inmuno ensayo enzimático, de cuatro tipos :clorimetrico, luminicente, quimioluminicente y bioluminicente.

Transcripción

1 Metodos inmunologicos Se inventaros desde mas o menos la tercera década del siglo 20 han tenido gran utilidad porque gracias a estos se ha podido ayudar en el diagnostico de una gran cantidad de enfermedades,hoy en dia estos métodos siguen siendo de gran utilidad no solo en el diagnostico de enfermedades infecciosas si no tambien en el diagnostico de las enfermedades no infecciosas como es el caso de las enfermedades entonces se definen los métodos inmunológicos como aquellos en los cuales primero que todo se genera un complejo inmune y este debe de ser detectado utilizando diferentes metodologias q permitan visualizar la formación de ese complejo inmune, cada dia se expanden mas los usos de estos métodos no solo son importantes desde el punto de vista medico clínico humano, clínico animal y de los alimentos, se han utilizado como ayudas diagnosticas para la confirmación de enfermedades infecciosas o no infecciosas por ej podemos detectar Ag, Acs en una muestra, por ejemplo en una muestra tisular, de un tejido se pueden detectar Ags tambien en el suero en el plasma se pueden detectar Ags. la diferencia entre detectar Ags y detectar Acs es bastante grande porque al detectar un Ag nos esta permitiendo (dependiendo de dos factores la sensibilidad y la especificidad de esa prueba de lab) confirmar presencia de enfermedad y la detección de Acs confirmación del titulo de Acs y variación de títulos de Acs en un periodo de tiempo determinado, de todas maneras la presencia de Acs nos esta mostrando que el paciente tuvo o tiene la enfermedad no solo permite detecta tambn permiten cuantificar decir cuanta es la concentración de una determinada molecula de Ac o de Ag que tiene un individuo en un momento determinado, frente a un determinado agente o frente a una enfermedad. los métodos inmunológicos se han clasificado en 2 grupos : Convencionales o clásicos: se empezaron a utilizar en diagnostico de algunas enfermedades infecciosas dentro de estos están los de precipitación, eliminación, método de fijación del complemento, neutralización q se dividen en dos tipos de inhibición de la hemaglutinación e inhibición de la hemolisis, son métodos que son bastante utilizados. Inmunoanalisis o métodos no clásicos Radio inmunoanalisis o inmunoensayo radiométrico inmuno ensayo enzimático, de cuatro tipos :clorimetrico, luminicente, quimioluminicente y bioluminicente. También el inmunoensayo no enzimático luminicente y otros métodos como la inmunofluorecencia, la inmunohistoquimica y el western blot. Primer grupo métodos de, precipitación : se forma un precipitado y para que esto ocurra ( un precipitado es una sustancia que se vuelve insoluble en una solución ) se requiere de un medio liquido para que se produzca la precipitación, los elementos solubles que intervienen en esa reaccion forman el complejo inmune esos reactantes los ags y acs que están solubles se vuelven insolubles al formarse el complejo inmune, estas pruebas se clasifican en : Floculación, inmunoturbidimetria, nefelometría, inmunodifusion doble, inmunodifucion radial

2 Floculación: son microscópicas, se requiere un microscopio de luz para poder visualizar formación de grumos en la reacción microscópica, un ejemplo de una muy utilizada hoy en dia es la VDRL iniciales del laboratorio que las implemento. Esta técnica permite detectar Acs no treponemicos en la enfermedad que se conoce con el nombre de sífilis. Inmunoturbidimetria : cuando se genera reacción Ag Ac se genera un cambio en la transparencia de esa solución, pasa de una solución transparente a una solución con diferentes cambios de turbidez, esa turbidimetria se mide con un aparato llamado fotómetro, este tiene una fuente de luz la cual pasa a travez de un filtro y este filtro escoge una determinada longitud de onda que incide sobre un tubo que tiene esta solución parte de la luz es absorbida y parte es transmitida y esto mide la que es transmitida, el porcentaje de luz transmitida es inversamente proporcional a la cantidad de turbidez, la cantidad de absorción de la luz es directamente proporcional a la turbidez que hay allí como se sabe si es un Ac o un Ag?depende que voy a detectar yo, si detecto un Ac contra toxoplasma aunque no se utiliza para esto, lo que debo tener son concentraciones poco del Ag y en el suero del paciente van a ver los Acs, concentración de Acs proporcional a la turbidez. Nefelometría : muy semejante a la inmunoturbidimetria pero se basa en un efecto llamado Tyndall que se refiere a la capacidad que tienen las partículas suspendidas en el aire de dispersar la luz, entonces lo que se hace es medir el grado de dispersión de la luz, entre mayor sea el grado quiere decir esos complejos inmunológicos son mas grandes, por esto se puede medir el complejo inmune, se utiliza para medir moléculas importantes para el sistema inmune, por ejemplo la proteína c reactiva para cuantificarla, factores del complemento, moléculas de Ac, aquí todas esas moléculas están actuando como Ag, incluso los mismos Acs, por este método puedo medir concentraciones totales de IgM, IgG, IgA o IgE Contra que parte de la molécula de Ac debe estar dirigido ese Ac? La inmunodifusion doble y radial se caracterizan porque se utiliza un medio semisólido que usualmente se forma con moléculas o sustacias químicas como la agarosa, la., la mas utilizada es la agarosa, la diferencia entre la inmunodifusion doble y la inmunodifusion radial es que en la inmunodifusion radial el ag o el ac se disuelve en ese medio semisólido,cuando la agarosa esta liquida allí se coloca el ag o el ac, en cambio en la inmunodifusion doble no se requiere agregar ninguno de los dos reactantes, en ambos métodos se hacen posos, huecos o agujeros y en el caso de la inmuno difusión radial alii se coloca la muestra del paciente el ag o el ac dependiendo de lo que haya colocado en ese medio semisólido, ese suero del paciente va a difundir en ese medio y al ocurrir esto va a provocar una reacción con su contra parte en el medio que forma un halo de precipitación, un halo de color blanquesino alrededor del sitio donde se pudo la muestra del paciente en la doble no se produce un halo en esta se coloca un pozo central y unos pozos periféricos en eel pozo central se agrega ag o ac y en los otros las muestra s de pacientes va a haber una migración simultanea en ese medio semisólido y en el punto de encuentro de ags y asc se genera una línea de precipitación la presencia de esta indica que en la muestra hay lo que yo quiero detectar, la otra diferencia entre estas dos es que en la radial se puede hacer

3 cuantificación porque yo puedo medir el diámetro del halo y compararlo frente a un estándar mientras que en el otro no tengo la manera de medir un diámetro. Por ejemplo estoy detectando por inmunodifusion radial la proteína c reactiva en el medio semisólido debo tener los Acs contra la proteína c reactiva, en los pozos el suero de paciente, al cabo de 48 horas miro la concentración de esta en el suero del paciente, dependiendo del tamaño del halo. La inmunodifusion doble es una técnica que se empleo mucho para mirar la presencia de acs frente a algunos eventos experimentales o frente a unas enfermedades como micoticas sistémicas como por ejemplo la histoplasmosis,la criptococosis, la aspergilosis indican la presencia de esos acs pero no me dice en que consiste. esta se emplea de igual manera como se emplea elementos inmunoturbidigenicos o inmunogenicos para factores de complemento, proteínas de fase aguda. Métodos de aglutinación : utilizan partículas o células, cuando se utilizan células se pretende detectar en células la presencia del ag, tambn existe la posibilidad de hacer absorción de ags a células principalmente a globulos rojos tambn se pueden utilizar partículas que se van a unir a un determinado ag, por ejemplo el Ltex, tambn se utilizo en un tiempo el oro coloidal estos se métodos se clasifican en dos tipos, directos e indirectos. Directos : en estos se detecta la presencia de ag en una determinada células ej las pruebas de hemoclasificacion para detectar si una persona es A, B u O, si es Rh positivo o negativo por la presencia de Ag a, b o d en glóbulos rojos y para eso se requieren Acs antia A, anti B y anti D en laboratorio, entonces debido a la reacción Ag Ac se aglutinan glóbulos rojos y esto se observa macroscópica o microscópicamente. Las pruebas indirectas se han dividido en dos grupos : en los cuales donde no se requiere un anti anticuerpo usualmente en estos con el simple hecho de que el ag se una al ac y se produzca un entrecruzamiento de estas partículas o estas células y se forme un complejo inmune insoluble es suficiente para que se produzca la reacción,, ej para detectar proteína c reactiva, en la sparticulas se coloca el ac contra prot c reactiva y uego se agrega suero del paciente donde se supone hay prot c reactiva y esto provoca una aglutinación directa q es macroscópica Utilizando anti anticuerpo estas se utilizan cuando el ac que se quiere detectar es denominado con ac incompleto es decir q a pesar d éter 2 sitios de unión al ag solo le funciona uno ent para poder producir la aglutinación se requiere un anti ac, una ig g dirigida contra esa ig g humana usualmente se producen en conejos, ratones o ratas a esto se les denomina anti IgG esto es el principio de una técnica que se conoce con el nombre de coombs indirecto esta es una prueba de lab qu e se utiliza para detectar reacciones trasnfucionales y para detectar ant contra el rh o contra el ag d estos acs contra rh se forma por ej en mujeres rh negativas cuyo producto es rh positivo, la evidencia de coombs indirecto positivo indica riesgo bastante alto de q el niño presente eritoblastosis fetal o una enfermedad hemolítica del recién nacido.

4 Métodos de neutralización : estos permiten detectar presencia de Acs frente a determinados microrganismos, porque estos Acs tienen la capacidad de neutralizar la acción de algunas de esas moléculas producidas por los microrganismos como es el caso de las hemaglutininas y las hemolisinas, las hemoglutininas aglutiman globulos rojos y las hemolisinas rompen hemolisan globulos rojos, usualmente este método permite detectar acs neutralizantes estos acs neutralizantes no solo pueden ser IgM si no q tambn pueden ser IgG. PARA HACER LAS PRUEBAS DE HEMOAGLUTINACION SE UTILIZAN GLOBULOS ROJOS DE POLLOS RECIEN NACIDOS esto permite detectar acs frente a muchas enfermedades virales como la influenza, el sarampión y la rubeola. Las pruebas de inhibicion de la hemolisis la mas conocida es la prueba de antiestreptolisina, la estreptolisina es una proteína por la cual el estreptococo productor de la hepatitis estreptocoxica pero tambn productor de secuelas post estreptocoxicas como es el caso de la fiebre reumática o de la poliartritis reumática, por eso este método se utilizaba mucho para detectar acs frente a la estreptomisina q indicaba que el parciente puediera tener anti acs que puedieran reconocer las válvulas cardiacas o reconocierona la membrana sinovial a nivel de las articulaciones. Los métodos de fijación del complemento : se caracterizan porq permiten detectar la presencia de una reacción ag ac utilizando para esto complemento de conejo. el método se caracteriaza por tener 2 estapas, en la primera etapa se coloca en contacto el suero del paciente que es el que tiene los acs en contacto con el ag, aquí pueden ocurrir dos cosas : la primera es que el suero del paciente tenga acs para este ag ent se produce reacción ag ac Lo segundo q puede ocurrir es q haya acs frente el ag y no haya reacción además se agrega complemento si hay reacción ag-ac el complemento se consume pasa de una concentración alta a a una concentración baja debido a que esta reacción ag ac se caracteriza por consumir el complemento. Pero hasta ahí no se ha podido visualizar la reacción para visualizarla se utilizan acs de conejo estérilisados. constituye en tener los acs a los cuales se les han unido acs dirigidos contra los glóbulos rojos estos acs son producidos en animales de experimentación, si el complemento se consume no va a haber conplemento para que se produzca destrucción de globulos rojos por lo tanto no hay hemolisis esto dice que la prueba es positiva si no hay reacción ag-ac el complemento no se consume e indica que la prueba es negativa, es para enfermedades micoticas sistémicas como la histoplasmosis, la criptococosis etc. Inmunofluorecencia : se implemento en 1954, dio origen a los inmunoanalisis, consiste en el uso de un fluorocromo ue es una molecula que tiene la propiedad de que cuando es estimulada por una fuente de luz de longitud de onda corta mas o menos entre los 35º y 450 nm usualmente produce luz a una longitud de onda mayor a la cual es estimulada entre los 520 y los 590 nm, si es estimulada por una luz violeta o ultra violeta puede producir una luz de color verde o de color anaranjado o de color rojo y eso va a depender del tipo de fluorocromo que se utiliza hay 3 q son los mas utilizados : la fluoresceína, la rodamina y la auramina la mas utilizada es la fluoresceína produce una luz de color verde manzana.

5 La inmunofluorecencia requiere un microscopio especial, llamado microscopio de fluorescencia y se caracteriza por tener dos fuentes de luz, una fuente de luz ultra violeta y una fuente de luz visible, la fuente de luz ultravioleta inside sobre la muestra y estimula el fluorocromo este libera la luz viaja por los objeticvos llega al ocular y de esta manera se puede observar. La inmunofluorecencia puede ser de dos tipos la directa y la indirecta. Inmunofluorecencia directa: es una prueba de un solo paso sirve para detectar ags, complejos inmunes presentes en un tejido, por ejemplo si hay depósitos de c3 a nivel del glomérulo renal y para esto requiere un ac contra el c3 marcado con el fluorocromo y asi nos muestra estos complejos inmunes, es de un solo paso porq solo se requiere el tejido fijado a una placa portaobjetos y desps se lle agrega el ac. Inmunofluorcencia indirecta: es una técnica de 2 pasos, permite detectar acs frente a un determinado ag por ejemplo frente a toxoplasma, frente a eimeria, babesia,treponema palidum, consiste en : en placas porta objetos se pone el ag en contacto con el suero del paciente, si el suero del paciente tiene acs estos se pegan al ag, en segunda etapa se elimina el exceso de acs o el exceso de suero del paciente presente en esta reacción se hace un lavado barriendo lo que no se unio y en una tercera etapa se agrega un anti ac una anti IgG o una anti IgM si hay complejos inmunes allí entonces el anti ac se va a pegar y el microscopio va a producir una fluorecencia q va a pertmitri determinar si hay acs contra el microrganismo entonces va a ver una fluorecencia de color verde o de color anaranjado dependiendo de lo que se quiera buscar. Inmunohistoquimica : se caracteriza por que no se requiere de microscopio de fluorecencia, no utiliza fluorocromos en el proceso de marcaje si no que utiliza enzimas la que mas utiliza es la peroxidasa, la detección del complejo inmune formado se hace por una reacción enzimática en la cual hay cambio de color y este cambio de color prenste en el sitio donde esta localizado el ag es un indicio de que la reacción es positiva. solo se utiliza para detección de ag o de complejo inmune en biopsias de diferentes tejidos por ej biopsias renales, hepáticas. Por medio de este método por ejemplo se pueden detectar no solo complejos inmunes si no tambn ags presentes en algunos tumores y la presencia de esos ags pueden servir en el pronostico de ese cáncer. Inmunoanalisis Son métodos de laboratorio que permitieron detectar concentraciones muy bajas de diferentes ags, gracias a estos inmunoanalisis se pueden hacer mediciones de muchas moléculas como citoquinas, de acs dirigidos contra determinados microrganismos, hormonas por este se puede detectar un embarazo 4 o 5 dias depues de la consepcion detecta cantidades muy pequeñas no solo de nanogramos si no tambnie de picogramos picogramos es 10 a la menos 12 gramos, se mejoro la detección de moléculas porque se empezaron a conjugar con otras moléculas como isotopos radiactivos yodo 125 y yodo 131 de esto surgio el radiinmunoensayo.

6 Radioinmunoensayo : para detectar radiación se utiliza un equipo que se llama contador de los rayos gamma por que el yodo 125 y el yodo 131 producen radiación gamma que son fuentes de energía de alta penetración, el gran problema de este es que es altamente contaminante a pesar de que los yodos tienen una vida media muy corta, esa es otra desventaja. Inmunoensayo enzimático : los ags y los acs se les conjugo enzimas como la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina, gracias a estas conjugación de las moléculas con las enzimas, se podría hacer la detección de diferentes maneras una es colorimétrica, cambios de color se forma un color café hay unos metros colimetricos, pruebas rápidas para detectar embarazo. y los fluorometricos que utilizan una reacción enzimática que activa el fluorocromo uya intensidad va a ser proporcional a la cantidad de ag o ac que hay. Quimioluminicente : reacción exergonica genera liberación de enrgia por producción de luz. El ultimo avance de los inmunoensayos es la inmunoluminicencia basada en, la diferencia con la enzimática es el uso de moléculas como bromio, torio. Estas moléculas son estimuladas por una fuente de luz ultravioleta que genera luz fluorecente y esta se encarga de detreminar la presencia de un ag. Inmunocromatografia : pruebas de embarazo, en una superficie solida que es un pael de nitrocelulosa allí se colocan acs o ags en determinados sitios que permiten la captura del ag que se quiera detectar en la muestra. Wenster blot : es un método que permite discriminar la precenca de acs contra diferentes ags de la muestra ya sea de un mismo microo o de diferente microo en una muestra, utiliza papel de nitrocelulosa para poder detectar acs contra diferentes ags el primer paso del western blot es la electroforesis : es una prueba física en la cual se coloca una corriente eléctrica en un medio semisólido, por medio de esto se hace separación de las proteínas por sus diferentes pesos moleculares luego de esto se hace la transferencia de esas proteínas al papel de nitro celulosa utilizando una corriente directa el papel se corta en fragmentos y luego se coloca en contacto con el suero del paciente luego de un tiempo de incubación con agitación constante se lava la tira de nitro celulosa y se coloca en contacto con un anti ac dirigido contra la IgG humana marcado con una enzima usualmente se utiliza la fosfatasa alcalina, se deja encubar un tiempo y se vuelve a lavar, luego se agrega el sustrato que permite que se produzca la reacción enzimática y esta genera un cambio de color en el sitio donde esta esa base puede ser una prueba confirmatoria de algunas enfermedades como en pacientes que se sospeche tengan VIH, primero se hace una prueba rápida, una prueba de Elisa que es una prueba inmunocromatografica si esta da positiva se debe confirmar con una prueba de Elisa normal y si las dos son positivas se debe confirmar con el western blot allí se van a mostrar el patrón de acs que esa persona tiene contra el VIH. La confiabilidad depende de una alta sensibilidad mayor de 98 %y una alta especificidad del 100%

7 Sensibilidad: probabilidad que una prueba de laboratorio especifica para una determinada enfermedad sea positiva en un paciente que tenga esa enfermedad Especificidad: probabilidad que la prueba sea negativa en pacientes que no tengan la enfermedad Puede ser altamente sensible y especifica pero esto además esto va asociado al valor predictivo positivo y negativo Valor predictivo positivo: es la probabilidad de que una persona que dio positiva en una determinada prueba tenga la enfermedad Valor predictivo negativo: es la probabilidad de que una persona con una prueba negativa no tenga la enfermedad El valor predictivo depende en gran medida de la prevalencia de la enfermedad en una determinada región +para poder determinar todos los anteriores se emplea la tabla de contingencia Si la prueba es positiva en pacientes enfermos es un verdadero positivo si es negativa en pacientes enfermos es falso negativo Si la prueba es positiva en personas sanas es un falso positivo y si es negativa en personas sanas es un verdadero negativo La probabilidad de que una prueba sea positiva es los enfermos, la especificidad es la cantidad de personas positivas sobre el total de personas sanas El valor predictivo positivo es el número de verdaderos positivos sobre el total de muestras que dieron positivas por esa prueba Valor predictivo negativo: Verdaderos negativos sobre el total de personas que fueron negativas por esta prueba Una prueba puede tener una muy alta sensibilidad pero un valor predictivo positivo bajo eso quiere decir que si la prueba es positiva la probabilidad de tener la enfermedad es baja.