FIRMA DEL (DE LA) DIRECTOR(A) DEL PROYECTO JORGE ENRIQUE ARAYA ROJAS

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1 PROYECTO FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO INFORME FINAL TITULO DEL PROYECTO: ARACTERIZACION A NIVEL MOLECULAR DEL VENENO DE LOXOSCELES LAETA (ARAÑA DE RINCON). OBTENCION DE UN A NTIDOTO ESPECIFICO Y ELABORACION DE UN KIT DIAGNOSTICO PARA DETECCION TEMPRANA DE LA MORDEDURA CÓDIGO DEL PROYECTO: D04I1247 FECHA DE EMISION: 09/04/2011 FIRMA DEL (DE LA) DIRECTOR(A) DEL PROYECTO JORGE ENRIQUE ARAYA ROJAS

2 I. Acta De Término Del Proyecto 1.1 Identificación del proyecto TITULO DEL PROYECTO CÓDIGO FONDEF DIRECTOR(A) DEL PROYECTO INSTITUCIÓN(ES) BENEFICIARIA(S) BIOS CHILE INGENIERIA GENETICA S.A. UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA, ASISTENCIA TECNICA S.A EMPRESA Y OTRAS ENTIDADES ASOCIADAS ARACTERIZACION A NIVEL MOLECULAR DEL VENENO DE LOXOSCELES LAETA (ARAÑA DE RINCON). OBTENCION DE UN A NTIDOTO ESPECIFICO Y ELABORACION DE UN KIT DIAGNOSTICO PARA DETECCION TEMPRANA DE LA MORDEDURA D04I1247 JORGE ENRIQUE ARAYA ROJAS UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA BIOS CHILE INGENIERIA GENETICA S.A. UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA, ASISTENCIA TECNICA S.A

3 1.2 Ejecución del proyecto FECHA DE TOMA DE RAZON POR LA CONTRALORÍA 25/01/2006 GENERAL DE LA REPÚBLICA DURACIÓN CONTRACTUAL 30 FECHA EFECTIVA DE INICIO 20/03/2006 FECHA EFECTIVA DE TÉRMINO 20/06/2010 DURACIÓN EFECTIVA 51

4 1.3 Plan de Continuidad Nombre Institución Beneficiaria Nombre Representante Legal Firma UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA LUIS ALBERTO LOYOLA MORALES Firma Electrónica

5 1.4 Tabla de Conformidad Nombre Institución Empresa u Otra Entidad Socia BIOS CHILE INGENIERIA GENETICA S.A. UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA, ASISTENCIA TECNICA S.A Nombre Representante Legal ARTURO YUDELEVICH SIROTA Documento conformidad Si Si

6 II. Informe Ejecutivo 2.1 Resumen Ejecutivo Versión en Castellano En el presente proyecto se realizó un kit de diagnóstico inmunocromatográfico con el propósito de contribuir al diagnóstico y manejo de la mordedura de Loxosceles laeta (araña de rincón) en forma temprana y oportuna, para instalar tratamiento de primera línea frente a la acción del veneno de este arácnido. Inicialmente se utilizó anticuerpos policlonales que fueron producidos contra el veneno total y contra 2 proteínas recombinantes (LlPLD1 y LlPLD2), los cuales fueron capaces de inhibir la actividad hemolítica y dermonecrótica en ensayos in vitro e in vivo en conejos, respectivamente. De igual manera, se produjeron anticuerpos monoclonales contra el veneno total y contra las proteínas recombinantes anteriormente descritas. Estos anticuerpos reconocen en forma específica y con una alta sensibilidad sus antígenos respectivos, e inhiben la actividad hemolítica y dermonecrótica de los componentes del veneno. Finalmente, para el desarrollo del Kit diagnóstico se utilizó anticuerpos monoclonales de alta sensibilidad y especificidad, cuatro de ellos producidos en el Laboratorio de la Universidad de Antofagasta y 1 en el Laboratorio de BiosChile. Los anticuerpos monoclonales ya purificados, reconocieron proteínas del veneno de L.laeta en el rango de 30,5 a 35,7 kda y las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2, que son antígenos constituyentes del veneno de L. laeta. Ensayos preliminares a nivel de laboratorio se llevaron a cabo utilizando el kit prototipo armado inmunocromatográficamente con anticuerpo monoclonal, utilizando como volumen de muestra mínimo 50 ul y máximo de 100 ul, y como tiempo de lectura mínimo 5 min y máximo de 1 hora con una solución de recolección y transporte de la muestra tamponada a ph 7,5. La sensibilidad se evaluó frente a veneno reciente de L.laeta en un rango de 50 a 0,375 µg/ml, pudiendo el kit detectar en estas condiciones hasta una concentración de 3 µg/ml, mientras que con las proteínas recombinantes PLD-1 y PLD-2 logró detectar hasta una concentración de 0,1 µg/ml. La evaluación de especificidad del kit se realizó frente a veneno de Abeja (Apis mellifera), escorpión azul (Rhopalurus junceus) y de la araña del trigo o viuda negra (Latrodecutus mactans), frente a ninguno de los cuales se observó reacción cruzada. También se evaluó el rendimiento del kit in vivo frente a mordedura experimental de L.laeta en conejos, demostrándose positividad en las lecturas a los minutos y hasta las.horas. De esta forma se evidencia que es factible el uso de anticuerpos monoclonales para detectar componentes del veneno de L.laeta mediante su incorporación a un kit inmunocromatográfico para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de la mordedura de la araña de rincón L.laeta. Esta línea de trabajo ha generado nuevos conocimientos y líneas de investigación en el ámbito de la salud pública. Generó nuevo conocimiento sobre el veneno de este arácnido y aplicaciones biotecnológicas de alto valor para evitar las complicaciones e incluso la muerte por la mordedura de L.laeta. El mercado para el producto, desarrollado como kit diagnóstico de fácil acceso a todo público, posee un potencial enorme, tanto social como empresarial, pues contribuye a resolver un problema de salud pública y abre oportunidades a las empresas del rubro para invertir y comercializar el paquete tecnológico. Los principales impactos logrados con este proyecto se pueden resumir en: a) Científico-Tecnológico: El uso de anticuerpos monoclonales para fabricar un kit inmunocromatográfico de diagnóstico temprano de la mordedura por L. laeta en personas. Estos anticuerpos además, constituyen el soporte tecnológico para el desarrollo de un antisuero para el tratamiento específico frente al veneno de L.,laeta. b) Económico-Social: Comercialización de un kit efectivo para el diagnóstico y manejo del loxoscelimo en salud pública. Se puede mejorar significativamente el tratamiento con el futuro desarrollo del antisuero. c) Institucional: i) Aumento del número de especialistas con formación en aplicación de anticuerpos monoclonales. ii) Potenciamiento de la investigación multidisciplinaria en el área inmunológica-molecular. iii) Aumentar las relaciones investigación-empresas en áreas relevantes de desarrollo. iv) Aumentar la relación con la comunidad resolviendo problemas como los planteados.

7 Versión en Ingles In this project we developed an immunochromatographic diagnostic kit to contribute to the early and opportune diagnosis and treatment of the bite of the corner spider Loxoscles laeta, to provide a first line therapy against the action of the venom of this spider. We initially used two polyclonal antibodies which were produced against the total venom and against two recombinant proteins (LIPLD1 and LIPLD2); these antibodies were capable of inhibiting the hemolytic and dermonecrotic activity in tests in vitro and in vivo using rabbits. We then produced monoclonal antibodies against the total venom and the same two recombinant proteins. These antibodies recognize their respective antigens specifically and with high sensitivity, and inhibit the hemolytic and dermonecrotic activity of the components of the venom. Finally, to develop the diagnostic kit we used monoclonal antibodies of high sensitivity and specificity, four of which were produced in the laboratory of the Universidad de Antofagasta and one in the laboratory of BiosChile. The purified monoclonal antibodies recognized proteins of the venom of L. laeta in the range of 30.5 to 35.7 kda and the recombinant proteins LIPLD1 and LIPLD2, which are constituent antigens of the venom of L. laeta. Preliminary laboratory tests were performed using the prototype kit prepared immunochromatographically with monoclonal antibodies, using a minimum sample volume of 50 µl and a maximum of 100 µl, minimum reading time of 5 min and maximum of 1 hour, with a solution for sample collection and transport buffered at ph 7.5. The sensitivity was evaluated against fresh venom of L. laeta in a range of 50 to µg/ml. In these conditions the kit detected concentrations down to 3 µg/ml, and detected the recombinant proteins PLD-1 and PLD-2 at concentrations of 0.1 µg/ml. The specificity of the kit was evaluated using the venoms of bees (Apis mellifera), blue scorpions (Rhopalurus junceus) and black widow spiders (Latrodecutus mactans); cross reactions were not observed for any of these three species. We also evaluated the performance of the kit in vivo in experimental bites of rabbits; a positive reaction was obtained in readings from XXX minutes to XXX hours. These experiments demonstrated the feasibility of the use of monoclonal antibodies incorporated in an immunochromatographic kit to detect components of the venom of L. laeta to improve the diagnosis and treatment of the bite of the corner spider. This line of research has generated new knowledge and areas of investigation in the area of public health. It generated new information about the venom of this spider, and valuable biotechnological applications which help to avoid the complications and possible death from the bite of L. laeta. The market for the product, developed as a diagnostic kit with easy access for everyone, has enormous social and commercial potential, since it contributes to the solution of a public health problem and provides an opportunity for specialized companies to produce and commercialize the technological package. The principal impacts produced by this project may be summarized in several areas: a) Scientific-Technological: The use of monoclonal antibodies to produce an immunochromatographic kit for the early diagnosis of the bite of L. Laeta in persons. In addition, these antibodies provide the technological support for the development of an antiserum for the specific treatment against the venom of L. laeta. b) Economic-Social: The commercialization of an effective kit for the diagnosis and treatment of loxoscelism in public health. Treatment may be significantly improved with the future development of an antiserum. c) Institutional: i) An increase in the number of specialists with preparation in the application of monoclonal antibodies. ii) Stimulus of multidisciplinary research in the immunological-molecular area. iii) An increase in the relations between investigators and companies in relevant areas of development. iv) An increase in the relations with the general public, contributing to resolve a public health problem.

8 2.2 Cuadro De Sintesis de Resultados y Objetivos Objetivos Generales Nombre Objetivo Descripción OBJETIVOS GENERALES Desarrollar un antídoto específico y un sistema de detección/confirmación temprana para el tratamiento de la mordida de la araña del rincón mediante el uso de las herramientas de biología molecular, proteomica e inmunología, permitiendo adicionalmente establecer las bases preliminares para la identificación de fármacos existentes con acción bloqueadora del mecanismo de acción del envenenamiento que permitan desarrollar un sistema de tratamiento clínico especializado. Objetivos Específicos Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 1 Desarrollar y evaluar un antídoto constituido por anticuerpos monoclonales Descripción humanizados para el tratamiento de la mordedura de araña del rincón. Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 2 Desarrollar un sistema de diagnóstico temprano para mordedura de araña Descripción del rincón que permita la producción de un Kit de diagnóstico comercializable. Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 3 Identificar y evaluar acción de drogas ya en uso para otras patologías y/o moléculas que presenten actividad farmacológica antagónica contra los Descripción componentes biológicos más activos del veneno de arañas del género Loxosceles. Tipo Nombre RESULTADO Resultado de Producción ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS

9 Descripción Descripción del Logro Es una formulación médica inyectable. Indicada para el tratamiento de mordeduras de animales ponzoñosos (atención médica) para evitar los efectos nocivos (sea el cuadro visceral o el cuadro dérmico) de una mordedura de este arácnido. Su innovación es una alta eficacia y nula contraindicación (por lo tanto pueden ser aplicados incluso preventivamente) al ser anticuerpos monoclonales humanizados y seleccionados por su acción específica de inactivación sobre los elementos más activos y dañinos de la toxina de loxosceles laeta (araña de rincon). Principales competidores serían los sueros antiloxoscélicos actualmente existentes, los cuales no se sabe si tienen algún efecto y son potencialmente peligrosos, se usan solo en casos extremos como ayuda al tratamiento pero nunca se ha sabido si es realmente eficaz. Principal diferencia operacional es que al no haber contraindicaciones el suero se puede administrar aún sin la certeza de que la mordida es por Loxosceles laeta, no se espera ningún efecto secundario negativo. Principal diferencia funcional es que los anticuerpos son humanizados (sin reacción alérgica potencial) y seleccionados específicamente para inactivar las moléculas altamente peligrosas del veneno (caracterizadas previamente a nivel molecular), a diferencia del antídoto existente que es un pool de anticuerpos de equino que no se sabe si se ligan o no a las moléculas reactivas y es potencialmente alergénico. Beneficios adicionales para el usuario intermedio es contar con licencia de tecnología única a nivel mundial para tratamiento de loxoscelismo. Para el usuario final es la posibilidad de contar con una solución a un problema de salud que presenta alta letalidad, evitando la muerte y secuelas de los pacientes afectados. Debe hacerse énfasis en que este resultado, conforme se acordó ente el Comité Directivo del Proyecto y el Comité de Fondef, a raíz de las recomendaciones de la consultoría externa del Dr. Aguillón, fue limitado hasta el nivel experimental y se excluyó la posibilidad de hacerlo hasta etapa piloto. Consiste en un antisuero experimental elaborado en base a anticuerpos monoclonales que permite la neutralización del efecto tóxico del veneno de L. laeta en animales de laboratorio. Este producto se usaría solamente en función de seguir con el desarrollo a nivel de investigación, sin embargo, ya estando disponibles los Anticuerpos monoclonales (ACM) a partir de los cuales se elabora el antisuero, se requiere un paso adicional que es la humanización de estos ACM para poder utilizarlo en humanos sin riesgo de shock anafiláctico. Este producto no tiene competidores ni sustitutos. El beneficio que genera es que, si se combina con la herramienta de detección temprana de la mordedura, este antisuero que es el otro resultado de producción de este proyecto, este antisuero, una vez que se complete su desarrollo a nivel de humanización, permitirá que los afectados por un accidente de mordedura de araña de rincón tendrán un riesgo de mortalidad y/o secuelas graves, significativamente reducido o inexistente. Este antisuero será obtenido por la UA a través de un proyecto de continuidad, pero que será relativamente corto porque se ha logrado un 90% del avance hacia la obtención de este antisuero utilizable en humanos.

10 Referencia Bibliográfica KÖHLER G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature Aug 7;256(5517):495-7 FUTRELL JM, Loxoscelism. Am J Med Sci 304: BARBARO, K.C.; Eickstedt, V.R.D.; Mota, I. Adjuvant effect of Loxosceles gaucho (South American brown spider) venom. Toxicon. 1994; 32: BRAVO, L. M.; Puratic, S.O.; Behn, T.C.; Fardella, B.C.; Contrepa, F.A. Estudio de la hemólisis inducida por veneno de Loxosceles laeta. Experiência in vitro. Rev. Med. Chile. 1993; 121: MOTA, I.; Barbaro, K.C. Biological and biochemical-properties of venoms from medically important Loxosceles (Araneae) species in Brazil. J. Toxicol. Tox. Rev. 1995; 14: BARBARO, KC; Ferreira, ML; Cardoso, DF; EIckstedt, VRD; Mota,I. Identification and neutralization of biological activities in the venoms of Loxosceles spiders. Braz. J. Med. Biol. Res. 1996; 29: VALDERRAMA R. Artrópodos venenosos. Arañas, escorpiones, abejas, artrópodos venenosos. Córdoba, D. Toxicología. Tercera Edición, Medellín, 1997: Valderrama, 1997 SEZERINO, UM; Zannin, M; Coelho, LK, et al. A clinical and epidemiological study of Loxosceles spider envenoming in Santa Catarina, Brasil. Trans. R. Soc. Trop. Méd. Hyg. 1998; 92:546. HEARD K, O'Malley GF, Dart RC. Antivenom therapy in the Americas. Drugs Jul;58(1):5-15. Review. BRAZ A, Minozzo J, Abreu JC, et al. Development and evaluation of the neutralizing capacity of horse antivenom against the Brazilian spider Loxosceles intermedia. Toxicon 1999; 37: BRASIL SMd. Manual de diagnostico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. In: Ministry H, ed. Fundacão Nacional de Saude. Brasilia, Brasil: CENEPI; 1999: GOMEZ HF, Miller MJ, Trachy JW, Marks RM, Warren JS. Intradermal anti-loxosceles Fab fragments attenuate dermonecrotic arachnidism. Acad Emerg Med. 1999a; 6(12): GOMEZ HF, Miller MJ, Trachy JW, et al. Inhibition of dermonecrotic arachnidism with intradermal polyclonal anti-loxosceles spider venom Fab fragments. Acad Emerg Med. 1999b;6: GUILHERME P, Fernandes I, KC. B. Neutralization of dermonecrotic and lethal activities and differences among kda toxins of medically important Loxosceles spider venoms in Brazil revealed by monoclonal antibodies. Toxicon 2001; 39: MÁLAQUE, C.M.S., Castro-Valencia, J.E., Cardoso, J.L.C., França, F.O.S., Barbaro, K.C., Fan, H.W., Clinical and epidemiological features of definitive and presumed loxoscelism in São Paulo, Brazil. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 2002; 44. KALAPOTHAKIS, E., Araujo, S.C., de Castro, C.S., Mendes, T.M., Gomez, M.V., Mangili, O.C., Gubert, I.C., Chavez- Olortegui, C. Molecular cloning, expression and immunological properties of LiD1, a protein from the dermonecrotic family of Loxosceles intermedia spider venom. Toxicon (12), FERNANDES-PEDROSA MF., Junqueira de Azevedo ILM., Gonçalves-de-Andrade, RM., van den Berg CW., Ramos CRR, Lee Ho P, and Tambourgi DV. Molecular cloning and expression of a functional dermonecrotic and haemolytic factor from Loxosceles laeta venom. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002; 298: QUINTANA, J.C. y Otero, R.. Envenenamiento aracnídico en las Américas. Medunab (13) ARAUJO S.C., Castanheira P., Alvarenga L.M., Mangili O.C.,Kalapothakis E., Chavez-Olortegui C.Protection against dermonecrotic and lethal activities of Loxosceles intermedia spider venom by immunization with a fused recombinant protein. Toxicon : MINISTERIO DE SALUD DE CHILE, Servicio

11 de Salud M. Central, Subdirección Médica, Unidad de Epidemiología. Informe de Loxoscelismo. Boletín informativo a los Servicios de Salud. Int N 067 F: ZELA SP, Fernandes-Pedrosa MF, Murakami MT, de Andrade SA, Arni RK, et al.: Crystallization and preliminary crystallographic analysis of SMase I, a sphingomyelinase from Loxosceles laeta spider venom. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 2004, 60: DE SANTI FERRARA GI, Fernandes-Pedrosa M de F, Junqueira-de-Azevedo I de L, Gonçalves-de-Andrade RM, Portaro FC, Manzoni-de-Almeida D, Murakami MT, Arni RK, van den Berg CW, Ho PL, Tambourgi DV. SMase II, a new sphingomyelinase D from Loxosceles laeta venom gland: molecular cloning, expression, function and structural analysis. Toxicon. 2009; 53(7-8): PAULI I., Minozzo JC, da Silva PH, Chaim OM, Veiga SS. Analysis of therapeutic benefits of antivenin at different time intervals after experimental envenomation in rabbits by venom of the brown spider (Loxosceles intermedia). Toxicon. 2009; 53(6): DE ALMEIDA DM, Fernandes-Pedrosa M de F, de Andrade RM, Marcelino JR, Gondo-Higashi H, de Azevedo Ide L, Ho PL, van den Berg C, Tambourgi DV. A new anti-loxoscelic serum produced against recombinant sphingomyelinase D: results of preclinical trials. Am J Trop Med Hyg. 2008; 79(3):

12 Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Resultado de Producción KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Es un kit rapido de facil lectura (similar en forma y tamaño a un test de embarazo)donde se coloca una muestra de un frotado de la zona de la herida o potencial mordedura del arácnido, que puede, con una alta sensibilidad y especificidad evidenciar la presencia de proteinas del veneno de Loxosceles laeta (araña de rincon), en un corto periodo de tiempo. Lo usan las personas que necesitan comprobar o descartar en un breve tiempo si la lesión es producto o no de una mordedura de araña de rincon, generalmente en clínicas, centros hospitalarios o postas rurales. Lo usan precisamente para confirmar o descartar que una mordedura es de araña de rincon, lo que define la necesidad o no de iniciar el tratamiento especifico y la internación o traslado del paciente. Su innovación se basa en el reconocimiento altamente específico y sensible de las proteinas del veneno de Loxosceles laeta por parte de anticuerpos monoclonales humanizados, permitiendo la formación de una reacción muy veloz y detectable a simple vista. la situacion actual es detectar la mordedura de araña de rincon mediante la identificacion del aracnido antes del desarrollo de los sintomas o en forma tardia se presume con la evaluacion del cuadro clinico donde los antidotos actuales no han demostrado una eficacia comprobable. La diferencia operacional con el caso actual es que este kit será comercializado en farmacias y estará disponible en recintos de atención primaria permitiendo determinar en pocos minutos si la mordedura fue o no causada por la temida araña del rincón, lo cual podría permitir la acción temprana del antidoto en desarrollo. El usuario intermedio tendrá la licencia de la tecnología para la elaboración del Kit y se esperan altas ventas dada la abundancia del arácnido y la gravedad de su mordedura, lo cual hace que todo esfuerzo preventivo sea valioso. El usuario final se verá beneficiado por la posibilidad de que una mordedura sea detectada tempranamente y el tratamiento (asociado al otro producto del proyecto) impida que se desarrollen los sintomas graves y menos graves de la mordedura, siendo un tratamiento breve y ambulatorio. Se ha desarrollado un kit de diagnóstico en forma de test inmunocromatográfico (similar a la forma de un test de embarazo ya existente en el mercado). Este Kit puede ser utilizado por un profesional de la salud, ó por el público en general. No tiene competidores ni sustitutos en el mercado actualmente. No teniendo sustitutos ni competidores, las ventajas son absolutas a favor de nuestro resultado. Los beneficios son la posibilidad de detectar en forma temprana (a partir de 5 minutos de ocurrida la mordedura), con alta sensibilidad (0,375 microgramos/ml) y específica (sin reacciones cruzadas) la mordedura de la araña del rincón. La producción comercial (Bajo Licencia de la U.A.) estará a cargo de la Empresa Grupo Bios S.A.

13 Referencia Bibliográfica SCHENONE, H.; Saavedra, T.; Rojas, A.; Villarroel, F. Loxoscelismo en Chile. Estudios $epidemiológicos, clínicos y experimentales. Rev. Inst. Med. Trop. 1989; 31(6): SMITH JA. Antibody-sandwich ELISA to detect soluble antigens. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley; 1993: BARRETT, S. M., Romine-Jenkins, M. and Blick, K. E. Passive hemagglutination inhibition test for diagnosis of brown recluse spider bite envenomation. Clin Chem. 1993; 39: CHAVEZ-OLORTEGUI, Zanetti VC, Ferreira AP, et al. ELISA for the detection of venom antigens in experimental and clinical envenoming by Loxosceles Intermedia spiders. Toxicon. 1998;35: MILLER, M. J., Gomez, H. F., Snider, R. J., Stephens, E. L., Czop, R. M. and Warren, J. S. Detection of Loxosceles venom in lesional hair shafts and skin: application of a specific immunoassay to identify dermonecrotic arachnidism. Am J Emerg Med. 2000; 18: GOMEZ HF, Miller MJ, Waggener MW, et al. Antigenic cross-reactivity of venoms from medically important North American Loxosceles spider species. Toxicon. 2001; 39: GOMEZ HF, Krywko DM, Stoecker WV. A new assay for the detection of Loxosceles species (brown recluse) spider venom. Ann Emerg Med. 2002; 39: KRYWKO DM, Gomez HF. Detection of Loxosceles species venom in dermal lesions: a comparison of 4 venom recovery methods. Ann Emerg Med. 2002; 39: ALVARENGA, L. M., Martins, M. S., Moura, J. F., Kalapothakis, E. Oliveira, J. C., Mangili, O. C., Granier, C. and Chavez-Olortegui, C. Production of monoclonal antibodies capable of neutralizing dermonecrotic activity of Loxosceles intermedia spider venom and their use in a specific immunometric assay. Toxicon. 2003; 42: SCHENONE, H. Cuadros tóxicos producidos por mordeduras de araña en Chile: latrodectismo y loxoscelismo. Rev Méd Chile. 2003; 131: BARBARO, K.C.; Knysak, I.; Martins, R.; Hogan, C.; Winkel, K. Enzymatic characterization, antigenic cross-reactivity and neutralization of dermonecrotic activity of five Loxosceles spider venoms of medical importance in the Americas. Toxicon. 2005; 45: STOECKER WV, Green JA, Gomez HF. Diagnosis of loxoscelism in a child confirmed with an enzyme-linked immunosorbent assay and noninvasive tissue sampling. J Am Acad Dermatol. 2006; 55(5): AKDENIZ S, Green JA, Stoecker WV, Gomez HF, Keklikçi SU. Diagnosis of loxoscelism in two Turkish patients confirmed with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and non-invasive tissue sampling. Dermatol Online J. 2007; 13(2):11. Tipo Nombre RESULTADO Resultado de Protección OBTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANIZADOS ESPECIFICOS PARA EL VENENO

14 Descripción Resultados de Producción Asociados Descripción del Logro El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. El mercado que sera protegido sera el nacional, y con posterioridad a nivel internacional. Se patentara todos los pasos y métodos necesarios para obtener y mantener las líneas celulares capaces de producir los anticuerpos específicos para proteínas del veneno de araña de rincon (proteínas previamente caracterizadas y clonadas molecularmente para conocer cuales son las de mayor actividad dañina, que deben ser neutralizadas por los anticuerpos). Serán usados por los fabricantes de medicamentos. ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS El día 09 de Diciembre del presente año se envio al Instituto Nacional de Propiedad Industrial (INAPI) la solicitud de 2 Patentes que tienen relación con los resultados de producción: - ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS Ellas tienen por titulo - \"Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados especificos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación su aplicación para un Kit diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones\" SOLICITUD y - \"Fosfolipasas D (ESFINGOMIELINASAS D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos\" SOLICITUD Con estas patentes se pretende licenciar el producto final del proceso, que en este caso serian los Anticuerpos monoclonales humanizados. Tipo Nombre Descripción Resultados de Producción Asociados RESULTADO Resultado de Protección PATENTE DEL KIT DE DIAGNOSTICO. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. El mercado que sera protegido sera el nacional, y con posterioridad a nivel internacional. Se patentara todos los pasos y métodos necesarios para obtener y mantener las líneas celulares capaces de producir los anticuerpos específicos para proteínas del veneno de araña de rincon (proteínas previamente caracterizadas y clonadas molecularmente para conocer cuales son las de mayor sensibilidad y especificidad de la respuesta inmunogénica, que son los más útiles para una detección por medio de un test con anticuerpos monoclonales). Serán usados por los fabricantes de insumos de utilidad médica. Serán usados para la elaboración del kit de detección altamente eficaz, rápido y específico de la mordedura de araña de rincon. KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON

15 Descripción del Logro El día 09 de Diciembre del presente año se envio al Instituto Nacional de Propiedad Industrial (INAPI) la solicitud de 2 Patentes que tienen relación con los resultados de producción: - KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Ellas tienen por titulo - \"Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados especificos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación su aplicación para un Kit diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones\" SOLICITUD y - \"Fosfolipasas D (ESFINGOMIELINASAS D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos\" SOLICITUD Con estas patentes se pretende licenciar el producto final del proceso, que en este caso seria el Kit Diagnóstico para detección temprana de mordedura de Loxosceles laeta. Tipo Nombre Descripción Resultados de Producción Asociados Descripción del Logro RESULTADO Resultado de Transferencia y Negocios LICENCIAMIENTO DEL ANTIDOTO El rol del licenciatario sera el de comercializador y productor del antidoto. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS No se ha logrado el resultado de transferencia en función de que, a raíz de la Consultoría Externa al proyecto efectuada por el Dr. Juan Carlos Aguillón por recomendación de Fondef, se acordó entre los investigadores y Fondef limitar la continuidad del desarrollo hasta el nivel de licenciamiento del antisuero. Independientemente de lo anterior, los avances y resultados científico-técnicos para el logro final de producción piloto del antisuero continuaron hasta la obtención de Anticuerpos Monoclonales de alta especificidad y sensibilidad frente a los componentes del veneno de L. laeta, los cuales están caracterizados en su efecto protector frente a modelos animales. Estos resultados, si bien son la base para un desarrollo para una solución aplicable en humanos, no son hasta ahora sujetos de interes para un licenciamiento, por lo cual este logro no podrá ser obtenido en el marco del actual proyecto, pero en cualquier caso es muy probable que la continuidad del trabajo del equipo de investigación logre que esto ocurra en el mediano plazo (3 años). Tipo Nombre Descripción RESULTADO Resultado de Transferencia y Negocios LICENCIAMIENTO DEL KIT El rol del Licenciatario sera comercializador y productor del Kit desarrollado. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon.

16 Resultados de Producción Asociados KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Descripción del Logro Grupo Bios S.A. ha adquirido la licencia del Kit de diagnóstico temprano de la mordedura de L. laeta. Esta empresa es una empresa biotecnológica productora entre otras cosas de artículos de uso médico. Se licienció el derecho exclusivo de fabricación y comercialización a nivel nacional e internacional de kit por periodos renovables. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Evaluacion de Pinturas para la prevencion del Loxoscelismo Se presentará una publicación en la Revista Medica de Chile, con la evaluación de pinturas con insecticidas para el control de arañas domiciliarias. Quedó programada para Febrero de 2009 la publicación de este estudio en la revista médica de Chile. Este trabajo logró demostrar que las pinturas \"repelentes\" de L. laeta no mostraron el efecto con el cual se publicitó su venta en ninguna magnitud. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis Para Optar Al titulo de Medico Veterinario CARACTERIZACIÓN INMUNOBIOLÓGICA DEL VENENO OBTENIDO POR ELECTROESTIMULACION DE LA ARAÑA DE LOS RINCONES Loxosceles laeta. Las estudiantes de la Carrera de Licenciatura en Medicina Veterinaria Srta. Mirtha Natalia Acuña Aguirre ha concluido con su tesis para optar al grado academico de Licenciado en Medicina Veterinaria, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Abel Vásquez y M.V. Claudia Lopez ambos del Instituto de Salud Publica de Chile. Tipo Nombre Descripción RESULTADO Otros Resultados Publicacion de Articulo aceptada para revista TOXICON Con fecha 17 de Junio de 2010 se ha recibido la aceptación para publicación del artículo titulado \"Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment.\" en la prestigiosa revista TOXICON.

17 Descripción del Logro Se aceptó esta publicación en la revista: Date: Jun 16, 2010 To: \"Jorge Enrique Araya\" From: \"Toxicon\" Subject: Your Submission Ms. Ref. No.: TOXCON-D R1 Title: Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment. Toxicon Dear jearaya, I am pleased to confirm that your paper \"Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment.\" has been accepted for publication in Toxicon. Thank you for submitting your work to this journal. With kind regards, Alan Harvey Editor in Chief Toxicon Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis Doctoral Ciencias Biologicas CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLÓGICA FUNCIONAL DE FOSFOLIPASAS D DEL VENENO DE Loxosceles laeta. El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis de Magister UTILIZACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE COMPONENTES DEL VENENO DE Loxosceles laeta PARA EL MONTAJE DE UN KIT DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO PARA EL LOXOSCELISMO. Tesis conducente al grado de Magister en Ciencias Biomédicas El estudiante de Magisater en Ciencias Biomédicas Señor William Cortes Araya ha concluido su tesis de post-grado para optar al titulo de Mágister En Ciencias Biomedicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas y el Dr.(c) Alejandro Catalán R. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para Grado de Licenciado CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL VENENO DE EXTRACTO DE GLÁNDULA DE Loxosceles laeta (ARAÑA DE RINCÓN). Tesis para optar al grado de Licenciado. Año.2007 mes Marzo Los estudiantes de la Carrera de Licenciatura en Tecnología Medica Sr. Juan Carlos Alcayaga Barraza y la Srta. Andrea Patricia Arancibias Ortega han concluido con su tesis para optar al grado académico de Licenciado en Tecnología Médica, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoría del Dr. Jorge Araya Rojas, y de la Mg.(c) Andrea Bugueño Plaza.

18 Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para optar al grado de Licenciado CLONAJE MOLECULAR DE LA ENZIMA ESFINGOMIELINASA D, A PARTIR DE GENES AISLADOS DEL TEJIDO GLANDULAR DE Loxosceles laeta (ARAÑA DE RINCÓN). Tesis para optar al grado de Licenciado. Año 2009 mes Marzo Los estudiantes de la Carrera de Licenciatura en Tecnología Medica Srta. Leslyie Nevenka Arredondo Zapata y el Sr. William Antonio Cortes Araya han concluido con su tesis para optar al grado académico de Licenciado en Tecnología Médica, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoría del Dr. Jorge Araya Rojas y del Dr.(c) Patricio Orrego Lillo. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para optar al grado de Licenciado EVALUACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE FOSFOLIPASA D DE Loxosceles laeta PARA EL MONTAJE DE UN TEST DIAGNÓSTICO DE DETECCIÓN DE LOXOSCELISMO. Año 2010, mes Nov Las estudiantes de la Carrera de Licenciatura en Tecnología Medica Srtas. Jocelyn Bugueño Campillay, Andrea Muñoz Burgos y Ailyn Ramírez Soto han concluido con su tesis para optar al grado academico de Licenciado en Tecnología Médica, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas, Dr.(c) Alejandro catalán Rodriguez y Mg.(c) William Cortes Araya.

19 RESULTADO DE PRODUCCIÓN Categoría Cantidad Lograda Producto 2 RESULTADO DE PROTECCIÓN Categoría Cantidad Lograda Patente 2 RESULTADO DE TRANSFERENCIA Y NEGOCIOS Categoría Cantidad Lograda Licenciamiento 2 OTROS RESULTADOS Categoría Cantidad Lograda Publicación 2 Tesis o Proyecto de título 6

20 2.3 Informe financiero a la fecha de término Información no editable por el director. Montos Monto Girado por Fondef Comprometidos según Convenio por fuente de financiamiento Gastos financiados por fuente de financiamiento FONDEF ,65 % Institución(es) Beneficiaria(s) UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA No Aplica ,4 % Empresas y otras Entidades Asociadas No Aplica % Totales % % Monto por Reintegrar Monto Reintegrado a FONDEF ( ) Costo Final del Proyecto Montos Presupuestados Montos efectivamente aportados Empresas y otras Entidades Asociadas BIOS CHILE INGENIERIA GENETICA S.A UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA, ASISTENCIA TECNICA S.A Total

21 2.4 Autoevaluación de la Ejecución del Proyecto El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA El desarrollo del proyecto ha permitido ir consolidando una nueva línea de investigación en la Universidad de Antofagasta en el área biotecnológica relacionada con un problema de salud pública de alta prevalencia y con riesgo de muerte en algunas ocasiones. Por lo tanto, el aporte de los investigadores de la U.A. constituye un avance concreto hacia el mejor manejo y menor nivel de riesgo frente a los accidentes provocados por el veneno de la araña de rincón (Loxosceles laeta). El(la) Director(a) del proyecto Los objetivos planteados en la formulación del proyecto Fondef D04I1247 mantienen vigencia en cuanto a la problemática que abordó y plantean la necesidad de seguir avanzando en esta línea de investigación y desarrollo en base a los importantes resultados obtenidos que constituyen las directrices para continuar optimizando el nivel de conocimiento y de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y el manejo del Loxoscelismo humano. Mediante la extracción y caracterización inmunobiológica del veneno, la identificación de proteínas del veneno altamente inmunogénicas, la obtención de proteínas recombinantes y la obtención de Anticuerpos Monoclonales, este proyecto investigó y aplicó herramientas inmunológicas y moleculares con el objetivo de desarrollar un kit diagnóstico y dejar sentadas las bases para el desarrollo de un antisuero para el diagnóstico temprano y el manejo de los pacientes que son afectados por la mordedura e inoculación del veneno de Loxosceles laeta (araña de rincón). La ejecución científico tecnológica de este proyecto permitió generar una línea de trabajo en el ámbito de la salud pública aportando nuevo conocimiento sobre el veneno de este arácnido y aplicaciones biotecnológicas de alto valor para evitar las complicaciones e incluso la muerte por la mordedura de L.laeta. El mercado para el producto, desarrollado como kit diagnóstico de fácil acceso a todo público y a instituciones de salud, posee un potencial enorme, tanto social como empresarial, pues contribuye a resolver un problema de salud pública y abre oportunidades a las empresas del rubro para invertir y comercializar el paquete tecnológico. Los principales impactos logrados con este proyecto se pueden resumir desde el punto de vista científico-tecnológico, en el uso de anticuerpos monoclonales para fabricar un kit inmunocromatográfico de diagnóstico temprano de la mordedura por L. laeta en personas. Estos anticuerpos además, constituyen el soporte tecnológico para el desarrollo de un antisuero para el tratamiento específico frente al veneno de L.,laeta. Además, desde el punto de vista económico-social, se visualiza la comercialización de un kit efectivo para el diagnóstico y manejo del loxoscelimo en salud pública y se puede mejorar significativamente el tratamiento con el futuro desarrollo del antisuero. Desde el punto de vista institucional se logró un aumento del número de especialistas con formación en aplicación de anticuerpos monoclonales, como también un potenciamiento de la investigación multidisciplinaria en el área inmunológica-molecular (trabajo conjunto con ISP y Universidad Austral de Chile), aumentándose las relaciones Universidad-Empresas en áreas relevantes de desarrollo, también incrementó la relación con la comunidad resolviendo problemas como los planteados, y finalmente se favoreció la docencia de pre y post grado de carreras y programas del área de la salud de la Universidad de Antofagasta.

22 2.5 Propuesta de Continuidad de la(s) Institucion(es) Beneficiaria(s) Debido al estado de desarrollo en el cual quedo la investigación, en la cual se generaron productos con solicitud de patente en trámite, que tienen un alto potencial de ser la base de un negocio para el mercado nacional y al menos latinoamericano, la estrategia de continuidad del proyecto considera los siguientes elementos: Para el mercado nacional, se desarrollará la comercialización del Kit de detección de la mordedura de L. laeta en acuerdo con la empresa Grupo Bios. Para el aprovechamiento de la base tecnológica alcanzada en lo que respecta al antìdoto contra la mordedura de L. laeta, se plantea la ejecución de un proyecto para finalizar la humanización de los anticuerpos monoclonales de alto valor inmunogénico con los que se cuenta actualmente. Esto se hará en asociación con una industria biotecnológica con presencia en el mercado de EUA. Para maximizar el impacto comercial de la tecnología de detección de la toxina de Loxosceles, se realizará un proyecto para ampliar el espectro de especies del genero Loxosceles que el kit pueda discriminar, incluyendo la toxina de las especies que son importantes como amenaza en los países con mayor incidencia de ataques (EUA, México, Brasil, Argentina, Perú, entre otros). Este proyecto se hará en conjunto con grupo Bios y UATSA.

23 III. Informe De Gestión 3.1 Objetivos Objetivo(s) General(es) Nombre Objetivo Descripción OBJETIVOS GENERALES Desarrollar un antídoto específico y un sistema de detección/confirmación temprana para el tratamiento de la mordida de la araña del rincón mediante el uso de las herramientas de biología molecular, proteómica e inmunología, permitiendo adicionalmente establecer las bases preliminares para la identificación de fármacos existentes con acción bloqueadora del mecanismo de acción del envenenamiento que permitan desarrollar un sistema de tratamiento clínico especializado. (*). (*) Este objetivo general y el específico asociado, fueron modificados en acuerdo mutuo entre el equipo técnico del proyecto y Fondef, en virtud de la Consultoría Externa realizada por el Dr. Juan Carlos Aguillón, que indicó que el logro del antídoto no sería posible en el marco de recursos y tiempo disponibles para el proyecto, con lo cual este antídoto solo se desarrolló hasta el nivel experimental, con eficacia comprobada en la inhibición del loxoscelismo en modelos animales Objetivos Específicos Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 1 Desarrollar y evaluar un antídoto constituido por anticuerpos monoclonales Descripción humanizados para el tratamiento de la mordedura de araña del rincón. Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 2 Desarrollar un sistema de diagnóstico temprano para mordedura de araña Descripción del rincón que permita la producción de un Kit de diagnóstico comercializable. Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 3 Identificar y evaluar acción de drogas ya en uso para otras patologías y/o moléculas que presenten actividad farmacológica antagónica contra los Descripción componentes biológicos más activos del veneno de arañas del género Loxosceles. 3.2 Resultados Tipo Nombre RESULTADO Resultado de Producción ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS

24 Descripción Descripción del Logro Es una formulación médica inyectable. Indicada para el tratamiento de mordeduras de animales ponzoñosos (atención médica) para evitar los efectos nocivos (sea el cuadro visceral o el cuadro dérmico) de una mordedura de este arácnido. Su innovación es una alta eficacia y nula contraindicación (por lo tanto pueden ser aplicados incluso preventivamente) al ser anticuerpos monoclonales humanizados y seleccionados por su acción específica de inactivación sobre los elementos más activos y dañinos de la toxina de loxosceles laeta (araña de rincon). Principales competidores serían los sueros antiloxoscélicos actualmente existentes, los cuales no se sabe si tienen algún efecto y son potencialmente peligrosos, se usan solo en casos extremos como ayuda al tratamiento pero nunca se ha sabido si es realmente eficaz. Principal diferencia operacional es que al no haber contraindicaciones el suero se puede administrar aún sin la certeza de que la mordida es por Loxosceles laeta, no se espera ningún efecto secundario negativo. Principal diferencia funcional es que los anticuerpos son humanizados (sin reacción alérgica potencial) y seleccionados específicamente para inactivar las moléculas altamente peligrosas del veneno (caracterizadas previamente a nivel molecular), a diferencia del antídoto existente que es un pool de anticuerpos de equino que no se sabe si se ligan o no a las moléculas reactivas y es potencialmente alergénico. Beneficios adicionales para el usuario intermedio es contar con licencia de tecnología única a nivel mundial para tratamiento de loxoscelismo. Para el usuario final es la posibilidad de contar con una solución a un problema de salud que presenta alta letalidad, evitando la muerte y secuelas de los pacientes afectados. Debe hacerse énfasis en que este resultado, conforme se acordó ente el Comité Directivo del Proyecto y el Comité de Fondef, a raíz de las recomendaciones de la consultoría externa del Dr. Aguillón, fue limitado hasta el nivel experimental y se excluyó la posibilidad de hacerlo hasta etapa piloto. Consiste en un antisuero experimental elaborado en base a anticuerpos monoclonales que permite la neutralización del efecto tóxico del veneno de L. laeta en animales de laboratorio. Este producto se usaría solamente en función de seguir con el desarrollo a nivel de investigación, sin embargo, ya estando disponibles los Anticuerpos monoclonales (ACM) a partir de los cuales se elabora el antisuero, se requiere un paso adicional que es la humanización de estos ACM para poder utilizarlo en humanos sin riesgo de shock anafiláctico. Este producto no tiene competidores ni sustitutos. El beneficio que genera es que, si se combina con la herramienta de detección temprana de la mordedura, este antisuero que es el otro resultado de producción de este proyecto, este antisuero, una vez que se complete su desarrollo a nivel de humanización, permitirá que los afectados por un accidente de mordedura de araña de rincón tendrán un riesgo de mortalidad y/o secuelas graves, significativamente reducido o inexistente. Este antisuero será obtenido por la UA a través de un proyecto de continuidad, pero que será relativamente corto porque se ha logrado un 90% del avance hacia la obtención de este antisuero utilizable en humanos. Tipo RESULTADO Resultado de Producción

25 Nombre Descripción Descripción del Logro KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Es un kit rapido de facil lectura (similar en forma y tamaño a un test de embarazo)donde se coloca una muestra de un frotado de la zona de la herida o potencial mordedura del arácnido, que puede, con una alta sensibilidad y especificidad evidenciar la presencia de proteinas del veneno de Loxosceles laeta (araña de rincon), en un corto periodo de tiempo. Lo usan las personas que necesitan comprobar o descartar en un breve tiempo si la lesión es producto o no de una mordedura de araña de rincon, generalmente en clínicas, centros hospitalarios o postas rurales. Lo usan precisamente para confirmar o descartar que una mordedura es de araña de rincon, lo que define la necesidad o no de iniciar el tratamiento especifico y la internación o traslado del paciente. Su innovación se basa en el reconocimiento altamente específico y sensible de las proteinas del veneno de Loxosceles laeta por parte de anticuerpos monoclonales humanizados, permitiendo la formación de una reacción muy veloz y detectable a simple vista. la situacion actual es detectar la mordedura de araña de rincon mediante la identificacion del aracnido antes del desarrollo de los sintomas o en forma tardia se presume con la evaluacion del cuadro clinico donde los antidotos actuales no han demostrado una eficacia comprobable. La diferencia operacional con el caso actual es que este kit será comercializado en farmacias y estará disponible en recintos de atención primaria permitiendo determinar en pocos minutos si la mordedura fue o no causada por la temida araña del rincón, lo cual podría permitir la acción temprana del antidoto en desarrollo. El usuario intermedio tendrá la licencia de la tecnología para la elaboración del Kit y se esperan altas ventas dada la abundancia del arácnido y la gravedad de su mordedura, lo cual hace que todo esfuerzo preventivo sea valioso. El usuario final se verá beneficiado por la posibilidad de que una mordedura sea detectada tempranamente y el tratamiento (asociado al otro producto del proyecto) impida que se desarrollen los sintomas graves y menos graves de la mordedura, siendo un tratamiento breve y ambulatorio. Se ha desarrollado un kit de diagnóstico en forma de test inmunocromatográfico (similar a la forma de un test de embarazo ya existente en el mercado). Este Kit puede ser utilizado por un profesional de la salud, ó por el público en general. No tiene competidores ni sustitutos en el mercado actualmente. No teniendo sustitutos ni competidores, las ventajas son absolutas a favor de nuestro resultado. Los beneficios son la posibilidad de detectar en forma temprana (a partir de 5 minutos de ocurrida la mordedura), con alta sensibilidad (0,375 microgramos/ml) y específica (sin reacciones cruzadas) la mordedura de la araña del rincón. La producción comercial (Bajo Licencia de la U.A.) estará a cargo de la Empresa Grupo Bios S.A. Tipo Nombre RESULTADO Resultado de Protección OBTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANIZADOS ESPECIFICOS PARA EL VENENO

26 Descripción Resultados de Producción Asociados Descripción del Logro El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. El mercado que sera protegido sera el nacional, y con posterioridad a nivel internacional. Se patentara todos los pasos y métodos necesarios para obtener y mantener las líneas celulares capaces de producir los anticuerpos específicos para proteínas del veneno de araña de rincon (proteínas previamente caracterizadas y clonadas molecularmente para conocer cuales son las de mayor actividad dañina, que deben ser neutralizadas por los anticuerpos). Serán usados por los fabricantes de medicamentos. ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS El día 09 de Diciembre del presente año se envio al Instituto Nacional de Propiedad Industrial (INAPI) la solicitud de 2 Patentes que tienen relación con los resultados de producción: - ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS Ellas tienen por titulo - \"Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados especificos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación su aplicación para un Kit diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones\" SOLICITUD y - \"Fosfolipasas D (ESFINGOMIELINASAS D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos\" SOLICITUD Con estas patentes se pretende licenciar el producto final del proceso, que en este caso serian los Anticuerpos monoclonales humanizados. Tipo Nombre Descripción Resultados de Producción Asociados RESULTADO Resultado de Protección PATENTE DEL KIT DE DIAGNOSTICO. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. El mercado que sera protegido sera el nacional, y con posterioridad a nivel internacional. Se patentara todos los pasos y métodos necesarios para obtener y mantener las líneas celulares capaces de producir los anticuerpos específicos para proteínas del veneno de araña de rincon (proteínas previamente caracterizadas y clonadas molecularmente para conocer cuales son las de mayor sensibilidad y especificidad de la respuesta inmunogénica, que son los más útiles para una detección por medio de un test con anticuerpos monoclonales). Serán usados por los fabricantes de insumos de utilidad médica. Serán usados para la elaboración del kit de detección altamente eficaz, rápido y específico de la mordedura de araña de rincon. KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON

27 Descripción del Logro El día 09 de Diciembre del presente año se envio al Instituto Nacional de Propiedad Industrial (INAPI) la solicitud de 2 Patentes que tienen relación con los resultados de producción: - KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Ellas tienen por titulo - \"Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados especificos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación su aplicación para un Kit diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones\" SOLICITUD y - \"Fosfolipasas D (ESFINGOMIELINASAS D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos\" SOLICITUD Con estas patentes se pretende licenciar el producto final del proceso, que en este caso seria el Kit Diagnóstico para detección temprana de mordedura de Loxosceles laeta. Tipo Nombre Descripción Resultados de Producción Asociados Descripción del Logro RESULTADO Resultado de Transferencia y Negocios LICENCIAMIENTO DEL ANTIDOTO El rol del licenciatario sera el de comercializador y productor del antidoto. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon. ANTIDOTO CONTRA LA ARANA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS No se ha logrado el resultado de transferencia en función de que, a raíz de la Consultoría Externa al proyecto efectuada por el Dr. Juan Carlos Aguillón por recomendación de Fondef, se acordó entre los investigadores y Fondef limitar la continuidad del desarrollo hasta el nivel de licenciamiento del antisuero. Independientemente de lo anterior, los avances y resultados científico-técnicos para el logro final de producción piloto del antisuero continuaron hasta la obtención de Anticuerpos Monoclonales de alta especificidad y sensibilidad frente a los componentes del veneno de L. laeta, los cuales están caracterizados en su efecto protector frente a modelos animales. Estos resultados, si bien son la base para un desarrollo para una solución aplicable en humanos, no son hasta ahora sujetos de interes para un licenciamiento, por lo cual este logro no podrá ser obtenido en el marco del actual proyecto, pero en cualquier caso es muy probable que la continuidad del trabajo del equipo de investigación logre que esto ocurra en el mediano plazo (3 años). Tipo Nombre Descripción RESULTADO Resultado de Transferencia y Negocios LICENCIAMIENTO DEL KIT El rol del Licenciatario sera comercializador y productor del Kit desarrollado. El mercado potencial puede ser Latinoamerica, EE.UU. y todas las regiones en las cuales existe la araña de rincon.

28 Resultados de Producción Asociados KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARANA DE RINCON Descripción del Logro Grupo Bios S.A. ha adquirido la licencia del Kit de diagnóstico temprano de la mordedura de L. laeta. Esta empresa es una empresa biotecnológica productora entre otras cosas de artículos de uso médico. Se licienció el derecho exclusivo de fabricación y comercialización a nivel nacional e internacional de kit por periodos renovables. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Evaluacion de Pinturas para la prevencion del Loxoscelismo Se presentará una publicación en la Revista Medica de Chile, con la evaluación de pinturas con insecticidas para el control de arañas domiciliarias. Quedó programada para Febrero de 2009 la publicación de este estudio en la revista médica de Chile. Este trabajo logró demostrar que las pinturas \"repelentes\" de L. laeta no mostraron el efecto con el cual se publicitó su venta en ninguna magnitud. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis Para Optar Al titulo de Medico Veterinario CARACTERIZACIÓN INMUNOBIOLÓGICA DEL VENENO OBTENIDO POR ELECTROESTIMULACION DE LA ARAÑA DE LOS RINCONES Loxosceles laeta. Quedó programada para Febrero de 2009 la publicación de este estudio en la revista médica de Chile. Este trabajo logró demostrar que las pinturas \"repelentes\" de L. laeta no mostraron el efecto con el cual se publicitó su venta en ninguna magnitud. Tipo Nombre Descripción RESULTADO Otros Resultados Publicacion de Articulo aceptada para revista TOXICON Con fecha 17 de Junio de 2010 se ha recibido la aceptación para publicación del artículo titulado \"Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment.\" en la prestigiosa revista TOXICON.

29 Descripción del Logro Se aceptó esta publicación en la revista: Date: Jun 16, 2010 To: \"Jorge Enrique Araya\" From: \"Toxicon\" Subject: Your Submission Ms. Ref. No.: TOXCON-D R1 Title: Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment. Toxicon Dear jearaya, I am pleased to confirm that your paper \"Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: its implications in loxoscelism treatment.\" has been accepted for publication in Toxicon. Thank you for submitting your work to this journal. With kind regards, Alan Harvey Editor in Chief Toxicon Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis Doctoral Ciencias Biologicas CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLÓGICA FUNCIONAL DE FOSFOLIPASAS D DEL VENENO DE Loxosceles laeta. El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis de Magister UTILIZACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE COMPONENTES DEL VENENO DE Loxosceles laeta PARA EL MONTAJE DE UN KIT DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO PARA EL LOXOSCELISMO. Tesis conducente al grado de Magister en Ciencias Biomédicas El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para Grado de Licenciado CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL VENENO DE EXTRACTO DE GLÁNDULA DE Loxosceles laeta (ARAÑA DE RINCÓN). Tesis para optar al grado de Licenciado. Año.2007 mes Marzo El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas.

30 Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para optar al grado de Licenciado CLONAJE MOLECULAR DE LA ENZIMA ESFINGOMIELINASA D, A PARTIR DE GENES AISLADOS DEL TEJIDO GLANDULAR DE Loxosceles laeta (ARAÑA DE RINCÓN). Tesis para optar al grado de Licenciado. Año 2009 mes Marzo El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas. Tipo Nombre Descripción Descripción del Logro RESULTADO Otros Resultados Tesis para optar al grado de Licenciado EVALUACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE FOSFOLIPASA D DE Loxosceles laeta PARA EL MONTAJE DE UN TEST DIAGNÓSTICO DE DETECCIÓN DE LOXOSCELISMO. Año 2010, mes Nov El estudiante de doctorado Señor Alejandro Catalán Rodriguez ha concluido su tesis doctoral para optar al titulo de Doctor en Ciencia Biológicas, la cual realizo en el marco del proyecto FONDEF D04I1247, bajo la tutoria del Dr. Jorge Araya Rojas.

31 3.3 Gestión del Proyecto Plazos efectivamente utilizados v/s plazos considerados inicialmente El proyeto se inicio el 20/03/2006 y termino el 20/06/2010. Inicialmente se habian considersado 3 años para su realización, pero por problemas ajenos al grupo de investigadores(retiro de unas de las empresas contraparte RECALCINE), el proyecto se vio atrasado en su realización, por lo que se produjo un aplazamiento de 1 año Gastos Ejecutados vs. Presupuesto inicial Los gastos ejecutados se realizaron dentro del presupuesto solicitado y otorgado Participación de las instituciones y Empresas La Universidad de Antofagasta participo apoyando en todo lo necesario para la realización del proyecto, de igual manera lo hicieron las empresas contrapartes. GruposBios cumplió a cabalidad con sus compromisos con el proyecto Participación de las instituciones y Empresas El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA El desarrollo del proyecto ha sido excelente ya que ha permitido ir consolidando una nueva línea de investigación en la Universidad de Antofagasta en el área biotecnológica relacionada con un problema de salud pública de alta prevalencia y con riesgo de muerte en algunas ocasiones. Por lo tanto, el aporte de los investigadores de la U.A. constituye un avance concreto hacia el mejor manejo y menor nivel de riesgo frente a los accidentes provocados por el veneno de la araña de rincón (Loxosceles laeta). El(la) Director(a) del proyecto

32 El proyecto fue ejecutado de muy buena manera cumpliendose los objetivos planteados, la formulación del proyecto Fondef D04I1247 mantienen vigencia en cuanto a la problemática que abordó y plantean la necesidad de seguir avanzando en esta línea de investigación y desarrollo en base a los importantes resultados obtenidos que constituyen las directrices para continuar optimizando el nivel de conocimiento y de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y el manejo del Loxoscelismo humano. Mediante la extracción y caracterización inmunobiológica del veneno, la identificación de proteínas del veneno altamente inmunogénicas, la obtención de proteínas recombinantes y la obtención de Anticuerpos Monoclonales, este proyecto investigó y aplicó herramientas inmunológicas y moleculares con el objetivo de desarrollar un kit diagnóstico y dejar sentadas las bases para el desarrollo de un antisuero para el diagnóstico temprano y el manejo de los pacientes que son afectados por la mordedura e inoculación del veneno de Loxosceles laeta (araña de rincón). La ejecución científico tecnológica de este proyecto permitió generar una línea de trabajo en el ámbito de la salud pública aportando nuevo conocimiento sobre el veneno de este arácnido y aplicaciones biotecnológicas de alto valor para evitar las complicaciones e incluso la muerte por la mordedura de L.laeta. El mercado para el producto, desarrollado como kit diagnóstico de fácil acceso a todo público y a instituciones de salud, posee un potencial enorme, tanto social como empresarial, pues contribuye a resolver un problema de salud pública y abre oportunidades a las empresas del rubro para invertir y comercializar el paquete tecnológico. Los principales impactos logrados con este proyecto se pueden resumir desde el punto de vista científico-tecnológico, en el uso de anticuerpos monoclonales para fabricar un kit inmunocromatográfico de diagnóstico temprano de la mordedura por L. laeta en personas. Estos anticuerpos además, constituyen el soporte tecnológico para el desarrollo de un antisuero para el tratamiento específico frente al veneno de L.,laeta. Además, desde el punto de vista económico-social, se visualiza la comercialización de un kit efectivo para el diagnóstico y manejo del loxoscelimo en salud pública y se puede mejorar significativamente el tratamiento con el futuro desarrollo del antisuero. Desde el punto de vista institucional se logró un aumento del número de especialistas con formación en aplicación de anticuerpos monoclonales, como también un potenciamiento de la investigación multidisciplinaria en el área inmunológica-molecular (trabajo conjunto con ISP y Universidad Austral de Chile), aumentándose las relaciones Universidad-Empresas en áreas relevantes de desarrollo, también incrementó la relación con la comunidad resolviendo problemas como los planteados, y finalmente se favoreció la docencia de pre y post grado de carreras y programas del área de la salud de la Universidad de Antofagasta.

33 IV. Informe CT y Económico Social 4.1 Negocios Tecnológicos y Productivos Síntesis de las actividades realizadas en Transferencia En función de las decisiones que se tomaron durante el desarrollo del proyecto y que determinaron que uno de los objetivos del proyecto (Antídoto contra la mordedura) fuese considerado como inalcanzable dentro del plazo y recursos disponibles, finalmente el producto tecnológico en el cual se concentró el esfuerzo y resultó desarrollado en su forma de prototipo comercializable es el kit de detección de la mordedura, que genera el negocio tecnológico asociado a la protección intelectual de este producto y los aspectos relacionados (con solicitud de patente presentada) y por el cual la Universidad de Antofagasta espera recibir un royaltie al licenciar el producto a la contraparte privada Grupo Bios. El negocio productivo de la venta del kit a nivel nacional e internacional, que requiere aún varios trámites legales en cada mercado, será llevado a cabo por Grupo Bios, quien pagará los respectivos derechos a la Universidad de Antofagasta.

34 4.3 Impactos Producidos Y Esperados Impactos económicos-sociales -Mejoramiento de la calidad del servicio en los establecimientos de salud: Esto se explica por el hecho de que cuando un paciente concurre a un centro asistencial tiene la expectativa de que dicho establecimiento debería brindarle una solución rápida y efectiva a su problema de salud. En el caso particular del producto del proyecto, este deberá estar disponible en todos los hospitales base de regiones permitiendo a los establecimientos de salud disponer de las herramientas efectivas a nivel de detección/confirmación (kit) que permitan una mejora sustancial en la capacidad y acertividad de la respuesta. Esta situación a medida que sea percibida por los beneficiaros directos (pacientes) se traducirá en una evaluación positiva de parte de la comunidad hacia éstos establecimientos de salud. - Mejoramiento de la calidad de vida de los afectados por loxoscelismo: Al existir un método diagnóstico rápido y específico, que permite actuar con la adecuada rapidez para evitar las más graves consecuencias del loxoscelismo, se es capaz de contrarrestar las secuelas de la mordedura y que además su aplicación no conlleve riesgos colaterales, lo que implica una mejoría neta en la calidad de vida de los posibles afectados, grupo de riesgo que en nuestro país es constituido por la mayoría de la población. - Impacto positivo en la economía nacional al generar un producto biomédico de tecnología avanzada que resuelve un problema presente en gran parte del macro continente americano, y que se constituye de esta manera en una fuente neta de exportaciones para nuestro país Impactos científicos-tecnológicos - Se consolida el equipo de investigación de la Unidad de Parasitología Molecular de la facultad de Ciencias de la Salud de la UA, como un referente a nivel nacional en las capacidades de I+D+i con resultados de alto impacto en el mercado. - Se generó la base para el desarrollo del antídoto para la mordedura de L. laeta que podrá ser desarrollado en un corto plazo para terminar de resolver el problema por el cual se plantéo originalmente el proyecto. - Se generó una metodología de trabajo de investigación y aplicación a la resolución de problemas concretos de la ciencia y de la técnica que puede adaptarse y replicarse para otros problemas similares tanto a nivel nacional como a nivel internacional. - Se generó propiedad intelectual basada en un sólido concimiento de un problema de salud pública al que está expuesto una gran parte de la población nacional Impactos Institucionales - La consolidación de las capacidades de I+D+i de la Unidad de Parasitología molecular posiciona a la UA como una de las universidades regionales con capacidades demostradas de generar un aporte neto a la resolución de problemas reales que afectan a la población nacional, y que por extensión se pueden transformar en soluciones exportables a otros países afectados por el mismo problema. La capacidad del equipo de asociarse y mantener la vinculación con agentes clave para la generación de un negocio tecnológico y el negocio productivo derivado, así como para contratar las asesorías y los servicios requeridos para ello, dejan de manifiesto que este equipo ha sabido sortear todas las dificultades que se experimentan para materializar un resultado de I+D en un producto innovativo Impactos Ambientales -Este proyecto ha permitido generar herramientas para el tratamiento del loxoscelismo causado por L. laeta que hace que este accidente tenga mejores probabilidades de ser tratado a tiempo y que no genere consecuencias negativas de ningún tipo para el paciente. Así como en otros casos en que el agente causante es una especie natural que no tiene la culpa de ser peligrosa para el ser humano, el desarrollo de métodos que permiten evitar las consecuencias negativas de la interacción humano-naturaleza, es un aporte neto al cuidado del medio ambiente ya que estas especies, aún siendo peligrosas para el ser humano, son esenciales en el ecosistema y cumplen una función que no puede eliminarse.

35 4.3.5 Impactos Regionales - Mejoramiento de la calidad de vida de los habitantes de la región. La zona norte de nuestro país y en especial la II región presenta una alta frecuencia de accidentes provocados por la mordedura de araña de rincón Loxosceles laeta que desencadenan en los cuadros clínicos ya descritos de LC y LCV, lo que conlleva que las personas afectadas se vean temporalmente incapacitadas de realizar sus labores habituales como concurrir al lugar de trabajo, y en el caso de los niños asistir a su centro educativo. En ambos casos, además se produce un daño psicológico que tiene que ver con el aspecto estético de la persona debido a las cicatrices post-accidente. De esta manera, el disponer del kit de diagnóstico de alta efectividad y seguridad que esté disponible para ser aplicado en las primeras horas del accidente, mejoraría las expectativas de los afectados y por ende de la calidad de vida. - Generación de conocimiento científico local. La Universidad de Antofagasta busca consolidarse como un referente necesario del desarrollo regional. Es por ello que la Universidad en conjunto con Fondef y las contrapartes nacionales privadas y públicas asociadas para este evento, ponen a disposición del proyecto los recursos necesarios para la investigación y desarrollo de una solución específica y altamente eficaz para un problema de salud pública a nivel nacional que hasta ahora permanece sin alternativas eficaces y que representa una sobrecarga que debe enfrentar nuestro sistema público de salud. - Desarrollo de infraestructura científica y formación de recursos humanos especializados. Con la ejecución del proyecto la Región a través de la Universidad de Antofagasta, se consolidó la infraestructura y recursos humanos altamente especializados, necesarios para el escalamiento y aumento de la productividad de otros emprendimientos biotecnológicos regionales necesarios a futuro. V. Anexos

36 SOLICITUD DE PATENTE Fecha: 8 Diciembre 2009 Inventores: Araya Rojas, Jorge; Sagua Franco, Hernán; González Cortes, Jorge; Catalán Rodríguez, Alejandro; Cortes Araya, William; Osorio Rodríguez, Luis; Vásquez Veloso, Abel. Solicitante: UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA Fosfolipasas D (Esfingomielinasas D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos Resumen del Invento: Se han obtenido dos esfingomielisas D (Fosfolipasas D) recombinantes, denominadas LlPLD1 (GenBanK Accesion GU121905) y LlPLD2 (GenBanK Accesion GU121906) a partir de glándulas de veneno de la araña de rincón (Loxosceles laeta). Se describe la forma de obtenerlas, producirlas y los usos principales.

37 Fosfolipasas D (Esfingomielinasas D) recombinantes de Loxosceles laeta, sus principales variantes y usos MEMORIA DESCRIPTIVA Descripción de lo Conocido en la Materia La invención aquí descrita tiene su principal campo de aplicación en el tratamiento de cuadros de envenenamiento asociados a la mordedura de las arañas de la familia Loxoscelidae, género Loxosceles, particularmente la especie Loxosceles laeta, con una especial aptitud y ventajas para una aplicación como inductor de inmunidad en vertebrados, a partir de lo cual es posible desarrollar anticuerpos específicos, que tienen múltiples aplicaciones evidentes para cualquier persona versada en el arte. Además, la presente invención tiene aplicación tanto industrial como médica y farmacéutica. La Organización Mundial de la Salud (OMS), considera cuatro géneros de arañas de verdadero interés médico por las manifestaciones clínicas y la letalidad de sus venenos. Tres de ellos pertenecen al infraorden Araneomorphae, siendo: Latrodectus, familia Theridiidae; Loxosceles, familia Loxoscelidae; Phoneutria, familia Ctenidae. El cuarto género pertenece al infraorden Mygalomorphae, Atrax, familia Hexathelidae (Quintana y Otero, 2002). Por su condición de depredadores, la mordedura de un arácnido en el ser humano sucede como consecuencia de un accidente, en el caso del género Loxosceles, la araña habitualmente durante la noche abandona su tela en busca de alimentos, y al ser sorprendida por la luz del día o bien luz artificial, busca rápidamente refugio en el primer lugar oscuro que encuentra, escondiéndose en prendas de vestir colgadas en la pared, o bien entra en la cama. Ahora bien, el accidente ocurre casi siempre cuando las arañas son aplastadas inadvertidamente contra la superficie cutánea de las personas, ella se siente atacada, se defiende y muerde, entonces los quelíceros son clavados en la piel, donde permanecen algunos segundos, simultáneamente la musculatura de las glándulas se contraerá haciendo que estas expulsen el veneno. La toxicidad de esta solución ponzoñosa, estará

38 en relación directa con el volumen inoculado en ese momento y con la susceptibilidad del individuo mordido. Si la araña se ha alimentado recientemente, tendrá poco veneno en sus glándulas, pero si ha permanecido en un estado de ayuno prolongado, la cantidad de este será mayor (Schenone y cols., 1988; Schenone, 2003). Importancia de las arañas del género Loxosceles spp. El veneno de arañas del género Loxosceles es una de las ponzoñas más tóxicas del planeta, y que en el ser humano puede resultar en una serie numerosa de síntomas y signos referidos como Loxoscelismo. En las personas que sufren el accidente, la toxina puede causar severas lesiones necróticas en la piel, en localizaciones restrictas al sitio de la mordedura, originando un cuadro clínico conocido como, loxoscelismo cutáneo (Pizzi y cols., 1957; Schenone, 1988; Futrell, 1992; Meier y White 1995; Ospedal y cols., 2002; Schenone, 2003) y dependiendo de la susceptibilidad del individuo y de la cantidad de veneno inoculada se origina el loxoscelismo cutáneo-visceral, provocando serios efectos sistémicos, tales como coagulación intravascular diseminada, hemolisis intravascular, deficiencia renal aguda, pudiendo incluso producir desenlaces fatales ( White y cols., 1995; Boyer y cols., 2001; Zanetti y cols., 2002; Luciano y cols., 2004). Las arañas del género Loxosceles (Heinecken & Lowe, 1835), conocidas bajo el nombre común de reclusa parda, araña violinista ó araña de los rincones, están ampliamente distribuidas en la orbe, incluyendo cerca de 100 especies de las cuales la mayoría han sido descritas en el nuevo mundo (Platnick, 2002). Se les encuentra distribuidas en América, en la región mediterránea de Europa, en África y Asia (Gertsch 1967; Gertsh y Ennik, 1983). Pertenecen al orden Araneida, al suborden Labidogntha (caracterizándose porque sus quelíceros, son de ubicación horizontal y al morder se entrecruzan como una pinza al cerrar) y a la familia Sicariidae (Keyserling, 1880). Las especies Loxosceles laeta (Nicolet, 1849) y Loxosceles coquimbo (Gertsch, 1967) han sido descritas como las únicas de su género en Chile (Suarez y cols., 1971; Schenone y Suarez 1978; Platnick, 2004) y particularmente Loxosceles laeta es considerada sin duda la más tóxicas y peligrosas (Nelson, 1988; Allen, 1988; Futrell, 1992; Pedrosa y cols., 2002). Loxosceles reclusa se encuentra en Norteamérica (Harrison y cols., 1998) y la Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) en países

39 Mediterráneos y en el Medio Oriente (Borkan y cols., 1995). Esto no excluye que se hayan descrito mordeduras por otras especies como Loxosceles gaucho (Gertsh, 1969) en Argentina y Loxosceles intermedia en Brasil (Tambourgi y cols., 1998). En São Paulo-Brasil se informan cada año cerca de 300 casos (Lucas y Meier, 1997), siendo L. gaucho, L. laeta y L. intermedia las más abundantes y de mayor importancia médica (Cardoso y cols., 1988; Araujo y cols., 2003). En Estados Unidos, en 1997 se informaron casos de mordeduras por Loxosceles spp., siendo Loxosceles reclusa (Gertsch y Mulaik, 1940) la especie más abundante (Rees y cols., 1987; Walter y cols., 1999). Más recientemente Aguilera y Casanueva (2005) añaden la posibilidad de encontrar en Chile a L. rufescens por ser esta una araña cosmopólita. Aspectos Fisiopatológicos del Veneno El veneno es un líquido cristalino viscoso, que es termolábil y constituido esencialmente por proteínas. Tiene propiedad necrotizante, hemolítica, vasculítica y coagulante. Razón por lo cual, en la piel provoca graves alteraciones vasculares, con áreas de vasoconstricción y otras de hemorragia, que llevan rápidamente a la isquemia local y a la constitución de una placa gangrenosa. Si el veneno alcanza la circulación sistémica, ya sea por inoculación directa en un capilar o por alteración en la permeabilidad, ejerce el gran poder hemolítico, que es el aspecto central en el loxoscelismo cutáneovisceral. Los componentes proteínicos del veneno han sido identificados, entre los que destacan la hialorunidasa (factor de difusión), desoxirribonucleasa, ribonucleasa, lipasa, fosfatasa alcalina y esfingomielinasa-d. La esfingomielinasa-d, proteína de 32 a 35 kda, que ha sido aislada y purificada de L. reclusa y L. intermedia, entre otras especies del género Loxosceles, es el componente mayoritario del veneno. Causa oclusión de la micro circulación (vasculítis), con inflamación de la pared capilar e infiltración leucocitaria secundaria a activación del complemento y, hemólisis dependiente de complemento local o sistémica que termina causando anemia e insuficiencia renal (Futrell, 1992; Kurpiewski y cols., 1981; Tambourgi y cols., 1998; Luciano y cols., 2004).

40 Luciano y cols. (2004), han demostrado experimentalmente en ratones, que el envenenamiento por Loxosceles induce un complejo patrón de nefrotoxicidad. Estudios histopatológicos muestran alteraciones a nivel de la estructura glomelular y tubular, el daño glomelular es evidente por la presencia de hematíes extravasculares alrededor de los capilares glomerulares y en el espacio de Bowman; en el también se observa un exudado rico en proteína. Se ha observado diferencias ontogénicas en la acción del veneno de L. intermedia, siendo más letales y dermonecróticos los venenos de las arañas adultas que de las ninfas recién nacidas, al igual que diferencias según el sexo, siendo mas potente el de las hembras que el de los machos (Gonçalves y cols., 1999; de Oliveira y cols., 1999). Por otro lado, las investigaciones realizadas dejan en evidencia la participación de componentes moleculares y celulares sanguíneos en el nocivo efecto del veneno. Así, una glicoproteína altamente conservada conocida como componente amiloide P del suero, pareciera ser un blanco de esfingomielinasa D para la activación de plaquetas y del efecto isquémico, jugando un probable papel en la necrosis causada por el veneno (Gates y Rees, 1990). En consecuencia, el veneno de Loxosceles sp produce agregación plaquetaria por la unión de la glicoproteína amiloide P a la membrana de la plaqueta en presencia de iones Ca ++, llevando finalmente a una coagulación intravascular diseminada (CID). Todo esto contribuye al daño local por obstrucción vascular, además de la secreción de serotonina por las plaquetas activadas y la inducción de quimiotaxis para los PMN hacia el sitio de la mordedura (Otero, 1998; Quintana y Otero, 2002). La gravedad del loxoscelismo es mayor, y la probabilidad de intervenir sobre la actividad del veneno es menor, mientras más tiempo transcurra entre la mordedura y el inicio del tratamiento, dado que existen indicios claros de que los peores daños en el organismo afectado por la mordedura, son causados como consecuencia de la acción de los mecanismos propios del metabolismo en respuesta al daño celular inicial que la acción inicial del veneno desencadena, lo que implica que el daño profundo no es causado directamente por el veneno, sino más bien es desencadenado por este.

41 El mecanismo por los cuales el veneno actúa sobre los componentes de la matriz extracelular pareciera ser muy similar para el grupo de arañas del género Loxosceles incluyendo; Loxosceles reclusa, encontrada en Norteamérica, Loxosceles gaucho y Loxosceles intermedia procedentes de Brasil y Loxosceles laeta nativa de Chile (Mota y Barbaro, 1995; Kalapothakis y cols., 2002). La esfingomielinasa D, que ha sido descrita como la de mayor actividad biológica (Kurpiewski y cols., 1981; Zela y cols., 2004), sería responsable por los daños necróticos en la piel, ya que es el factor de necrosis dérmica más importante, ya que altera las membranas celulares, activa mecanismos de inflamación, induciendo la quimiotaxis de neutrófilos, activando la vía de complemento, causando trombosis vascular local y reacciones inmunológicas parecidas a la reacción de Arthus. Esto contribuye a que en la piel haya isquemia local y se constituya una placa gangrenosa con gran edema. Los mecanismos moleculares por los cuales actuarían cada uno de los constituyentes del veneno, en el nocivo efecto sobre los tejidos y sus componentes celulares, aún no han sido completamente determinados. Diagnóstico El diagnóstico del loxoscelismo hoy en día, es eminentemente clínico y basado en la observación, siendo sustentado por las características de las lesiones y su orden de aparición. Es decir, cuadros cutáneos son reconocidos por la existencia de signos locales con nula o escasa repercusión general y un cuadro visceral es evidente ante la aparición precoz de un violento síndrome hemolítico, el cual puede ser evidenciado por pruebas de laboratorio. Obviamente que el hallazgo y captura del arácnido por parte del paciente o de algún familiar, para su posterior identificación taxonómica en laboratorio (6 ojos de disposición en pares formando un triangulo y la existencia de una mancha más oscura en forma de violín en el cefalotórax), facilita y orienta el diagnóstico y el tratamiento (Schenone, 2003). Por otro lado, es absolutamente necesario realizar un diagnóstico diferencial con otros cuadros clínicos inflamatorios o necróticos de la piel (herpes, enfermedad de Lyme, erisipela necrótica, carbunclo, necrosis química), o síndromes hemolíticos de otras causas que no sean la venenotoxemia (Schenone y cols., 1989).

42 No existen en la actualidad, en ningún laboratorio clínico del mundo, técnicas diagnosticas de rutina que permitan realizar un diagnostico rápido, precoz, sensible y especifico de la toxemia inducida por la mordedura de arañas del género Loxosceles. Sin embargo, algunos estudios han tratado de establecer algunas técnicas auxiliares de diagnostico tales como; ELISA para detectar antígenos del veneno (Smith, 1993), Hemaglutinación pasiva (Barret y cols., 1993) y la transformación blástica de los linfocitos. Los resultados obtenidos hasta ahora en ocasiones suelen ser contradictorios y no tienen ninguna aplicación práctica fuera del campo de investigación y experimental. ELISA para la detección de antígenos, ha sido montado experimentalmente en diversos laboratorios, sueros hiperinmunes preparados en caballos son empleados para la obtención de IgGs especificas anti-antígenos del veneno de alguna especie de Loxosceles, mediante cromatografía de inmunoafinidad, finalmente los anticuerpos inmunopurificados son empleados para montar el ELISA tipo sandwich (Smith, 1993; Chavez-Olortegui y cols., 1998; Gomez y cols., 1999; Miller y cols., 2000; Gomez y cols.,2001; Krywko y Gomez, 2002), los ensayos detectan 0,1 0,8 ngr de antígenos del veneno. Las muestras analizadas han sido: exudado o aspirados del sitio de la mordedura, pelos, piel y suero. Recientemente, usando conejos como modelos experimentales, Krywko y Gomes (2002) mostraron que el veneno puede ser detectado en pelos, en aspirados y en biopsias de piel a lo menos después de siete días post-inoculación, pero no detectables en suero. Al respecto, Alvarenga y cols. (2003), desarrollaron un ELISA para la detección de una de las proteínas responsables de la actividad tóxica encontrada en los fluidos de animales envenenados. Ellos emplean un anticuerpo monoclonal (Li mab) para la captura del antígeno y para revelar una IgG F(ab )2 de caballo anti L. intermedia para acoplar la peroxidasa, mediante este ensayo se evidencio que el factor dermonecrótico era detectado rápidamente en el suero de animal de experimentación, alcanzando un máximo de reactividad a los 15 minutos, y luego a partir de los 30 minutos empieza a decaer progresivamente hasta las cuatro horas. El Li mab empleado no presenta reacción cruzada con el factor dermonecrótico de otras especies, entre ellas L. laeta, por lo tanto

43 seria solo especifico para L. intermedia, este ensayo es bastante sensible (0,2 ng/ensayo) y podría ser usado para detectar factor dermonecrótico directamente en suero humano. Stoecker y cols. (2006) informaron una confirmación de mordedura por L. reclusa mediante el uso de un test ELISA tomando una muestra de tejido no invasiva del área afectada por una mordedura con sintomatología no dermonecrótica. El test utilizado fue el reportado por Gomez y cols en 2002, y se logro detectar una cantidad de veneno estimada en 34 picogramos obtenida por frotis de la lesión cutánea. En este caso se logró confirmar efectivamente que la mordedura fue por L. reclusa porque se capturó e identificó el causante. La patente BRPI (A) y sus equivalentes WO (A2), WO (A3),MXPA (A), AU (A1), AR (A1) propone el uso de las esfingomielinasas D recombinantes de 3 especies de Loxosceles (L. boneti, L. reclusa y L. laeta) como parte de un antígeno matriz útil en inmuno purificación de anticuerpos y sus fragmentos o como parte de un dispositivo de diagnóstico para apoyar la confirmación clínica de que el agente causante del estado de intoxicación en un paciente es un araña Loxosceles. Sin embargo, la patente no provee ejemplos de su utilización para estos fines. Tratamiento Para el tratamiento del loxoscelismo en pacientes humanos existen varias propuestas, que van desde el uso de: analgésicos, suero anti-loxosceles polivalente, oxígeno hiperbárico, excisión quirúrgica, corticoides sistémicos o intra lesionales y las sulfonas (Dapsone ), además de la terapia de sostenimiento (King y Rees, 1983; Rees y cols., 1987; Srain y cols., 1991; Furtrel, 1992; Gomez y cols., 1999). Antitoxina o antisuero El término antitoxina o antisuero antiloxosceles engloba un compuesto biológico que conceptualmente consiste en una mezcla de anticuerpos capaces de unirse específicamente a las

44 moléculas biológicamente activas del veneno e inactivarlas, evitando así que produzcan daño en los tejidos del organismo afectado por la mordedura. Hoy en día, estos sueros se obtienen en animales, especialmente en caballos, los cuales son inmunizados con pequeñas dosis del veneno. Estos sueros, a menudo, son procesados para concentrar los anticuerpos antiveneno y a su vez disminuir la presencia de otras proteínas que puedan causar reacciones alérgicas en el receptor. Efectos adversos del suero antiloxosceles han sido reportados en Santa Catarina, Brasil, en donde un 6,4% (8/125) de reacciones fueron observadas, erupciones cutáneas, rubor facial, náuseas y vómitos, urticaria, escalofríos y broncoespasmo, todas ellas catalogadas como leves (Severino y cols., 1998). En el Instituto Butantan, según Málaque y cols. (2002), fueron registradas un 20% de reacciones anafilácticas tempranas, la mayoría leves y sin riesgo vital. No obstante estos hallazgos, siempre hay que considerar que el shock anafiláctico es un cuadro clínico grave y que puede llevar a la muerte a un individuo susceptible, sobre todo si se piensa que estos sueros son empleados en un paciente que ya está siendo afectado fuertemente por la intoxicación del veneno de la araña. Existen antisueros monovalentes y polivalentes, los primeros serian aquellos que son preparados a partir del veneno de una única especie de arácnido y en los segundo combinan venenos de diferentes variedades de arañas así como también otras especies ponzoñosas (escorpiones, alacranes, etc.), para cuando no existe un diagnóstico preciso del agente causal (Heard y cols., 1999; Braz y cols., 1999; Araujo y cols., 2004). Los antisueros monovalentes producidos a partir de la inmunización con veneno de distintas especies de Loxosceles muestran compartir sus capacidades de neutralizar la actividad dermonecrótica. Así, sueros anti-l. intermedia y anti-l. gaucho son capaces de bloquear la acción toxica del veneno de L. laeta (Barbaro y cols., 1994; Mota y cols., 1995). En el campo de la investigación, Gómez y cols. (1999), emplearon un antiveneno experimental con fragmentos Fab, el cual atenúa el efecto dermonecrótico el veneno de Loxosceles en conejos. Esta antitoxina presenta mayor seguridad en su uso con respecto a antisueros de inmunoglobulinas completas porque disminuye las posibilidades de reacciones adversas. La eficiencia de un antisuero monovalente producido en caballos contra el veneno de L. intermedia fue demostrada por Braz y

45 cols, (1999), este posee una potente acción neutralizante del veneno y se constituye en una alternativa de tratamiento para el envenenamiento por L. intermedia en Brasil. Recientemente, estudios experimentales realizados en conejo han demostrado la eficacia de la inyección de antiveneno in situ para disminuir tanto la lesión dermonecrótica como la migración de PMN, siempre y cuando el tiempo de aplicación del antídoto no sea retardado (Gómez y cols., 1999; Guilherme- Fernandez, 2001) Así, los estudios experimentales en animales sugieren que el antisuero disminuiría el riesgo de necrosis cutánea y que la efectividad de este sería mayor mientras más precoz es la administración. Ello es consistente con los resultados de estudios in vitro, en cuanto a la neutralización de la actividad dermonecrótica. No obstante, no es posible inferir a partir de dichos estudios, cuál sería el tiempo máximo dentro del cual se podría esperar el efecto en el ser humano. En conejos, el efecto parece no extenderse más allá de las 4 horas que siguen al accidente. Por otro lado, existen evidencias que sugieren que el antisuero no previene la acción hemolítica del veneno (Bravo y cols., 1994) pero, contradictoriamente a ello Barbaro y cols. (1996), no observaron actividad hemolítica directa en el veneno. En relación a los efectos adversos del antisuero, si bien existe el riesgo grave y potencialmente mortal por la administración del suero originándose un shock anafiláctico, la experiencia acumulada sugiere que dichos eventos son poco probables (Araujo y cols.,2004). Pauli y cols. (2009), estudiaron el uso de un antiveneno mejorado, a partir del clásico, por ser los segmentos f(ab )2 de IgG de equinos hiper inmunizados con veneno de diferentes arañas del género Loxosceles (producido por el CPPI de Curitiba) en conejos, intentando establecer el mayor intervalo de tiempo entre la mordedura y la aplicación del antiveneno para que este último lograse reducir la lesión y la mortalidad. Concluyeron que los efectos del envenenamiento pueden minimizarse en los conejos si la aplicación del antiveneno es hasta 12 horas posteriores a la mordedura, y la lesión necrótica puede reducirse si la inyección del antiveneno ocurre hasta 48 horas posteriores a la mordedura. Sin embargo, estos investigadores no se pronunciaron respecto a los potenciales inconvenientes del antiveneno producido a partir de IgG equinas aplicado a seres humanos. Manzoni

46 de Almeida y cols (2008), desarrollaron un suero equino basado en la inmunización con una variedad de proteínas recombinantes (SMasa D) de L. intermedia y L. laeta, cuyos ensayos preclínicos en conejos comparados con el antisuero anti-aracnidico (Instituto Butantan), fueron superiores en protección, tanto en el desafío con veneno de L. intermedia y L. laeta, pero no en el caso de L. gaucho. Estos autores concluyeron la factibilidad del empleo de proteínas recombinantes de SMasa D para la elaboración de un antisuero, sin embargo, esta estrategia no resuelve el riesgo de shock anafiláctico a causa de proteínas equinas, en futuras pruebas en humanos. Recientemente, Felicori y cols (2009), desarrollaron una nueva estrategia de antiveneno producido en conejos, basado en el empleo de péptidos sintéticos de regiones altamente inmunogenicas de la proteína recombinante Loxtox LiD1. Los resultados indican que esta estrategia, cuya intención es minimizar el riesgo para los pacientes al usar segmentos con alta capacidad inmunogenica pero sin actividad toxica, fueron insuficientes y requieren de mayor estudio para que puedan llegar a ser empleados en pruebas clínicas. Por otro lado, no existe evidencia directa derivada de estudios sistemáticos y controlados, sobre la efectividad del suero anti-loxosceles en seres humanos. En los casos clínicos publicados no se han registrados efectos evidentes que permitan suponer ni inferir de modo definitivo que el suero tiene algún efecto protector. En estas mismas series se han observado muertes y desarrollo de úlceras necróticas pese a la administración del suero. No existen tampoco datos que permitan distinguir los efectos de sueros polivalentes de los que podrían producir los antivenenos específicos. La afirmación de que el suero puede tener efectos beneficiosos pese a ser administrado tardíamente (hasta el tercer día siguiente a la mordedura) no tiene sustento científico, más aún, cuando los casos de LCV que han sobrevivido al tercer día parecen ser aquellos con mejor pronóstico independientemente del tratamiento (MINSAL, 2004). De este modo es posible afirmar que no existe actualmente un antisuero eficaz contra la mordedura de Loxosceles laeta. Proteínas recombinantes obtenidas a partir de Loxosceles spp. y su utilización

47 Una de las grandes problemáticas para la realización de estudios que permitan dilucidar definitivamente los mecanismos moleculares involucrados en el Loxoscelismo, es la dificultad de obtener en gran escala, e independientemente de la disponibilidad de arácnidos vivos, cada una de las moléculas componentes del veneno, principalmente aquellas involucradas en su toxicidad. Aunque, las toxinas sean preparadas a homogeneidad no puede ser excluida la posibilidad de que pequeños contaminantes existentes originen efectos biológicos no esperados llevando a interpretaciones equivocadas por parte del investigador (Pedrosa y cols., 2002). Con el advenimiento de la Biología Molecular y específicamente de la Tecnología del ADN Recombinante, hoy en día es posible clonar genes, expresar las proteínas, producirlas en el laboratorio en masa y caracterizarlas del punto de vista biológico y funcional. Recientemente, Kalapothakis y cols. (2002), describen la identificación y caracterización molecular de LiD1, una proteína que pertenece a la familia de los componentes con actividad dermonecrótica de L. intermedia, esta proteína es expresada en las glándulas de veneno del arácnido, fue clonada empleando una genoteca de ADN complementario (ADNc) y anticuerpos contra proteínas con actividad dermonecrótica aisladas de veneno de arañas del género Loxosceles. El clon aislado y caracterizado codifica para una proteína de aproximadamente 31 kda con un pi (punto isoeléctrico) de 1,37; presentaría un péptido señal, un pro-péptido y también una región no traducida de 218 nucleótidos. La proteína LiD1 fue expresada en fusión con β-galactosidasa en el vector pcmv resultando una proteína recombinante (rlid1) funcional y con propiedades inmunológicas importantes. Fue reconocida por anticuerpos anti-proteína dermonecrótica, así como también fue capaz de generar anticuerpos reactivos contra la proteína dermonecrótica nativa del veneno de L intermedia. Empleando secuencias marcadoras de expresión ( Expressed Sequencing Tag ), Fernández- Pedrosa y cols. (2002) aislaron de una genoteca de ADNc de L. laeta varios clones que codificaban para proteínas con significativa símilaridad con la región N-terminal de esfingomielinasa de L. intermedia. Uno de los clones denominado H17 fue expresado como una proteína de fusión conteniendo en su región N-terminal 6 histidinas (His-Tag), con un peso molecular de 33 kda. La proteína recombinante presentó todas las características descritas en la proteína esfingomielinasa

48 de L. laeta y de L. intermedia, incluyendo la actividad dermonecrótica y la actividad hemolítica dependiente de complemento. Anticuerpos dirigidos contra la proteína recombinante reconocen en un Western-blot de un extracto crudo del veneno de L. laeta, la proteína nativa de 32 kda (esfingomielinasa). Estos mismos anticuerpos son capaces de bloquear la reacción dermonecrótica producida por el veneno de L. laeta. Este estudio demuestra, en forma conclusiva, que la actividad de esfingomielinasa sería responsable por el mayor efecto patológico observado en el veneno de arañas del género Loxosceles. Recientemente, este mismo grupo de investigadores consiguieron la cristalización y los primeros análisis cristalográficos de esfingomielinasa (SMasa I) del veneno de L. laeta (Zela y cols., 2004). Araujo y cols. (2003), emplearon una proteína recombinante fusionada con β-galactosidasa (Li-rec) como antígeno para inmunizar conejos y ratones. Los anticuerpos obtenidos en ambas especies animales, reconocen la proteína nativa en un extracto crudo de veneno de L. intermedia. Ensayos de neutralización del efecto letal in vitro, indicaron que 1 ml de suero de conejo conteniendo anti-li-rec fue capaz de neutralizar 25 LD50 del veneno. Por otro lado, ensayos de protección in vivo en conejos, demostraron que la proteína de fusión empleada como inmunógeno inducía una respuesta protectora duradera en el tiempo, contra la actividad dermonecrótica del veneno de Loxosceles. Ratones inmunizados fueron totalmente protegidos contra 2,5 DL50 del veneno. Estos resultados proveen evidencias básicas para la utilización de estas proteínas recombinantes como inmunógenos para la producción de antisueros para el uso clínico y/o tal vez como potenciales vacunas induciendo eficiente inmunidad protectora contra L. intermedia. Bertoni da Silveira y cols. (2006), clonaron dos isoformas de esfingomielinasas D de L. intermedia LiRecDT2 (1062 bp ADNc) y LiRecDT3 (1007 bp ADNc) expresándolas en vectores dentro de E. coli. Las toxinas de origen recombinante mostraron funcionalidad diferencial en conejos: LiRecDT2 causado una lesión macroscópica de propagación con la gravedad a la inyección intradérmica, mientras que LiRecDT3 causó inflamación transitoria y eritema en el sitio de inyección. El análisis de microscopía óptica de las biopsias de la piel reveló un edema, una colección de células inflamatorias en y alrededor de los vasos sanguíneos y una red proteica en la dermis. Por otra parte, la funcionalidad diferencial para las toxinas recombinantes también fue demostrada por una alta

49 actividad esfingomielinasa D para LiRecDT2 y baja actividad para LiRecDT3 así como mayor en la agregación plaquetaria in vitro y la permeabilidad de los vasos sanguíneos inducida por LiRecDT2 y la actividad residual de LiRecDT3. La clonación y expresión de las dos toxinas recombinantes dermonecróticas demostraría la existencia de una familia intraespecífica de toxinas homólogas que actúan en sinergia para las actividades perjudiciales del veneno. La patente BRPI (A) (2007) establece el uso de 2 esfingomielinasas recombinantes denominadas P1 (GenBank - número de acceso AY304471) y P2 (GenBank número acceso AY304472) obtenidas a partir del veneno de L. intermedia, y una esfingomielinasa recombinante (GenBank número acceso AY093599) aislada a partir del veneno de L. laeta, así como otras esfingomielinasas expresadas en otras especies del género Loxosceles, como antígenos para la inmunización de caballos, la purificación de la IgG y/o fragmentos de los sueros inmunes producidos y la combinación de estas fracciones para la composición final de un suero anti loxoscelico. La ya mencionada patente BRPI (A) y sus equivalentes WO (A2), WO (A3),MXPA (A), AU (A1), AR (A1) proponen el uso de las esfingomielinasas D recombinantes de 3 especies de Loxosceles (L. boneti, L. reclusa y L. laeta) como inmunógeno para la producción, en vertebrados, de los anticuerpos neutralizantes contra el veneno y los correspondientes fragmentos F (ab) 2 de la misma. Manzoni de Almeida y Cols. (2008) utilizaron una esfingomielinasa D recombinante para inmunizar caballos y obtener suero antiloxoscelico para comparar su actividad con un suero preexistente denominado anti-arácnido (obtenido por inmunización en caballos con el veneno completo de las arañas). Sus resultados en conejos indicaron una mayor actividad neutralizante de este suero antiloxoscelico para los venenos de L. intermedia y L. laeta, mientras que una menor actividad neutralizante para el veneno de L. gaucho, con respecto al suero anti-arácnido. Felicori y cols. (2009) sintetizaron algunos polipéptidos en base a la imitación de epitopes antigénicos identificados por el método SPOT en esfingomielinasas D recombinantes de Loxosceles intermedia, y evaluaron su actividad neutralizante de los anticuerpos obtenidos a partir de conejos

50 desafiados con estos péptidos con respecto a los obtenidos por inmunización con la proteína recombinante completa de L. intermedia. Ninguna de las preparaciones peptídicas fue superior a la toxina recombinante completa como inductora de inmunización y solo una fue capaz de inducir la formación de anticuerpos con alguna acción neutralizante luego de su inyección en conejos desafiados con la toxina recombinante. Polimorfismo en esfingomielinasas D del género Loxosceles e importancia funcional. Hasta aquí se han expuesto antecedentes que implican que las esfingomielinasas D del veneno de las arañas del género Loxosceles spp. corresponden al principal componente causante de los cuadros de Loxoscelismo. Sin embargo, es importante destacar que existe una enorme variación polimórfica en estas proteínas a lo largo del género, y es por ello que las afirmaciones de que una proteína aislada de una población determinada sea capaz de ser utilizable como base para el desarrollo de todos los casos que se puedan presentar es, a lo menos, cuestionable. En este sentido, Fernández Pedrosa y cols. (2008) fueron quienes descubrieron que el polimorfismo de las esfingomielinasas D tan solo en la especie Loxosceles laeta es de una magnitud tal, que un 16,4% del transcriptoma de la población evaluada (3008 etiquetas de secuencia expresadas) de esta especie corresponde a variantes de esfingomielinasas D. Este antecedente debe tenerse en cuenta al momento de considerar que el trabajo efectuado por los presentadores de la presente invención tiene similaridades con lo versado en el arte, y, sin embargo, las proteínas recombinantes que se han creado, son categóricamente distintas de las ya reportadas en el arte, siendo la homología más alta de un 95% tanto en la secuencia de nucléotidos y de aminoácidos, mientras que la más baja, es de un 84% en este mismo sentido. El efecto práctico de esta diferencia entre las esfingomielinasas D es tan dramático como que una de las dos esfingomielinasas que estamos protegiendo como invención en la presente solicitud, no presenta actividad dermonecrótica, pero si tiene alta actividad neutralizadora del veneno, con lo cual se comprende su importancia y utilidad práctica superiores. En este mismo sentido, se puede agregar que de Santi Ferrara y cols (2009) clonaron otra esfingomielinasa D de L. laeta por el método de las etiquetas de expresión de secuencias, la cual expresaron luego en un vector y compararon con otras esfingomielinasas previamente identificadas

51 en L. laeta y L. boneti, encontrando respectivamente un 40% y un 77% de homología en las secuencias de nucléotidos.

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65 Descripción de la Invención Han sido desarrolladas dos nuevas esfingomielinasas D recombinantes, denominadas LlPLD1 y LlPLD2 a partir de los ARNm de una población de glándulas de veneno de Loxosceles laeta, la síntesis de sus correspondientes ADNc y la construcción de estos en un vector de expresión pet- SUMO-LlPLD1 y pet-sumo-llpld2 para ser producida en cultivos de Escherichia coli BL21 (DE3) y luego purificadas a partir de estos cultivos para ser utilizadas en diversas formas las cuales son descritas a continuación. La invención aquí revelada, en su manifestación o forma de ejecución principal, se describe a continuación de modo secuencial: Se capturan arañas pertenecientes al género Loxosceles, siendo las que se capturen pertenecientes a las especies descritas en el área geográfica donde se han recolectado (en este caso, corresponderían probablemente a las especies L. laeta, L. coquimbo y L. rufescens), predominantemente de L. laeta. Las arañas recolectadas fueron identificadas por un estudio morfotaxonómico para asegurar que solo se trabajo con ejemplares de L. laeta. Se extraen un número significativo de glándulas de veneno de las arañas recolectadas, para luego extraer los ARNm que codifican para las esfingomielinasas D presentes en las glándulas de veneno de la araña L. laeta. Utilizando para este fin el kit de aislamiento de ARNm MicroFast Track 2.0 (Invitrogen,Carlsbad, USA), siguiendo las instrucciones entregadas por el fabricante. Los ARNm aislados de las glándulas de veneno de la araña L. laeta fueron utilizados para síntesis de la primera hebra de ADNc mediante el kit SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen), siguiendo las instrucciones entregadas por el fabricante. Para esto µg de ARNm fueron incubados con un oligo(dt)20 y amplificada por RT-PCR para obtener la primera hebra de ADNc que sintetizarían para las proteínas deseadas. La doble hebra de ADNc fue obtenida incubando el producto de la primera reacción con una T4 DNA polimerasa. La genoteca de ADNc fue utilizada en la realización de reacción de polimerasa en cadena (PCR) utilizando partidores gen específico para esfingomielinasa D, diseñados a partir de

66 secuencia de nucleótidos para PLD de la especie L. laeta depositadas en el GenBank (accesos AY y AY093600; Fernandes Pedrosa et al., 2002). Los oligos (partidores) fueron degenerados en las bases no idénticas presentes en la región 5 del gen y presentaron la adición de un sitio de restricción para la enzima Eco RI. La PCR se realizó utilizando µl de ADNc en un volumen final de reacción de µl, cuyos componentes fueron: 50 mm KCl, 20 mm Tris HCl (ph 8.4), 1.5 mm MgCl2, 0.2 mm de cada dntp, 1 U Taq DNA polimerasa (Invitrogen Inc, Carlsbad, USA) y 12 pmol de cada oligo. La reacción se llevo a cabo utilizando un termociclador Programmable Thermal Controller PTC-100 (MJ Research, Inc). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un paso inicial de denaturación a 95 ºC por 5 min; 35 ciclos de denaturación a 95 ºC por 1 min, alineamiento a 50 ºC por 30 s y extensión a 72 ºC por 1 min; y una extensión final a 72 ºC por 7 min. Productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 0.8% teñidos con bromuro de etidio. El ORF completo fue clonado en un vector de clonaje, pudiendo ser empleado cualquiera de los existentes en el mercado, en particular en este caso el vector pcr2.1 TOPO utilizando el Kit TOPO TA Cloning (Invitrogen) y posteriormente transformado en células químicamente competentes E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen). Una vez obtenidos los diferentes transformantes, fueron seleccionados mediante la adición de X-Gal para selección de colonias blanco/azul en placas de agar LB (Luria-Bertani) conteniendo µg/ml de Ampicilina, pudiendo utilizarse cualquier otro medio de cultivo enriquecido como 2YT, Terrific, o modificaciones de ellos. Se obtuvo un grupo de clones escogidos al azar, los cuales fueron secuenciados en ambas hebras utilizando un ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) y analizados por un secuenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems) empleando para el secuenciamiento partidores para el promotor T7. Las secuencias fueron comparadas con las previamente reportadas (Fernandes-Pedrosa et al., 2002; WO2006/025718), seleccionando aquellos que presentaron identidad menor al 99% con respecto a la secuencia de nucleótidos. Concretamente, LlPLD1 mostro un 96% de identidad con SMasaI (H17), un 89% con Smasa like (H13), un 96% con SMasaDLl1 y un 88% con SMasaDLl2. Por su parte LlPLD2 mostro un porcentaje de identidad de 87% con SMasaI (H17), un 95% con Smasa like (H13), un 87% con SMasaDLl1 y un 95% con SMasaDLl2.

67 Los ADNc obtenidos fueron incorporados en un vector de expresión petsumo (Invitrogen), mediante el cual los constructos recombinantes petsumo-llpld1 y petsumo-llpld2 fueron expresados como una proteína de fusión con un Tag de 6-His en la región N- terminal junto con la adición de la proteína SUMO (correspondiente a una proteína Smt3 de Sacharomyces cereviceae, con actividad tipo ubiquitina), la cual permite aumentar los niveles de expresión así como la solubilidad de las proteínas recombinantes. El constructo recombinante fue preparado mediante amplificación por PCR con la enzima Pfx DNA polimerasa (Invitrogen) y se realizó un ciclo adicional de amplificación con la enzima Taq DNA polimerasa, la cual permite adicionar una deoxiadenosina al extremo 3 del producto de PCR, y de esta forma poder ser ligado al vector pet-sumo, el cual presenta un deoxitimidina en su extremo 5. Se emplearon partidores diseñados a partir de las secuencias nucleotidicas LlPLD1 y LlPLD2, con sitios de restricción BamHI en el extremo 5 de partidor sentido (delineado) y en el extremo 5 del partidor antisentido (delineado). Los partidores sentidos utilizados fueron: 5 -ggattcatggtgaacgctgta-3 para la LlPLD1 y 5 - ggattcatgtacgttcacttagcg-3 para la LlPLD2. Mientras que, los partidores antisentido utilizados fueron: 5 -ggatccttattttttataagtctccca-3 para la LlPLD1 y 5 - ggatccctaatttttaaaagtgtc-3 para la LlPLD2, el codón de inicio y término se muestran en negrita. Los insertos amplificados por PCR fueron digeridos con la enzima de restricción BamHI y purificados en electroforesis en gel de agarosa utilizando UltraClean TM 15 DNA Purification Sample Kit (MO BIO Lab, Carlsbad, USA) y ligados al vector de expresión mediante incubación con T4 ligasa a 16 C por 18 horas. La correcta secuencia fue confirmada por secuenciamiento. Los vectores de expresión recombinante, petsumo-llpld1 y petsumo-llpld2, fueron transformados en una cepa bacteriana E. coli BL21 (DE3) químicamente competente e incubados en medio LB con µg/ml del antibiótico Kanamicina. Los clones recombinantes E. coli BL21 (DE3)-pETSUMOLlPLDs, fueron inoculados en caldo LB (50 µg/ml de Kanamicina) e incubados toda la noche a 37 C. Luego los cultivos fueron diluidos 1:50 en 50 ml de caldo LB/Kanamicina e incubados a 37 C con constante agitación hasta una OD600 0,5. La expresión de las proteínas recombinantes fue inducida mediante la adición de isopropil-β-d-tiogalactosido (IPTG) a una concentración final de 0.1 0,025 mm e incubados a una temperatura en el rango de 20 a 30 C, preferentemente 25 C con vigorosa agitación (250 rpm) por 3-8 h, preferentemente 7 horas.

68 La purificación de las proteínas recombinante se efectúo como se indica. Las células fueron centrifugadas sobre 4000 x g por 15 min y resuspendidas en buffer de extracción (100 mm de Tris-HCl ph 8.0, 300 mm NaCl, 10 mm imidazol, 1 mg/ml lisozima). Las suspensiones celulares fueron lisadas por 6 ciclos de sonicación de 10 s cada uno a baja intensidad. Posteriormente los lisados fueron centrifugados a x g por 20 min y los sobrenadantes fueron cargados en una columna Ni +2 Chelating Fast Flow (Amersham Pharmacia, Piscataway, USA). Las columnas fueron lavadas con 10 volúmenes de buffer de extracción, seguido por 10 volúmenes de buffer de lavado (100 mm Tris-HCl ph 8.0, 300 mm NaCl, 20 mm imidazol) y la proteína recombinante fue eluida con el buffer de elusión (100 mm Tris-HCl ph 8.0, 300 mm NaCl, 250 mm imidazol). Fracciones de 1 ml fueron recolectadas y analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones fueron mezcladas y dializadas en PBS. Concentración de proteínas fue determinado por el método de Azul de Coomassie (BioRad, Hercules, USA) descrito por Bradford, Las fosfolipasas D (esfingomielinasa D) aisladas de esta manera han sido registradas en el GenBank quedando identificadas con los siguientes denominadores (Accesión N GU121905) para LlPLD1 y (Accesión N GU121906) para LlPLD2. La secuencia nucleotídica de la esfingomielinasa D LlPLD1 es: ATGTACGTTCACTTAGCGTTAATCTTAGGTTGCTGGACCGTAGTCCTACAGGGAGCCGAAACGG ATGTTGGTGAACGAGCTGATAACCGTCGTCCAATTTGGAACCTGGCTCATATGGTGAACGCTGT GAAACAAATACCAACCTTTTTAGATCTCGGTGCAAACGCATTAGAAGCGGATGTTACTTTTAAGG GATCGGTGCCTACCTATACTTACCACGGAACACCTTGCGACTTCGGTAGGGACTGCATCAGATG GGAGTATTTCAACGTATTTCTGAAAACACTGAGAGAATACACAACGCCAGGAAATGCCAAGTATC GTGATGGGTTCATACTGTTCGTTTTGGACTTGAAGACGGGTAGCCTGAGCAACGATCAAGTACG TCCTGCCGGAGAAAATGTAGCAAAGGAACTTCTACAGAATTACTGGAACAATGGTAATAATGGTG GAAGAGCGTACGTAGTATTGTCACTACCTGATATCGGGCATTACGAATTTGTAAGAGGATTTAAA GAAGTACTTAAGAAAGAAGGTCATGAGGACTTGTTGGAGAAAGTAGGATACGACTTCTCTGGCC CATACCTGCCAAGCCTGCCTACACTAGATGCAACTCACGAAGCCTATAAAAAAGCTGGAGTGGA CGGCCACATCTGGTTAAGTGATGGCCTCACCAATTTTTCCCCACTTGGTGACATGGCTCGACTA AAAGAAGCTATAAAAAGTAGGGATTCGGCAAATGGATTTATCAATAAAATTTACTACTGGTCTGTA GACAAATATTCAACAACGAGAACAGCACTAGATGTTGGCGTTGATGGAATAATGACCAATTATCC

69 GAACGTTCTTATCGACGTCCTCAACGAAGATGGATACAAGGATAACTACAGGTTGGCAACTTAC GACGACAATCCATGGGAGACTTATAAAAAATAACAAGCTTCAACATAATACTGTAG La secuencia nucleotídica de la esfingomielinasa D LlPLD2 es: ATGGTGAACGCTGTAAAACAGATACCAACCTTTTTGAACGATGGTGCAAACGCAATAGAAGCGG ACATTACTTTTAAGGGAGCGGTGCCCACCTACAGTTACCATGGAACGCCTTGCGACTTCGGTAG GGACTGCATCAGATGGGAGTATTTCAACGTATTTCTGCAAACACTGAGAGATTACACAACGCCA GGAAATTCCAAGTATCGTGAGAAGTTCATACTGTTTGTTTTGGACTTGAAGACGGGCAGCTTGAA CAACCATGAAGTGAGAAAAGCCGGAGAAAATGTAGCCAAGGGACTTCTAGAGAATTACTGGAAC AATGGTAATAATGGAGGAAGAGCATACGTAGTATTGTCATTACCTGATATCGCGCATTACGAATT TATACGAACATTTAAAGAAGTACTTAAGACAAAAGGTCATGAGAATTTGTTGGACAAAGTAGGAT ACGACTTATCTGGCCCATACTGGCCAAGCCTACCCTCACTGGATTCAGTTCACGAAGCCTTTAAA AAAGCTGGAGTGGATGGTCACGTCTGGCTAAGTGATGGCCTCACCAATTGGGCGGCACTTGAT GACATGGCTCGACTAAAACAAATTGTAGAAAGAAGGGACTCGGAAAATGGATTTATTAGTAAAGT TTACTACTGGTCTGTAGACAAATATTCAACAACGAGAACAGCACTAGAAGTTGGCGTTGATGGAA TAATGACCAATTATCCGTACGTTATTATTGACGTCCTCAACGAAGCTAAATACAAGGATAAATACA GGTTAGCAACTTACGACGACAATCCATGGGAGACTTTTAAAAATTAg La secuencia de aminoácidos de la esfingomielinasa D LlPLD1 es: MYVHLALILGCWTVVLQGAETDVGERADNRRPIWNLAHMVNAVKQIPTFLDLGANALEADVTFKGSV PTYTYHGTPCDFGRDCIRWEYFNVFLKTLREYTTPGNAKYRDGFILFVLDLKTGSLSNDQVRPAGEN VAKELLQNYWNNGNNGGRAYVVLSLPDIGHYEFVRGFKEVLKKEGHEDLLEKVGYDFSGPYLPSLP TLDATHEAYKKAGVDGHIWLSDGLTNFSPLGDMARLKEAIKSRDSANGFINKIYYWSVDKYSTTRTAL DVGVDGIMTNYPNVLIDVLNEDGYKDNYRLATYDDNPWETYKK. La secuencia de aminoácidos de la esfingomielinasa D LlPLD2 es: MVNAVKQIPTFLNDGANAIEADITFKGAVPTYSYHGTPCDFGRDCIRWEYFNVFLQTLRDYTTPGNSK YREKFILFVLDLKTGSLNNHEVRKAGENVAKGLLENYWNNGNNGGRAYVVLSLPDIAHYEFIRTFKEV LKTKGHENLLDKVGYDLSGPYWPSLPSLDSVHEAFKKAGVDGHVWLSDGLTNWAALDDMARLKQIV ERRDSENGFISKVYYWSVDKYSTTRTALEVGVDGIMTNYPYVIIDVLNEAKYKDKYRLATYDDNPWE TFKN La esfingomielinasa D LlPLD1 presenta actividad esfingomielinasa D, dermonecrótica y hemolítica dependiente del complemento.

70 La esfingomielinasa D LlPLD2 presenta actividad esfingomielinasa D, pero escasa actividad dermonecrótica y hemolítica dependiente del complemento.

71 Ejemplos de aplicación La invención aquí descrita tiene una amplia gama de usos para los cuales ha sido aplicada, y de los cuales a continuación se hace referencia porque ha sido empleada para ello. La Figura 1, muestra el alineamiento de secuencia deducida de aminoácidos de las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2, protegidas en la presente invención, comparándolas con las secuencias de las proteínas recombinantes obtenidas por otros grupos de investigación. Nótese que en el mejor de los casos las proteínas recombinantes de la presente invención, presentan un 95% de identidad con respecto a las previamente descritas. Es importante resaltar que este porcentaje de identidad permite afirmar que se trata de proteínas diferentes, no reportadas previamente en el estado del arte. En la Figura 2 se puede observar la electroforesis en geles de SDS-PAGE de la expresión y purificación de las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2, siendo los pesos moleculares de estas proteínas de 35 kda y 31 kda, respectivamente. Nótese que los pesos moleculares corresponden a las proteínas de fusión conformada por el tag de 6 histidinas, la proteína SUMO, que incrementa el peso en 13 kda, obteniéndose las respectivas proteínas recombinantes, LlPLD1 de 48 kda (Figura 2A) y LlPLD2 de 44 kda (Figura 2B). Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado como inmunógenos para la producción de anticuerpos policlonales en mamíferos, evaluado por enzimoinmunoensayo (Figura 3), los cuales, a su vez han sido utilizados como base para un método diagnóstico, en el cual se utilizan dichos anticuerpos policlonales para la identificación de antígenos constituyentes del veneno de L. laeta pudiendo ser el procedimiento técnico de reconocimiento de los antígenos cualquiera de los siguientes: un test de ELISA, un test de Western blot (Figura 4), un dot blot ó un test de inmunocromatografía. Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado como antígenos para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones, cuya respuesta inmunológica fue evidenciada por

72 enzimoinmunoensayo (Figura 5 y Figura 6), los cuales, a su vez han sido utilizados como base para un método diagnóstico en el cual se utilizan dichos anticuerpos para la identificación de antígenos constituyentes del veneno de L. laeta. Pudiendo ser el procedimiento técnico de reconocimiento de los antígenos cualquiera de los siguientes: un test de ELISA, un test de Western blot (Figura 7), un dot blot ó un test de inmunocromatografía. Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado como antígenos para la producción de anticuerpos policlonales en mamíferos, los cuales, a su vez han sido utilizados como base para un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, inyectados en cantidad suficiente para generar inhibición del cuadro cutáneo (Figura 8) o cutáneo visceral (Figura 9). Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado como antígenos para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones, los cuales, a su vez han sido utilizados como base para un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, inyectados en cantidad suficiente para generar inhibición del cuadro cutáneo o cutáneo visceral (Figura 10) y comparándose su efectividad en relación a un suero policlonal anti veneno de L. laeta producido en nuestro laboratorio. La proteína LlPLD1 ha sido utilizada como inmunógeno protector contra el veneno de L. laeta, luego de haber sido sometida a inactivación por un tratamiento que permite conservar su forma pero no su acción, al inocularse en mamíferos incluido el ser humano. La proteína LlPLD2 ha sido utilizada como inmunógeno protector contra el veneno de L. laeta, al inocularse en mamíferos, incluido el ser humano. Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado como antígenos para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones, los cuales, han sido luego humanizados y utilizados como base para un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, inyectados en cantidad suficiente para generar inhibición del cuadro cutáneo o cutáneo visceral. Las proteínas LlPLD1 y LlPLD2 se han utilizado para su aplicación en investigación tal como:

73 a) Identificación de moléculas de membrana unidas a ceramidas en organismos unicelulares. b) Identificación y localización de componentes celulares ligados a las proteínas recombinantes ó a anticuerpos derivados de estas proteínas. c) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles. Las proteínas LlPLD1 y Llpld2 se han utilizado para su aplicación oncológica tal como: a) Uso de secuencias de las proteínas recombinantes para construcción de vectores transfectados en líneas celulares con fines antitumorales. b) El uso de las proteínas recombinantes como preparación farmacéutica tóxica contra canceres de tipo dérmico, subdérmico y epiteliales. c) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles. Otros usos de las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2 o sus secuencias codificantes que se han identificado en la industria son: a) Enzima b) En preparaciones de limpieza de alta demanda c) En preparaciones como insecticida d) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles. Los ejemplos aquí descritos son solo una parte de las posibilidades de aplicación de la presente invención y no constituyen en modo alguno una descripción exhaustiva de las mismas, siendo posible para cualquier persona versada en el arte encontrar múltiples otras

74 aplicaciones del invento en el ámbito de aplicación enunciado, considerándose todas ellas tácitamente descritas como parte de la presente invención. Pliego de Reivindicaciones 1. Un ADN complementario representativo del ARNm del veneno de glándulas de L. laeta, CARACTERIZADO por que codifican para la expresión de los componentes proteicos tóxicos del veneno. 2. Un fragmento del ADNc de la reivindicación 1, que codifican para una proteína recombinante del veneno de L. laeta CARACTERIZADO por presentar la secuencia del GenBank (Accesión N GU121905). 3. Un fragmento del ADNc de la reivindicación 1, que codifican para una proteína recombinante del veneno de L. laeta CARACTERIZADO por presentar la secuencia del GenBank (Accesión N GU121906). 4. Una proteína recombinante codificada por el ADNc de la reivindicación 2, CARACTERIZADA por la secuencia de aminoácidos denominado LlPLD1(Accesión N GU121905). 5. Una proteína recombinante codificada por el ADNc de la reivindicación 3, CARACTERIZADA por la secuencia de aminoácidos denominado LlPLD2(Accesión N GU121906). 6. Una proteína recombinante de la reivindicación 4, CARACTERIZADA por presentar actividad dermonecrótica in vivo y actividad de fosfolipasa D (esfingomielinasa D) y hemolítica in vitro. 7. Una proteína recombinante de la reivindicación 5, CARACTERIZADA por presentar actividad de fosfolipasa D (esfingomielinasa D) y carecer de actividad dermonecrótica in vivo y hemolítica in vitro. 8. El vector de expresión CARACTERIZADO por contener cualquiera de los fragmentos de ADNc de las reivindicaciones 2 y 3.

75 9. Una cepa bacteriana recombinante de Escherichia coli BL21 (DE3) CARACTERIZADA por haber sido transformada con el vector de la reivindicación Un método de producción de las proteínas recombinantes de la reivindicaciones 4 y 5, CARACTERIZADO por la inducción de la expresión del cultivo de la cepa bacteriana recombinantes de la reivindicación 9 con una concentración de 0.05 mm de IPTG incubado a una temperatura entre 20 y 30 C preferentemente entre C por un tiempo de entre 3 y 10 horas, preferentemente 8 horas. 11. Las proteínas recombinantes de las reivindicaciones 4 y 5, CARACTERIZADAS porque se utilizan como antígenos para la producción de anticuerpos policlonales en mamíferos. 12. Las proteínas recombinantes de las reivindicaciones 4 y 5, CARACTERIZADAS porque se utilizan como antígenos para la producción de anticuerpos monoclonales en ratones. 13. Un método diagnóstico basado en los anticuerpos policlonales de la reivindicación 11, CARACTERIZADOS porque se utilizan dichos anticuerpos para la identificación de antígenos constituyentes del veneno de L. laeta. 14. El método diagnóstico de la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque el procedimiento técnico de reconocimiento de los antígenos sea un test de ELISA, ó un test de Western blot, ó un dot blot ó un test de inmunocromatografía. 15. Un método diagnóstico basado en los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 12, CARACTERIZADOS porque se utilizan dichos anticuerpos para la identificación de antígenos constituyentes del veneno de L. laeta. 16. El método diagnóstico de la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque el procedimiento técnico de reconocimiento de los antígenos sea un test de ELISA, ó un test de Western blot, ó un dot blot ó un test de inmunocromatografía. 17. Un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, CARACTERIZADO por que se utilizan los anticuerpos policlonales de la reivindicación 11 en cantidad suficiente para generar inhibición. 18. Un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, CARACTERIZADO por que se utilizan los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 12 en cantidad suficiente para generar inhibición.

76 19. Un inmunógeno protector contra el veneno de L. laeta basado en la proteína recombinante de la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque dicha proteína es sometida a inactivación por un tratamiento que permita inhibir su actividad dermonecrótica y utilizarla para inocular mamíferos, incluyendo seres humanos. 20. Un inmunógeno protector contra el veneno de L. laeta basado en la proteína recombinante de la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque dicha proteína se utiliza para inocular mamíferos, incluyendo seres humanos. 21. Un método para inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, CARACTERIZADO por que se utilizan los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 12 previamente humanizados. 22. El uso de las proteínas recombinantes de las reivindicaciones 2, 3, 4 y 5, CARACTERIZADO por su aplicación en investigación tales como: a) Identificación de moléculas de membrana unidas a ceramidas en organismos unicelulares. b) Identificación y localización de componentes celulares ligados a las proteínas recombinantes ó a anticuerpos derivados de estas proteínas. c) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles. 23. El uso de las proteínas recombinantes de las reivindicaciones 2, 3, 4 y 5, CARACTERIZADO por su aplicación oncológica tales como: a) Uso de secuencias de las proteínas recombinantes para construcción de vectores transfectados en líneas celulares con fines antitumorales. b) El uso de las proteínas recombinantes como preparación farmacéutica tóxica contra canceres de tipo dérmico, subdérmico y epiteliales. c) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles. 24. Otros usos de las proteínas recombinantes o sus secuencias codificantes de las reivindicaciones 2, 3, 4 y 5, CARACTERIZADO por ser aplicaciones útiles en la industria tales como: a) Enzima b) En preparaciones de limpieza de alta demanda c) En preparaciones como insecticida d) En cualquier otra aplicación no restringido a los ya enunciados para los cuales las proteínas recombinantes sean útiles.

77 SOLICITUD DE PATENTE Fecha: 9 Diciembre 2009 Inventores: Araya Rojas, Jorge; Sagua Franco, Hernán; González Cortes, Jorge; Catalán Rodríguez, Alejandro; Cortes Araya, William; Osorio Rodríguez, Luis; Aguayo Lozano, Juan; Skorin Milovic, Cetna; Vásquez Veloso, Abel. Solicitante: UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados específicos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación para un kit de diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones. Resumen del Invento: Han sido desarrolladas anticuerpos monoclonales a partir del veneno de Loxosceles laeta (Chilena), y además anticuerpos monoclonales a partir de las proteínas recombinantes (LlPLD1, GenBank acceso GU y LlPLD2, GenBank acceso GU121906) obtenidas a partir de ADNc de las glándulas de veneno de la araña. Esta invención tiene su aplicación en el campo de la medicina, tanto para el diagnóstico temprano y preciso del loxoscelismo, como para la elaboración de un antídoto eficaz y seguro contra la mordedura de arañas del genero Loxosceles, preferentemente Loxosceles laeta (Chilena). Se describe la forma de obtenerlas, producirlas y los usos principales.

78 Anticuerpos monoclonales y monoclonales humanizados específicos para el veneno de Loxosceles laeta, su aplicación para un kit de diagnóstico temprano de la mordedura, uso como antiveneno y otras aplicaciones. MEMORIA DESCRIPTIVA Descripción de lo Conocido en la Materia La invención aquí descrita tiene su principal campo de aplicación en el tratamiento de cuadros de envenenamiento asociados a la mordedura de las arañas de la familia Loxoscelidae, género Loxosceles, particularmente la especie Loxosceles laeta, con una especial aptitud y ventajas para una aplicación como herramienta biotecnológica para el desarrollo de métodos diagnósticos y antídoto inmunoprotector con potencial aplicación terapéutica en vertebrados incluido el ser humano. Además, la presente invención tiene aplicación tanto industrial como médica y farmacéutica. La Organización Mundial de la Salud (OMS), considera cuatro géneros de arañas de verdadero interés médico por las manifestaciones clínicas y la letalidad de sus venenos. Tres de ellos pertenecen al infraorden Araneomorphae, siendo: Latrodectus, familia Theridiidae; Loxosceles, familia Loxoscelidae; Phoneutria, familia Ctenidae. El cuarto género pertenece al infraorden Mygalomorphae, Atrax, familia Hexathelidae (Quintana y Otero, 2002). Por su condición de depredadores, la mordedura de un arácnido en el ser humano sucede como consecuencia de un accidente, en el caso del género Loxosceles, la araña habitualmente durante la noche abandona su tela en busca de alimentos, y al ser sorprendida por la luz del día o bien luz artificial, busca rápidamente refugio en el primer lugar oscuro que encuentra, escondiéndose en prendas de vestir colgadas en la pared, o bien entra en la cama. Ahora bien, el accidente ocurre casi siempre cuando las arañas son aplastadas inadvertidamente contra la superficie cutánea de las personas, ella se siente atacada, se defiende y muerde, entonces los quelíceros son clavados en la piel, donde permanecen algunos segundos, simultáneamente la musculatura de las glándulas se contraerá haciendo que estas expulsen el veneno. La toxicidad de esta solución ponzoñosa, estará

79 en relación directa con el volumen inoculado en ese momento y con la susceptibilidad del individuo mordido. Si la araña se ha alimentado recientemente, tendrá poco veneno en sus glándulas, pero si ha permanecido en un estado de ayuno prolongado, la cantidad de este será mayor (Schenone y cols., 1988; Schenone, 2003). Importancia de las arañas del género Loxosceles spp. El veneno de arañas del género Loxosceles es una de las ponzoñas más tóxicas del planeta, y que en el ser humano puede resultar en una serie numerosa de síntomas y signos referidos como Loxoscelismo. En las personas que sufren el accidente, la toxina puede causar severas lesiones necróticas en la piel, en localizaciones restrictas al sitio de la mordedura, originando un cuadro clínico conocido como, loxoscelismo cutáneo (Pizzi y cols., 1957; Schenone, 1988; Futrell, 1992; Meier y White 1995; Ospedal y cols., 2002; Schenone, 2003) y dependiendo de la susceptibilidad del individuo y de la cantidad de veneno inoculada se origina el loxoscelismo cutáneo-visceral, provocando serios efectos sistémicos, tales como coagulación intravascular diseminada, hemolisis intravascular, deficiencia renal aguda, pudiendo incluso producir desenlaces fatales ( White y cols., 1995; Boyer y cols., 2001; Zanetti y cols., 2002; Luciano y cols., 2004). Las arañas del género Loxosceles (Heinecken & Lowe, 1835), conocidas bajo el nombre común de reclusa parda, araña violinista ó araña de los rincones, están ampliamente distribuidas en la orbe, incluyendo cerca de 100 especies de las cuales la mayoría han sido descritas en el nuevo mundo (Platnick, 2002). Se les encuentra distribuidas en América, en la región mediterránea de Europa, en África y Asia (Gertsch 1967; Gertsh y Ennik, 1983). Pertenecen al orden Araneida, al suborden Labidogntha (caracterizándose porque sus quelíceros, son de ubicación horizontal y al morder se entrecruzan como una pinza al cerrar) y a la familia Sicariidae (Keyserling, 1880). Las especies Loxosceles laeta (Nicolet, 1849) y Loxosceles coquimbo (Gertsch, 1967) han sido descritas como las únicas de su género en Chile (Suarez y cols., 1971; Schenone y Suarez 1978; Platnick, 2004) y particularmente Loxosceles laeta es considerada sin duda la más tóxicas y peligrosas (Nelson, 1988; Allen, 1988; Futrell, 1992; Pedrosa y cols., 2002). Loxosceles reclusa se encuentra en Norteamérica (Harrison y cols., 1998) y la Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) en países

80 Mediterráneos y en el Medio Oriente (Borkan y cols., 1995). Esto no excluye que se hayan descrito mordeduras por otras especies como Loxosceles gaucho (Gertsh, 1969) en Argentina y Loxosceles intermedia en Brasil (Tambourgi y cols., 1998). En São Paulo-Brasil se informan cada año cerca de 300 casos (Lucas y Meier, 1997), siendo L. gaucho, L. laeta y L. intermedia las más abundantes y de mayor importancia médica (Cardoso y cols., 1988; Araujo y cols., 2003). En Estados Unidos, en 1997 se informaron casos de mordeduras por Loxosceles spp., siendo Loxosceles reclusa (Gertsch y Mulaik, 1940) la especie más abundante (Rees y cols., 1987; Walter y cols., 1999). Más recientemente Aguilera y Casanueva (2005) añaden la posibilidad de encontrar en Chile a L. rufescens por ser esta una araña cosmopólita. Aspectos Fisiopatológicos del Veneno El veneno es un líquido cristalino viscoso, que es termolábil y constituido esencialmente por proteínas. Tiene propiedad necrotizante, hemolítica, vasculítica y coagulante. Razón por lo cual, en la piel provoca graves alteraciones vasculares, con áreas de vasoconstricción y otras de hemorragia, que llevan rápidamente a la isquemia local y a la constitución de una placa gangrenosa. Si el veneno alcanza la circulación sistémica, ya sea por inoculación directa en un capilar o por alteración en la permeabilidad, ejerce el gran poder hemolítico, que es el aspecto central en el loxoscelismo cutáneovisceral. Los componentes proteínicos del veneno han sido identificados, entre los que destacan la hialorunidasa (factor de difusión), desoxirribonucleasa, ribonucleasa, lipasa, fosfatasa alcalina y esfingomielinasa-d. La esfingomielinasa-d, proteína de 32 a 35 kda, que ha sido aislada y purificada de L. reclusa y L. intermedia, entre otras especies del género Loxosceles, es el componente mayoritario del veneno. Causa oclusión de la micro circulación (vasculítis), con inflamación de la pared capilar e infiltración leucocitaria secundaria a activación del complemento y, hemólisis dependiente de complemento local o sistémica que termina causando anemia e insuficiencia renal (Futrell, 1992; Kurpiewski y cols., 1981; Tambourgi y cols., 1998; Luciano y cols., 2004).

81 Luciano y cols. (2004), han demostrado experimentalmente en ratones, que el envenenamiento por Loxosceles induce un complejo patrón de nefrotoxicidad. Estudios histopatológicos muestran alteraciones a nivel de la estructura glomelular y tubular, el daño glomelular es evidente por la presencia de hematíes extravasculares alrededor de los capilares glomerulares y en el espacio de Bowman; en el también se observa un exudado rico en proteína. Se ha observado diferencias ontogénicas en la acción del veneno de L. intermedia, siendo más letales y dermonecróticos los venenos de las arañas adultas que de las ninfas recién nacidas, al igual que diferencias según el sexo, siendo mas potente el de las hembras que el de los machos (Gonçalves y cols., 1999; de Oliveira y cols., 1999). Por otro lado, las investigaciones realizadas dejan en evidencia la participación de componentes moleculares y celulares sanguíneos en el nocivo efecto del veneno. Así, una glicoproteína altamente conservada conocida como componente amiloide P del suero, pareciera ser un blanco de esfingomielinasa D para la activación de plaquetas y del efecto isquémico, jugando un probable papel en la necrosis causada por el veneno (Gates y Rees, 1990). En consecuencia, el veneno de Loxosceles sp produce agregación plaquetaria por la unión de la glicoproteína amiloide P a la membrana de la plaqueta en presencia de iones Ca ++, llevando finalmente a una coagulación intravascular diseminada (CID). Todo esto contribuye al daño local por obstrucción vascular, además de la secreción de serotonina por las plaquetas activadas y la inducción de quimiotaxis para los PMN hacia el sitio de la mordedura (Otero, 1998; Quintana y Otero, 2002). La gravedad del loxoscelismo es mayor, y la probabilidad de intervenir sobre la actividad del veneno es menor, mientras más tiempo transcurra entre la mordedura y el inicio del tratamiento, dado que existen indicios claros de que los peores daños en el organismo afectado por la mordedura, son causados como consecuencia de la acción de los mecanismos propios del metabolismo en respuesta al daño celular inicial que la acción inicial del veneno desencadena, lo que implica que el daño profundo no es causado directamente por el veneno, sino más bien es desencadenado por este.

82 El mecanismo por los cuales el veneno actúa sobre los componentes de la matriz extracelular pareciera ser muy similar para el grupo de arañas del género Loxosceles incluyendo; Loxosceles reclusa, encontrada en Norteamérica, Loxosceles gaucho y Loxosceles intermedia procedentes de Brasil y Loxosceles laeta nativa de Chile (Mota y Barbaro, 1995; Kalapothakis y cols., 2002). La esfingomielinasa D, que ha sido descrita como la de mayor actividad biológica (Kurpiewski y cols., 1981; Zela y cols., 2004), sería responsable por los daños necróticos en la piel, ya que es el factor de necrosis dérmica más importante, ya que altera las membranas celulares, activa mecanismos de inflamación, induciendo la quimiotaxis de neutrófilos, activando la vía de complemento, causando trombosis vascular local y reacciones inmunológicas parecidas a la reacción de Arthus. Esto contribuye a que en la piel haya isquemia local y se constituya una placa gangrenosa con gran edema. Los mecanismos moleculares por los cuales actuarían cada uno de los constituyentes del veneno, en el nocivo efecto sobre los tejidos y sus componentes celulares, aún no han sido completamente determinados. Diagnóstico El diagnóstico del loxoscelismo hoy en día, es eminentemente clínico y basado en la observación, siendo sustentado por las características de las lesiones y su orden de aparición. Es decir, cuadros cutáneos son reconocidos por la existencia de signos locales con nula o escasa repercusión general y un cuadro visceral es evidente ante la aparición precoz de un violento síndrome hemolítico, el cual puede ser evidenciado por pruebas de laboratorio. Obviamente que el hallazgo y captura del arácnido por parte del paciente o de algún familiar, para su posterior identificación taxonómica en laboratorio (6 ojos de disposición en pares formando un triangulo y la existencia de una mancha más oscura en forma de violín en el cefalotórax), facilita y orienta el diagnóstico y el tratamiento (Schenone, 2003). Por otro lado, es absolutamente necesario realizar un diagnóstico diferencial con otros cuadros clínicos inflamatorios o necróticos de la piel (herpes, enfermedad de Lyme, erisipela necrótica, carbunclo, necrosis química), o síndromes hemolíticos de otras causas que no sean la venenotoxemia (Schenone y cols., 1989).

83 No existen en la actualidad, en ningún laboratorio clínico del mundo, técnicas diagnosticas de rutina que permitan realizar un diagnostico rápido, precoz, sensible y especifico de la toxemia inducida por la mordedura de arañas del género Loxosceles. Sin embargo, algunos estudios han tratado de establecer algunas técnicas auxiliares de diagnostico tales como; ELISA para detectar antígenos del veneno (Smith, 1993), Hemaglutinación pasiva (Barret y cols., 1993) y la transformación blástica de los linfocitos. Los resultados obtenidos hasta ahora en ocasiones suelen ser contradictorios y no tienen ninguna aplicación práctica fuera del campo de investigación y experimental. ELISA para la detección de antígenos, ha sido montado experimentalmente en diversos laboratorios, sueros hiperinmunes preparados en caballos son empleados para la obtención de IgGs especificas anti-antígenos del veneno de alguna especie de Loxosceles, mediante cromatografía de inmunoafinidad, finalmente los anticuerpos inmunopurificados son empleados para montar el ELISA tipo sandwich (Smith, 1993; Chavez-Olortegui y cols., 1998; Gomez y cols., 1999; Miller y cols., 2000; Gomez y cols.,2001; Krywko y Gomez, 2002), los ensayos detectan 0,1 0,8 ngr de antígenos del veneno. Las muestras analizadas han sido: exudado o aspirados del sitio de la mordedura, pelos, piel y suero. Recientemente, usando conejos como modelos experimentales, Krywko y Gomes (2002) mostraron que el veneno puede ser detectado en pelos, en aspirados y en biopsias de piel a lo menos después de siete días post-inoculación, pero no detectables en suero. Al respecto, Alvarenga y cols. (2003), desarrollaron un ELISA para la detección de una de las proteínas responsables de la actividad tóxica encontrada en los fluidos de animales envenenados. Ellos emplean un anticuerpo monoclonal (Li mab) para la captura del antígeno y para revelar una IgG F(ab )2 de caballo anti L. intermedia para acoplar la peroxidasa, mediante este ensayo se evidencio que el factor dermonecrótico era detectado rápidamente en el suero de animal de experimentación, alcanzando un máximo de reactividad a los 15 minutos, y luego a partir de los 30 minutos empieza a decaer progresivamente hasta las cuatro horas. El Li mab empleado no presenta reacción cruzada con el factor dermonecrótico de otras especies, entre ellas L. laeta, por lo tanto

84 seria solo especifico para L. intermedia, este ensayo es bastante sensible (0,2 ng/ensayo) y podría ser usado para detectar factor dermonecrótico directamente en suero humano. Sin embargo, es imprescindible destacar que la alta especificidad de este anticuerpo monoclonal (Li mab) empleado en la detección de veneno de L. intermedia, no permitiría la detección de veneno de otras especies, en particular de L. laeta, especie predominante en Sudamérica, y prácticamente la única especie del genero Loxosceles de importancia clínica en Chile. Stoecker y cols. (2006) informaron una confirmación de mordedura por L. reclusa mediante el uso de un test ELISA tomando una muestra de tejido no invasiva del área afectada por una mordedura con sintomatología no dermonecrótica. El test utilizado fue el reportado por Gomez y cols en 2002, y se logro detectar una cantidad de veneno estimada en 34 picogramos obtenida por frotis de la lesión cutánea. En este caso se logró confirmar efectivamente que la mordedura fue por L. reclusa porque se capturó e identificó el causante. En este caso es importante destacar que los mismos autores reconocen la limitada y escasa evidencia clínica a favor de la aplicación de su método diagnóstico sumado al hecho de que se trata de un método que requiere de infraestructura de laboratorio, insumos y personal calificado. La patente BRPI (A) y sus equivalentes WO (A2), WO (A3),MXPA (A), AU (A1), AR (A1) propone el uso de las esfingomielinasas D recombinantes de 3 especies de Loxosceles (L. boneti, L. reclusa y L. laeta) como parte de un antígeno matriz útil en inmuno purificación de anticuerpos y sus fragmentos o como parte de un dispositivo de diagnóstico para apoyar la confirmación clínica de que el agente causante del estado de intoxicación en un paciente es un araña Loxosceles. Sin embargo, la patente no provee ejemplos de su utilización para estos fines. Tratamiento Para el tratamiento del loxoscelismo en pacientes humanos existen varias propuestas, que van desde el uso de: analgésicos, suero anti-loxosceles polivalente, oxígeno hiperbárico, excisión quirúrgica, corticoides sistémicos o intra lesionales y las sulfonas (Dapsone ), además de la terapia

85 de sostenimiento (King y Rees, 1983; Rees y cols., 1987; Srain y cols., 1991; Furtrel, 1992; Gomez y cols., 1999). Antiveneno para el género Loxosceles y el rol de los anticuerpos en su desarrollo. El término antitoxina, antisuero o antiveneno anti-loxosceles, engloba un compuesto biológico que conceptualmente consiste en una mezcla de anticuerpos capaces de unirse específicamente a las moléculas biológicamente activas del veneno e inactivarlas, evitando así que produzcan daño en los tejidos del organismo afectado por la mordedura. Hoy en día, estos sueros se obtienen en animales, especialmente en caballos, los cuales son inmunizados con pequeñas dosis del veneno. Estos sueros, a menudo, son procesados para concentrar los anticuerpos antiveneno y a su vez disminuir la presencia de otras proteínas que puedan causar reacciones alérgicas en el receptor. Efectos adversos del suero antiloxosceles han sido reportados en Santa Catarina, Brasil, en donde un 6,4% (8/125) de reacciones fueron observadas, erupciones cutáneas, rubor facial, náuseas y vómitos, urticaria, escalofríos y broncoespasmo, todas ellas catalogadas como leves (Severino y cols., 1998). En el Instituto Butantan, según Málaque y cols. (2002), fueron registradas un 20% de reacciones anafilácticas tempranas, la mayoría leves y sin riesgo vital. No obstante estos hallazgos, siempre hay que considerar que el shock anafiláctico es un cuadro clínico grave y que puede llevar a la muerte a un individuo susceptible, sobre todo si se piensa que estos sueros son empleados en un paciente que ya está siendo afectado fuertemente por la intoxicación del veneno de la araña. Existen antisueros monovalentes y polivalentes, los primeros serian aquellos que son preparados a partir del veneno de una única especie de arácnido y en los segundo combinan venenos de diferentes variedades de arañas así como también otras especies ponzoñosas (escorpiones, alacranes, etc.), para cuando no existe un diagnóstico preciso del agente causal (Heard y cols., 1999; Braz y cols., 1999; Araujo y cols., 2004). Los antisueros monovalentes producidos a partir de la inmunización con veneno de distintas especies de Loxosceles muestran compartir sus capacidades de neutralizar la actividad dermonecrótica. Así, sueros anti-l. intermedia y anti-l.

86 gaucho son capaces de bloquear la acción toxica del veneno de L. laeta (Barbaro y cols., 1994; Mota y cols., 1995). En el campo de la investigación, Gómez y cols. (1999), emplearon un antiveneno experimental con fragmentos Fab, el cual atenúa el efecto dermonecrótico el veneno de Loxosceles en conejos. Esta antitoxina presenta mayor seguridad en su uso con respecto a antisueros de inmunoglobulinas completas porque disminuye las posibilidades de reacciones adversas. La eficiencia de un antisuero monovalente producido en caballos contra el veneno de L. intermedia fue demostrada por Braz y cols, (1999), este posee una potente acción neutralizante del veneno y se constituye en una alternativa de tratamiento para el envenenamiento por L. intermedia en Brasil. Recientemente, estudios experimentales realizados en conejo han demostrado la eficacia de la inyección de antiveneno in situ para disminuir tanto la lesión dermonecrótica como la migración de PMN, siempre y cuando el tiempo de aplicación del antídoto no sea retardado (Gómez y cols., 1999; Guilherme- Fernandez, 2001) Así, los estudios experimentales en animales sugieren que el antisuero disminuiría el riesgo de necrosis cutánea y que la efectividad de este sería mayor mientras más precoz es la administración. Ello es consistente con los resultados de estudios in vitro, en cuanto a la neutralización de la actividad dermonecrótica. No obstante, no es posible inferir a partir de dichos estudios, cuál sería el tiempo máximo dentro del cual se podría esperar el efecto en el ser humano. En conejos, el efecto parece no extenderse más allá de las 4 horas que siguen al accidente. Por otro lado, existen evidencias que sugieren que el antisuero no previene la acción hemolítica del veneno (Bravo y cols., 1994) pero, contradictoriamente a ello Barbaro y cols. (1996), no observaron actividad hemolítica directa en el veneno. En relación a los efectos adversos del antisuero, si bien existe el riesgo grave y potencialmente mortal por la administración del suero originándose un shock anafiláctico, la experiencia acumulada sugiere que dichos eventos son poco probables (Araujo y cols.,2004).

87 Pauli y cols. (2009), estudiaron el uso de un antiveneno mejorado, a partir del clásico, por ser los segmentos F(ab ) 2 de IgG de equinos hiper inmunizados con veneno de diferentes arañas del género Loxosceles (producido por el CPPI de Curitiba) en conejos, intentando establecer el mayor intervalo de tiempo entre la mordedura y la aplicación del antiveneno para que este último lograse reducir la lesión y la mortalidad. Concluyeron que los efectos del envenenamiento pueden minimizarse en los conejos si la aplicación del antiveneno es hasta 12 horas posteriores a la mordedura, y la lesión necrótica puede reducirse si la inyección del antiveneno ocurre hasta 48 horas posteriores a la mordedura. Sin embargo, estos investigadores no se pronunciaron respecto a los potenciales inconvenientes del antiveneno producido a partir de IgG equinas aplicado a seres humanos. Manzoni de Almeida y cols (2008), desarrollaron un suero equino basado en la inmunización con una variedad de proteínas recombinantes (SMasa D) de L. intermedia y L. laeta, cuyos ensayos preclínicos en conejos comparados con el antisuero anti-aracnidico (Instituto Butantan), fueron superiores en protección, tanto en el desafío con veneno de L. intermedia y L. laeta, pero no en el caso de L. gaucho. Estos autores concluyeron la factibilidad del empleo de proteínas recombinantes de SMasa D para la elaboración de un antisuero, sin embargo, esta estrategia no resuelve el riesgo de shock anafiláctico a causa de proteínas equinas, en futuras pruebas en humanos. Recientemente, Felicori y cols (2009), desarrollaron una nueva estrategia de antiveneno producido en conejos, basado en el empleo de péptidos sintéticos de regiones altamente inmunogenicas de la proteína recombinante Loxtox LiD1. Los resultados indican que esta estrategia, cuya intensión es minimizar el riesgo para los pacientes al usar segmentos con alta capacidad inmunogenica pero sin actividad toxica, fueron insuficientes y requieren de mayor estudio para que puedan llegar a ser empleados en pruebas clínicas. Por otro lado, no existe evidencia directa derivada de estudios sistemáticos y controlados, sobre la efectividad del suero anti-loxosceles en seres humanos. En los casos clínicos publicados no se han registrados efectos evidentes que permitan suponer ni inferir de modo definitivo que el suero tiene algún efecto protector. En estas mismas series se han observado muertes y desarrollo de úlceras necróticas pese a la administración del suero. No existen tampoco datos que permitan distinguir los efectos de sueros polivalentes de los que podrían producir los antivenenos específicos. La afirmación de que el suero puede tener efectos beneficiosos pese a ser administrado tardíamente

88 (hasta el tercer día siguiente a la mordedura) no tiene sustento científico, más aún, cuando los casos de LCV que han sobrevivido al tercer día parecen ser aquellos con mejor pronóstico independientemente del tratamiento (MINSAL, 2004). De este modo es posible afirmar que no existe actualmente un antisuero eficaz contra la mordedura de Loxosceles laeta. Como se observa, en los antecedentes anteriormente descritos, a la fecha no se han empleado anticuerpos monoclonales o derivados de estos, como serían los anticuerpos monoclonales humanizados, para ser empleados en la terapia a través de un antídoto contra el veneno de arañas Loxosceles. Particularmente, esta moderna estrategia presenta ventajas que permitirían su utilización clínica con escaso o nulo riesgo de inducción de shock anafiláctico para el paciente, a causa de la presencia de proteínas extrañas en los antivenenos disponibles en la actualidad tanto experimental como comercialmente. Proteínas recombinantes en el desarrollo de antiveneno contra Loxosceles. Una de las grandes problemáticas para la realización de estudios que permitan dilucidar definitivamente los mecanismos moleculares involucrados en el Loxoscelismo, es la dificultad de obtener en gran escala, e independientemente de la disponibilidad de arácnidos vivos, cada una de las moléculas componentes del veneno, principalmente aquellas involucradas en su toxicidad. Aunque, las toxinas sean preparadas a homogeneidad no puede ser excluida la posibilidad de que pequeños contaminantes existentes originen efectos biológicos no esperados llevando a interpretaciones equivocadas por parte del investigador (Pedrosa y cols., 2002). Con el advenimiento de la Biología Molecular y específicamente de la Tecnología del ADN Recombinante, hoy en día es posible clonar genes, expresar las proteínas, producirlas en el laboratorio en masa y caracterizarlas del punto de vista biológico y funcional. Recientemente, Kalapothakis y cols. (2002), describen la identificación y caracterización molecular de LiD1, una proteína que pertenece a la familia de los componentes con actividad dermonecrótica de L. intermedia, esta proteína fue clonada empleando una genoteca de ADN complementario (ADNc) y utilizando anticuerpos contra proteínas con actividad dermonecrótica aisladas de veneno de arañas

89 del género Loxosceles. La proteína LiD1 fue expresada en fusión con β-galactosidasa en el vector pcmv resultando una proteína recombinante (rlid1) funcional y con propiedades inmunológicas importantes. Fue reconocida por anticuerpos anti-proteína dermonecrótica, así como también fue capaz de generar anticuerpos reactivos contra la proteína dermonecrótica nativa del veneno de L. intermedia. Empleando secuencias marcadoras de expresión ( Expressed Sequencing Tag ), Fernández- Pedrosa y cols. (2002) aislaron de una genoteca de ADNc de L. laeta varios clones que codificaban para proteínas con significativa símilaridad con la región N-terminal de esfingomielinasa de L. intermedia. Uno de los clones denominado H17 fue expresado como una proteína de fusión conteniendo en su región N-terminal 6 histidinas (His-Tag), con un peso molecular de 33 kda. La proteína recombinante presentó todas las características descritas en la proteína esfingomielinasa de L. laeta y de L. intermedia, incluyendo la actividad dermonecrótica y la actividad hemolítica dependiente de complemento. Anticuerpos dirigidos contra la proteína recombinante reconocen en un Western-blot de un extracto crudo del veneno de L. laeta, la proteína nativa de 32 kda (esfingomielinasa). Estos mismos anticuerpos son capaces de bloquear la reacción dermonecrótica producida por el veneno de L. laeta. Este estudio demuestra, en forma conclusiva, que la actividad de esfingomielinasa sería responsable por el mayor efecto patológico observado en el veneno de arañas del género Loxosceles. Recientemente, este mismo grupo de investigadores consiguieron la cristalización y los primeros análisis cristalográficos de esfingomielinasa (SMasa I) del veneno de L. laeta (Zela y cols., 2004). Araujo y cols. (2003), emplearon una proteína recombinante fusionada con β-galactosidasa (Li-rec) como antígeno para inmunizar conejos y ratones. Los anticuerpos obtenidos en ambas especies animales, reconocen la proteína nativa en un extracto crudo de veneno de L. intermedia. Ensayos de neutralización del efecto letal in vitro, indicaron que 1 ml de suero de conejo conteniendo anti-li-rec fue capaz de neutralizar 25 LD50 del veneno. Por otro lado, ensayos de protección in vivo en conejos, demostraron que la proteína de fusión empleada como inmunógeno inducía una respuesta protectora duradera en el tiempo, contra la actividad dermonecrótica del veneno de Loxosceles. Ratones inmunizados fueron totalmente protegidos contra 2,5 DL50 del veneno. Estos resultados proveen evidencias básicas para la utilización de estas proteínas recombinantes como inmunógenos

90 para la producción de antisueros para el uso clínico y/o tal vez como potenciales vacunas induciendo eficiente inmunidad protectora contra L. intermedia. Bertoni da Silveira y cols. (2006), clonaron dos isoformas de esfingomielinasas D de L. intermedia LiRecDT2 (1062 bp ADNc) y LiRecDT3 (1007 bp ADNc) expresándolas en vectores dentro de E. coli. Las toxinas de origen recombinante mostraron funcionalidad diferencial en conejos: LiRecDT2 causado una lesión macroscópica de propagación con la gravedad a la inyección intradérmica, mientras que LiRecDT3 causó inflamación transitoria y eritema en el sitio de inyección. El análisis de microscopía óptica de las biopsias de la piel reveló un edema, una colección de células inflamatorias en y alrededor de los vasos sanguíneos y una red proteica en la dermis. Por otra parte, la funcionalidad diferencial para las toxinas recombinantes también fue demostrada por una alta actividad esfingomielinasa D para LiRecDT2 y baja actividad para LiRecDT3 así como mayor en la agregación plaquetaria in vitro y la permeabilidad de los vasos sanguíneos inducida por LiRecDT2 y la actividad residual de LiRecDT3. La clonación y expresión de las dos toxinas recombinantes dermonecróticas demostraría la existencia de una familia intraespecífica de toxinas homólogas que actúan en sinergia para las actividades perjudiciales del veneno. La patente BRPI (A) (2007) establece el uso de 2 esfingomielinasas recombinantes denominadas P1 (GenBank - número de acceso AY304471) y P2 (GenBank número acceso AY304472) obtenidas a partir del veneno de L. intermedia, y una esfingomielinasa recombinante (GenBank número acceso AY093599) aislada a partir del veneno de L. laeta, así como otras esfingomielinasas expresadas en otras especies del género Loxosceles, como antígenos para la inmunización de caballos, la purificación de la IgG y/o fragmentos de los sueros inmunes producidos y la combinación de estas fracciones para la composición final de un suero anti loxoscelico. La ya mencionada patente BRPI (A) y sus equivalentes WO (A2), WO (A3),MXPA (A), AU (A1), AR (A1) proponen el uso de las esfingomielinasas D recombinantes de 3 especies de Loxosceles (L. boneti, L. reclusa y L. laeta) como inmunógeno para la producción, en vertebrados, de los anticuerpos neutralizantes contra el veneno y los correspondientes fragmentos F (ab) 2 de la misma.

91 Manzoni de Almeida y Cols. (2008) utilizaron una esfingomielinasa D recombinante para inmunizar caballos y obtener suero antiloxoscelico para comparar su actividad con un suero preexistente denominado anti-arácnido (obtenido por inmunización en caballos con el veneno completo de las arañas). Sus resultados en conejos indicaron una mayor actividad neutralizante de este suero antiloxoscelico para los venenos de L. intermedia y L. laeta, mientras que una menor actividad neutralizante para el veneno de L. gaucho, con respecto al suero anti-arácnido. Felicori y cols. (2009) sintetizaron algunos polipéptidos en base a la imitación de epitopes antigénicos identificados por el método SPOT en esfingomielinasas D recombinantes de Loxosceles intermedia, y evaluaron su actividad neutralizante de los anticuerpos obtenidos a partir de conejos desafiados con estos péptidos con respecto a los obtenidos por inmunización con la proteína recombinante completa de L. intermedia. Ninguna de las preparaciones peptídicas fue superior a la toxina recombinante completa como inductora de inmunización y solo una fue capaz de inducir la formación de anticuerpos con alguna acción neutralizante luego de su inyección en conejos desafiados con la toxina recombinante. Finalmente, es importante indicar que la invención, anticuerpos monoclonales y anticuerpos monoclonales humanizados, que estamos presentando es esta solicitud, contribuye significativamente a resolver la problemática de disponer de un verdadero método de diagnóstico precoz y de fácil uso e interpretación para el loxoscelismo. Además, junto con lo anterior, la invención permite la obtención de un antídoto eficaz y sin contraindicaciones para la gran mayoría de los pacientes expuestos a un potencial accidente por arañas del genero Loxosceles.

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105 Descripción de la Invención Han sido desarrolladas anticuerpos monoclonales a partir del veneno de Loxosceles laeta (Chilena), y además anticuerpos monoclonales a partir de las proteínas recombinantes (LlPLD1, GenBank acceso GU y LlPLD2, GenBank acceso GU121906) obtenidas a partir de ADNc de las glándulas de veneno de la araña. Esta invención tiene su aplicación en el campo de la medicina, tanto para el diagnóstico temprano y preciso del loxoscelismo, como para la elaboración de un antídoto eficaz y seguro contra la mordedura de arañas del genero Loxosceles, preferentemente Loxosceles laeta (Chilena). La invención aquí revelada, en su manifestación o forma de ejecución principal, se describe a continuación de modo secuencial: Se capturan arañas pertenecientes al género Loxosceles, siendo las que se capturen pertenecientes a las especies descritas en el área geográfica donde se han recolectado (en este caso, corresponderían probablemente a las especies L. laeta, L. coquimbo y L. rufescens), predominantemente de L. laeta. Las arañas recolectadas fueron identificadas por un estudio morfotaxonómico para asegurar que solo se trabajo con ejemplares de L. laeta. Se extraen un número significativo de glándulas de veneno de las arañas L. laeta recolectadas, para luego extraer los ARNm que codifican para las esfingomielinasas D. Se sintetizo el ADNc, y empleado para expresión en sistemas bacterianos y purificación de las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2 (GenBank acceso GU y GU121906), respectivamente. Se extrae el veneno puro de L. laeta, mediante electroestimulación, aplicando pulsos eléctricos de volts, en la base del aparato mordedor (quelíceros) para la expulsión y recolección del veneno, el cual posteriormente es almacenado como un pool de veneno a 70 C. Los anticuerpos monoclonales contra proteínas del veneno de L. laeta, son obtenidos utilizando ratones Balb/c hembras (3 semanas), los cuales son inoculados con µg de proteínas del veneno de L. laeta por inyección intraperitoneal, utilizando un adyuvante, cualquiera de los siguientes: Titter Max Gold (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo, USA), adyuvante completo e incompleto de Freund s, Hidróxido de aluminio o cualquier otro conocido. Cada ratón recibe tres

106 dosis con intervalos de 10 días. Al final de la tercera inmunización, los ratones son sangrados para obtener µl de sangre total y se realiza la evaluación de los títulos de anticuerpos mediante ELISA, Western Blots, Dot Blot o citometría de flujo. El ratón con mayor título recibe una dosis de refuerzo. Tres días después, el animal es sacrificado para obtener las células de bazo, las que son fusionadas con células inmortalizadas provenientes de mieloma murino, preferentemente utilizando células P3U1. La fusión se realiza utilizando polietilenglicol (PEG) al 42% precalentado a 37 C o cualquier otro método conocido. Las células fusionadas son resuspendidas en RPMI-Hipoxantina aminopterin timidina (HAT), sembrándose 10 5 células por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos. A partir del quinto día posterior a la fusión, las placas de 96 pocillos son observadas y los pocillos con crecimiento son sometidos a screening mediante inmunoanalisis, preferentemente ELISA y Western Blot, utilizando cada sobrenadante como fuente de primer anticuerpo y un conjugado antiinmunoglobulinas totales marcado con peroxidasa o fosfatasa alcalina como segundo anticuerpo. Los blots son revelados mediante quimioluminescencia (ECL) o métodos enzimáticos. Los clones productores de anticuerpos que posean reactividad contra el veneno de L. laeta, son seleccionados, expandidos y sometidos a dos o más rondas de reclonaje. De manera análoga al párrafo anterior, se obtienen los anticuerpos monoclonales que detectan a las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2. En este caso particular, ratones Balb/c hembras son inoculados intraperitonealmente con µg de cada una de las proteínas recombinantes. Para la determinación de isotipo de cada anticuerpo, se utilizó el sistema comercial, Mouse Antibody Isotyping Kit (Thermo Scientific), procediendo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para ello, se utilizó una reacción de ELISA, donde se consideró reactivo los valores iguales o superiores a 0.8. Los clones de hibridomas seleccionados son inoculados por inyección en la cavidad intraperitoneal en ratones Balb/c hembras, mediante un inoculo de células en el rango de a para la obtención de ascitis en un periodo de tiempo de 1-3 semanas. Posteriormente el contenido ascítico es recuperado de cada animal, re-evaluado para la detección del veneno de L. laeta y las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2. Finalmente, los anticuerpos monoclonales presentes en las ascitis, son purificados en columnas de sepharose-protein G ó A, cuantificados y almacenados en congelación.

107 Los anticuerpos monoclonales (Ll mab, LlPLD1 mab o LlPLD2 mab), con alta especificidad para detectar mínimas concentraciones del veneno de L. laeta y ambas proteínas recombinantes, son empleadas para la confección de un kit de diagnóstico, enzimoinmunoensayo (ELISA), Western Blot, Dot Blot, inmunocromatografia o citometría de flujo, de preferencia inmunocromatografia, por su sencillez y rapidez de aplicación. Anticuerpos monoclonales obtenidos contra el veneno de L. laeta, son ensayados en la detección del veneno de L. laeta separado por electroforesis en doble dimensión (2D SDS-PAGE). Para esto, el veneno de L. laeta fue precipitado con 1 ml de TCA al 20 % en acetona, por 1 hora a 20 C. Luego, es centrifugado a x g por 15 min a 4 C. El sobrenadante es descartando y el precipitado es lavado 4 veces con acetona fría. Después del último lavado, el sobrenadante se descarta y el pellet es secado a temperatura ambiente por 10 min. El pellet resultante es resuspendido en buffer 2D (8 M Urea, 1 M tiourea, 4 % CHAPS, 66 mm DTT y 0,8 % de anfolitos en un rango de ph 3-10, más un cocktail de inhibidores de proteasas) por 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el pellet se solubiliza, se determina la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (BioRad, Hercules, CA). Luego las tiras IPG strips son rehidratadas, ph 3-10 NL de 7 cm (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando el sistema Protein IEF Cell (BioRad, Hercules, CA). La rehidratación se realizó de manera activa a 50 V por 12 h, utilizando 100 µg de proteína (cuando los geles son teñidos con Comassie) y 50 µg de proteínas (cuando los geles son trasferidos para realizar inmunoblots). Luego de la rehidratación de las tiras, se da inicio la primera dimensión, ejecutando un programa de 1 h a 100 V, 1 h a 500 V y 4 h a 4000 V, hasta que cada tira recibe un total de V. Luego las tiras son sometidas a la segunda dimensión, utilizando un gel de acrilamida al 10 % en un sistema TetraCell (BioRad, Hercules, CA). Se realizaron 4 geles en donde uno fue teñido con Azul de Comassie y los otros 3 geles fueron electro transferidos a membranas de nitrocelulosa para la realización de Western Blot, con el fin de caracterizar la reactividad de los anticuerpos monoclonales (1B3, 3B9 y 9B9). Los anticuerpos monoclonales (Ll mab, LlPLD1 mab o LlPLD2 mab), con alta especificidad para detectar mínimas concentraciones del veneno de L. laeta y ambas proteínas recombinantes, y comprobado efecto neutralizante sobre el veneno de la araña, son sometidos a un proceso de humanización, mediante la remoción de la región Fc del anticuerpo de ratón, y su

108 reemplazo por la región Fc de humano. Estos mab ahora humanizados, son utilizados como antídoto en el tratamiento clínico de pacientes con loxoscelismo. Ejemplos de aplicación La invención aquí descrita tiene una amplia gama de usos para los cuales ha sido aplicada, y de los cuales a continuación se hace referencia porque ha sido empleada para ello. La Figura 1, muestra la identificación de isotipo de los anticuerpos monoclonales desarrollados contra el veneno de L. laeta. Los cuales resultaron ser de tipo IgG1. Nótese, que son capaces de reconocer componentes de veneno (Figura 2A), principalmente aquellas presentes en el rango de peso molecular de kda, correspondientes a las denominadas fosfolipasas D (esfingomielinasa D) del veneno de arañas del genero Loxosceles (Figura 2B). Junto con lo anterior, los Ll mab indicados en la invención son capaces de reconocer a su vez las propias proteínas recombinantes (Figura 3). La Figura 4, muestra la detección de componentes del veneno de L. laeta por parte de anticuerpos monoclonales desarrollados a partir de las proteínas recombinantes LlPLD1 y LlPLD2. En la Figura 5, se puede observar la electroforesis en geles de dos dimensiones (2D SDS- PAGE) del veneno de L. laeta junto con su respectivo Western Blot, en el cual se puede apreciar el reconocimiento específico de algunos Ll mabs, capaces de reconocer varias isoformas de fosfolipasa D presentes en el veneno. Esto permite sustentar que la invención es de gran utilidad para su utilización como herramienta diagnóstica (confección de kits de diagnóstico clínico).

109 En relación a la aplicación de los anticuerpos monoclonales indicados en la invención como un neutralizante de la acción toxica del veneno, en la Figura 6, podemos observar claramente la capacidad del tratamiento con los anticuerpos monoclonales en la reducción del área de lesión en pruebas pre-clínicas con conejos, destacándose su valor neutralizante comparado con el uso de antisuero policlonal anti veneno de L. laeta. La comprobación visual a nivel cutáneo de esta capacidad neutralizante se puede apreciar en la Figura 7, en el cual se compara la evolución de la lesión dermonecrótica en el tiempo tanto en el animal inoculado con veneno y en el inoculado con veneno tratado previamente con el anticuerpo monoclonal. De este modo se observa que la humanización de estos Ll mabs permite su uso para tratamiento de estas lesiones en ser humano. Los ejemplos aquí descritos son solo una parte de las posibilidades de aplicación de la presente invención y no constituyen en modo alguno una descripción exhaustiva de las mismas, siendo posible para cualquier persona versada en el arte encontrar múltiples otras aplicaciones del invento en el ámbito de aplicación enunciado, considerándose todas ellas tácitamente descritas como parte de la presente invención.

110 Patente 2: Anticuerpos monoclonales específicos para el veneno de Loxosceles laeta y proteínas recombinantes del veneno de L.laeta y sus usos. Reivindicaciones: 1. Hibridomas (clones híbridos), CARACTERIZADO por producir anticuerpos monoclonales cualquiera de ellos capaces de reconocer en forma específica moléculas presentes en el veneno de Loxosceles laeta. 2. Hibridomas (clones híbridos), CARACTERIZADO por producir anticuerpos monoclonales cualquiera de ellos capaces de reconocer en forma específica las proteínas recombinantes denominadas PLD1 (ascensión GenBank N GU121905) y PLD2 (ascensión GenBank N GU121906). 3. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno producido a partir de los hibridomas de las reivindicaciones 1, CARACTERIZADO por ser: a) Una inmunoglobulina IgG, una IgM, una IgE, una IgA ó una IgD ó cualquiera de sus derivados. b) Un fragmento Fab, un fragmento F(ab ) 2, un fragmento Fv, una cadena simple de anticuerpos, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico ó un anticuerpo bi específico. 4. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno producido a partir de los hibridomas de las reivindicaciones 2, CARACTERIZADO por ser: a) Una inmunoglobulina IgG, una IgM, una IgE, una IgA ó una IgD ó cualquiera de sus derivados. b) Un fragmento Fab, un fragmento F(ab ) 2, un fragmento Fv, una cadena simple de anticuerpos, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico ó un anticuerpo bi específico. 5. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 7F5 que reconoce una molécula de 30,5 kda del veneno de L. laeta. 6. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 7G9 que reconoce una molécula de 31,8 kda, del veneno de L. laeta.

111 7. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 1B3 que reconoce una molécula de 30,5 kda del veneno de L. laeta. 8. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 9B9 que reconoce una molécula de 31,8 kda del veneno de L. laeta. 9. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 6E2 que reconoce una molécula de 30,5 kda del veneno de L. laeta. 10. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 3B9 que reconoce una molécula de 31,8 kda del veneno de L. laeta. 11. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 10D2 que reconoce una molécula de 31,8 kda del veneno de L. laeta. 12. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 6C10 que reconoce una molécula de 31,8 kda del veneno de L. laeta. 13. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 2D4 que reconoce una molécula de 35,7 kda del veneno de L. laeta. 14. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 2D4 que reconoce una molécula de 26,4 kda del veneno de L. laeta. 15. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 6E5 que reconoce una molécula de 31,8 kda del veneno de L. laeta.

112 16. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 5G4 que reconoce una molécula de 35,7 kda del veneno de L. laeta. 17. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 5G4 que reconoce una molécula de 28,8 kda del veneno de L. laeta. 18. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 3, CARACTERIZADO, porque es denominado LlMAb 4E4 que reconoce una molécula de 35,7 kda del veneno de L. laeta. 19. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 4, CARACTERIZADO, porque es denominado como Ll MAb 7E4-D2 que reconoce una proteína recombinante LlPLD1 (ascensión del GenBank N GU121905). 20. Un anticuerpo monoclonal o la porción que se une al antígeno de la reivindicación 4, CARACTERIZADO, porque reconoce una proteína recombinante LlPLD2 (ascensión del GenBank N GU ). 21. El uso de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones 5-20, CARACTERIZADOS, porque con estos anticuerpos se puede elaborar un método diagnóstico para detectar: a) Antígenos del veneno de L. laeta. b) Antígenos del veneno de L. laeta en muestras clínicas de diversos tejidos y/o líquidos biológicos de seres humanos. c) Antígenos del veneno de L. laeta en muestras de diversos tejidos y/o líquidos biológicos provenientes de mamíferos. 22. Un método diagnóstico basado en el uso de los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 21, CARACTERIZADO, porque dicho método diagnóstico sea un test de ELISA. 23. Un método diagnóstico basado en el uso de los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 21, CARACTERIZADO, porque dicho método diagnóstico sea un test de Western blot.

113 24. Un método diagnóstico basado en el uso de los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 21, CARACTERIZADO, porque dicho método diagnóstico sea un test de dot blot. 25. Un método diagnóstico basado en el uso de los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 21, CARACTERIZADO, porque dicho método diagnóstico sea un test de inmunocromatografía. 26. El uso de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones 5-20, CARACTERIZADO porque estos anticuerpos se inoculan en mamíferos (incluidos los seres humanos) para ejercer acción inhibitoria del efecto toxico del veneno de Loxosceles laeta. 27. El uso de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones 5-20, particularmente cuando estos sean humanizados, CARACTERIZADO porque estos anticuerpos se inoculan en los seres humanos para ejercer acción inhibitoria del efecto toxico del veneno de Loxosceles laeta. 28. Las preparaciones farmacéuticas para el uso de los anticuerpos monoclonales de la reivindicación 26 y 27, CARACTERIZADO por ser de cualquiera de las siguientes: a) En solución de los anticuerpos b) En preparado liofilizado de los anticuerpos para preparación de soluciones.

114 Rev Méd Chile 2009; 137: Evaluación experimental de la eficiencia de una pintura repelente para arañas del género Loxosceles Alejandro Catalán 1a, Jorge E Araya 2b, Héctor Varela 3c, William Cortés 1a, Hernán Sagua 2d, Jorge González 2b. Effectiveness of a repellent paint against the spider Loxosceles laeta Background: Loxoscelism is a severe reaction to the bite of the spider Loxosceles laeta. In recent years, a paint with repellent properties has been promoted in the commerce. However, there are no reports of experiments evaluating its effectiveness. Aim: To evaluate experimentally the repellent properties of a paint against Loxosceles laeta. Material and methods: Males, females and nymphs of L laeta were deposited in cockpits that allow the free displacement of the spider. Half of the cockpit was covered with repellent paint. Daily observations during one week, determined how frequently the spiders occupied the space covered with repellent paint. The experiments were run in triplicate. Results: No statistical differences in the occupancy of spaces covered with repellent pain or not covered with it were observed for nymphs (87% and 67%, respectively), males (72% and 77%, respectively) or females (91% and 84%, respectively). Conclusions: The tested paint does not have a repellent action against the spider Loxosceles laeta (Rev Méd Chile 2009; 137: 240-5). (Key words: Insect repellents; Loxosceles venom; Spider venoms) Recibido el 10 de enero, Aceptado el 10 de noviembre, Trabajo financiado por proyecto FONDEF D04I Unidad de Parasitología Molecular, Universidad de Antofagasta, Chile. 2 Unidad de Parasitología, Departamento de Tecnología Médica, Facultad Ciencias de la Salud, Universidad de Antofagasta, Chile. 3 Departamento de Matemáticas, Universidad de Antofagasta, Chile. a TM. Lic., Dr (C) en Ciencias Biológicas b Doctor en Ciencias, Unidad Parasitología c Doctor en Ciencias Matemáticas d Doctor en Bioética (C), Unidad Parasitología Loxosceles laeta, conocida como araña de los rincones es un arácnido de hábitos nocturnos e intradomiciliarios. Su cuerpo mide mm de largo y mm con las patas extendidas y su Correspondencia a: Dr. Jorge González Cortés. Av. Universidad de Antofagasta Fax: E mail: jgonzalez@uantof.cl, abdomen es más oscuro que el resto del cuerpo y extremidades. Se establece en entretechos, rincones de habitaciones, detrás de cuadros, en closets, estantes, en la cara inferior de muebles y en ocasiones en prendas de vestir que han estado colgadas en las paredes. En estos sitios teje una tela en la cual deposita sus huevos en capullos que ella construye 1,2. L laeta es una araña solitaria que vive y caza aislada de sus congéneres, es 240 A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N

115 EVALUACIÓN EXPERIMENTAL DE PINTURA REPELENTE DE ARAÑAS DEL GÉNERO LOXOSCELES - A Catalán et al huraña y rehuye la presencia del hombre. No obstante, durante las noches abandona su tela y camina por las paredes en busca de insectos. Cuando su tránsito es interrumpido por la presencia de una cama apegada a la pared o decide refugiarse en prendas de vestir colgadas en la pared, se generan condiciones para el encuentro accidental con el hombre, donde el arácnido al sentirse atacado responde mordiendo mediante dos potentes quelíceros e inoculando su veneno. Este accidente que habitualmente ocurre durante el sueño nocturno o en las primeras horas de la mañana se denomina loxoscelismo 1,3 y puede evolucionar como un cuadro de intoxicación bajo dos formas clínicas, denominadas loxoscelismo cutáneo (LC) y loxoscelismo cutáneo-visceral (LCV) o sistémico 4,5. En los Servicios de Urgencia de la ciudad de Antofagasta, la mordedura por araña de los rincones es motivo frecuente de consulta (alrededor de 70 ingresos semestrales por cuadros de loxoscelismo) al Servicio de Medicina del Hospital Clínico Regional. En virtud de lo anterior, la implementación sistemática de medidas orientadas a prevenir la mordedura accidental por L laeta constituye una real necesidad. Dentro de las estrategias de profilaxis, se encuentran aquellas tendientes a reducir las posibilidades de encuentro entre el hombre y el arácnido. La utilidad de estas medidas incluye el aseo riguroso de la vivienda humana, el evitar colgar prendas de vestir en las paredes y el no apegar las camas a las paredes entre otras. Por otro lado, el uso de substancias repelentes ha sido sistemáticamente utilizado en la profilaxis de la picadura y mordedura de artrópodos 6. Sin embargo, poco se conoce acerca del uso de substancias repelentes contra arácnidos. De esta manera, la reciente introducción al mercado, de una pintura con propiedades repelentes contra la araña de rincón, podría ofrecer una opción en la perspectiva de una nueva forma de profilaxis del cuadro tóxico producido por mordedura de arañas del género Loxosceles. En esta comunicación, se presenta un estudio en el cual se evaluó experimentalmente la efectividad de una pintura con actividad repelente contra la araña de rincón, mediante un diseño experimental que simula en un microambiente aislado, el efecto que tendría la aplicación de esta pintura en muros y techos de un domicilio real. MATERIAL Y MÉTODO Recolección de ejemplares L laeta en domicilios de Antofagasta. Un total de 90 ejemplares de L laeta fueron capturados en diferentes ambientes intradomiciliarios de la ciudad de Antofagasta. Los ejemplares fueron transportados al laboratorio de Parasitología Molecular de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Antofagasta y mantenidos en recipientes plásticos herméticos por un periodo de tiempo no mayor de 7 días para comprobar su vitalidad hasta el momento de su utilización. Los arácnidos una vez identificados según características morfológicas 7,8 y diferenciados según estadio y sexo, fueron divididos en tres grupos compuestos cada uno por 30 ejemplares: hembras, machos y ninfas, respectivamente. Todos los estadios fueron mantenidos en habitación a temperatura ambiente en oscuridad, hasta el momento de su utilización. Evaluación experimental de una pintura antiarañas de rincón. Para la evaluación experimental del efecto repelente de la pintura anti-araña de los rincones, se empleo una metodología en la cual se diseñaron y fabricaron diez cajas de madera con cubierta de melamina (Figura 1). Este tipo de material, se escogió por su bajo costo y su menor capacidad de absorción. Las cajas fueron preparadas para contener en su interior a un espécimen del arácnido. Cada caja proporcionaba dos habitáculos con ambientes separados por un tabique con orificio que permitía el libre tránsito de la araña desde un ambiente a otro. Cinco cajas fueron utilizadas como control (C 1-5) y en ellas el primer habitáculo se encontraba recubierto con 2 a 3 capas de pintura látex no repelente (mínimo de capas recomendado por el fabricante), tanto en sus muros como en sus caras superiores, mientras que el segundo habitáculo no se encontraba pintado y sus caras superiores estaban cubiertas con la misma madera para evitar el paso de la luz. Otras 5 cajas fueron utilizadas como experimentales (E 1-5) y en ellas uno de los habitáculos se encontraba recubierto con 2 a 3 capas de pintura látex anti-araña de rincón y el segundo ambiente no se encontraba pintado. En todos los casos la superficie, porosidad y textura de los ambientes revestidos con pintura, no fue diferente de aquellos que los arácnidos podrían A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N 241

116 Rev Méd Chile 2009; 137: Figura 1. A) Esquema del habitáculo utilizado para evaluar en condiciones de laboratorio el efecto repelente de la pintura anti-arañas de rincón. B) Establecimiento del arácnido en el ambiente con pintura anti-arañas de rincón. C) Arácnido en ambiente con pintura sin repelente. D) Presencia de ooteca en los grupos de hembras de L laeta usadas para evaluar el efecto de la pintura anti-arañas de rincón, donde la ooteca está indicada con una flecha. encontrar en un muro convencional. La aplicación de la pintura se realizó un día antes de iniciado el experimento y tanto la pintura repelente como la no repelente fueron de la misma marca, color y calidad. Ambas series experimentales se mantuvieron en idénticas condiciones de temperatura y humedad en habitaciones separadas. Se registró el habitáculo de permanencia del arácnido diariamente en el mismo horario durante 7 días. Cada experimento se realizó en triplicado y las observaciones fueron realizadas por una misma persona. Estadística. Los datos obtenidos de E (1-5) y C (1-5), para cada serie de estudio, según estadios (ninfas, hembras y machos), fueron tabulados y sometidos a análisis estadístico basados en pruebas Chi-cuadrado mediante software Statgraphics Plus 5.1 y la prueba exacta de Fisher, para un tamaño de muestra pequeño (n =5), a un nivel de significación de 0,05. RESULTADOS Efecto de la pintura anti-araña de rincón sobre L laeta. En relación a la serie de hembras, se registró que en 91,4% de las observaciones, las hembras permanecieron en el habitáculo con pintura antiaraña de rincón, mientras que entre las hembras del grupo control se registró 84,29% de especímenes que permanecían en el espacio con pintura sin repelente (Figura 2). En la serie machos, se registró que en 72,85% de las observaciones, éstos se encontraron habitando el habitáculo con pintura anti-araña de rincón, mientras que entre los del grupo control se observó una permanencia de 77,14%, (Figura 2). Finalmente, en la serie correspondiente a ninfas se registró 87,15% de permanencia en el habitáculo con pintura anti-araña de rincón, mientras que entre las ninfas del grupo control este parámetro fue de 67,15% de permanencia en el habitáculo con pintura sin repelente (Figura 2). Colonización de L laeta en el ambiente con pintura anti-araña de rincón. Paralelo a la evaluación del efecto repelente de la pintura anti-araña de rincón sobre los diferentes estadios de L laeta, se realizaron observaciones para evaluar si esta pintura era además capaz de afectar la colonización de su nuevo hábitat experimental por parte 242 A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N

117 EVALUACIÓN EXPERIMENTAL DE PINTURA REPELENTE DE ARAÑAS DEL GÉNERO LOXOSCELES - A Catalán et al Figura 2. Efecto de la pintura anti-araña de los rincones sobre los diferentes estadios de L laeta. Los experimentos se realizaron en triplicado y son representativos de experimentos independientes, ejecutados con idéntico protocolo y similares resultados. de la araña. Como se observa en la Figura 1D y Tabla 1, 11 de las 30 hembras evaluadas (36,6%) elaboraron ooteca sobre la superficie recubierta con pintura repelente, mientras que 17 (56,6%) también lo hicieron dentro de las arañas del grupo control. Estadística. En este caso, la hipótesis de nulidad establece que la proporción de L laeta presentes en los habitáculos con pintura no repelente es igual a la proporción de L laeta presentes en los habitáculos tratados con látex anti-arañas de rincón. Valores del estadístico exacto de Fisher indican para todos los grupos en estudio el no efecto de la pintura sobre L laeta, donde no se rechaza la hipótesis de nulidad y se descarta la hipótesis alternativa de una mayor proporción de L laeta en habitáculos tratados con la pintura látex anti-araña de rincón respecto de los arácnidos presentes en los habitáculos sin pintura antiarañas, donde no existe efecto repelente. Los tests estadísticos para evaluar asociación entre la pintura y el estadio evolutivo de L laeta, indicaron que no existe asociación entre la presencia de la pintura y el estadio evolutivo de L laeta en estudio. Tabla 1. Porcentaje de hembras de L laeta con presencia de ooteca Hembras L laeta N % En habitáculo con pintura repelente Presencia de ooteca 11 36,6 Sin presencia de ooteca 19 63,4 En habitáculo con pintura control Presencia de ooteca 17 56,6 Sin presencia de ooteca 13 43,4 Total ,0 A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N 243

118 Rev Méd Chile 2009; 137: DISCUSIÓN El loxoscelismo en sus diferentes formas clínicas, es un accidente eminentemente domiciliario, que ocurre debido a factores absolutamente evitables. Por ello, es necesario evaluar las medidas de vigilancia y control que las personas adoptan para evitar o reducir el riesgo de la mordedura de araña, especialmente las nuevas propuestas de control, como es el uso de pintura repelente. Lo anterior, resulta especialmente relevante en la ciudad de Antofagasta, debido a la alta casuística observada y la presentación de cuadros de envenenamiento severo (LCV) con desenlace fatal que con cierta frecuencia se reportan en el Servicio de Medicina del Hospital Clínico Regional de Antofagasta 9,10. Componentes con actividad repelente contra artrópodos, principalmente derivados de plantas, han sido sistemáticamente empleados contra mosquitos y garrapatas. Entre estos compuestos destacan el N, N-dietil-3-metilbenzamida (DEET), permetrina, picaridina, aceite de citronella y el aceite de eucaliptus limón 6. En general los compuestos usados como substancias repelentes deben poseer como características, un efecto prolongado, ser atóxicos para el ser humano, poseer un bajo costo y ser inodoros o carentes de olor desagradable 13. De igual manera, el uso de pinturas insecticidas ha sido propuesto como una estrategia de control de triatominos 11,12. Sin embargo, con excepción de los repelentes de uso personal que se aplican en ropa o directamente sobre la piel, el uso de pinturas repelentes o insecticidas no han tenido aplicación a gran escala. En el caso particular de la pintura insecticida contra triatomas, aunque la literatura reporta un relativo buen efecto, éstas no llegaron a ser comercializadas al observarse problemas en su estabilidad y viscosidad 12. No obstante, no existen en la literatura científica reportes respecto al uso de pinturas repelentes contra arácnidos de hábitat domiciliario. En virtud de lo anterior y considerando la introducción en el mercado nacional de una pintura repelente de arañas de rincón, evaluamos su efecto en el comportamiento de machos, hembras y ninfas de L laeta, que en nuestro país es la especie de arácnidos domiciliarios más prevalente y peligrosa. Para este efecto, se utilizaron habitáculos con ambientes recubiertos con pintura látex repelente en el grupo experimental y ambientes recubiertos con pintura látex del mismo color y calidad sin efecto repelente en los controles. De esta manera, pudimos observar que todos los estadios estudiados fueron poco sensibles al efecto de esta pintura. Más aún, en los experimentos realizados con las hembras de L laeta, se observó que además de permanecer en una alta proporción (91,4%), en el ambiente con pintura-anti araña de rincón, 36,6% de ellas fue capaz de desarrollar allí nido y ooteca, lo que es indicativo de una condición de asentamiento y adaptación del artrópodo a un nuevo ambiente (Figura 1D, Tabla 1). Del mismo modo, los estadios ninfales, considerados teóricamente más susceptibles al efecto que podría causarles la pintura, mostraron una frecuencia de permanencia en el habitáculo recubierto con pintura repelente, similar a la observada en el grupo de hembras (87,15%). Los resultados mostrados por las series experimentales fueron muy similares a los observados en las series del grupo control (Figura 2). De esta manera, la frecuencia con que los arácnidos permanecieron sobre la superficie cubierta con pintura repelente versus los que permanecieron sobre la pintura normal no repelente (pintura normal) no mostraron diferencias estadísticamente significativas (p >0,05). El uso de cajas o habitáculos en la evaluación experimental del efecto de insecticidas y substancias repelentes, es el procedimiento habitualmente aceptado para este tipo de estudios. De modo general, consiste en disponer un determinado número de ejemplares en cada habitáculo, en el que previamente o con posterioridad se aplica la substancia a evaluar 13,14. No obstante en nuestro estudio, por tratarse de una especie de hábitos solitarios, que defiende su territorio y que practica el canibalismo, se debió disponer de cada ejemplar en habitáculos separados. De esta manera, es posible concluir, que al menos en las condiciones evaluadas en nuestro laboratorio, la pintura repelente no tiene efecto sobre los tres estadios de L laeta. La composición y el principio repelente de esta pintura, por tratarse de un producto comercial protegido por patente, no es conocida. Sin embargo, es posible que este principio repelente sea inestable o posea una vida media corta que pudiese ser afectado por 244 A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N

119 EVALUACIÓN EXPERIMENTAL DE PINTURA REPELENTE DE ARAÑAS DEL GÉNERO LOXOSCELES - A Catalán et al diferentes condiciones de almacenamiento o que pudiesen existir diferencias en distintos lotes de fabricación. Por lo anterior parece también necesario evaluar pinturas provenientes de diferentes lotes de fabricación. De igual manera, diferencias genéticas entre subpoblaciones de L laeta, que resulten en ejemplares con una menor susceptibilidad al efecto repelente no pueden ser descartadas. A la luz de estos resultados, y en ausencia de otras alternativas, la práctica permanente de medidas tales como el aseo riguroso de la vivienda humana usando especialmente la aspiradora en todos los rincones y espacios inaccesibles, sumado a evitar apegar la cama a la pared y colgar ropas en las paredes, siguen teniendo permanente vigencia como acciones de vigilancia y control frente a los accidentes provocados por la mordedura de araña de rincón. No obstante, resulta aún más necesario el implantar programas de educación sanitaria de la población, especialmente en la ciudad de Antofagasta en que la prevalencia domiciliaria de L laeta es alta. Finalmente, la búsqueda de nuevos compuestos activos con efecto repelente contra L laeta parece ser altamente necesaria. REFERENCIAS 1. SCHENONE H. A propósito del loxoscelismo en Chile. Rev Méd Chile 2004; 132: SCHENONE H, SAAVEDRA T, ROJAS A, VILLARROEL F. Loxoscelismo en Chile. Estudios epidemiológicos, clínicos y experimentales. Rev Inst Med Trop S Paulo 1989; 31: ATIAS A. Parasitología Médica. Ed. Mediterráneo 1ª Edición Santiago de Chile. 1999; SCHENONE H, SUÁREZ G. Venoms of Scytodidae. Genus Loxosceles. A. Distribution and biology of Venenous Species; Chemistry, Toxicity, Pharmacology, and Mode of Action of Venom. B. Epidemiology, Symptomatology, Pathology, Prognosis, Treatment, and Prevention of Envenomations. En: Bettini S. Ed. Arthropod Venoms. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York. 1978; SCHENONE H. Toxic pictures produced spiders bites in Chile: latrodectism and loxoscelism. Rev Med Chil 2003; 131: KATZ TM, MILLER JH, HEBERT AA. Insect repellents: historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol 2008; 58: AGUILERA MA, CASANUEVA ME. Arañas chilenas: estado actual del conocimiento y clave para las familias de araneomorphae. Gayana 2005; 69: GERTSCH WJ. The spider genus Loxosceles in South America (Araneae Scytodidae). Bull Am Mus Nat Hist 1967; 136: GUTIÉRREZ J, SAGUA H. Loxoscelismo en el niño. Análisis de 15 casos. Hospital Regional Dr. Leonardo Guzmán ( ) Antofagasta-Chile. Rev Chil Pediatr 1979; 50: ZAMBRANO A, GONZÁLEZ J, CALLEJAS G. Desenlace fatal por loxoscelismo cutáneo visceral. Rev Méd Chile 2005; 133: AVILA MONTES GA, PONCE C, PONCE E, MARTÍNEZ HERNÁNDEZ M, FLORES M. Insecticidal paint and fumigant canisters for Chagas disease control: community acceptance in Honduras. Rev Panam Sal Publ 1999; 6: DIAS JC, JEMMIO A. About an insecticidal paint for controlling Triatoma infestans, in Bolivia. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41: BUNNER BL, PERICH MJ, BOOBAR LR. Culicidae (Diptera) mortality resulting from insecticide aerosols compared with mortality from droplets on sentinel cages. J Med Entomol 1989; 26: CHUNG YK, LAM-PHUA SG, CHUA YT, YATIMAN R. Evaluation of biological and chemical insecticide mixture against Aedes aegypti larvae and adults by thermal fogging in Singapore. Med Vet Entomol 2001; 15: A R T Í C U L O D E I N V E S T I G A C I Ó N 245

120 This article appeared in a journal published by Elsevier. The attached copy is furnished to the author for internal non-commercial research and education use, including for instruction at the authors institution and sharing with colleagues. Other uses, including reproduction and distribution, or selling or licensing copies, or posting to personal, institutional or third party websites are prohibited. In most cases authors are permitted to post their version of the article (e.g. in Word or Tex form) to their personal website or institutional repository. Authors requiring further information regarding Elsevier s archiving and manuscript policies are encouraged to visit:

121 Author's personal copy Toxicon 56 (2010) Contents lists available at ScienceDirect Toxicon journal homepage: Tetracycline and penicillin resistant Clostridium perfringens isolated from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta: Its implications in loxoscelism treatment A. Catalán, M.C. Espoz, W. Cortés, H. Sagua, J. González, J.E. Araya * Departamento de Tecnología Médica, Unidad de Parasitología Molecular, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Antofagasta, Casilla 160, Av. Angamos # 601, Antofagasta, Chile article info abstract Article history: Received 7 January 2010 Received in revised form 12 June 2010 Accepted 16 June 2010 Available online 25 June 2010 Keywords: Clostridium perfringens Loxosceles laeta b-lactamase Tetracycline Antimicrobial resistance The venom of Loxosceles spiders produces severe dermonecrotic damage, intravascular hemolysis, systemic alterations and risk of death. Clostridium perfringens is present in the microbial flora of the fangs and venom glands of Loxosceles intermedia. Its inoculation with the venom may infect the wound site and exacerbate the dermonecrotic damage. This anaerobic bacterium is widely distributed in nature and capable of damage with similar characteristics and severity to the spider venom. In this study we isolated and characterized species of Clostridium from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta, including C. perfringens. The sensitivity patterns of different isolates of C. perfringens were evaluated by minimum inhibitory concentration against penicillin, ampicillin, erythromycin, gentamicin, chloramphenicol, clindamycin and tetracycline, under anaerobic conditions, using the method of microdilution in broth. Strain C. perfringens H28 showed resistance to penicillin, ampicillin, tetracycline and chloramphenicol. Resistance to penicillin and ampicillin was mediated by b-lactamase. In vivo evaluation of dermonecrosis in rabbits using L. laeta venom co-inoculated with isolate C. perfringens H28 produced an increase in the area of dermonecrotic lesions in the presence of penicillin and tetracycline, but not with gentamicin. Antibiotic therapy Loxosceles poisoning should be re-evaluated, considering the existence of multi-resistant strains of C. perfringens. Ó 2010 Published by Elsevier Ltd. 1. Introduction Poisoning due to the bite of spiders of the genus Loxosceles is known as loxoscelism. In Chile is produced by Loxosceles laeta, a species usually domestic, and endemic to our country, commonly known as corner spider (Schenone, 2003). Loxoscelism is a clinical picture which may evolve in two ways: cutaneous loxoscelism (CL) and cutaneous visceral or systemic loxoscelism (CVL). The CL symptoms are characterized by a skin lesion which begins with a nailing burning sensation, acute inflammatory * Corresponding author. Tel.: þ ; fax: þ address: jearayar@uantof.cl (J.E. Araya). reaction with edema, followed by the accumulation of inflammatory cells, vessel rupture and erythema, and finally by a marked necrotic reaction, characterized by the formation of livedoid plaque, consist of a pale violet stain ecchymotic initial appearance, which evolves to a necrotic scar with the pass of hours. This latter is indicated as the hallmark of cutaneous loxoscelism. The most severe cases of CVL are characterized by hematological perturbations, like hemoglobinuria with evidence of massive intravascular hemolysis and kidney damage with systemic involvement, which may lead to the death of the patient (Futrell, 1992; Schenone et al., 2001; Schenone, 2003; da Silva et al., 2004; Hogan et al., 2004). Few epidemiological studies relating to loxoscelism have been made in Chile. Only in Santiago, during the years /$ see front matter Ó 2010 Published by Elsevier Ltd. doi: /j.toxicon

122 Author's personal copy A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) , there were 250 cases, of which 81.2% presented cutaneous loxoscelism, while 18.8% presented cutaneousvisceral loxoscelism (Schenone et al., 2001; Schenone, 2003). Recently, an assessment of the prevalence and epidemiology of the bite of L. laeta through telephone consultations and subsequent confirmation, made at the Toxicological Information Center and Drug at the Pontifical Catholic University of Chile (CITUC) during 2005, revealed that from 2831 consultations with suspected loxoscelism, 287 were confirmed as cutaneous loxoscelism and of these only the 7.3% presented in addition a visceral loxoscelism, reflecting a real public health problem in our country (Ríos et al., 2007). Studies performed with Loxosceles intermedia (Monteiro et al., 2002) have demonstrated that the anaerobic bacterium Clostridium perfringens is present in the venom and fangs and may be inoculated together with the venom and develop into the bite site, favored by the anaerobic microenvironment induced by the cytotoxic components of the venom and greatly increasing the dermonecrotic damage. These authors suggested antibiotic therapy in the treatment of loxoscelism associated with C. perfringens. Bacteria of the genus Clostridium are widely distributed in soil, water, dust, plants and the gastrointestinal tract of arthropods, animals and humans; thus there is a high probability that spiders may be contaminated with Clostridium spores because of their feeding habits (Rood and Cole, 1991). In particular, C. perfringens produces pathologies in humans such as gas gangrene (Clostridial myonecrosis), food poisoning and necrotic enteritis (Smith, 1979; McDonel, 1980). The alpha toxin of C. perfringens is the main pathogenic factor in these pathologies, which exhibits enzymatic activities of phospholipase C (PLC) and sphingomyelinase (SMase), along with hemolytic and dermonecrotic activity (Songer, 1997). The necrotic damage induced by this bacterium has characteristics which are very similar to those observed in cutaneous loxoscelism. However, its association as an exacerbating factor in the dermonecrotic lesion of cutaneous loxoscelism is still not well understood, thus it complicates the administration of an efficient antibiotic therapy by the clinician as a complementary treatment. The treatment of choice for C. perfringens infections is penicillin G, although erythromycin and tetracycline are alternative drugs usually recommended (Schwartzman et al., 1977). Recently, tetracycline administered topically has been suggested as an option in the treatment of cutaneous loxoscelism, due to its capacity to diminish the dermonecrotic lesion produced by the venom of L. intermedia (Paixão-Cavalcante et al., 2007). The presence of C. perfringens in other species of the genus Loxosceles such as L. laeta, which is the main species that causes loxoscelism in Chile (Schenone et al., 2001) and other South American countries, has not yet been studied, nor its importance in the application of antimicrobial treatments in cases of cutaneous loxoscelism. Here we report the isolation and identification of anaerobic bacteria of the genus Clostridium from the fangs and venom glands of L. laeta, among them a strain of C. perfringens (H28) with high levels of resistance to antimicrobial drugs. Using an animal model, we evaluated experimentally the role of these bacteria together with the venom of L. laeta in the development and evolution of the dermonecrotic lesion treated with the antibiotics usually used to treat these lesions. 2. Materials and methods 2.1. Collection of specimens of L. laeta We collected 190 adult specimens of L. laeta from houses in the city of Antofagasta, Chile; each spider was placed in a transparent plastic container with a tight lid for safe handling to avoid accidents, and was kept in the dark at room temperature until used. Venom was extracted from fifty randomly selected adult spiders by electrostimulation according to Bücherl (1969), with slight modifications. Twenty volts of electrical stimulus was applied at the base of the chelicerae to spiders which had been previously starved for a minimum of 3 weeks. Venom was collected with micropipettes, pooled and stored at 80 C. The remaining 140 adult spiders were used for bacteriological studies Extraction of the biting apparatus of L. laeta and bacteriological study The biting apparatus (fangs þ venom glands) of 140 adult specimens of L. laeta was extracted manually in sterile conditions after anesthesia with ethyl ether, and then immediately inoculated into screw top tubes with thioglycolate broth (Oxoid, Basingstoke, UK) and cultivated at 37 C for 48 h in an anaerobic jar (BBL Gas Pak System) with an anaerobic generator system Anaerogen Compact (Oxoid, Basingstoke, UK; 80 85% N, 5 10% CO 2, 5 10% H). The cultures with microbial development were seeded in Schaedler agar plates with 5% sheep blood (BioMérieux, Lyon, France) supplemented with hemin (5 mg/ml) and menadione (10 mg/ml), and incubated at 37 C for 48 h in an anaerobic atmosphere. The initial identification of C. perfringens was by microscopic morphology, Gram stain and a double hemolytic zone in Schaedler agar with 5% sheep blood. Final identification used a set of biochemical tests with the API 20A system (BioMérieux, Lyon, France), after 24 h of anaerobic incubation at 37 C Isolation of total DNA C. perfringens DNA was isolated from 2 to 4 colonies of Schaedler agar cultures after 48 h of anaerobic development. Cells were inoculated in 5 ml of TPYG broth (trypticase peptone 3%, yeast extract 0.5%, glucose 0.5%, cysteine 0.05%, sodium thioglycolate 0.1%, ph 7.5) and incubated anaerobically at 37 C for 48 h without agitation. Tubes were then centrifuged for 15 min at 4300g, and the bacterial pellet was resuspended in a buffer with 10 mm Tris/HCl (ph 8.0), 5 mm EDTA, 0.5% SDS, 2 mg/ml lysozyme and 100 mg/ml RNase and incubated at 37 C for 1 h. Cell lysates were then treated with 100 mg/ml of proteinase K for 18 h at 56 C and centrifuged for 10 min at 11,000g at room temperature. The DNA present in the supernatant was extracted with phenol:chloroform:isoamyl alcohol

123 Author's personal copy 892 A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) (25:24:1) and precipitated with 0.3 M sodium acetate in ethanol for 30 min at 70 C. Finally, the DNA was resuspended in sterile H 2 O and stored at 20 C PCR to detect resistance genes b-lactamase (bla) and tetracycline (teta(p)) The detection of antibiotic resistance genes bla and teta (P) was performed by PCR. Specific oligonucleotides for the b-lactamase gene were designed from putative b-lactamase genes present in the genome of C. perfringens strains ATCC and SM101 (Myers et al., 2006). The sequences were bla Cp forward (5 0 -ATGAAAGAAGTTCAAAAATATTTAGAG-3 0 ) and bla Cp reverse (5 0 -TTAGTGCCAATTGTTCATGATGG-3 0 ), which amplified a fragment of 780 bp. Oligonucleotides for the detection of the teta(p) gene were the primers TET P 1366 and TET P 1367, previously described, with a product of 764 bp (Johanesen et al., 2001). PCR was performed using 1 ml of DNA template in a final volume of 50 ml, with 50 mm KCl, 20 mm Tris/HCl (ph 8.4), 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm of each dntp, 1 U Taq DNA polymerase (Invitrogen Inc, Carlsbad, USA) and 10 pmol of each primer. Amplification conditions were the following: an initial denaturation at 95 Cfor5min; 35 cycles of denaturation at 95 C for 1 min, alignment at 50 C for 30 s and extension at 72 Cfor1min;andafinal extension at 72 C for 7 min. PCR products were visualized in 0.8% agarose gels stained with ethidium bromide. All amplified fragments were cloned and sequenced Antibiotics Antibiotics penicillin G, ampicillin, erythromycin, gentamicin, chloramphenicol, clindamycin and tetracycline were obtained from Sigma (St. Louis, MO). Stock solutions were prepared at 512 mg/ml in sterile distilled water except for erythromycin and tetracycline, whose standard solutions were dissolved in 95% ethanol and then diluted with water. For the microdilution susceptibility studies, the antibiotics were used in a concentration range from 128 to mg/ml Enzymatic determination of b-lactamase The enzymatic determination of b-lactamase was performed with commercial sticks impregnated with nitrocefin, a chromogenic cephalosporin (Oxoid, Basingstoke, UK), in anaerobic cultures for 48 h Minimum inhibitory concentration The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the method of microdilution in broth (Rotilie et al., 1975). Each of the studied antibiotics was added in a double dilution series from 128 to mg/ml in a 96-well microplate. To prepare the inoculates, 5 colonies which had been grown for 48 h in Schaedler agar were inoculated in Brucella broth and standardized at 0.5 McFarland in a concentration estimated at UFC/ml, and diluted 1:10 for a final approximate inoculate concentration of UFC/ml. The microplates were sealed with cellophane to avoid evaporation and incubated at 37 C for 48 h in an anaerobic chamber. The MIC was defined as the lowest concentration of antibiotic which inhibited visible growth of C. perfringens. As a control we used strain ATCC of C. perfringens; all values of antibiotic sensitivity were determined according to the guidelines of the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference (NCCLS, 2001) Experimental animals Adult male New Zealand rabbits of approximately 3 kg were obtained from the Public Health Institute of Chile. Animals were maintained and used according to the protocol of animal manipulation approved by the Ethics Committee of the Antofagasta University, Chile Dermonecrosis in vivo and antibiotic treatment A volume of 100 ml of pure L. laeta venom (20 mg/ml) in PBS ph 7.2 was inoculated by intradermic injection in the shaved dorsum of male New Zealand rabbits. Also, 100 mlof L. laeta venom co-inoculated with C. perfringens H28 in an inoculum of cells was injected intradermically in the dorsum of rabbits. The negative control group was inoculated with an equal volume of PBS. Two hours after inoculation, the animals of both experimental groups were treated intramuscularly every 12 h with penicillin G sodium ( U/kg/12 h in H 2 O), tetracycline (15 mg/ kg/12 h in H 2 O) or gentamicin (5 mg/kg/12 h in H 2 O). The dermonecrotic lesion was evaluated 2, 6, 12, 24 and 48 h post injection and expressed as lesion area in cm 2. The results are presented as mean S.E.M of three replicates and were analyzed using repeated measures analysis followed by a post Bonferroni test using the SPSS software version 15.0 (SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA). Statistical significance was established at p < Re-isolation of C. perfringens from experimental lesions We recovered samples from the dermonecrotic lesions of the experimental rabbits used in the antibiotic study, and re-isolated C. perfringens presents in the samples using the bacteriological method described above for the fangs and venom glands of L. laeta. 3. Results 3.1. Isolation and identification of C. perfringens from the fangs of L. laeta Of the 140 samples of fangs and venom glands of L. laeta studied, 22 (15.7%) were positive for different species of Clostridium. Four of these isolates (2.9% of the total) were identified as C. perfringens by the API 20A system (Table 1). We also isolated and identified other species of the genus Clostridium, including Clostridium beijerinckii/butyricum, Clostridium histolyticum, C. bifermentans and Clostridium botulinum Resistance to antibiotics The MIC values for all the strains of C. perfringens isolated demonstrated a high resistance to penicillin G and

124 Author's personal copy A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) Table 1 Isolation of Clostridium spp and other anaerobic bacteria from the fangs and venom glands of Loxosceles laeta. Isolates strains N (%) Clostridium perfringens 4 (2.9%) Clostridium beijerinckii 8 (5.7%) Clostridium botulinum 5 (3.6%) Clostridium histolyticum 3 (2.1%) Clostridium bifermentans 1 (0.7%) Other anaerobic bacteria 16 (11.4%) Total samples 140 (100%) ampicillin (Table 2). One of the strains (C. perfringens H28) was resistant to penicillin G and ampicillin with MIC > 128 mg/ml in both cases. This strain was also resistant to chloramphenicol and tetracycline. The MIC value for tetracycline was 8 mg/ml; more than 4 mg/ml is considered resistant (Table 2). The MIC values of strain H28 challenged with clindamycin, gentamicin and erythromycin were 0.5, 8 and 8 mg/ml, respectively. To evaluate whether the observed resistance to penicillin by the strains of C. perfringens is due to the production of b-lactamase, the strains resistant to these drugs were analyzed for the phenotypic presence of the enzyme. All the isolates showed expression of b-lactamase. This enzyme was also present in high frequency in the isolates of C. beijerinckii/butyricum (Table 3) PCR of resistance genes to b-lactam and tetracycline The isolates of C. perfringens were analyzed for the presence of the bla gene, which confers resistance to beta lactam. Only strain H28 amplified a product of 780 bp (Fig. 1), however, this product was also amplified in the control strain ATCC Also, we evaluated the presence of the most common gene conferring tetracycline resistance in C. perfringens, teta(p); again only strain H28 amplified a PCR product of 764 bp, in accordance with the MIC results for this strain. The sequences of the fragments amplified had 98% 99% identity with the bla and teta(p) genes (data not shown) Dermonecrotic activity in vivo in the presence of antibiotics Penicillin G is the antibiotic of choice in C. perfringens infections. Considering the resistance profile to this drug and its derivatives and to tetracycline found in our isolate H28, we evaluated the efficiency of antibiotic treatment Table 3 Production of b-lactamase in strains of C. perfringens. with penicillin, tetracycline and gentamicin in a rabbit model. Animals inoculated with the venom of L. laeta associated with C. perfringens H28 showed a marked exacerbation of the dermonecrotic lesion compared to the evolution in rabbits inoculated only with venom or the controls with PBS (Fig. 2A). In the group of rabbits treated with penicillin and tetracycline there was a similar exacerbation of the lesion produced by the mixture venom þ bacteria compared to the effects of L. laeta venom alone (Fig. 2B and C). The sensitivity of C. perfringens strain H28 to gentamicin is reflected in Fig. 2D; animals treated with this antibiotic had a smaller area of dermonecrotic damage and less severe symptoms Re-isolation of C. perfringens from experimental lesions To demonstrate that the exacerbated damage in the dermonecrotic lesion of experimental rabbits was worsened by the presence of bacteria from the venom þ bacteria injection, we re-isolated C. perfringens under anaerobic conditions from the lesions in all the experimental groups. We were able to isolate the bacteria from all the experimental groups except those inoculated with venom only, including those animals treated with penicillin and tetracycline (Table 4). 4. Discussion Isolates b-lactamase C. perfringens ATCC Negative C. perfringens strain H28 Positive C. perfringens strain M43 Positive C. perfringens strain M8 Positive C. perfringens strain M70 Positive C. beijerinckii strain H27 Positive C. perfringens is one of the anaerobic pathogenic bacteria with widest world distribution. It is found in soil, water and in the intestinal tract of arthropods, animals and humans (Rood and Cole, 1991). Here, from the biting apparatus (fangs and venom glands) of the L. laeta spider, we isolated and characterized several species of Clostridium, among these C. perfringens and C. botulinum were the species of greatest pathological importance. A previous study (Monteiro et al., 2002) isolated C. perfringens from 25% of Table 2 Antibiotic susceptibility of C. perfringens strains isolates from fangs and venom glands of L. laeta. Strains MIC (mg/ml) a Penicillin Ampicillin Tetracycline Clindamycin Erythromycin Chloramphenicol Gentamicin C. perfringens ATCC C. perfringens strain H28 >128 > C. perfringens strain M43 > C. perfringens strain M8 > C. perfringens strain M a MIC values after anaerobic incubation at 37 C for 48 h.

125 Author's personal copy 894 A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) Fig. 1. Electrophoretic separation in agarose gels of PCR products for the genes bla y teta(p). The PCR products of 780 bp of the bla resistance gene and the 764 bp for the teta(p) resistance gene of C. perfringens was evaluated for the following strains. (1) C. perfringens strain ATCC (2) C. sporogenes. (3) C. beijerincki/ butyricum strain H27. (4) C. perfringens strain H28. (5) C. perfringens strain M43. (6) C. perfringens strain M70. (7) C. perfringens strain M8. (M) 100 bp DNA ladder. the fangs and 6.25% of the venom obtained by electrostimulation of L. intermedia, while only 2.9% of our bacterial isolates were C. perfringens. The greater percentage of strains isolated by Monteiro et al., (2002) could be related to a larger number of samples processed. However, they only made a presumptive identification of the species and did not use a set of biochemical tests to differentiate it from other species of Clostridium. C. botulinum produces botulinum toxin (Burgen et al., 1949). The effect of this toxin has not been associated with clinical manifestation of cutaneous loxoscelism, so that a direct involvement of C. botulinum as a possible exacerbating factor cannot be established. However, the involvement of this bacterium in secondary complications of loxoscelism remains to be resolved. The presence of C. perfringens in the fangs of L. laeta may be due to the wide distribution of its resistant spores in the environment. However, since the spider is a predator capable of dissolving and sucking the visceral Fig. 2. Dermonecrosis in vivo from L. laeta venom and C. perfringens H28 in the presence and absence of antibiotic treatment. (A) 100 ml of L. laeta venom (20 mg/ ml) in PBS ph 7.2 inoculated by intradermic injection in the dorsum of rabbits; alone (-), and co-inoculated with C. perfringens strain H28 (B), in inoculums of Two hours after inoculation, animals were treated by intramuscular injection with (B) Penicillin G sodium ( U/kg/12 h in H 2 O), (C) Tetracycline ( U/kg/12 h in H 2 O) and (D) Gentamicin (5 mg/kg/12 h in H 2 0). The dermonecrotic lesion was evaluated after 2, 6, 12, 24 and 48 h. Points on the graphs represent the means of triplicates S.E.M.

126 Author's personal copy A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) Table 4 Reisolation of C. perfringens from experimental dermonecrosis after 24 h inoculation in rabbits. Samples Dermonecrotic lesion with venom alone. Dermonecrotic lesion evoked by venom and C. perfringens without antibiotic treatment. Dermonecrotic lesion evoked by venom and C. perfringens with penicillin treatment. Dermonecrotic lesion evoked by venom and C. perfringens with tetracycline treatment. Dermonecrotic lesion evoked by venom and C. perfringens with gentamicin treatment. Anaerobic culture (48 h) Negative Positive Positive Positive Positive contents of its arthropod prey, it may also serve as a vector for the transmission of the bacterium once it is contaminated (Murray et al., 2000). Once C. perfringens has been introduced in the site of the dermal lesion produced by the bite of the spider, under appropriate conditions such as the tissue necrosis produced by the venom of Loxosceles species, it can colonize the tissue and proliferate intensely, facilitating the installation of the dermonecrotic states and grave systemic consequences (Middlebrook and Dorland, 1984) which characterize loxoscelism. Under this premise, Monteiro et al., (2002) demonstrated that a conjugate of the spider venom with the anaerobic bacterium is capable of exacerbating the dermonecrotic lesion in rabbits, which was not as notable in the presence of antibiotic treatment with penicillin administrated before and during the test. However, this study did not consider or evaluate the susceptibility of the isolates of C. perfringens to antimicrobial drugs. Although penicillin G is the treatment of choice for C. perfringens infections, erythromycin and tetracycline are used as alternative drugs in patients allergic to b-lactam (Schwartzman et al., 1977). Chilean norms for the handling of spider bites of the genus Loxosceles suggest the use of antibiotic treatment only as prophylaxis for secondary infections caused by Streptococcus spp. and Staphylococcus spp. (Ríos et al., 2004), and do not consider the possible association of anaerobic bacteria such as C. perfringens. We showed by MIC studies that one of the strains of our study, C. perfringens H28 isolated from the fangs of a L. laeta female, had multiple resistance to antimicrobial drugs; it was resistant to 4 of the 7 antibiotics tested, all of which are used in the treatment of C. perfringens infections. Multiple resistances to antibiotics have been found previously in strains of C. perfringens obtained from different sources (Dornbusch et al., 1975; Dutta and Devriese, 1981; Rood et al., 1978a). However, there are no previous reports of a multiple antibiotic resistances in strains of C. perfringens isolated from Loxosceles spiders and particularly from L. laeta, one of the most damaging species. b-lactams susceptibility is frequently found in clinical human samples of C. perfringens, including Penicillin G, ampicillin, meropenem, imipenem, amoxicillin clavulanate, ampicillin sulbactam, to which C. perfringens is very sensitive and have low rates of resistance in clinical isolates (Alexander et al., 1995), although the resistance of isolates of C. perfringens to penicillin and its derivatives may be explained by a reduced affinity of the antibiotic to penicillin binding protein 1 (PBP1) (Murphy et al., 1981; Williamson, 1983). Additionally, this resistance has not been demonstrated by the production of b-lactamase (Allen et al., 1999; Hecht, 2006). However, the high resistance to penicillin and ampicillin of our isolates may be explained by the production of b-lactamase, since all resistant strains were capable of producing this enzyme (Table 3). In the case of strain C. perfringens H28, this was confirmed by PCR of the bla gene. Resistances in other species of Clostridium include clindamycin and b-lactam antibiotics such as penicillin, cephalosporins and imipenem (Hecht, 2006). Our isolates of C. beijerinckii/butyricum also produced b-lactamase, which is concordant with reports indicating resistance of clinical samples of this species due to b-lactamase (Brazier et al., 1985). Our isolate C. perfringens H28 also showed resistance to tetracycline. High levels of in vitro resistance to tetracycline have been documented for strains of C. perfringens obtained from domestic fowl and livestock (Sasaki et al., 2001; Johansson et al., 2004). Tetracycline resistance has been indicated as the most common antibiotic resistance found in C. perfringens; four resistance genes have been identified, teta(p), tetb(p), teta408(p) y tetm (Lyras and Rood, 1996), the most common of which is teta(p) (Johanesen et al., 2001). Only strain H28 amplified the 764 bp fragment of the teta(p) gene, in agreement with the MIC values found for this strain. Transfer of tetracycline resistance between strains of C. perfringens has been reported, due to the conjugative plasmid pcw3 (Rood et al., 1978b). It has also been reported that exposition to concentrations of tetracycline less than the MIC value may induce resistance transfer by plasmids in species of Bacteroides, and from and to Bacteroides with other Gram positive bacteria (Shoemaker et al., 2001); thus we cannot discount the presence of this phenomenon in our isolates. The tetracycline resistance we found in a strain isolated from the fangs of L. laeta is an important finding, considering the recent role assigned to tetracycline as an inhibitor and preventive of the effect of L. intermedia venom in in vitro and in vivo models of dermonecrotic lesions, which suggested the use of this antibiotic as an effective therapeutic agent in the treatment of cutaneous loxoscelism (Paixão-Cavalcante et al., 2007). In our study, the ineffectiveness of antibiotic treatment with penicillin and tetracycline in dermonecrosis models was evident; we demonstrated an exacerbating effect of the dermonecrotic lesion in rabbits inoculated with the mixture of L. laeta venom and C. perfringens strain H28 compared to venom alone, which contrasts with the results of an earlier report (Monteiro et al., 2002). These results clearly indicate that the presence of a strain of C. perfringens resistant to penicillin and tetracycline associated with the spider venom increased the severity of the symptoms and extension of the dermonecrotic lesion in rabbits.

127 Author's personal copy 896 A. Catalán et al. / Toxicon 56 (2010) In conclusion, our results strongly suggest that the use of antibiotic therapy associated with the treatment of loxoscelism should be re-evaluated, considering the existence of strains with multiple antibiotic resistances, with special emphasis in the bacteriological study which would evaluate the presence of C. perfringens resistant to the antibiotics of choice such as penicillin and tetracycline. This association should be considered principally for treatment of secondary bacterial infections associated with spider poisoning, in antibiotic therapy associated with the treatment of cutaneous loxoscelism, the prescribed treatment should include antibiotics such as cephalosporins (cefoxitin and cefotetan), imipenem, meropenem or beta lactam associated with beta-lactamase inhibitor such as ampicillin sulbactam and piperacillin taxobactam. Acknowledgements We thank the statistical support given by the Dr Hector Varela. This investigation was financed by Project FONDEF D04I1247, and doctoral scholarship D from the program of graduate fellowships, of the National Commission for Scientific and Technological Research, CONICYT, Chile. Conflict of interest statement There is no conflict of interest. Funding source This investigation was financed by Project FONDEF D , of Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica, CONICYT, Chile. The funding source, has not participated in the design, sample collection, analysis, interpretation of data, or decision to submit the manuscript for publication. References Alexander, C.J., Citron, D.M., Brazier, J.S., Goldstein, E.J.C., Identification and antimicrobial resistance patterns of clinical isolates of Clostridium clostridioforme, Clostridium innocuum, and Clostridium ramosum compared with those of clinical isolates of Clostridium perfringens. J. Clin. Microbiol. 33, Allen, S.D., Emery, C.L., Siders, J.A., Clostridium. 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Pediatr. 72 (2), Schwartzman, J.D., Reller, L.B., Wang, W.L., Susceptibility of Clostridium perfringens isolated from human infections to twenty antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 11 (4), Shoemaker, N.B., Vlamakis, H., Hayes, K., Salyers, A.A., Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl. Environ. Microbiol. 67, da Silva, P.H., da Silveira, R.B., Appel, M.H., Mangili, C.O., Gremski, W., Veiga, S.S., Brown spiders and loxoscelim. Toxicon 44, Smith, L.D.S., Virulence factors of Clostridium perfringens. Rev. Infect. Dis. 1, Songer, J.G., Bacterial phospholipases and their role in virulence. Trends Microbiol. 5, Williamson, R., Resistance of Clostridium perfringens to beta-lactam antibiotics mediated by a decreased affinity of a single essential penicillin-binding protein. J. Gen. Microbiol. 129,

128 ANEXO 5. DOCUMENTOS DE CONFORMIDAD DE LAS EMPRESAS (0 DE OTRA ENTIDAD SOCIA) DOCUMENTO DE CONFORMIDAD DE EMPRESA (O DE OTRA ENTIDAD SOCIA): GrupoBios (BiosChile). Por la presente, con fecha. 20 de Julio de 2010, la empresa (o entidad socia).grupobios (BiosChile) da fe de su participación en el proyecto FONDEF código D04I1247, titulado 11 CARACTERIZACION A NIVEL MOLECULAR DEL VENENO DE LOXOSCELES LAETA (ARAÑA DE RINCON). OBTENCION DE UN ANTIDOTO ESPECIFICO Y ELABORACION DE UN KIT DIAGNOSTICO PARA DETECCION TEMPRANA DE LA MORDEDURA", presentado por la Universidad de Antofagasta, cuya ejecución ha concluido. l. Los siguientes resultados obtenidos por el proyecto son de particular interés para esta empresa (o entidad socia): l. Resultado 1 KIT RAPIDO DE DETECCION TEMPRANA DE MORDEDURA DE ARAÑA DERINCON Se ha desarrollado un kit de diagnóstico en forma de test inmunocromatográfico basado en la tecnología anticuerpos monoclonales. Este Kit diagnóstico puede ser utilizado por un profesional de la salud, ó por el público en general. No tiene competidores ni sustitutos en el mercado actualmente. No teniendo sustitutos ni competidores, las ventajas son absolutas a favor de nuestro resultado. Pues permitirán obtener los siguientes beneficios: II. Los beneficios son la posibilidad de detectar en forma temprana (a partir de 5 minutos de ocurrida la mordedura), con alta sensibilidad (0,375 microgramos/ml) y específica (sin reacciones cruzadas) la mordedura de la araña del rincón. III. La empresa (o entidad socia) participó en las siguientes actividades de investigación y/o de transferencia tecnológica: l. En el marco del Acuerdo de Participación GrupoBios realizó la producción de dos Anticuerpos monoclonales dirigidos contra las proteínas recombinantes PLP1 y PLP2 ambas Esfingomielinasas D, propias del veneno de Loxosceles laeta 2. En el marco del Acuerdo de Participación GrupoBios realizó el montaje del ensayo de inmunocromatografía (Kit Diagnóstico). IV. Los aportes realizados por la empresa (o entidad socia) al proyecto, fueron: Suma de aportes no incrementales: $ Suma de aportes totales: 1 $ V. El(la) representante de la empresa que participó en el Comité Directivo del

129 Proyecto fue la Dra. Cetna Skorin M. cuya función actual en esta organización es Gerente General GrupoBios (BiosChile). VI. Conclusiones y comentarios respecto de la ejecución del proyecto y de los resultados e impactos obtenidos y por obtenerse El proyecto permitió desarrollar un prototipo de ensayo inmunocromatográfico para la detección del veneno de araña de rincón. Los ensayos de sensibilidad y especificidad realizados hasta la fecha son satisfactorios, sin embargo aún faltan algunas validaciones para su eventual comercialización. El ensayo es rápido, fácil de utilizar y no requiere de equipamiento adicional, lo que permitiría su empleo en centros de atención de urgencia. Vll. Recomendaciones para la(s) institución(es) beneficiaria(s) y para FONDEF Consideramos importante el esfuerzo realizado por la Universidad de Antofagasta, para llegar al término del proyecto con un prototipo de ensayo para la detección del veneno de araña de rincón en un formato simple, comercial y que hasta la fecha cumple las especificaciones. Igualmente se agradece la excelente disposición de Fondef para acceder a las prórrogas solicitadas y que permitieron terminar exitosamente el proyecto. Santiago, Chile 20 de Julio de 2010

130 - ANEXO 5. DOCUMENTOS DE CONFORMIDAD DE LAS EMPRESAS (0 DE OTRA ENTIDAD SOCIA) DOCUMENTO DE CONFORMIDAD DE EMPRESA (O DE OTRA ENTIDAD SOCIA): UAT S.A. Por la presente, con fecha. 20 de Julio de 2010, la empresa (o entidad socia).uat S.A: da fe de su participación en el proyecto FONDEF código D , titulado 'CARACTERIZACION A NIVEL MOLECULAR DEL VENENO DE LOXOSCELES LAETA (ARAÑA DE RINCON). OBTENCION DE UN ANTIDOTO ESPECIFICO Y ELABORACION DE UN KIT DIAGNOSTICO PARA DETECCION TEMPRANA DE LA MORDEDURA', presentado por la Universidad de Antofagasta, cuya ejecución h a concluido. I. Los siguientes resultados obtenidos por el proyecto son de particular interés para esta empresa (o entidad socia): l. Resultado 1 ANTIDOTO CONTRA LA ARAÑA DE RINCON BASADO EN ANTICUERPOS HUMANIZADOS Consiste en un antisuero experimental elaborado en base a anticuerpos monoclonales que permite la neutralización del efecto tóxico del veneno de L. laeta en animales de laboratorio. Pues permitirán obtener los siguientes beneficios: l. Serian anticuerpos monoclonales seleccionados por su acción específica de inactivación sobre los elementos m ás activos y dañinos de la toxina de L. laeta (araña de rincón). Permitirá la confección en un antisuero experimental elaborado en base a anticuerpos monoclonales que permite la neutralización del efecto tóxico del ven eno de L. laeta en animales de laboratorio. Este producto se usaría solamente en función de seguir con el desarrollo a nivel de investigación, sin embargo, ya estando disponibles los Anticuerpos monoclonales (ACM) a partir de los cuales se elabora el antisuero, se requiere un paso adicional que es la humanización de estos ACM para poder utilizarlos en humanos sin riesgo de shock anafiláctico. U. La empresa (o entidad socia) participó en las siguien tes actividades de investigación y/o de transferencia tecnológica: 1.- El establecimiento de P.nsayos inmuno biológicos en el Laboratorio de la Unidad de Parasitología Molecular, que permitieron h acer la caracterización del veneno de L. laeta, identificación de las moléculas más inmunogénicas y las de mayor importancia etiopatogénica en cuadros clínicos de

131 Loxoscelismo y la instauración de la producción de anticuerpos monoclonales. 2.- También apoyo la realización de las pruebas pilotos en conejos que permitieron evaluar la efectividad de los anticuerpos policlonales y monoclonales para inhibir el efecto del veneno de L. laeta. III. Los aportes realizados por la empresa (o entidad socia) al proyecto, fueron: Suma de aportes incrementales: Suma de aportes no incrementales: Suma de aportes totales: 1 $ $ $ IV. El(la) representante de la empresa (u otra entidad socia) que participó en el Comité Directivo del Proyecto fue el Sr. Osvaldo Herreros Romero cuya función actual en esta organización es Gerente General de UATSA. V. Conclusiones y comentarios respecto de la ejecución del proyecto y de los resultados e impactos obtenidos y por obtenerse VI., , El proyecto permitió desarrollar anticuerpos monoclonales (ACM) seleccionados por su acción Específica de-inactivación sobre los elementos más activos y dañinos de la toxina de Loxosceles!aeta (araña de rincón). Permitirá la producción de un antisuero experimental elaborado en base a anticuerpos monoclonales que actúan neutralizando el efecto tóxico del veneno de Loxosceles!aeta en animales de laboratorio. Para su aplicación final a nivel humano se requiere un paso adicional que es la humanización de estos ACM para poder utilizar el antisuero sin riesgo de shock anafiláctico. VII. Recomendaciones para la(s) institución( es) beneficiaria(s) y para FONDEF Consideramos importante el esfuerzo realizado por la Universidad de Antofagasta, con esta iniciativa de la Unidad de Parasitología Molecular a través del financiamiento FONDEF, para realizar ensayos inmunobiológicos que permitieron contribuir a la caracterización del veneno de Loxosceles!aeta, identificación de las moléculas inmunogénicas y las de mayor importancia etiopatogenica en el cuadro clínico de Loxoscelismo y la obtención de anticuerpos monoclonales (ACM), para producir un antisuero y un kit de diagnóstico rápido. La etapa de humanización de los ACM permitirá completar exitosamente esta propuesta, respecto al antisuero. Gerente General UATSA Antofagasta, Chile 20 de Julio del Debe coincidir con la cifra reportada en la sección 2.3. del Infom1e Final del proyecto

132 Resultados del Proyecto El cuadro clínico denominado de Loxocelismo es producido por la mordedura de la araña de rincón (Loxosceles laeta) y es considerado hoy en día un problema de salud pública en Chile y en otros países del continente americano. En Chile se registra un promedio de 230 casos anuales con una alta morbi mortalidad, de hasta 4 casos anuales y un deterioro a la calidad de vida de los afectados, implicando un elevado costo directo para el sistema de salud pública y una pérdida económica neta para el país. Este cuadro patológico, no cuenta actualmente con una terapia preestablecida totalmente efectiva que elimine los síntomas y sus secuelas. Así como tampoco, existe una metodología de laboratorio o ambulatoria, rápida y objetiva para determinar al agente etiológico y causal de la mordedura, dado que al transcurrir el tiempo el veneno actúa rápidamente y las probabilidades de detener su acción son menores. En nuestro proyecto, mediante el uso de las herramientas biotecnológicas como son la; biología molecular, la proteómica y la inmunología, pretendemos desarrollar; a) un antídoto específico de ultima generación y b) un sistema de detección / confirmación temprana para el manejo primario y posterior tratamiento de la mordida de Loxosceles laeta (araña de rincón). De manera adicional, se establecerán los lineamientos iniciales para la identificación de fármacos existentes con acción bloqueadora del mecanismo de acción toxica del veneno que permitan a futuro desarrollar una farmacoterapia especializada. Para ello. nuestro equipo de trabajo planteo y desarrollo los siguientes objetivos específicos: A) Generar la infraestructura tecnológica básica para la elaboración de una anti-toxina de última generación, en base a anticuerpos monoclonales humanizados, capaces de bloquear la acción tóxica del veneno de Loxosceles laeta uno de los principales arácnidos que causa serios problemas de morbimortalidad en nuestro país y en otros países del continente americano. B) Empleando la misma base tecnológica, obtener los anticuerpos monoclonales que posibilitan generar un Kit diagnóstico rápido, que detecte en forma precoz, en las personas afectadas, la presencia de componentes moleculares de la toxina del arácnido en los tejidos cercanos al sitio de la mordedura, permitiendo así el inicio de un tratamiento específico y de aplicación inmediata para el Loxoscelismo.

133 C) En una línea paralela de investigación, planteada como un desarrollo de bases preliminares, se investigará una vía complementaria (fármacos y productos naturales) al tratamiento del loxoscelismo con antídoto, especialmente orientada hacia las mordeduras detectadas tardíamente en las cuales el veneno desencadena procesos metabólicos propios del sistema inmune que se asocian con los cuadros más graves de loxoscelismo y que pueden ser interrumpidos in vitro con diversos agentes que permitirían, a futuro, desarrollar una terapia farmacológica. Además, es importante, del punto de vista productivo y comercial, recordar y destacar que el Loxoscelismo producido por la mordedura de arañas del Género Loxosceles, no es solo un problema nacional, sino un problema continental. El accidente aracnídico es considerado en Chile, Estados Unidos y Brasil un problema de salud pública. Actualmente, no existe en ningún país del mundo la producción de un antisuero anti veneno de Loxosceles, constituido por anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos específicamente contra los componentes moleculares etiopatogénicos del veneno (Antisuero de última generación). De igual forma, no existe en el mercado nacional ni extranjero, un kit diagnóstico que permita evidenciar, en un paciente, la mordedura por arácnidos del género Loxosceles. Siguiendo las directrices anteriormente mencionadas el Proyecto fue avanzado en todos los aspectos básicos que sustentaron el desarrollo de los productos finales. Captura de Loxosceles laeta y creación de aracnarios. Recolección y captura de Loxosceles laeta: inicialmente se emplearon dos fuentes de arañas 1) Ejemplares adultos de diversos lugares de la ciudad de Antofagasta fueron recolectados y, 2) Se emplearon las arañas disponibles en el aracnario del Instituto de Salud Pública (ISP) las cuales fueron capturadas en la región metropolitana. Las arañas capturadas, fueron separadas en frascos plásticos individuales (Fig.1), fueron identificadas taxonómicamente bajo lupa estereoscópica, en base a sus características fenotípicas; de color pardo, con el abdomen más oscuro que el resto del cuerpo y sus extremidades. Presenta tres pares de ojos dispuestos en pares, un par en el lado anterior del

134 cefalotórax y dos laterales formando un triangulo. Además, en el dorso del cefalotórax se le observa una zona más oscura a modo de un diseño que asemeja un violín con el mango dirigido hacia el abdomen, su cuerpo mide mm de largo y mm con las patas extendidas (Fig. 2). También, fueron separadas por sexo, el macho es más pequeño que la hembra, presenta el abdomen más fino y alargado, en los pedí-palpos se observa la presencia de espermateca, la hembra es mas grande que el macho y presenta un abdomen mas desarrollado, globoso (Fig. 3). Figura 1.-Arañas, Loxosceles laeta, capturadas Figura 2.- Características taxonómicas de L. laeta; hembra, disposición de los ojos y mancha en forma de violín invertido y macho. L. laeta hembra y macho en cajas plasticas donde eran alimentadas y mantenidas.

135 Establecimientos de Aracnarios: tanto en el Laboratorio de la Unidad de Parasitología Molecular de la Universidad de Antofagasta, como en el Laboratorio de Biotecnología e Inmunobiológicos, Departamento de Salud Ambiental del Instituto de Salud Publica de Chile a cargo del Dr. Abel Vasquez, se consolidaron sendos Aracnarios (Fig. 4). Las arañas fueron alimentadas con moscas adultas o bien con larvas de moscas obtenidas por Myasis experimental (Fig 4), el agua esencial para su sobrevida, se les deposita en un algodon (Fig.5). Figura 4.- Las arañas fueron alimentadas con moscas adultas, larvas de moscas o tebos. Figura 5.- Aracnários

136 Desde el punto de vista operativo técnico científico hemos continuado capturando arañas adultas de L. laeta desde la I a la Región Metropolitana, con la finalidad de hacer un estudio que demuestre, en Chile, la coexistencia de otra especie descrita en la literatura, denominada de Loxosceles coquimbo (Tesis de pregrado que esta aun en desarrollo por estudiantes de Licenciatura en Tecnología Médica), es importante señalar aquí que hasta la fecha todos los ejemplares capturados y caracterizados taxonomicamente, mas de 1000 ejemplares, corresponden todos a Loxosceles laeta, al parecer la otra especie descrita no existe, en todos ellos no se observo ninguna diferencia taxonomica, el punto clave era el encontrar. Obtención y caracterización inmunobiologica del veneno de L. laeta. Obtención del veneno Previamente a la obtención del veneno, las arañas fueron mantenidas en ayuno por 30 a 40 días, a fin de incrementar la producción de las toxinas (veneno). Fue considerado evaluar dos protocolos para extraer el veneno, las cuales fueron empleadas en paralelo para establecer diferencias en las características de las toxinas recolectadas por ambos medios. Extracto de glándulas. Una de las alternativas a evaluar fue la obtención del veneno extrayendo las glándulas productoras del veneno, lo cual implica el sacrificio del animal. Las arañas fueron anestesiadas con éter etílico y con pinzas, bajo lupa estereoscópica se le extrajeron, las glándulas del veneno. Las glándulas así extraídas serán colocadas en Buffer fosfato salino (PBS) ph 7,2, adicionándoseles una mezcla de inhibidores de proteasas y manteniendo todo siempre en hielo. Una vez reunidas varias de ellas, fueron maceradas, se

137 centrifugaron a g. por 15 minutos a 4º C. El sobrenadante se almaceno en alícuotas a menos 70º C hasta su utilización (Figuras 7-16). Figuras L.laeta proceso extracción glándulas.

138 Veneno puro obtenido por electroestimulación El modelo de electroestimulación para la obtención del veneno de la araña de los rincones se desarrolló inicialmente en la Unidad de Biotecnología e Inmunobiológicos utilizando como referencias modelos de estimulación eléctrica de arácnidos descritos por Burchel (1969) y Tambourgi y cols., (1981), con algunas modificaciones, pero con el objetivo fundamental de obtener un veneno puro y no permitir la muerte del arácnidos, utilizando un estímulo eléctrico adecuado para que esto no ocurra, el veneno fue recolectado en diferentes partidas o lotes, centrifugados, filtrados, liofilizados y guardados a - 70º C hasta su uso.

139 En nuestras investigaciones, hemos incorporado una nueva modificación en el proceso de electroestimulación, lográndose un veneno más puro, que permite un manejo óptimo para la confección de anticuerpos monoclonales, la modificación corresponde a la aplicación de los electrodos en la base de los quelícero. Esta modificación permite la obtención de un veneno limpio de constituyentes estomacales del arácnido, así el rendimiento del veneno en calidad es mejor. Electroestimulación y obtención de veneno Para la electroestimulación se han utilizado preferentemente hembras, tomando en cuenta su mayor potencial tóxico a causa de la mayor cantidad y concentración proteica de su veneno (da Silva y cols., 2004). Además, las arañas han sido dejadas en ayuno, por al menos tres semanas para ser electroestimuladas, considerando que al permanecer en esta condición la cantidad de veneno en sus glándulas será mayor ( Schenone, 2003). Se probaron diferentes modelos de electroestimulación, finalmente el que resultó ser más adecuado y aplicado a las descripciones realizadas principalmente en Brazil fue la sujeción manual de la araña viva, con el uso de tres pares de guantes de procedimiento en las manos y vestuario adecuado que prevenga contacto con la piel si la araña llegase a escapar. Se procura sólo sujeción de las extremidades del ejemplar (Fig. 2). Figura 2: Manipulación de un ejemplar de L. Laeta vivo.

140 La fuente de poder que entrega el estímulo eléctrico y con la que se han obtenido mejores resultados respecto a la regulación del Voltaje es la fuente de poder Sigma para cámaras de electroforesis (Fig. 3A) y que se programa en low range con 20 Volt. Dos cables conectados a esta fuente de poder y alambre de cobre en sus extremos son los que se colocan directamente en la base de los quelíceros de la araña (Fig.3B) y que permiten por este estímulo eléctrico la eyección de su veneno, el que no alcanza a ser más un microlitro. Este veneno eyectado, de aspecto transparente y viscoso, es recolectado con una micropipeta de 10 microlitos y es resuspendido en 50 µl de PBS 1X en presencia de inhibidores de proteasas dentro de un tubo Eppendorff de 0.6 ml. Siempre se trabaja con hielo en un recipiente, en donde son colocados estos tubos Eppendorff, debido a la característica de termolabilidad del veneno. El veneno es almacenado a -20º C. La fuente de poder que se empleo se muestra en la Figura 3A, mientras que la aplicación de los 20 Volt para la electroestimulación en la base de los quelíceros del arácnido, se muestra en la Figura 3B. Así, el modelo diseñado para obtener veneno por electroestimulación de la araña de los rincones cumple con el objetivo de recolectar un veneno puro impidiendo la muerte del arácnido, sin embargo, un pequeño número de ejemplares muere post electroestimulación siendo la causa la manipulación de la araña.ya que muchas veces pierden extremidades por la sujeción misma, debido a la fragilidad de estas y también debido al tiempo de exposición del Voltaje en sus quelícero, ya que ciertos ejemplares demoran en eyectar veneno muchos simplemente no eyectan veneno, en una relación 1:1 aproximadamente. Figura 3. A: Fuente de poder para cámara de electroforesis. B: Electroestimulación: 20 Volt aplicados en la base de los quelíceros del arácnido.

141 Cuantificación del veneno obtenido Cuantificación de proteínas del veneno mediante Método Bradford (1976). Para la cuantificación de las proteínas del veneno, la metodología utilizada fue la descrita en el catálogo de Bio Rad Protein Assay nº A-6393 (59) Se realizó una curva de calibración de 5 puntos con una solución patrón de BSA 1,4 mg/ml se agregó a cada tubo en la cantidad de: 12 µl, 20 µl, 32 µl, 40 µl 50 µl. A cada tubo se agregó agua suficiente hasta completar un volumen de 60 ul. A continuación se añadieron 3 ml de reactivo de Bradford Bio Rad diluido 1:5 a cada tubo los que se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se leyó absorbancia a 595 nm. TUBO Vol. µl BSA C.Prot. (µg/µl ) Absorv. Prom ,8 0, , ,8 0, , ,063 1,4 1,2 1 0,8 0,6 y = 0,0122x + 0,2291 R 2 = 0,995 Serie1 Lineal (Serie1) 0,4 0, Muestra Dilución Abs µg/µl µl Totales Total prot µg V.E 1/5 0,413 1, ,58 La concentración de proteínas del veneno obtenido por electroestimulación es de 1,5 a 3,5 µg/µl con un total de proteínas de 492,5 µg a 1342,30 contenidos en 325 µl totales. Fraccionamiento de las proteínas constituyentes del veneno de L. laeta.

142 Las fracciones constituyentes del veneno, proteínas u otros componentes (glicoconjugados), contenidas en los extractos fueron separados mediante electroforesis en gel de poli-acrilamida en presencia de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS-PAGE), para determinar el número y peso molecular de las diferentes bandas. Las proteínas separadas electroforéticamente, fueron teñidas con Comassie blue. Análisis electroforético de los venenos obtenidos mediante geles de poliacrilamida en presencia de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS-PAGE). SDS-PAGE del veneno electroeluido y de glándula de veneno macerada, que fueron almacenados a -20º C, con el fin de comparar perfil electroforético de ambas muestras (Figura 1) El perfil electroforético del veneno obtenido por electroestimulación muestra un menor número de bandas en relación a la glándula de veneno macerada. Estas bandas son de bajo peso molecular y coinciden con la descripción de las toxinas proteicas constituyentes del veneno, enriquecidas con moléculas de bajo peso molecular, entre los 5 y 40 KDa (Mota y Barbaro, 1995., da Silva y cols., 2004., da Silveira y cols., 2002). Alrededor de los 34 kda se observa una mayor concentración de bandas protéicas, las que corresponderían al grupo de proteinas llamadas Esfingomielinasas D o toxina dermonecrótica (30 35 kda). La muestra de glándula de veneno macerada presenta un mayor número de bandas, puede concluirse que el veneno obtenido por electroestimulación es más puro y, por lo tanto, menos contaminado que el obtenido por maceración de la glándula del veneno.

143 Figura 1: SDS-PAGE 12,5%. Carril 1: éstandar de bajo peso molecular Bio Rad catálogo Carril 2: éstandar de peso molecular BSA Bio Rad catálogo Carril 3: veneno electroestimulado (VE) de L.laeta. Carril 4: Glándula de veneno macerada (VEG) de L. laeta. Preparación de suero anti-veneno (extracto de glándula y/o obtenido por electroestimulación) por metodología clásica para fines de caracterización Inicialmente, para la caracterización inmunológica de los componentes moleculares del veneno, es preciso contar con sueros hiperinmunes obtenidos mediante la inmunización de animales de experimentación. Los anticuerpos anti-loxosceles así obtenidos serán luego purificados o inmuseleccionados. En ratones C3H, el suero hiperinmune antiveneno de L. laeta (extracto de glándula), fue obtenido de acuerdo a estándares de inmunización (Kalapothakis y cols., 2002). En forma breve, antes del inicio de la inmunización de cada animal se recolecto una muestra de sangre para la obtención de suero preinmune (control), cada animal recibió una inoculación inicial de 10 µgr de veneno solubilizado con hidróxido de aluminio. Seguido de 4 inoculaciones adicionales, las cuales fueron aplicadas en intervalos de una semana. Luego

144 los animales fueron sangrados, 1 semana después de la última inoculación, para la obtención del suero hiperinmune anti- L. laeta. En conejos, después de la recolección del suero pre-inmune, cada animal recibió una inyección inicial de 20 µgr de veneno de L. laeta (extracto de glándula), vía intradérmica con hidróxido de aluminio. Luego de dos nuevas inoculaciones de 20 µgr, administradas con dos semanas de intervalo. Un grupo control recibirá solo hidróxido de aluminio bajo las mismas condiciones antes señaladas. Finalmente, muestras de sangre serán recolectadas 1 semana después de la última inoculación, para la obtención del suero anti- L. laeta. Caracterización biológica del veneno obtenido por electroestimulación. Desarrollo de un modelo de evolución clínica de mordedura de L. laeta en conejo. Con el Objetivo de inducir la mordedura directa de un ejemplar de L. Laeta en un conejo Neozelandés de 1,600 g. de peso, se sujeto manualmente un arácnido en el dorso previamente depilado del conejo y se procuró su mordedura en la dermis, hecho que duró unos 40 segundos. Cuatro horas post mordedura era posible observar en el sitio de inoculación del veneno una placa liveloide característica, con evidente eritema e inflamación de la piel. Al día siguiente el animal amaneció muerto y por Rigor Mortis se estimó que esta se produjo unas 10 horas post-mordedura del arácnido. Por medio de la necropsia que se le realizó con posterioridad se pudieron observar las lesiones características que se describen ante un cuadro de Loxoscelismo Cutáneo-Visceral. Se observó congestión del tejido subcutáneo a nivel del sitio de la mordedura (Fig.13A), congestión e inflamación del ganglio más cercano al sitio de la mordedura (Fig.13B), congestión renal leve (Fig.13C), hígado aumentado de tamaño y congestivo (Fig.13D) y vejiga con contenido de color oscuro (Fig. 13E). Las lesiones descritas en la literatura ante un cuadro de Loxoscelismo Cutáneo Visceral coinciden con las observadas en el modelo animal, anemia hemolítica intravascular masiva e insuficiencia renal aguda, con la consecuente hematuria

145 observable en la vejiga, confirman la agudeza de este cuadro y la potencial mortalidad que es capaz de provocar el veneno de la araña de los rincones presente en nuestro país. Figura 13A: Congestión de tejido Subcutáneo. Figura 13B: Congestión de ganglio inguinal. Figura 13C: Leve congestión renal Figura 13D: Congestión leve y aumento de tamaño del hígado.

146 Figura 13E: Vejiga con contenido de color negruzco. Preparación de suero anti-veneno por metodología clásica para fines de caracterización. Suero policlonal de conejo inducido por mordedura directa de la araña de los rincones para identificar componentes protéicos inmunogénicos de este. Inducción y obtención de anticuerpos Anti-veneno de L. Laeta por mordedura directa del arácnido. Se realizó una inmunización de un conejo Neozelandés (Fig. 5A) con un peso inicial de 3,900 gr., cada 7 días el conejo fue mordido directamente por un ejemplar de L. Laeta (Fig.5B), a nivel del músculo bíceps femoral, se alternaba la pierna mordida en cada inmunización, previa depilación de su muslo (Fig. 5C). Figura 5: A) Conejo Neozelandés de 3,900 gr. de peso B) Mordedura de araña de los rincones en la dermis del conejo C) Sitio de la mordedura de la araña del rincones. Inicialmente desde la vena marginal de la oreja se obtuvieron aproximadamente 5 ml de sangre con aguja 21 G, la que fue recolectada en un tubo. La sangre., se dejo en un baño maría a una temperatura de 37º C durante

147 30 minutos. Para obtener el suero, se centrifugó en centrífuga Janetski T5 a 5500 RPM durante 15 minutos. El suero preinmune, así obtenido fue depositado en tubos Eppendorff de 2 ml. y se almacenó a -20º C. Este mismo protocolo de obtención de suero se utilizó con la sangre obtenida en cada inmunización. 1º Inmunización: Un ejemplar adulto hembra de araña de rincón alimentada por última hace 20 dias fue sujetada manualmente y colocada en el muslo del animal. La araña rápidamente mordió al conejo y permaneció apróximadamente unos 30 segundos con sus quelíceros en contacto con la dermis del animal, tiempo en el cual se supuso inoculó el veneno. Lo anterior fue comprobado con la evolución de la lesión del sitio de la mordedura, puesto que 1 hora post-mordedura era posible observar eritema y edema de la zona, 18 horas postmordedura un halo circunscrito de color blanco era evidente, sumado a congestión e inflamación de la zona. Cinco días post-mordedura una costra necrótica de unos 2 mm. de diámetro, sin edema ni eritema alrededor era observable (Fig.6). Figura 6: Costra necrótica en el sitio de la mordedura de la araña de los rincones, observable 5 días post-mordedura. 2º Inmunización: La araña utilizada mordió al animal durante un tiempo aproximado de 40 seg. Ella tenia un ayuno de mas de 30 dias. Un halo

148 violaceo, parecido al de la primera inmunización (placa liveloide) se observó 24 hrs. post inmunización rodeando el sitio de la mordedura, lugar donde se observa una mácula oscura. Cinco días post-mordedura un anillo necrótico ocupó el lugar de la mordedura y hacia la región caudal se observó inflamación evidente, con una reacción cutánea más severa que la desencadenada en la primera inmunización (Fig. 7) Figura 7: Lesión dermonecrótica en el conejo observable 5 días postmordedura de la araña de los rincones. 3º Inmunización: El conejo pesó 4,200 gr. Las lesiones de las dos anteriores mordeduras permanecieron en forma de una pequeña costra. Esta vez se realizaron 4 intentos para que una araña mordiera al animal, habían sido alimentadas por última vez hace 40 dias. Las lesiones en el sitio de la mordedura fueron similares a las descritas anteriormente, pero en esta ocasión la dermis presentó edema con endurecimiento de los tejidos comprometidos en un área aproximada de 4 cm., que aún era evidente 7 días post-mordedura (Fig.10).

149 Figura 10: Lesión 7 días post-mordedura. de la araña de los rincones. Las inmunizaciones periódicas del conejo, así realizadas permitieron observar un cuadro de Loxoscelismo cutáneo y, además, cumplir con el objetivo de obtener un suero Anti veneno de L. laeta - que con posterioridad fue evaluado Se comprobó también que el conejo era capaz de soportar la mordedura del arácnido, sin inducir en el un cuadro sistémico ni provocarle la muerte. Se describe que el conejo es el modelo animal de elección para evaluar lesiones provocadas por el veneno de L. laeta debido a la habilidad creciente del animal para detoxificar y eliminar el veneno (Schenone y cols., 1970). Así, se obtuvo un suero pre-inmune del conejo y se realizó la primera inmunización por mordedura directa del arácnido. Titulación del Suero Anti-veneno de L. Laeta. Con el objetivo de titular suero del conejo, obtenido 15 días post inmunización por mordedura directa. En le animal se realizó el sangrado A Blanco, para ello se utilizó el siguiente protocolo de anestesia; Ketamina 10%: 1,6 ml y Acepromazina 1%: 1,2 ml. La sangre se obtuvo mediante punción cardíaca. El conejo murió durante el procedimiento, hecho que se corroboró por la cianosis de sus mucosas, ausencia de respiración y de latidos cardiacos a la auscultación. Análisis mediante ELISA La placa de ELISA fue activada con 1 µg de proteína de veneno obtenido por electroestimulación en PBS 1X / BSA 5% durante 1 hora a 37º C y luego durante toda la noche a 4º C. Un lavado con PBS 1X/ Tween 0,05% fue realizado antes de bloquear la placa con 400 ul de PBS 1X / BSA 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó un nuevo lavado y se adiciono el

150 suero policlonal de conejo con una primera dilución de 1/20 para ir aumentado hasta llegar a una dilución de 1/1280, completando un total de 8 diluciones. La placa se incubó durante 1 hora a 37º C. Seis lavados se realizaron posterior a la incubación y se preparó el anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina anti IgG de conejo marca SIGMA diluído 1/1000, el que fue colocado en cada posillo e incubado por 1 hora a 37º C. Seis lavados fueron realizados antes del revelado con 100 ul de sustrato de 0,01 g. de PNPP en 5 ml de buffer Carbonato/Bicarbonato y 5 ul de MgCl2 en cada posillo. La reacción fue detenida con 50 ul de NaOH 3 M y se leyó la absorbancia a 405 nm A 0,015 0,143 B 0,038 0,149 C 0,263 0,178 0,155 0,131 0,121 0,102 0,09 0,071 D 0,269 0,17 0,154 0,139 0,128 0,102 0,089 0,074 SIN AC SIN AG Controles DILUCIÓN PROMEDIO 10 0, , , , , , , ,0725 TITULACION SUERO POLICLONAL EN CONEJO ANTI-VENENO DE ARAÑA DE LOS RINCONES 0,3 ABS 405 nm 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 y = -0,0334Ln(x) + 0,2977 R 2 = 0, DILUCION DEL SUERO

151 El título de Anticuerpos del suero policlonal Anti- veneno de L. Laeta obtenido por inmunización mediante mordedura directa fue de 1/80, correspondiendo a la mitad del promedio mayor de las 8 diluciones. Esta dilución fue empleada para realizar Western Blot. Determinación de anticuerpos anti-l..laeta por Westem blot. Datos experimentales del análisis del suero policlonal de conejo mediante Western Blot. Análisis preliminar del suero policlonal mediante Western Blot, para identificar componentes proteicos inmunogénicos, las proteínas del veneno (extracto de glándulas) fueron separadas mediante SDS-PAGE y electro transferidas para un soporte de nitrocelulosa. en cámara de electrotransferencia y con buffer de transferencia, a 200 mâ. Luego la membrana de nitrocelulosa fue bloqueada con PBS 1X/BSA 5% durante toda la noche a 4º C. Luego de bloqueada la membrana, se realizaron 3 lavados cada 10 minutos en agitación con PBS 1X/Tween 0,05%. El anticuerpo policlonal de conejo obtenido 7 días posteriores a la última inmunización fue incubado en la membrana de nitrocelulosa con 10 ml de PBS 1X/BSA 5% durante 2 horas a temperatura ambiente en una dilución 1/20. Tres lavados iguales a los hechos post bloqueo se realizaron y el anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina anti IgG de conejo marca SIGMA fue incubado en 10 ml de PBS 1X/BSA 5% durante 1 hora a 37º C.en una dilución 1/1000 Tres nuevos lavados se realizaron y se procedió al revelado incubando en oscuridad con solución BCIP/NBT. La reacción fue detenida con agua destilada. Así, en el Laboratorio del Instituto de Salud Publica (ISP), se realizó en conejos Neozelandeses una inmunización inducida por inoculación directa del veneno mediante la mordedura de L. laeta, simulando el accidente en el humano. Se observo un fuerte reconocimiento de componentes proteicos altamente inmunogénicos en el suero Anti- veneno de L. laeta obtenido por mordedura directa del arácnido.

152 Figura 11.- A) SDS-PAGE 12,5%. Carril 1 estándar de peso molecular Invitrogen catálogo Carril 2 veneno electroestimulado de L. laeta. B) Western blot. Carril 1 estándar de peso molecular pre-teñido Invitrogen catálogo Carril 2 proteínas de veneno electrodiluido de L. laeta reconocido por suero policlonal inducido en conejo con mordeduras de L. laeta. Se demostró que el sistema inmune del animal reconoce exactamente las mismas moléculas inmunogénicas observadas en inmunización con veneno electro estimulado y/o veneno de glándulas (Fig. 12). Siendo siempre, en ensayos de Western blot, las bandas entre kda las mas inmunoreactivas, en consecuencia las con mayor poder inmunogénico (Fig.11A y B). De forma similar a lo descrito anteriormente, la caracterización inmunobiológica del veneno puro, obtenido por electroestimulación a evidenciado que las bandas mayoritarias y altamente inmunogénicas, se encuentran en el rango de 32 a 35 kda, patrón de migración electroforético de las Esfingomielinasas D.

153 Figura 12.- A) SDS-PAGE 12,5%. Carril 1 estándar de peso molecular Invitrogen catálogo Carril 2 veneno electroestimulado de L. laeta y carril 3 veneno de glandula. B) Western blot. Carril 2 veneno electroestimulado de L. laeta y carril 3 veneno de glandula de L. laeta reconocido por suero policlonal inducido en conejo por mordeduras de L. laeta. Clonaje y caracterización molecular de genes que codifican para diferentes isoformas de PLD (Esfingomielinasa D), principal componente con acción tóxica del veneno de L. laeta (araña de rincón). Clonaje molecular. Se realizó el clonaje molecular de los genes que codifiquen para Esfingomielinasa y para ello empleamos la tecnología del DNA recombinante. Mediante la amplificación por RT/PCR y el tamizaje de una genoteca de cdna. Varios clones fueron aislados a partir del tamizaje, ellos fueron secuenciados y sus deducidas secuencias de aminoácidos, fueron analizadas por BLASTp. Así, 3 genes que codifican para 3 isoformas diferentes de esfingomielinasa D han sido clonados, denominadas de Rec1(PDL1), Rec2(PDL2) y Rec3(PDL3). Posteriormente, los insertos de los respectivos clones, fueron introducidos en vectores de expresión, con la finalidad de obtener las diferentes proteínas en cantidades apropiadas para realizar análisis inmunobiológicos y para la posterior confección de anticuerpos monoclonales. Como sistema de expresión se empleo la fusión con el gen que codifica para glutationa-s-transferasa (GST) y para ello se eligió el vector pgex λ1t. Los insertos fueron colocados en fase de lectura abierta ( ORF ) con GST, la

154 construcción fue verificada por secuenciamiento. Para la obtención de las diferentes proteínas recombinantes se procedió a recuperarlas por elusión del gel de SDS-PAGE. Las proteínas recombinantes fusionadas a GST así obtenidas, se emplearon para la inmunización y obtención de anticuerpos policlonales en ratones Balb c. Los anticuerpos policlonales contra las proteínas recombinante Rec1(PDL1) y Rec2(PDL2), reconoce fuertemente las proteínas del veneno en el rango de 32 a 35 kda es decir reconoce las diferentes isoformas de Esfingomielinasa D. Estos sueros policlonales son capaz de inhibir la acción tóxica del veneno de L. laeta, disminuyendo notoriamente la dermonecrosis. De igual manera el suero policlonal fue capaz de inhibir la actividad hemolítica del veneno, en ensayos de hemólisis in vitro es capas de inhibir la hemólisis en un 61,8 %. De similar manera, el suero policlonal anti veneno obtenido por electro estimulación también presenta la capacidad de inhibir la acción dermonecrótica e in vitro la hemólisis, pero este lo hace con una menor eficiencia. Diseño de Partidores Gen Específico para PLD (esfingomielinasa D) de L. laeta. Mediante un análisis in silico en la base de datos de GenBank del servidor NCBI ( se realizó una búsqueda para secuencias de PLD (anteriormente esfingomielinasa D) de L. laeta, se escogieron cuatro secuencias nucleotidicas L. laeta (clon H17) SMasa I, L. laeta (clon H13) SMasa like, L. laeta SMasa D (Ll1) y L. laeta SMasa D (Ll2). Con ellas se realizó un alineamiento nucleotídico de las secuencias, se determinó la región del gen que correspondía a los extremos terminales 5 y 3 de la fase de lectura abierta (ORF) y se diseñaron los partidores gene específico a partir de las secuencias de SMasa I y SMasa like, por presentar una región 5 mayor que los dos genes restantes (Figura 1). La secuencia de los partidores degenerados fue la siguiente: sentido, 5 -GCGAATTCATGTACG YTCACTTAGCGTTA-3, y antisentido, 5 -CGGAATTCCTYCAGWATTTGTT GAAGCTTMRTA-3. Estos partidores fueron empleados para amplificación por PCR a partir del ADNc sintetizado a su vez de 4 µg de ARNm de las glándulas de veneno de L. laeta.

155 Figura 1. Alineamiento de secuencias nucleotidicas de genes de SMasa D de L. laeta depositados en el GenBank. (A) Alineamiento extremo 5 de genes SMasaD (N Acceso AY093599, AY093600, DQ369999, DQ370000), secuencias escogidas para diseño de partidor degenerado sentido se muestra enmarcado. (B) Alineamiento extremo 3 de genes SMasaD, secuencias escogidas para diseño de partidor degenerado antisentido se muestra enmarcado. PCR de ADNc de Glándulas de Veneno de L. laeta. Empleando los partidores degenerados gen específico diseñados para PLD de L. laeta, se amplificó mediante PCR a partir del ADNc de glándulas de veneno dos diferentes fragmentos, uno correspondiente a 959 pb y el otro de 825 pb (Figura 2), los cuales fueron identificados como LlPLD1 y LlPLD2, respectivamente. Para la reacción de PCR se empleo una enzima Taq polimerasa, con la finalidad de agregar una adenina terminal, para ser utilizado en el clonaje del vector pcr 2.1 TOPO TA.

156 Figura 2. PCR a partir de ADNc de glándulas de veneno de L. laeta. (A) Amplificación de un producto de 959 pb de cdna sintetizado a partir de ARNm de glándulas de veneno de L. laeta. (A1) Marcador de tamaño molecular Lambda DNA digerido con Hind III. (A2) Amplicon LlrPLD1. (B) Amplificación de un producto de 825 pb de PLD2. (B1) Marcador de tamaño molecular Lambda DNA digerido con Hind III. (B2) Amplicon LlrPLD2. Clonaje de PLD de L. laeta. Los fragmentos amplificados por RT/PCR fueron clonados en vector pcr2.1 TOPO, el vector con el inserto ligado fue introducido por transformación en bacterias TOP 10. Los clones recombinantes fueron seleccionados, verificándose la presencia del inserto por ensayos de restricción (Fig. 3 y Fig. 4).

157 Figura 3. Clonaje de LlrPLD1 en vector pcr2.1 TOPO. El inserto de 959 pb amplificado por PCR fue clonado en un vector pcr2.1 TOPO y transformado en células químicamente competentes TOP10, para luego ser crecido en medio LB con 100 µg/ml de ampicilina a 37 C por h, posteriormente los clones escogidos al azar fueron sometidos a digestión enzimática del vector purificado con la enzima de restricción EcoRI. Clones positivos fueron seleccionados para posterior secuenciamiento. M: marcador de tamaño molecular λ DNA digerido con Hind III.

158 Figura 4. Clonaje de LlrPLD2 en vector pcr2.1 TOPO. El inserto de 825 pb amplificado por PCR fue clonado en un vector pcr 2.1 TOPO y transformado en células químicamente competentes TOP10, para luego ser crecido en medio LB con 100 µg/ml de ampicilina a 37 C por h, posteriormente los clones escogidos al azar fueron sometidos a digestión enzimática del vector purificado con la enzima EcoRI. Clones positivos fueron seleccionados para secuenciamiento. M: marcador de tamaño molecular λ DNA digerido con Hind III. Análisis de Secuencias. El análisis de las secuencias para ambos fragmentos, de 959 pb y 825 pb, obtenidos por PCR a partir de ADNc de glándulas de veneno de la araña L. laeta, se realizó utilizando herramientas de nblast. Ambos ADNc codificaban para posibles fosfolipasas D (anteriormente conocidas como SMasas D), con alta identidad de secuencias nucleotidicas con las depositadas en el GenBank para la especie L. laeta. Además, el ADNc de 959 pb presenta un ORF completo de 936 pb con un producto peptídico de 311 aminoácidos, el cual fue denominado como LlrPLD1 (Figura 5A). Mientras que un segundo ADNc de 825 pb presentó un ORF de 812 pb con un producto peptídico de 273 aminoácidos, el cual fue denominado LlrPLD2 (Figura 5B). Deducción teórica del producto peptídico, reveló una proteína madura de 35,169 Da y un pi de 5.45 para LlrPLD1 y de 31,236 Da y un pi de 6.11 para la LlrPLD2. Junto con esto, presencia de péptido señal fue encontrado solamente en la LlrPLD1, residuos aminoacidicos del 1 al 21 (Figura 5A, enmarcado), y ausente en la LlrPLD2, lo que se explica por el menor tamaño de secuencia y pérdida de parte de la región 5 del gen que se traduce en falta de 38 aminoácidos del

159 extremo N-terminal de la proteína madura, que incluye el péptido señal y uno de los residuos de histidina implicados en la actividad catalítica de la enzima. Además, ambas proteínas recombinantes presentan un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos (106 de 311 aa en LlrPLD1 y 93 de 273 aa en LlrPLD2), lo que les da un carácter altamente hidrofóbico. La identidad de secuencia de nucleótidos entre ambos ORF fue de un 88%. Empleando la secuencia proteíca deducida de ambas proteínas recombinantes se realizó una búsqueda en el GenBank utilizando la herramienta pblast, demostrando que ambas recombinantes son homólogas a las secuencias de aminoácidos de PLD (SMasas D) de diferentes especies de Loxosceles (Figura 7). Análisis de alineamiento múltiple de secuencias de los productos proteicos deducidos para ambas recombinantes, reveló que la LlrPLD1 presenta un 81% de identidad de secuencia con la LlrPLD2. De la misma forma, cuando fueron comparados con otras PLD de L. laeta, se demostró que ambos son homólogas a las ya descritas: SMasa I, SMasa like (Fernandes Pedrosa et al., 2002) y la recientemente documentada SMasa II (de Santi Ferrara et al, 2009). Es así como la proteína recombinante LlrPLD1 mostro un 95% de identidad con la SMasa I, un 83% de identidad con SMasa D-like y de un 41% de identidad con la SMasa II, mientras que la proteína recombinante LlrPLD2 mostró un 79%, 93% y 40% de identidad con las SMasa I, SMasa D-like y la SMasa II, respectivamente (Figura 6;Tabla 2). Las secuencias de las proteínas recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2 fueron depositadas en el GenBank con los siguientes números de acceso (GU para LlrPLD1 y GU para LlrPLD2).

160 Figura 5. Secuencias nucleotídicas y aminoacidica deducida de PLDs clonadas a partir de ADNc de glándulas de veneno de L. laeta. (A) ORF completo para LlrPLD1 de 936 pb que codifica para una proteína de 311 aminoácidos con un peso molecular estimado de 35,169 Da y un pi de (B) ORF completo para LlrPLD2 de 812 pb que codifica para una proteína de 273 aminoácidos con un peso molecular estimado de 31,236 Da y un pi de Asterisco representa al codón de término y enmarcado se muestra predicción de péptido señal para la LlrPLD1, el cual no se encontró en la secuencia de LlrPLD2.

161 Figura 6. Análisis de alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos clonadas para el gen PLD de L. laeta. Identidad entre ambos ADNc clonados fue de un 81%. La identidad de los residuos se muestran en negro (100% identidad), gris ( 80% identidad) y blanco ( 50% de identidad). Alineamiento fue realizado empleando el programa ClustalW. Tabla 2. Porcentajes de identidad entre secuencias de PLDs de L. laeta. SMasa I (H17) SMasa like (H13) SMasa D Ll1 SMasa D Ll2 Ll rpld1 95% 83% 95% 84% Ll rpld2 79% 93% 78% 95%

162 Figura 7. Análisis filogenético basado en la secuencia de aminoácidos deducida de ambas proteínas recombinantes, LlrPLD1 y LlrPLD2. Análisis comparativo se realizó con secuencias conocidas del GenBank para diferentes especies de arañas del género Loxosceles (L. laeta, L. intermedia, L. gaucho, L. reclusa, L. boneti y L. arizonica). Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa ClustalW. Expresión en procariontes, modelos bacterianos, cada una las diferentes isoformas de PLD, presentes en el veneno de L. laeta. Subclonaje en Vectores de Expresión. Considerando el alto contenido hidrofóbico de las proteínas recombinantes, se decidió utilizar, como primera alternativa de expresión, un vector de expresión pgex-λ-1t que expresa para una proteína de fusión con la glutatión-s-transferasa (GST), el cual además presenta una trombina situada entre el tag y la proteína recombinante para posterior clivaje y aislamiento de la proteína en condiciones nativas (Figura 11). El tag GST fue escogido puesto que permite obtener buenos niveles de expresión y solubilidad de la proteína. Dificultad para cumplimiento de objetivo: A pesar de variar las condiciones de expresión con diferentes concentraciones de IPTG (1 mm a 0,05 mm), temperatura (37 C a 30 C) y tiempos de inducción (2-4 horas), no se pudo obtener expresión de proteínas solubles en condiciones nativas (soluble). No obstante, las proteínas recombinantes fueron eluidas del gel y una vez comprobada su pureza, ellas fueron empleadas para inmunizar ratones Balb`c o conejos. Los sueros policlonales así obtenidos fueron ensayados por

163 Western blot (Fig....y...), en donde se observa que ellos son capaces de reconocer específicamente a su propia proteína recombinantes así como también las proteínas nativas presentes en el veneno obtenido por electroestimulación. Por otro lado, ambos sueros reconocen a ambas proteínas recombinantes PLD1 y PLD2, hecho que es de suma relevancia para la concreción de los objetivos del proyecto. Para superar el problema de insolubilidad se emplearon diferentes detergentes durante el proceso de lisis celular, entre estos un detergente iónico (Sarcosyl) que solubiliza la proteína y a continuación la adición de un detergente no iónico (Triton-X100), el cual secuestra al primer detergente. De esta forma se pudo solubilizar parte de la proteína recombinante, para posterior purificación. Sin embargo, la proteína de fusión fue incapaz de unirse a la glutatión sefarosa. Con la finalidad de resolver el problema de expresión de ambas proteínas recombinantes, se utilizó un tag de 6 residuos de histidina (6-His) unidos a la proteína SUMO (la cual permite un incremento de la expresión y solubilidad de las proteínas recombinantes), presentes en un vector de expresión pet-sumo (Figura 11).

164 Figura 11. (A) Mapa del vector pet SUMO. (B) Esquema de ambas proteínas de fusión para las recombinantes de PLD de L. laeta. En la Figura 12 se muestra el subclonaje de ambas recombinantes en el vector pet-sumo y selección de los clones al azar. Todos los datos mostrados a continuación fueron realizados utilizando el vector pet-sumo.

165 Figura 12. Subclonaje recombinantes PLD en vector de expresión pet-sumo. Producto de PCR de 959 pb de LlrPLD1 (A), y 825 pb de LlrPLD2 (B), fueron ligados en un vector pet- SUMO mediante el empleo de T4 ligasa. La ligación fue transformada en células BL21 (DE3) e incubadas en medio LB (50 µg/ml kanamicina). La presencia o ausencia de inserto fue analizada por PCR (clones 1-10, escogidos al azar). M: marcador de tamaño molecular 100 bp DNA Ladder (Fermentas). Los clones 3 y 9 fueron escogidos para expresión y purificación de las proteínas recombinantes para, LlrPLD1 y LlrPLD2, respectivamente. Expresión y Purificación de Proteínas Recombinantes. Las proteínas recombinantes expresadas en células E. coli BL21 (DE3) e inducidas con IPTG, fueron purificadas obteniéndose una proteína de 48 kda

166 correspondiente a la LlrPLD1 y otra de 44 kda correspondiente a la LlrPLD2 (Figura 13). El aumento del tamaño de la proteína se debe a que el tag en la región N-terminal de la proteína (6 His + SUMO), incrementan en alrededor de 13 kda el tamaño de la proteína de fusión. Inmunoreactividad cruzada entre ambas proteínas recombinantes fue observada mediante western blot con anticuerpos policlonales contra la LlrPLD1 y LlrPLD2. Como se observa en la Figura 14, ambas recombinantes son reconocidas por anticuerpos anti His, lo que confirma que las proteínas purificadas corresponden a las proteínas de fusión (6 His-SUMO-LlrPLD). Junto con lo anterior, sueros policlonales contra ambas recombinantes presentan reactividad cruzada entre ellas y con el veneno crudo de L. laeta. Figura 13. SDS PAGE 12% de proteínas recombinantes. Extractos de E. coli BL21 (DE3) transformados con el plásmido petsumo-llrpld1 y petsumo-llrpld2 fueron inducidos con 0.05 mm de IPTG por 8 h a 25 C. Muestras sin induc ir fueron recolectadas previamente (1). Las células fueron resuspendidas en buffer de extracción y sonicados, para luego ser recolectados por centrifugación el pellet celular (2) y sobrenadante (3). El sobrenadante fue puesto en contacto con Ni-NTA Agarosa y el flowthrought recuperado (4), la proteína recombinante fue eluida con el buffer de elusión (5). (A) recombinante LlrPLD1 de un peso de 48 kda, indicado por una flecha. (B) recombinante LlrPLD2 de 44 kda indicado por una flecha. Geles fueron teñidos con Coomassie blue. M: marcador de peso molecular.

167 Figura 14. Western Blot de recombinantes PLD. Proteínas recombinantes LlrPLD1, LlrPLD2 y veneno de L. laeta fueron corridos en gel SDS PAGE 12% en condiciones no reductoras y transferidos a una membrana de PVDF. Bloqueados con TBS/Tween 0,1%/leche 5%, e incubados con sueros policlonales contra ambas recombinantes de PLD (1:1.000) y anticuerpo anti His (1:10.000), posteriormente fueron incubados con un segundo anticuerpo anti IgG-HRP (1:40.000). La reacción fue revelada utilizando Kit ECL. Evaluación de las propiedades biológicas y funcionales de las diferentes proteínas recombinantes (rpld) a nivel dermonecrótico y hemolítico. Actividad de fosfolipasa D (esfingomielinasa D). Las proteínas recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2, presentaron actividad diferente sobre el sustrato esfingomielina. Así, como se observa en la Figura 15, LlrPLD1 presentó actividad similar a la observada con el veneno crudo de L. laeta, mientras que LlrPLD2 no presentó actividad de esfingomielinasa, lo cual fue en magnitud de diez veces menor a la actividad presentada por el veneno crudo de L. laeta. Esto se explica por la delección de parte de la región N-terminal de la proteína, que involucra al aminoácido His12, esencial para la actividad catalítica de la enzima.

168 Figura 15. Actividad de fosfolipasa de proteínas recombinantes de L. laeta. Actividad de fosfolipasa del veneno de L. laeta y las recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2 fueron determinadas mediante Amplex Red a 37 C por 1 h y la fluorescen cia medida luego de absorción a 544 nm y emisión a 590 nm. Resultados representan dos experimentos realizados por separado expresados como media ± S.E.M. Actividad hemolítica. En relación a la actividad hemolítica sobre glóbulos rojos humanos, esta se muestra en la Figura 16, en la cual ambas proteínas recombinantes presentaron actividad diferente. Al igual a lo observado con la actividad de esfingomielinasa, la proteína LlrPLD2 mostró escasa actividad hemolítica sobre glóbulos rojos humanos, mientras que LlrPLD1 mostró actividad hemolítica, sin embargo, esta fue en magnitud tres veces menor comparado con el veneno crudo de L. laeta. De esta forma se demuestra la funcionalidad de al menos una de las proteínas recombinantes, la LlrPLD1, junto con una, la LlrPLD2, con escasa o nula actividad funcional, tal como se esperaba por el análisis de secuencia.

169 Figura 16. Actividad hemolítica de las proteínas recombinantes. Glóbulos rojos fueron pre tratados con veneno de L. laeta y las recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2 y evaluados para hemolisis dependiente de complemento, después de incubación a 37 C por 1 h con suero fresco normal (SFN). La absorbancia del sobrenadante fue medida a 415 nm y expresadsa como porcentaje de hemolisis. Resultados representan dos experimentos realizados por separado expresados como media ± S.E.M. Evaluar la capacidad neutralizante de antisueros específicos contra las proteínas recombinantes, así como de sus variantes mutantes en ensayos de dermonecrosis y hemolisis. Neutralización actividad hemolítica del veneno de L. laeta. Sueros policlonales producidos contra las proteínas recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2, fueron evaluados en su capacidad neutralizante contra el efecto hemolítico del veneno puro de L. laeta sobre glóbulos rojos humanos. Como se observa en la Figura 17, tanto los sueros anti-llrpld1 y anti-llrpld2 fueron capaces de neutralizar la actividad hemolítica producida por el veneno de L. laeta ha concentraciones en las cuales el veneno es capaz de producir cerca del 100% de hemolisis (Figura 17A). El porcentaje de neutralización fue de un 55.2% para anti-llrpld1, de un 58.8% para anti-llrpld2 y de un 15.3% para anti-veneno de L. laeta (Figura 17B).

170 Figura 17. Neutralización actividad hemolítica del veneno L. laeta. (A) Actividad hemolítica veneno puro de L. laeta a diferentes concentraciones. (B) Antisueros policlonales contra LlrPLD1 y LlrPLD2, fueron incubados a 37 C por 1 h con el vene no de L. laeta (25 µg/ml) y evaluados en ensayo de hemolisis. Resultados representan media ± S.E.M de duplicado. *** indican significancia estadística para p-valor Neutralización de la actividad dermonecrótica producida por el veneno de L. laeta. Los sueros policlonales producidos contra las proteínas recombinantes LlrPLD1 y LlrPLD2, fueron evaluados en su capacidad neutralizante contra el efecto

171 dermonecrótico del veneno puro de L. laeta. Ambos fueron capaces de disminuir el área de lesión dermonecrótica producida por el veneno de L. laeta en mejor manera comparado con el suero anti veneno de L. laeta (Figura 18), además la presencia de edema y eritema fueron menos pronunciadas en presencia de los antisueros LlrPLD1 y LlrPLD2. Figura 18. Neutralización de la actividad dermonecrótica del veneno de L. laeta. 20 µg de veneno puro de L. laeta fueron incubados a 37 C por 1 hora con antisueros policlonales contra veneno, anti LlrPLD1 y anti LlrPLD2 en dilución 1:100. Áreas de lesión fueron medidas a las 2, 4, 8, 12, 24 y 48 h post inyección. Producción de Anticuerpos Monoclonales contra el veneno total de Loxosceles laeta y contra las proteínas recombinantes. Uno de los objetivos más importantes de esta Proyecto era la producción de Anticuerpos Monoclonales (MAb) contra el veneno total de L. laeta y contra las proteínas recombinantes, los cuales permitirían el desarrollo de los dos

172 productos finales de este proyecto, el desarrollo de un antídoto de última generación en base a anticuerpos monoclonales humanizados y en paralelo a la confección del Kit de diagnóstico rápido de detección temprana del Loxoscelismo. Obtención de anticuerpos monoclonales contra el veneno de L. laeta: Anticuerpos monoclonales contra proteínas del veneno de L. laeta, fueron obtenidos según fue descrito por Koller y Milstein (1975). Ratones Balb/c hembras fueron inmunizadas con 10 µg de proteínas del veneno de L. laeta utilizando Titter Max Gold (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo, USA) como ayudante. Cada ratón recibió tres dosis con intervalos de 10 días. Al final de la tercera inmunización, los ratones fueron sangrados para obtener µl de sangre total y se realizó la evaluación de los títulos mediante western blots. El ratón con mayor título recibió una dosis de refuerzo. Tres días después, el animal fue sacrificado para obtener las células de bazo, las que fueron fusionadas con células P3U1 provenientes de mieloma murino. La fusión se realizó utilizando polietilenglicol (PEG) al 42% precalentado a 37 C y las células fusionadas fueron resuspendidas en RPMIHAT, sembrándose 105 células por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos. A partir del quinto día posterior a la fusión, las placas de 96 pocillos fueron observadas y los pocillos con crecimiento fueron sometidos a screening mediante western blot, utilizando cada sobrenadante como fuente de primer anticuerpo y un conjugado anti-inmunoglobulinas totales marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. Los blots fueron revelados mediante quimioluminescencia (ECL) Los clones productores de anticuerpos que mostraron reactividad contra el veneno de L. laeta, fueron seleccionados, expandidos y sometidos a dos rondas de reclonaje. Western blot: El veneno electroeluido o la esfingomielinasa recombinante de L.laeta fueron diluidas en buffer de Laemli y separados mediante SDS-PAGE utilizando geles al 12%, los cuales fueron transferidos a una membrana de nitrocelulosa por 18 horas a 35 V y 4 oc en constante agitación, utilizando buffer de transferencia

173 (Metanol 20% Glicina 192mM Tris-base 25 mm ph 8,3). Las membranas fueronbloqueadas con TBS-leche al 5 % durante 1 hora en constante agitación.terminado el tiempo de bloqueo se realizaron 2 lavados de 5 min. cada uno en TBS Tween al 0,3 %. Luego de una hora de incubación con el primer anticuerpo (sobrenadante de los frascos de cultivo), el papel fue lavado 6 veces con TBS Tween al 0,3 % y luego incubado por 1 hora con un anticuerpo anti inmunoglobulinas totales conjugado con peroxidasa. El ensayo fue revelado mediante quimioluminescencia (Enhanced Chemiluminescent Assay, ECL,General Electric Health) Electroforesis bidimensional El veneno de L.laeta, fue precipitado con 1 ml de TCA al 20 % en acetona, por 1 hora a 20 o C. Luego, fue centrifugado a x g por 15 min. a 4 o C. El sobrenadante fue descartando y el precipitado fue lavado 4 veces con acetona fría. Después del último lavado, el sobrenadante se descarto y el pellet secado a temperatura ambiente por 10 min. El pellet resultante fue resuspendido en buffer 2D (8 M Urea, 1 M tiourea, 4 % CHAPS, 66 mm DTT y 0,8 % de anfolitos en un rango de ph 3-10, más un cocktail de inhibidores de proteasas) por 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el pellet se solubilizó, se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (BioRad, Hercules, CA). Luego se rehidrataron tiras IPG strips, ph 3-10 NL de 7 cm (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando el sistema Protein IEF Cell (BioRad, Hercules, CA). La rehidratación se realizó de manera activa a 50 V por 12 h, utilizando 100 µg de proteína (cuando los geles fueron teñidos con Comassie) y 50 µg de proteínas (cuando los geles fueron trasferidos para realizar inmunoblots). Luego de la rehidratación de las tiras, se inicio la primera dimensión, ejecutando un programa de 1 h a 100 V, 1 h a 500 V y 4 h a 4000 V, hasta que cada tira recibió un total de V. Luego las tiras fueron sometidas a la segunda dimensión, utilizando un gel de acrilamida al 10 % en un sistema TetraCell (BioRad, Hercules, CA). Se realizaron 4 geles en donde uno fue teñido con Azul de Comassie y los otros 3 geles fueron electro transferidos a membranas de nitrocelulosa como fue descrito anteriormente, con el fin de caracterizar la reactividad de los anticuerpos monoclonales (1B3, 3B9 y 9B9).

174 Isotipaje de anticuerpos Para la determinacion de isotipo de cada anticuerpo, se utilizó el sistema comercial, Mouse Antibody Isotyping Kit (Thermo Scientific), procediendo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para ello, se utilizó una reacción de ELISA, donde se consideró reactivo los valores iguales o superiores a 0.8. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de los procedimientos anteriormente descritos fueron los siguientes; Luego de la fusión, las placas fueron examinadas periódicamente a partir del quinto día. De esta manera, en todos los pocillos en que se detectó crecimiento, los clones fueron repicados a una placa de 24 pocillos, y luego nuevamente repicado una vez que se logro el crecimiento en los pocillos, a un frasco de cultivo de 25 cm 2. Los sobrenadantes fueron colectados y evaluados mediante western blot, para detectar reactividad contra moléculas presentes en el veneno de L.laeta. El análisis inicial, mostró que de un total de 600 pocillos sembrados, se detectaron 118 hibridomas con reactividad contra el veneno estudiado. En base a los patrones de reactividad observada, se seleccionaron 11 hibridomas, los cuales fueron reclonados 3 veces y su reactividad fue evaluada mediante western blot (Figura 1A), observándose que todos los sobrenadantes reconocieron proteínas del veneno de L.laeta en el rango de de 30,5 a 35,7 kda (Figura 1B). Para identificar si algún clon era capaz de reconocer la Esfingomielinasa D recombinante de L.laeta, la proteína recombinante, fusionada a GST, fue desarrollada en geles de poliacrilamida al 12 % y electrotransferidas a papel de nitrocelulosa. Los blots fueron incubados con los distinto sobrenadantes, observándose que 10 de los 11 anticuerpos monoclonales reaccionaron contra esfingomielinasa D recombinante, siendo el clon 6E2 el único clon que no la reconoció (Figura 2). Con el objetivo de identificar el isotipo de cada clon, mediante el Mouse Antibody Isotyping Kit (Thermo scientific) se realizo el isotipaje de los 11 clones observándose que todos los clones correspondían al isotipo IgG1. Debido a los resultados obtenidos mediante western blot e isotipaje, se realizó una nueva selección de clones (1B3, 3B9 y 9B9), a los cuales se les realizo una caracterización mediante western blot de geles bidimensionales para

175 determinar si esos anticuerpos eran capaces de reconocer una única forma de esfingomielinasa D o algunas de sus isoformas. El gel bidimensional fue capaz de separar 52 proteínas del veneno de L.laeta obtenido mediante electroestimulación (Figura 4 A). Por otro lado, los 3 anticuerpos monoclonales fueron capaces de reconocer más de una isoforma de esfingomielinasa D recombinante. El clon 1B3 reconoció 6 isoformas, el 3B9 11 isoformas y el clon 9B9 6 isoformas.. Figura 1. Reactividad de 11 hibridomas producidos contra el veneno de Loxosceles laeta. A) Veneno obtenido por electroestimulación fue desarrollado en un gel de poliacrilamida al 12% y luego electrotransferido a papel de nitrocelulosa. El papel fue cortado en tiras y éstas fueron incubadas con los 11 sobrenadantes de hibridomas. Las tiras fueron lavadas e incubadas con anti inmunoblobulinas totales de ratón marcadas con peroxidasa, utilizadas como segundo anticuerpo. Los blots fueron revelados mediante ECL. B) Peso molecular de las proteínas reconocidas por los distintos clones.

176 Figura 2. Reactividad de los distintos anticuerpos monoclonales contra Esfingomielinasa D recombinante. Esfingomielinasa D recombinante de L.laeta fue desarrollada en un gel de poliacrilamida al 12% y luego electrotransferida a una membrana de nitrocelulosa. El papel fue cortado en tiras y éstas fueron incubadas con los 11 sobrenadantes de hibridomas. Las tiras fueron lavadas e incubadas con anti inmunoblobulinas totales de ratón marcadas con peroxidasa, utilizadas como segundo anticuerpo. Los blots fueron revelados mediante ECL.

177 Figura 3. Determinación del isotipo de los clones seleccionados. El isotipaje se realizo mediante técnica de ELISA utilizando el kit Mouse Antibody Isotyping (Thermo scientific), según las instrucciones del fabricante. Las placas fueron leídas a 405 nm y todos los valores iguales o superiores a 0.8 fueron considerados reactivos.

178 Figura 4. Caracterización mediante geles bidimensionales de proteínas de 3 anticuerpos monoclonales obtenidos contra el veneno de L.laeta. Veneno obtenido mediante electroestimulación fue precipitado con TCA al 20% y fuego el pellet solubilizado con buffer 2D. Las tiras IPG strip de 7 cm con un rango de ph 3-10 NL fueron rehidratadas con 100 µg de proteínas (para el gel teñido con Comassie blue) y 50 µg proteínas (para los geles que fueron transferidos para realizar western blot). Luego. la segunda dimensión fue desarrollada en geles de poliacrilamida al 10% y teñidos con Azul de Coomasie (A) o electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa. El material electrotransferido fue incubado con los anticuerpos monoclonales 1B3 (B), 3B9 (C) y 9B9 (D), lavados e incubados con anticuerpo anti IgG de raton marcado con peroxidasa. Los blots fueron revelados mediante ECL. Producción de anticuerpos monoclonales contra las proteínas recombinantes Esfingomielinasas D, rpld1 y rpld2. Las proteínas recombinantes, rpld1 y rpld2, fueron obtenidas por elución del gel de poliacrilamida, las proteínas presentaban una alta puresa (Fig. ) Anticuerpos monoclonales anti-rpld1. c) Inmunización Se inmunizaron 2 ratones Balb/c de 2 meses de edad con 30 µg de antígeno por dosis en la primera inmunización con Adjuvante de Freund s completo y luego se uso Adjuvante incompleto. La Figura 1 muestra la respuesta inmune secundaria contra el antígeno 15-A, donde es posible observar una baja respuesta del ratón Nº 2 y una adecuada respuesta inmune del ratón Nº 1.

179 Figura 1: Evaluación respuesta inmune c) Fusión Se realizó el procedimiento de fusión somática con el ratón Nº1, ya que presentaba la mejor respuesta inmune. Las células fusionadas fueron sembradas en el medio de selección HAT que permite solo el crecimiento de los hibridomas c) Selección Se realizó la selección de los hibridomas secretores de anticuerpos antiesfingomielinasa D PLD1 mediante ELISA. Se ensayaron 350 clones obteniéndose 1 clon secretor de anticuerpo anti-pld1 (mab-pld1) Anticuerpos monoclonales anti-rpld2. a) Inmunización Se inmunizaron 1 ratón Balb/c y 1 ratón F1 de 2 meses de edad con 20 µg de antígeno por dosis en la primera inmunización con Adjuvante de Freund s completo y luego 30 µg en Adjuvante incompleto. La Figura 2 muestra la respuesta inmune secundaria contra el antígeno PDL2, donde es posible observar una potente respuesta inmune de los 2 ratones.

180 Figura 2: Evaluación respuesta inmune b) Fusión Se realizó el procedimiento de fusión somática con el ratón Nº2, ya que presentaba la mejor respuesta inmune. Las células fusionadas fueron sembradas en el medio de selección HAT el cual permite solo el crecimiento de los hibridomas c) Selección Se realizó la selección de los hibridomas secretores de anticuerpos antiesfingomielinasa D PLD2 mediante ELISA. Se ensayaron 350 clones obteniéndose 1 clon secretor de anticuerpo anti-pld2 (mab-pld2). Reactividad en Western blot de los anticuerpos monoclonales anti proteínas recombinantes PLD, mab-pld1 y mab-pld2, frente a veneno de L. laeta y a las propias proteínas recombinantes. 1. Cuantificación de veneno electroestimulado de Loxosceles laeta. La extracción del veneno de L. laeta, mediante la técnica de electroestimulación, resultó ser eficiente puesto que a todos los especímenes utilizados se les pudo extraer una cantidad óptima de veneno puro sin que estos murieran durante el procedimiento y pudiesen ser utilizados para una posterior extracción. Una vez extraído el veneno, se procedió a la determinación de la concentración por el método de Bradford (BIO-RAD Protein Assay, SIGMA). De esta forma la concentración promedio de veneno de L. laeta obtenido para la realización de los diferentes ensayos fue de 5,08 µg/µl.

181 Tabla 1: Obtención de veneno electroestimulado de Loxosceles laeta. Extracción Concentración de Animales vivos después de la proteínas* (µg/µl) extracción 1 4,89 9/10 2 5,59 10/10 3 4,78 10/10 Promedio 5,08 29/30 *Determinado mediante método de Bradford. 2. Electroforesis en gel de Poliacrilamida de las proteínas constituyentes del veneno de Loxosceles laeta. La integridad del veneno fue evaluada mediante SDS-PAGE como se muestra en la figura 1. Cuyo componente principal presentó proteínas en el rango de kda, correspondientes principalmente a fosfolipasa D.

182 Figura 1: Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bandas del veneno extraído por electroestimulación. M (marcador de peso molecular PageRuler Prestained Protein Ladder, FERMENTAS), VE (veneno electroestimulado).

183 3. Producción de antisueros policlonales polivalentes en conejos. Con la finalidad de producir sueros policlonales polivalentes se utilizó el veneno de L. laeta obtenido mediante electroestimulación como antígeno para la inmunización de conejos. En el cuál se procedió con el protocolo descrito en la Tabla 2. Tabla 2: Protocolo de inmunización en conejos. Antígeno 1 semana 2 semana 3 semana 4 semana Conejo 1 Veneno de L. laeta 20 µg/ml 10 µg/ml 10 µg/ml 10 µg/ml Conejo 2 LlPLD1 20 µg/ml 10 µg/ml 10 µg/ml 10 µg/ml Se utilizó como adyuvante 10 mg de hidróxido de aluminio en cada inmunización.

184 4. Reconocimiento de las proteínas del veneno mediante Western Blot utilizando: anticuerpo monoclonal anti - LlPLD1. y anticuerpo policlonal anti - LlPLD1. Las proteínas del veneno obtenido por electroestimulación fueron adheridas a la membrana de nitrocelulosa, lo que se comprobó revelando con Rojo Ponceau. La adhesión de estos antígenos a la membrana expuestos a una dilución de 1/ de anticuerpo policlonal anti-llpld1 y anticuerpo monoclonal anti-llpld1, evidenció un óptimo reconocimiento de las proteínas del veneno. El anticuerpo policlonal, fue capaz de reconocer todas las proteínas del veneno, a diferencia del anticuerpo monoclonal; que solo reconoció a las bandas correspondientes a los pesos moleculares de entre 27 y 32 kda. Figura N 2 a) b) Figura 2: Reconocimiento de las proteínas del veneno de L. laeta adheridas a la membrana de nitrocelulosa por los anticuerpos policlonal (a) y monoclonal (b) respectivamente mediante Western Blot.

185 5. ELISA indirecto, titulación sueros de conejo anti veneno y anti LlPLD1 El suero obtenido de conejos mediante las inmunizaciones fue titulado para el reconocimiento del veneno de L. laeta en una concentración de 5 µg/ml mediante un ELISA indirecto. Figura 3. Figura 3: ELISA Indirecto. Titulación de sueros de conejo con anticuerpos anti- Ll PLD1 y anti veneno.

186 6. Titulación del anticuerpo monoclonal anti-llpld1 mediante ELISA Indirecto. Se realizó un enzimoinmunoensayo para titular el anticuerpo monoclonal, a una concentración única de veneno de L. laeta. (5 µg/ml por pocillo). Se realizó una curva de concentración con las absorbancias obtenidas y estas evidenciaron que los anticuerpos poseen un alto título para la afinidad a la concentración de veneno. Figura N 4. Figura 4: ELISA Indirecto, titulación anticuerpo monoclonal Ll PLD1.

187 7. Reconocimiento del veneno de L. laeta por el anticuerpo monoclonal anti- LlPLD1 mediante Western Blot. El reconocimiento del veneno se realizó de manera satisfactoria, ya que las bandas obtenidas corresponden a la identificación del anticuerpo monoclonal anti LlPLD1 con las proteínas del veneno de manera específica. Figura 5: Western Blot. Reconocimiento de las proteínas del veneno de L. laeta por el anticuerpo anti. Ll PLD1.

188 8. Análisis de sensibilidad del anticuerpo policlonal anti-llpld1 y monoclonal anti-llpld1 mediante ELISA Indirecto. Se realizó un enzimoinmunoensayo (ELISA) para medir la sensibilidad de los anticuerpos policlonal y monoclonal, para la determinación mínima de concentración de veneno de L. laeta que son capaces de detectar. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que los anticuerpos evaluados (policlonal y monoclonal) tienen una alta afinidad a mínimas concentraciones de proteína del veneno. Resultando como concentración óptima de trabajo 1 µg/ml de veneno de L. laeta, que pueden ser detectados eficientemente por ambos anticuerpos. Figura N 6. Figura 6: Curva de sensibilidad del anticuerpos policlonal y monoclonal a distintas concentraciones de veneno electroestimulado.

189 9. Electroforesis en gel de Poliacrilamida de las proteínas constituyentes de los diferentes venenos para la evaluación de la especificidad de los anticuerpos policlonales α-llpld1 y monoclonales α-llpld1. Para poder determinar la especificidad de los anticuerpos policlonal y monoclonal fue necesario obtener veneno de otras especies ponzoñosas como: Latrodectus mactans (Araña viuda negra), Rhopalurus junceus (Escorpión azul), Apis mellifera (Abeja común), se utilizó como control positivo el veneno de Loxosceles laeta (Araña de rincón) y la proteína recombinante LlPLD1. Todos estos fueron corridos en una electroforesis en gel de poliacrilamida para poder separar sus diferentes constituyentes proteicos. Figura N 7 Figura 7: Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) bandas de distintos venenos. M (marcador de peso molecular PageRuler Prestained Protein Ladder, VRj (Rhopalurus junceus), VLm (Latrodectus mactans), VLl (Loxosceles laeta), LlPLD1 (proteína recombinante) y VAm (Apis mellifera).

190 10. Especificidad de Anticuerpos Policlonal Anti-LlPLD1 y Monoclonal Anti- LlPLD1 mediante Western Blot. Las proteínas del veneno obtenido por electroestimulación fueron adheridas a la membrana de nitrocelulosa, lo que se comprobó revelando con Rojo Ponceau. La adhesión de estos antígenos a la membrana expuestos a una dilución de 1/ de anticuerpo policlonal anti-llpld1 y anticuerpo monoclonal anti-llpld1, evidenció un óptimo reconocimiento de las proteínas del veneno. El anticuerpo policlonal, fue capaz de reconocer variadas proteínas de los distintos venenos, a diferencia del anticuerpo monoclonal; que solo reconoció a las bandas correspondientes a los pesos moleculares de entre 27 y 32 kda. Figura N 8 a) b) Figura 8: Western Blot evidenciando la especificidad de los anticuerpos policlonal (a) y monoclonal (b) respectivamente, frente a distintos venenos: VRj (Rhopalurus junceus), VLm (Latrodectus mactans), VLl (Loxosceles laeta), LlPLD1 (proteína recombinante) y VAm (Apis mellifera).

191 Inmunocromatografía o Prueba Rápida (Kit diagnóstico) La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno a problema, éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse. La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas. La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas. Después de haber sido evaluados los anticuerpos policlonales y monoclonales, GrupoBios envío a una empresa española a confeccionar el Kit inmunocromatografico, posteriormente ya con el Kit en nuestro laboratorio, se procedió a realizar los ensayos de evaluación del Kit.. Evaluación kit Inmunocromatografía Volumen de muestra: Mínimo: 50 µl (5 gotas con micropipeta) Máximo: 100 µl (10 gotas con micropipeta) Lectura de muestra: Mínimo: 5 minutos Máximo: 1 hora Evaluación del tampón de muestra Se evaluaron tres tampones distintos: Tampón 1: Fosfato Buffer Salino, PBS ph 7,5 (NaCl 1,4 M, KCl 27 mm, Na2HPO4 100 mm, KH2PO4 18 mm) SDS 0,1% Inhibidor de proteasas (cocktail, Complete Mini, Roche)

192 Tampón 2: Tris/HCl 50 mm ph 7,5 Azida de sodio 0,1 % Inhibidor de proteasas (cocktail, Complete Mini, Roche) Tampón 3: Tris Buffer Salino,TBS (Tris 25 mm, NaCl 1,4 M, KCl 27 mm) Resultados: El tampón 1 permite ver la banda control en el kit sin alterar la banda de muestra. El tampón 2 genera una reacción falso positivo en el kit, ya que marca tanto la banda control como la banda de muestra. El tampón 3 al igual que el tampón 1, permite ver la banda control sin alterar la banda de muestra. El falso positivo se debe a una pequeña diferencia de ph en la mezcla del tampón 2, por lo cual se analizo el kit a diferentes ph. Puffer ph 4.0 (C6H8O7/NaOH/NaCl) Puffer ph 7.0 (KH2PO4/Na2HPO4) Puffer ph 11

193 Resultados: Con un ph de 4.0 no se logra evidenciar la banda control y tampoco la banda de muestra. Con un ph de 7.0 se logra observar la banda control, pero con una leve reacción falso positivo en la banda de muestra. Con un ph de 11 se logra ver la banda de control y no la banda de muestra. Estos resultados indican que la variación de ph que pueda tener el tampón incide en la reacción que ocurre en el kit. Un ph por debajo de 7.1 puede producir un resultado falso positivo, por lo cual se mantiene el tampón 1 a ph 7.5 como el mas adecuado para obtener las muestras a analizar.

194 SENSIBILIDAD Se evaluó el kit con distintas concentraciones de veneno de Loxosceles laeta, utilizando veneno fresco (congelado a -20 por menos de 15 días) y veneno conservado (congelado a -20 por mas de 15 días). Ya establecido el tampón a utilizar en el procedimiento se procedió a evaluar la sensibilidad del kit.

195 Sensibilidad con veneno conservado de Loxosceles laeta Veneno conservado 50 µg/ml Veneno conservado 25 µg/ml Veneno conservado 12,5 µg/ml Veneno conservado 6,25 µg/ml Veneno conservado 3 µg/ml Veneno conservado 1,5 µg/ml Veneno conservado 0,75 µg/ml Veneno conservado 0,37 µg/ml Sensibilidad con veneno fresco de Loxosceles laeta Veneno fresco 50 µg/ml Veneno fresco 25 µg/ml Veneno fresco 12,5 µg/ml Veneno fresco 6,25 µg/ml Veneno fresco 3 µg/ml Veneno fresco 1,5 µg/ml Veneno fresco 0,75 µg/ml Veneno fresco 0,37 µg/ml

196 Sensibilidad con proteínas recombinantes PLD-1 y PLD-2 Rec. PLD-1 5 µg/ml Rec. PLD-2 5 µg/ml Rec. PLD-1 2,5 µg/ml Rec. PLD-2 2,5 µg/ml Rec. PLD-1 1,25 µg/ml Rec. PLD-2 1,25 µg/ml Rec. PLD-1 0,75 µg/ml Rec. PLD-2 0,75 µg/ml Rec. PLD-1 0,1 µg/ml Rec. PLD-2 0,1 µg/ml Resultados: La electroforesis del gel demuestra que hay una leve diferencia entre las bandas del veneno, las bandas correspondientes al veneno fresco (VE-f) se encuentran levemente más marcadas que las bandas del veneno conservado (VE-c). Para la detección en el kit también se observa una diferencia en la concentración mínima de detección del veneno: Con VE-c el kit puede detectar hasta una concentración de 6,25 µg/ml Con VE-f el kit puede detectar hasta una concentración de 3 µg/ml Con las proteínas recombinantes PLD-1 y PLD-2 el kit logro detectar hasta una concentración de 0,1 µg/ml

197 ESPECIFICIDAD Evaluación frente a veneno de Latrodectus mactans Veneno L. mactans 50 µg/ml Veneno L. mactans 25 µg/ml Veneno L. mactans 12,5 µg/ml Veneno L. mactans 6,25 µg/ml Veneno L. mactans 3 µg/ml Veneno L. mactans 1,5 µg/ml Veneno L. mactans 0,75 µg/ml Veneno L. mactans 0,37 µg/ml

198 Evaluación frente a veneno de Escorpión azul (Rhopalurus junceus) Veneno R. junceus 50 µg/ml ESPECIFICIDAD in vitro Evaluación frente a veneno de Abeja (Apis mellifera) Veneno A. mellifera 50 µg/ml Veneno R. junceus 25 µg/ml Veneno R. junceus 12,5 µg/ml Veneno R. junceus 6,25 µg/ml Veneno R. junceus 3,12 µg/ml Veneno A. mellifera 25 µg/ml Veneno A. mellifera 12,5 µg/ml Veneno A. mellifera 6,25 µg/ml Veneno A. mellifera 3,12 µg/ml Los ensayos de especificidad realizados con el Kit diagnóstico diseñado y montado ppor nuestro proyecto, muestran que este es capas de reconocer solo al veneno de Loxosceles laeta, los otros venenos ensayados no dan reactividad alguna. Ensayos diagnósticos in vivo en animales de experimentación. Con la finalidad de demostrar la utilidad diagnóstica del kit instaurado, en el laboratorio se realizaron ensayos in vivo conejos neozelandeses. en animales de experimentación, Para ello, conejos neozelandeses fueron mordidos por la araña de rincón, la cual estaba en ayuno prolongado, después de 1 hr se comenzó a tomar una muestra de la piel (sitio de la mordedura) con torula embebida en tampón, la torula fue depositada en su respectivo contenedor y posteriormente, de la muestra fue depositada sobre el kit y se procedió a la lectura del ensayo. También se hicieron ensayos en que a los animales se les inoculaba el veneno en la piel, posteriormente se procedía de manera similar a lo anteriormente descrito.

199 DIAGNÓSTICO in vivo Mordedura de Loxosceles laeta en piel de conejo neozelandes (conejo murió a las 24 horas después de la mordedura por loxoscelismo visceral) Piel antes de la mordedura 2 horas después de la mordedura 6 horas después de la mordedura 18 horas después de la mordedura ESPECIFICIDAD in vivo Muestras obtenidas de conejo mordido por Loxosceles laeta Control muestra piel conejo sin Muestra piel de conejo a las 2 horas Muestra piel de conejo a las 6 horas Muestra piel de conejo a las 18 horas

200 DIAGNÓSTICO in vivo Inoculación de veneno de Loxosceles laeta en piel de conejo neozelandes (conejo sobrevivió a la inoculación de 50 µl/ml) Piel antes de la inoculación 2 horas después de la inoculación 6 horas después de la inoculación 18 horas después de la inoculación 24 horas después de la inoculación