Introducción a los Bioprocesos
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- Ignacio Santos Saavedra
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1 Introducción a la Biotecnología 2011 IIB-UNSAM Introducción a los Bioprocesos Gastón Ortiz gas.ortiz@gmail.com
2 Introducción a los Bioprocesos Una breve historia Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y más tarde las chinas comienzan a producir alimentos y bebidas fermentadas. Sin embargo, pasan casi 7000 años para descubrir el origen microbiano de la fermentación (1856). Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos químicos industriales (1900). 70 años más para obtener el primer organismo transgénico (1972). Y 5 años más para la obtención de la primera proteína humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
3 Introducción a los Bioprocesos Que es un bioproceso? Es todo proceso industrial que involucra la manipulación de organismos vivos o sus componentes celulares para proveer bienes o servicios Bienes: (antibióticos, hormonas, fermentos, vacunas, ácidos orgánicos, amino ácidos, biocombustibles, biomasa, etc.) Servicios (biorremediación, biolixiviación, tratamiento de efluentes)
4 Introducción a los Bioprocesos
5 De acuerdo a su definición tenemos: Bioprocesos y biotransformaciones. BIOPROCESO Son los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS (nutrientes) son transformados por acción biológica (microorganismos, células, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS Glucosa + amonio + sales + oxígeno BIOMASA + PRODUCTOS + calor Moléculas sencillas Fuentes de carbono y energía, fuente de Nitrógeno y sales BIOTRANSFORMACIÓN Biocatalizador Moléculas complejas Antibióticos, drogas, vacunas, efluente tratado, vitaminas, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, hormonas, Son los procesos en los que sustratos naturales o sintéticos son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimática Enzimas, células inmovilizadas Sustrato + agua Sustrato modificado Moléculas complejas Moléculas sencillas Almidón Glucosa Fructosa
6 Un bioproceso se caracteriza entonces por: Uso de un catalizador biológico: Enzima, microorganismos, células vegetales, células animales, células insecto, hongos filamentosos, algas, plantas y animales Uso de un Biorreactor: La reacción ocurre en forma controlada Artificial Generación de un Producto o Servicio
7 Upstream Process Downstream Process
8 Introducción a los Bioprocesos Aspectos básicos b de un proceso Biotecnológico Upstream Processing Process Downstream Processing Elección del microorganismo. Preparación de medio (Formulación). Esterilización. Preparación del inoculo. Elección del reactor. Elección del sistema de operación: Bacth; Alimentado; Sistema Continuo; etc. Estequeometría y cinética. Instrumentación y control. Recuperación del producto por medio de operaciones unitarias (físicas/químicas) Acondicionamiento y estabilización del producto Formulación del producto
9 El microorganismo productor Tenemos varias posibilidades Partir del microorganismo productor wild type Microorganismos modificados genéticamente para tal fin. Recurrir a sistemas de expresión heteróloga
10 Microorganismos productores wild type Ventajas Generalmente suele ser el mejor productor. (seleccionado por la naturaleza) La manipulación genética es mínima o nula, esto nos ahora tiempo y dinero. Posibles desventajas Puede que no cumpla con las normas GRAS (Generally recognized as safe) Su utilización pueden presentar dificultades al momento del escalado y etapas danwstream. Ej hongos filamentosos.
11 Algunos microorganismos productores wild type Ac. orgánicos Alcoholes
12 Algunos microorganismos productores wild type Antibióticos Enzimas
13 Sistemas de expresión heteróloga Son utilizados para la producción de proteínas recombinantes Ventajas Sistemas preparados para una finalidad determinada Amplia variedad de hospedadores Gran variedad de herramientas moleculares disponibles (vectores, marcadores de selección, etc.) Desventajas No siempre el producto final posee las mismas características que el deseado. Es por eso que debemos poner énfasis en elegir el mejor sistema de expresión para nuestro fin
14 Sistemas de expresión heteróloga A tener en cuenta para la elección del sistema de expresión Productividad (es difícil determinar a priori pero se un buen tip es comenzar con una búsqueda de bibliografía) Complejidad estructural Modificaciones postraduccionales Bioactividad de la proteína de interés Manipulación del sistema de expresión Bioseguridad del sistema de expresión
15 Sistemas de expresión heteróloga
16 Sistemas de expresión heteróloga: Escherichia coli Ventajas Alta tasa de crecimiento Amplio conocimiento de su genética y fisiología Fácil manipulación genética: gran variedad de vectores y cepas disponibles, alta eficiencia de transformación, etc) Fácil de cultivar Bajo costo de cultivo Alta acumulación de proteínas recombinantes (30% del total celular). Lisis y recuperación relativamente sencilla Desventajas No es GRAS Contaminación con endotoxinas Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión No posee modificaciones postranducionales
17 Sistemas de expresión heteróloga: Escherichia coli Desventajas No todos los genes se expresan eficientemente debido a: Características de la secuencia nucleotídica del gen endógeno. Estabilidad y eficiencia traducción del RNAm Diferencias de uso de determinados codones de Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formación de puentes S-S. Toxicidad de la proteína recombinante No es GRAS Contaminación con endotoxinas Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión Generalmente se requiere un refolding de la proteína No posee modificaciones post-traduccionales
18 Sistemas de expresión heteróloga: Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris) Ventajas Unicelular eucariota, fácil crecimiento y manipulación Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales (glicosilación, acetilación, fosforilación, eliminación del Met- 1, procesamiento proteolítico de precursores) Fácilmente escalable Bajo o nulo nivel de endotoxinas Proteínas extracelulares e intracelulares Desventajas Baja eficiencia de transformación Hiperglicosilación (S. cerevisiae principalmente)
19 Crecimiento microbiano En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos. Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como en un reactor: Estequiométrico: Nos permite conocer la concentración final de microorganismos a obtener a partir de datos de la composición del medio de cultivo, saber si hay formación de algún producto, etc. Cinético: Nos dice con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.
20 Crecimiento microbiano (Estequiometría) Rendimientos Dada la ecuación de crecimiento microbiano S FCE + N FN + B O2 X Biomasa + P Producto + W H2O + C CO2 Para poder conocer la Estequiometría del proceso es necesario conocer los coeficientes (S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de: Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa, EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de carbono y energía consumida FCE (glucosa, glicerol, etc) Por que el signo negativo? Como seria el rendimiento para el nitrógeno?
21 Crecimiento microbiano (Estequiometría) El carbono mol (C-mol) Si deseamos efectuar cálculos estequiométricos debemos conocer el rendimiento en moles. La pregunta es qué peso de células (o biomasa) corresponde a "un mol"?. Experimentalmente se vio que la composición elemental promedio de un microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = De la cual podemos definir una "fórmula mínima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que está representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales) Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene un átomo gramo de Carbono. Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta representado por CH20 y pesará 30 g En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado es: Cn Hf Oq Nm C Hf/n Oq/n Nm/n 12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n Donde σx tiene unidades de (cmol/g) de X Donde σs tiene unidades de (cmol/g) de S
22 Crecimiento microbiano (Estequiometría) Ecuación de crecimiento y balances de materia Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta Como seria el balance de materia para el Nitrogeno? Tarea plantear los balances para el resto de los componentes Hidrogeno y Oxigeno De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. fórmula mínima de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2 Yx/s es f (FCE, FN) y de cómo c son estos son metabolizados De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fuentes
23 Crecimiento microbiano (Cinética) Velocidades volumétricas y especificas Donde µ = rx/x Los rendimientos pueden expresarse como cocientes de velocidades Y x/s = rx/rs = µ/qs Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto nos llevaría a pensar que el microorganismo consume FCE a la misma velocidad en ambos tiempos. Esto es engañoso por que al final del cultivo hay mas células A diferencia de las velocidades volumétricas, las velocidades especifica nos dan idea de lo que ocurre en el cultivo
24 Crecimiento microbiano (Cinética) Ecuación de Monod dependencia de µ con el Sustrato limitante El sustrato limitante es aquel que controlara la velocidad de crecimiento del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE Monod estudio la dependencia del µ con el sustrato limitante y encontró que la incorporación de un sustrato limitante a la célula sigue una cinética del tipo de Michaelis-Menten Supuestos de Monod El proceso difusión del sustrato limitante es rápido comparado con la cinética de crecimiento El sustrato es metabolizado por una única E que controla la velocidad de todo el metabolismo El proceso sigue la cinética de Michaelis-Menten
25 Crecimiento microbiano (Cinética) De que factores depende el µ? El sustrato limitante S >> Ks µ = µm S<< Ks µ = f (S) La composición del medio de cultivo (FCE, FN) afectan al µ
26 Crecimiento microbiano (Cinética) De que factores depende el µ? ph 10 g/l FCE
27 Crecimiento microbiano (Cinética) Mantenimiento celular Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como Y x/s = rx/rs = µ/qs Pero esta ecuación solo nos dice que el consumo de sustrato solo es posible cuando hay crecimiento. Pregunta: puede ocurrir consumo de sustrato sin que se produzca crecimiento (generación de biomasa)? Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su homeostasis. A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt) rs = r s + ms.x Ecuación de Pirt qs = (µ / Y x/s) + ms.x Divido por µ.x Otra forma de la ecuación de Pirt 1/Yx/s = (1 / Y x/s) + ms/µ Y x/s es el rendimiento máximo teórico el que tendría si no hay mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el real el que mido
28 Crecimiento microbiano (Cinética) Mantenimiento celular Qué factores afectan el mantenimiento? Ayuda (qs - (µ / Y x/s)) / X = ms Resp. Todos los factores que afectan al µ y al Y x/s Temperatura, ph Composición del medio de cultivo particularmente naturaleza del sustrato limitante (recordar la dependencia de µ con S Monod ) Presión osmótica
29 Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Película Como llega el oxigeno al microorganismo? 1 debe este disolverse en el líquido (Burbujas). Ley de Henry (PO2 = H.C*) 2 debe transferirse desde la burbuja al microorganismo. Ley de Fick (JO2 = -DO2.(dC/dX)) El modelo que combina estos dos principios es el modelo de la película, este nos dice Que existe una película estanca de líquido alrededor de la burbuja en donde la transferencia de materia sigue la ley de Fick La fuerza impulsora de esta transferencia es la diferencia de Concentraciones entre el seno del liquido y la Burbuja
30 Transferencia de Oxigeno Kla Fick Henry C* = PO2 / H JO2 = -DO2. (dc/dl)
31 Transferencia de Oxigeno. Factores que afectan al Kla. Agitación: si aumenta la agitación aumenta el Kla por que: Disminuye el espesor de la película (pendiente mas pronunciada) Disminuye el tamaño de la burbuja el área volumétrica (A) aumenta. Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el Kla por que: Aumenta el espesor de la película Temperatura: el Kla aumenta con la raíz cuadrada de la temperatura, dado que el coeficiente de difusión aumenta con la temperatura. Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensión superficial forman burbujas mas chicas aumenta el área volumétrica de transferencia Antiespumantes: estos aumentan la tensión superficial, burbujas mas grandes, disminuye el Kla
32 Consumo de Oxigeno Bueno sabemos que: El suministro de oxigeno esta dado por Ro2 La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la ecuación de Monod. Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno disuelto. Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno, es decir no se limite en oxigeno. El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max. Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con la siguiente igualdad. Kla = ro2 max / (C* - Cc)
33 Transferencia de Oxigeno Equipo Kla Tubo de ensayo sin agitación 10 Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su capacidad y agitación Reactor tipo tanque agitado según la agitación Tipo Celular µmax Kla apropiado Cél. Animales Cél. Vegetales Bacterias Levaduras Hongos filamentosos
34 Bioreactores Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentador, El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el desarrollo de los microorganismos Para eso un biorreactor debe poseer: Sistema de Mezclado: Debe mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación. Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes. Sistema de Termostatización: Debe mantener constante y homogénea la temperatura. Sistema de Oxigenación: n: Debe suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo Sistema de Esterilidad: El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores de mas de 100 l o vidrio menor volumen). Fácil de limpiar y de esterilizar (por calor húmedo preferentemente) Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire) Sistema de Control y Automatización: Debe garantizar las condiciones estables de ph, O2, agitación y temperatura como mínimo, también puede controlarse el volumen por medio de la alimentación, nivel de espuma, etc.
35 Biorreactores de uso mas frecuentes Tanque agitado Ventajas Alta flexibilidad de operación (controlada por agitación y flujo de gas). Desventajas Mecánicamente complejos (agitador, eje, sellos, etc.). En muchas ocasiones provocan alta cizalladura. Transferencia de O2 limitada por el diseño de las paletas Difíciles de limpiar; mayores posibilidades contaminación en operaciones extendidas
36 Biorreactores de uso mas frecuentes Air Lift Características Estructura sencilla. Agitación por inyección de aire. Separación física de las corrientes ascendentes y descendentes. Adecuado rendimiento de transferencia de materia y calor. Bajo shear. Usos: Cultivo de células animales, vegetales, procesos con catalizadores inmovilizados, producción de proteínas unicelulares a partir de metanol y tratamiento de aguas residuales.
37 Biorreactores de uso mas frecuentes Columna de burbujeo Características Estructura sencilla. Agitación por inyección de aire. Bajo shear. Adecuado rendimiento de transferencia de materia y calor. Bajo costo. Usos: Producción de levaduras de panificación, cerveza, vinagre, tratamiento de aguas residuales.
38 Biorreactores Agitación mecánica (Tanques agitados) Mecánicamente complejos (agitador, eje, sellos, etc.) En muchas ocasiones provocan alta cizalladura Carga de gas limitada por inundación del impelente Flexibilidad de operación (controlada por velocidad impelente y flujo de gas) Difíciles de limpiar; mayores posibilidades contaminación en operaciones extendidas En medios no-newtoniano se crean canales de gas a través de zona impelente Agitación neumática (Airlift, y Columnas de burbujeo) Mecánicamente simples y robustos Muy baja cizalladura, adecuados para cultivos frágiles Posibilidad de admitir altas cargas de gas (especialmente los airlift) Limitada flexibilidad. Requieren de un diseño más cuidadoso Fáciles de limpiar, posibilitan operación aséptica extendida Distribución más uniforme de la turbulencia
39 Sistemas de operación o de cultivo Llamamos así al modo de operar el biorreactor, este puede ser de forma continua o discontinua. Balance de materia Suponemos mezclado perfecto Velocidad de acumulación Velocidad de ingreso Velocidad de salida Velocidad de formación Velocidad de consumo Acumulación n de volumen Opera en continuo Opera en discontinuo Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres tipos de cultivos. Si F1 = F2 Tenemos un Cult.. Continuo. Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Cult.. Alimentado. Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Batch.
40 Cultivo en batch Es el cultivo mas simple Se realiza a volumen constante La composición inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo
41 Ecuación de diseño de un batch En un Batch tenemos que F1 = F2 =0 Batch Por lo que = 0 = cte Entonces el balance de materia nos queda Como V= cte
42 Descripción matemática del Batch en fase exponencial Para que nos sirve todo esto? Para calcular el tiempo que nos demandara el proceso.
43 Descripción matemática del Batch limitado en Oxigeno Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno? los microorganismos continúan creciendo? el tiempo del proceso se verá afectado? Resp. 1: Sí, continúan creciendo. En estas condiciones el microorganismo continua creciendo pero quien manda a que velocidad debe hacerlo es el sustrato limitante en este caso el Oxigeno Resp. 2: Sí, el tiempo del proceso será mayor Por qué?
44 Características de un cultivo batch La duración del cultivo batch depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes disponibles. Cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch. El crecimiento puede cesar también por la acumulación de algún producto toxico. (esto se puede solucionar con un cultivo continuo)
45 Cultivo continuo Batch Cult.. continuo Se inicia con un batch
46 Ecuación de diseño de un cultivo continuo Cult.. continuo En un C. Continuo tenemos que F1 = F2 = F Por lo que = 0 = cte V= cte El balance de materia nos queda Despejando V Donde D = F / V y es la velocidad de dilución. En el estado estacionario
47 Balances de materia en continuo Biomasa Sustrato: Para el sustrato tenemos El sustrato limitante es quien controla la velocidad de crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la ecuación de Monod en términos de la velocidad de dilución D Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenemos la dependencia de X con D
48 Balances de materia en continuo Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado estacionario, tenemos la dependencia de X con D. Nos dice que cual será la concentración de biomasa en el estado estacionario Situación real cuando tengo mantenimiento Velocidad óptima de operación 80% del µmax Dc Dilución critica cuando el D es igual al µmax
49 Cultivo continuo Aplicaciones del cultivo continuo Permite obtener los parámetros de crecimiento µmax, ms, Ks, Y x/s, entre otros. Permite realizar estudios fisiológicos. Podemos discriminar los efectos de la velocidad de crecimiento µ, de la composición del medio de cultivo y del ph y la Temperatura, sobre la fisiología celular del microorganismo. Permite realizar estudios de ingeniería metabólica. Inconvenientes del cultivo continuo Inestabilidad genética de la cepa en cultivos extendidos (perdida de plásmidos) Riesgos de contaminación en cultivos extendidos.
50 Cultivo Batch Alimentado En este tipo de cultivos el volumen varia con el tiempo debido a la alimentación esto permite mantener controlada la concentración Ci dentro del reactor. El objetivo de este cultivo es Al igual que el continuo es evitar la acumulación de productos tóxicos o inhibitorios Controlar la velocidad de crecimiento µ de forma constante (alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor (alimentado lineal) Incrementar la obtención de productos como intermediarios del metabolismo primario y proteínas recombinantes Maximizar la producción de biomasa o de proteínas unicelulares.
51 Productos Productos de bajo peso molecular: alcoholes, ác. orgánicos, aa, nucleótidos, antibióticos, etc. Tipo I: Productos finales del catabolismo anaeróbico Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario Tipo III: Productos del metabolismo secundario Productos de alto peso molecular: Productos de alto peso molecular: polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas etc.
52 Productos Tipo I (productos finales del catabolismo anaeróbico) En este grupo tenemos: etanol, acido láctico, acético, butírico, butanol y otros compuestos asociados a procesos anaeróbicos. Su formación es consecuencia directa de la degradación FCE acoplada a la producción de ATP por fosforilación al nivel del sustrato.(proceso anaeróbico) Siguen una cinética qp =αµ + β Donde β es directamente proporcional al ms y α con 1/Y x/s. Por lo que para este tipo de productos busco: Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura o tonicidad del medio. Que m se lo mas pequeño posible, lo logro por ejemplo limitando en Nitrógeno al cultivo. En definitiva busco un Y x/s bajo de forma tal que todo el sustrato sea destinado a la formación de productos
53 Productos Tipo II (Intermediarios del metabolismo primario) En este grupo tenemos: aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y ácidos orgánicos provenientes del ciclo de krebs. En este caso los procesos de obtención son aerobios. A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia directa entre la FCE y la obtención del producto. Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario, los microorganismos mas utilizados son los modificados genéticamente y estos se combinan con un buen sistema de cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo). Ejemplo: producción de lisina por Corynebacteriuin glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasa auxotrofo para metionina y treonina
54 Productos Tipo II (Ej. producción de lisina) La estrategia para obtener lisina consiste en: Realizar el cultivo en condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima. Cómo se logra esto? Limitando el cultivo en treonina (batch alimentado exponencial o cultivo continuo) Esto nos demuestra lo importante que resulta la elección del sistema de cultivo adecuado para nuestra cepa. Retroinhibición concertada Auxotrofo
55 Productos Tipo III (Metabolitos secundarios) En este grupo tenemos: antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas. Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis. Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de regulación de la síntesis de los precursores. Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente que el ms sea lo menor posible. Por otra parte las fuentes de nitrógeno fácilmente metabolizadas como sulfato de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja. Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a µ bajos. A µ altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas (represión catabólica) Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su acumulación inhibe su síntesis) Pregunta: que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos? El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el µ y mantener a raya el feed back negativo del producto
56 Resumen productos Tipo: I, II y III Producto Tipo cultivo ms? µ? Sistema de cultivo I Anaerobio Alto Bajo Batch limitado en nitrógeno Batch alimentado Cultivo continuo II Aerobio Alto o Bajo (depende del producto) Bajo Batch alimentado Cultivo continuo III Aerobio Bajo (la formación de producto consume energía) Bajo Batch alimentado Cultivo continuo Biomasa Aerobio Bajo Alto (siempre y cuando a m altos no forme productos). Ej. efecto crabtree en S. cereviciae Batch alimentado
57 Productos de alto peso molecular En este grupo tenemos: polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas, etc. Es importante entender la cinética de formación le estos productos, para ello definimos: La concentración intrínseca de nuestro producto i (enzima, antígeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X) Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.proteínas, UE, etc y X son los g.biomasa. Por otra parte la velocidad neta de formación de nuestro producto será igual a lo que se forma menos lo que se degrada. La variación de la concentración intrínseca en el tiempo es: Tenemos dos factores que afectan a Ri La velocidad neta de producción La velocidad con la que se diluye (µ.ri)
58 Productos de alto peso molecular Para maximizar su producción Entonces Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde la velocidad de producción debe ser igual a la de dilución Cómo lo logro? Experimentando a varios D en un continuo Enzima inducible en K. Latis K. lactis limitado en lactosa D (h-1) 0,1 0,25 Ri (UE/mg.biomasa) 8,25 18,3
59 Downstream Processing 1. SEPARACIÓN N CELULAR Intracelular remoción del componente más abundante 2. DISRUPCIÓN CELULAR Es muy importante la elección del PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayoría a de los contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor importancia 3. REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES Y DESECHOS 4. CONCENTRACIÓN 5. PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN Extracelular 6 ACABADO
60 Downstream Processing 1. Remoción celular: centrifugación y filtración. 2. Disrupción celular y separación de restos celulares: Homogenizadores: La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer). Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco. La concentración celular no afecta la eficiencia Es necesario refrigerar (4-5ºC) Los modelos más grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias) Molinos de perlas Las células se rompen mediante la abración generada por pequeñas perlas de vidrio ( mm φ) concentración de células afecta la eficiencia, la concentración óptima 30-60% peso húmedo Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h Ruptura química o enzimática Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
61 Downstream Processing 3. Separación de restos celulares centrifugación (no adecuada) Ultrafiltración (300, ,000 o mayor) Microfiltración (0.1µ m.) Partición en dos fases acuosas CDR (cell Debris Remover: Whatman) 4. Concentración Los productos deben concentrarse hasta veces. Técnica preferida : Ultrafiltración partición líquido-líquido. Extracción con solventes Precipitación (sulfato de NH4) Evaporación o destilación
62 Downstream Processing 5. Purificación de alta resolución Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) Cromatografía de intercambio iónico de alta resolución Cromatografía de afinidad Cromatografía metal quelante (IMAC) 6. Acabado Esterilización y estabilización del producto Deshidratación, liofilizado, estabilización (sales)
63 Downstream Processing Cómo elegimos las operaciones y la secuencias? Utilizando de las reglas de oro de la purificación REGLA 1 Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas REGLA 2 Separar las impurezas más abundantes primero Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial REGLA 3 Seleccionar un procesos que permita aprovechar al máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes. Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas REGLA 4 Realizar las separaciones más caras y difíciles al final KEEP IT SIMPLE!
64 Bibliografía Microbiología Industrial. Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone. Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5, Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation] - M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999) Bioprocess Engineering Principles. Pauline M. Doran Cat. de Biotecnología - Bioprocesos II UNQUI Cat. de Ingeniería bioquímica UNLP
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