilizando una unidad electroforética vertical MP3 (BioRad, Hercules, CA, USA) y una fuente de poder EC (Thermo EC, Waltham, MA, USA). Las proteínas fueron teñidas con una solución de azul brillante de Coomassie R-250 al 0.25% (p/v) (Sigma, St Louis, MO, USA) en 40% de metanol y 10% de ácido acético. Las imágenes de los geles fueron adquiridas con un sistema de fotodocumentación XRS (BioRad, Hercules, CA, USA). 5.-Análisis densitométrico El contenido relativo de GBSSI en cada una de las muestras se determinó por densitometría utilizando el programa Quantity One (BioRad, Hercules, CA). 3. Resultados Colecta Almidón Amilosa PAG (mg/100mg almidón) Chapalote a a ab Dulce a b a Blando a a b Negro a a b Reventador a a a Ocho Culiacán a a b Ocho Concordia a a b Promedio Cuadro 1. Composición de almidón y contenido de proteínas asociadas al gránulo (PAG) en siete accesiones de razas de maíz de Sinaloa.

5 4 A KDa SSIIa BEIIb SSIIa SSIa 54.3 GBSSI B Intensidad Figura 1. Expresión de proteínas asociadas al gránulo en siete accesiones de seis razas de maíces de Sinaloa. (A) Separación electroforética de proteínas asociadas al gránulo (PAG). SSI: almidón sintasa soluble I, SSIIa: almidón sintasa soluble IIa, BEIIb: enzima ramificadora IIa, GBSSI: almidón sintasa unida al gránulo. (B) Cuantificación densitométrica de GBSSI.

6 5 4. Discusión En el Cuadro 1 se muestran las siete accesiones utilizadas para el análisis sobre el contenido de almidón, amilosa y proteínas asociadas al gránulo El contenido de almidón es variable y está relacionado con la raza, variedad, tipo de cultivo y clima [5]. Los porcentajes en el contenido de almidón variaron entre 68.5 y 71.9%, siendo el maíz negro el que presentó el valor más bajo, mientras que el maíz dulce presentó el valor más alto; estos resultados concuerdan con los porcentajes obtenidos en maíces nativos de Argentina ( %) [6]. El contenido de amilosa impacta sobre las propiedades funcionales del almidón, las cuales influyen sobre el uso que se le da en la industria o para los alimentos. El contenido de amilosa para las diferentes accesiones de maíces (Cuadro 1) varió de 7.7% en el maíz dulce a 26% en el maíz de ocho de Culiacán (maíz blanco). A pesar de que el contenido de amilosa obtenido en el maíz dulce es muy bajo con respecto al resto de las accesiones, este resultado concuerda con lo obtenido para arroz dulce, el cual fue de 9.3% [7]. En cuanto al resto de las accesiones, los contenidos de amilosa obtenidos en este trabajo coinciden con lo reportado para maíces normales con valores de amilosa por arriba del 20% [8]. Las proteínas asociadas al gránulo fueron extraídas a partir de 300 mg de almidón, y la concentración de proteína se determinó de acuerdo con Bradford [9]. La concentración de proteínas asociadas al gránulo (PAG) varió de mg /100 mg almidón en el maíz de ocho concordia a mg /100 mg de almidón en el maíz dulce, con un promedio de mg / 100 mg de almidón. Estudios previos [3, 10] reportan una concentración de proteína desde 0.04 hasta 0.16 mg /100 mg de almidón, lo cual, a excepción del maíz dulce, coincide con los resultados obtenidos en este estudio. La Figura 1A muestra la separación electroforética de PAG en geles de poliacrilamida al 10%. Todas las accesiones utilizadas muestran una banda muy intensa, con un tamaño alrededor de 55 kda, la cual corresponde a la proteína almidón sintasa unida al gránulo (GBSSI), responsable de la síntesis de amilosa. Además, se identificaron otras proteínas como las almidón sintasas solubles I y IIa (SSI y

7 6 SSIIa), y la enzima ramificadora IIb (BEIIb), la cuales, en conjunto con GBSSI, han sido consideradas como proteínas estrechamente asociadas al gránulo de almidón. La cuantificación por densitometría de GBSSI (Fig.1B) mostró diferencias significativas en la acumulación de esta proteína entre las razas de maíz reventador y maíz de ocho con respecto al resto de las accesiones. Debido a que GBSSI participa exclusivamente en la formación de amilosa, se esperaría una correlación entre la acumulación de esta enzima y el contenido de amilosa; sin embargo, no se observó una correlación entre ellas. 5. Conclusiones Las razas típicas del estado de Sinaloa presentan una amplia variabilidad en la composición de almidón, principalmente en el nivel de proteínas responsables de la biosíntesis de los componentes del gránulo. Agradecimientos Este trabajo fue financiado por el Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación (PROFAPI). Referencias [1] Jeon, J.S.; Ryoo, N.; Hahn, T.R.; Walia, H.; Nakamura, Y. (2010). Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physiology and Biochemistry 48 (6), [2] Utrilla-Coello, R.G.; Agama-Acevedo, E.; de la Rosa, A.P.; Martinez-Salgado, J.L.; Rodríguez- Ambriz, S.L.; Bello-Pérez, L.A. (2009). Blue maize: morphology and starch synthase characterization of starch granule. Plant Foods Hum Nutr. 64 (1), [3] Grimaud, F.; Rogniax, H.; James, M.G.; Myers, A.M.; Planchot, V. (2008). Proteome and phosphoproteome analysis of starch granule-associated proteins from normal maize and mutants affected in starch biosynthesis. Journal of Experimental Botany 59 (12),

8 7 [4] Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259), [5] Billed de Sinibaldi, A.C.; Bressani, R. (2001). Características de cocción por nixtamalización de once variedades de maíz. ALAN 51 (1), [6] Robutti, J.; Borras, F.; Ferrer, M.; Percibaldi, M.; Knutson, C.A. (2000). Evaluation of quality factor in Argentine maize races. Cereal Chemestry 77 (1), [7] Kaushik, R.P.; Khush, G.S. (1991). Genetic analysis of endosperm mutant in rice Oryza sativa L. Theoretical and applied genetics 83 (2), [8] Agama-Acevedo, E.; Ottenhof, M.A.; Farhat, I.A.; Paredes-López, O.; Ortíz-Cereceres, J.; Bello- Pérez, L.A. (2005). Aislamiento y caracterización del almidón de maices pigmentados. Agrociencia 39 (4), [9] Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem 72, [10] Jae-Wook, Y.; Jae-Yeon J.; Hyun-Jung, C.; Mi-Ryung, K.; Chan-Wha, K.; Seung-Taik, L. (2010). Identification of botanical origin of starches by SDS-PAGE analysis of starch granuleassociated proteins. Journal of cereal science 52 (2),