ELECTRICIDAD Y MAGNETISMO TRABAJO PRACTICO Nº 10 ELECTROFORESIS

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1 ELECTRICIDAD Y MAGNETISMO TRABAJO PRACTICO Nº 10 ELECTROFORESIS CONTENIDOS Velocidad de migración. Movilidad electroforética. Fundamentos y gráficos. Factores que influyen. Tipos de Electroforesis. Equipamiento y Aplicaciones en análisis genético. OBJETIVOS Describir el fenómeno de electroforesis y las técnicas para producirla Discriminar los factores que influyen en la movilidad electroforética Justificar el uso de un campo eléctrico en el proceso de separación de biomoléculas X.1 FUNDAMENTOS TEORICOS Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo eléctrico. La electroforesis es un método analítico semipreparativo, en el que se separan biomoléculas, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico, fue empleado por primera vez por Tiselius en el año La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos y +), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácidobásicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas. La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e 95

2 inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio. v = q E / f La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la velocidad de migración de un ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula. La movilidad, (u), se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de campo, o u= v / E = q / f como la movilidad depende del coeficiente de fricción, que a su vez es función de ciertos parámetros físicos de las moléculas, el valor de u puede dar información acerca del tamaño y forma de la partícula. La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga, de la molécula (relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación, por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la corrida electroforética. La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el ph del medio y puede ser modificada por la interacción con pequeñas moléculas de iones u otras macromoléculas. De lo anterior se deduce que el ph influye sobre la velocidad de migración de las moléculas. En el punto isoeléctrico de la biomolécula, ph al cual su carga neta es cero, esta no migra. Por debajo del punto isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por encima del punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo. X.1.2 Fundamentos y Gráficos Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta son colocadas en una campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta: + Neg + Pos 96

3 Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; por un lado, la fricción con el solvente dificultará este movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado, las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. fricción atracción + Pos electrostática + ( +) + Movimiento Browniano La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. + frente + Efecto de + la difusión Atracción Electrostática Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos. Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la 97

4 intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos. La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica. Aunque el solvente puede, por si solo, producir una fricción diferente sobre diversas moléculas, su efecto es muy poco apreciable cuando no existe el entramado del gel. X.1.3 Circunstancias que pueden modificar la electroforesis 1. El ph: uno de los problemas más frecuentes vienen dados por la naturaleza del propio electrolito, ya que el más habitual es el NaCl o el TrisHCl, ambos presentan el ion Cl, que al verse sometido a un campo eléctrico se convierte en un radical libre, y dos de estas forman cloro molecular, que combinado con el agua forman HCl, que se disocia enseguida formando más ion cloruro que continua la reacción, y ClOH, que se disocia formando ClO y protones, que junto a los de la disociación del clorhídrico se dirigen al polo negativo aumentando el ph de la disolución, que aunque está tamponada hay que tener cuidado no dañe la muestra. 2. El Borato: uno de los tampones que se suelen utilizar es el del borato, que presenta el inconveniente de no ser del todo inerte. El resultado, por tanto de una electroforesis puede ser el de unas bandas desdobladas correspondientes a una sola proteína, una pura y una modificada por el borato. La forma de averiguar si en efecto se trata de una modificación o si son dos proteínas se asemeja mucho al que ya vimos en centrifugación, y se trata de recoger una las bandas y volverla a correr, de modo que si se vuelven a obtener dos bandas se tratará de una modificación y si sólo aparece una serán dos proteínas distintas. 3. El calentamiento: durante le proceso de electroforesis, el gel se va calentando debido al paso de corriente eléctrica (Efecto Joule). Este proceso puede llegar a desnaturalizar proteínas, de modo que podrían falsear la electroforesis. X.1.4 Tipos de Electroforesis Existen numerosos métodos de electroforesis pero de manera más general pueden clasificarse en: Electroforesis convencional Electroforesis capilar. 98

5 X Electroforesis Convencional La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme. Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse. La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA. Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida. La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de gelificación y propiedades físicoquímicas, lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. La poiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel. Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico. Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica, aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la literatura más actual. Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan general pero no por ello dejan de ser importantes. X Electroforesis Capilar (CE) La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento por el efecto Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en 99

6 un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. lo cual aumenta de manera considerable la disipación del calor generado y por lo tanto permite incrementar el voltaje aplicado. El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias. Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nl), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µl, con una elevada resolución y rapidez. Tipos de electroforesis capilar: La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son también de agarosa y poliacrilamida. Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño. En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros. Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un gradiente de ph estable en una disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de ph se le introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado. La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento. Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. 100

7 X.2 PROCEDIMIENTOS Análisis de la variabilidad genética utilizando electroforesis en gel El objetivo de esta técnica es, mediante un método bioquímico, basado en reacciones enzimáticas poder analizar de forma rápida la variabilidad genética que podemos encontrarnos en una población determinada, hay varios métodos para esto, como por ejemplo mediante el análisis de los fenotipos (hay que tener en cuenta los factores ambientales), mediante el estudio de los cromosomas, o mediante la Clonación y posterior secuenciación de ADN, siento este método muy preciso pero a la vez muy costoso. Como decimos, en esta practica utilizaremos la electroforesis de enzimas en gel, y aplicaremos una afirmación teórica, en la que el producto de un gen, será un polipéptido, es decir una proteína, que en nuestro caso, tendrá actividad enzimática. El método consiste en obtener las enzimas de raíz de bulbo( Muscaris comosum) mediante aplastamiento directo, empaparlas en papel secante, e introducir estos papeles en el gel, posteriormente habrá que someterlo a una electroforesis para lograr la migración de las proteínas que será diferencial dependiendo esta diferencia de la carga eléctrica de la proteína. Una vez esto, procederemos a cortar en láminas de 1 mm del bloque de gel sacando tres que serán las que utilizaremos para el experimento, posteriormente induciremos la reacción enzimática, teñiremos, y valoraremos los resultados. X.3.1 Preparado de la Practica Una vez resumido a grandes rasgos lo que pretendemos con esta practica, tenemos que proceder a la preparación de todos los elementos necesarios para la misma. 1. Preparación del gel de Almidón: Lo utilizamos ya procesado comercialmente, preparamos el tampón y mezclamos con el almidón (en polvo, a una concentración del 1012%) llevamos a hervir y apreciamos en ese momento como se densifica notablemente la muestra. En este momento se aparta del fuego, y se vierte en un molde de 5 mm de altura, dejamos solidificar unas cuantas horas. 2. Obtención de las proteínas: En este caso en particular mediante aplastamiento de las raíces que teníamos en remojo, sacaremos las proteínas que quedaran empapadas en tiritas de papel del tipo secante. 3. Inserción de las proteínas al gel: Se hace una ranura a todo el largo del gel, y se van poniendo los papeles de filtro, uno a continuación de otro, pero respetando una separación, ademas se nace necesario que estos toquen el fondo del molde, y ademas pondremos como frente de control que es el azul de bromofenol, que migrará mas rápido que cualquier proteína. 4. Electroforesis: Se hace con un método discontinuo, utilizando LiOH/Borato 0,02 M. PH 8.1, como tampón de electrodos, Tris/Citratos 0.05M ph 8.3, en lo que se refiere a tampón de gel. cristal en la parte superior y realizar el proceso en frío. Respecto a la las características eléctricas se realiza a 250 V y a 25 ma, una vez establecidas las conexiones y en frío, comienzan a migrar los proteínas. Pasadas unas horas, se procede al corte del gen, ( a un milímetro), logrando de esta manera tres planchas de gel. 101

8 Electrodos (LiOH/Bórico): LiOH gramos Acido Borico gramos Agua desionizada...1 Litro. Gel (Tris/Citrato): TRIS gr. Acido cítrico monohidrato gr. Tampón de electrodos ml. Agua desionizada ml 5. Reacción y tinción: Evidentemente ademas de la reacción enzimatica, tenemos que teñir la muestra para poder verla, aplicando estos protocolos Tinción para la Alcohol deshidrogenasa: Tris CLH 0.1 ph a 8.0, (50 ml) Cl2Mg 0.1 M (1 ml) Etanol absoluto (3 ml) NAD ( 0 Mg) PMS Tinción de GlutamatoOxalacetatoTransaminasa: Solución sustrato (25 ml): * AlfaCetoGlutámico: (36.5 mg) * LAspartico: (125 gr.) * PVP: (0.5 gr) *EDTA (50 mg) * PO4HNa (1.42 g.) * Agua desionizada (50 ml) 102

9 Agua desionizada (25 ml) Fast Blue. Esterasas: Betanaftilacetato 1% en acetona, (3ml) AlfaNaftilacetato, 1% en acetona, (3ml) FastBlueRR (50 mg) FastBlueGBC (50 mg) Tampón fosfato: *PO4H2K (0.92 gr) *PO4HNa (0.48g) Agua desionizada (100 Mililitros) X.3.2 Interpretación de los resultados Una vez que tenemos todo lo referente al laboratorio finalizado, nos queda lo mas importante, ver e interpretar teóricamente lo que vemos, aplicar los conocimientos y razonar los resultados, quizá con una sola frase, podamos resumir perfectamente que podemos interpretar: Si dos proteínas tienen la misma movilidad, será que los alelos son iguales, y en consecuencia el organismo será homizigoto, por el contrario, a movilidad desigual, los alelos serán diferentes aceptando en este caso que el individuo es heterozigoto. En realidad lo que vemos es una serie de puntos mas o menos alineados, en los que dependiendo de estos puntos, podemos fácilmente determinar la homozigosis o no del individuo, combinando muchos individuos, podremos entonces analizar la variabilidad genética de una determinada población, también con este método podremos calcular la frecuencia. Sobre el revelado hemos apreciado individuos homozigotos y heterozigotos, simplemente viendo los puntos que han quedado en la placa, hay que tener cuidado con los artefactos propios del revelado, y tener astucia para reconocerlos y descartarlos. 103