THE INHIBITORY EFFECT OF COLOSTRUM ON MICROBIOLOGICAL METHODS USED FOR ANTIBIOTIC DETECTION IN EWES MILK

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1 EFECTO DEL CALOSTRO SOBRE LOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE DE OVEJA THE INHIBITORY EFFECT OF COLOSTRUM ON MICROBIOLOGICAL METHODS USED FOR ANTIBIOTIC DETECTION IN EWES MILK BELTRÁN M.C., BORRÁS M., RODRÍGUEZ M., MOLINA M.P. Instituto de Ciencia y Tecnología Animal. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera, s/n Valencia. mbeltran@dca.upv.es RESUMEN El estudio evalúa el efecto de la presencia de calostro sobre la respuesta de diferentes métodos microbiológicos de detección de inhibidores en leche de oveja. Para ello se utiliza leche de oveja libre de sustancias inhibidoras a la que se adicionan cantidades crecientes de tres tipos de calostro (0-12, 24 y 48 horas postparto) procedentes de ovejas no tratadas con antibióticos en el momento del secado. Las muestras se analizaron con tres métodos microbiológicos (BRT AiM, Delvotest MCS y Eclipse 100). La presencia de calostro en la leche de oveja afecta a la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores a concentraciones relativamente elevadas en la leche. La concentración de calostro capaz de provocar la aparición de un 95% de resultados positivos en los métodos ensayados (CMI) depende del tipo de calostro (horas postparto) y del método considerado. En general, esta concentración se incrementa con el tiempo transcurrido desde el parto en todos los métodos utilizados siendo el método BRT AiM el más afectado por la presencia de la secreción calostral en la leche. Palabras clave: calostro, leche de oveja, inhibidores, métodos microbiológicos. SUMMARY The aim of this study is to analyse the effect that the presence of colostrum has on the response of the microbiological methods for the detection of inhibitors in ewes milk. Antibiotic free ewe s milk samples were used, artificially spiked with three types of colostrum (0-12, 24 and 48 hours postpartum) obtained from ewes not treated with antibiotics in the moment of the drying off. The spiked samples were analysed by three microbiological tests (BRT AiM, Delvotest MCS and Eclipse 100). The presence of colostrum in the milk affects the response of the methods at relatively high concentrations in the milk. The minimal inhibitory concentration of colostrum (CMI) in the milk depends on the type of colostrum and considered method. In general, the CMI increases with the time passed from the parturition in all the used methods being the method BRT AiM the most affected by the presence of this secretion in the milk. Key words: colostrum, ewe s milk, inhibitors, microbiological method. 5. CALIDAD DE PRODUCTOS 451

2 Introducción El calostro se considera un alimento imprescindible para el cordero durante las primeras fases de su vida postnatal, por su capacidad de transmitir al recién nacido una inmunidad de tipo pasivo que le permite hacer frente a posibles infecciones procedentes del medio ambiente que le rodea. Sin embargo, su presencia en la leche resulta indeseable y la legislación española, así como la de otros muchos países, exige que la leche destinada al consumo humano no contenga calostros (Real Decreto 2484/1967). Esta restricción se debe, principalmente, al hecho de que el calostro presenta unas características fisicoquímicas muy diferentes a las de la leche, propiamente dicha, que repercuten negativamente sobre su calidad higiénica y su aptitud tecnológica (Tsioulpas y col., 2007). Por otra parte, el incremento de proteínas, especialmente de inmunoglobulinas (IgG), que supone la incorporación de calostro a la leche podría estar relacionado, en determinadas circunstancias, con los resultados falsos positivos que se obtienen con los métodos microbiológicos de detección de antibióticos en leche (Egan y Meaney, 1984). Estos métodos, basados en la inhibición del crecimiento microbiano, pueden verse afectados por varios factores, tanto metodológicos (presencia de conservante, calentamiento previo de las muestras) como relacionados con la propia composición de la leche (Althaus y col., 2003). Así, por ejemplo, elevados recuentos de células somáticas, de ácidos grasos libres y de grasa o proteína, han sido relacionados con un elevado porcentaje de resultados falsos positivos en diversos métodos comerciales de cribado (Andrew, 2001). El calostro presenta, además de un gran contenido en grasa y proteína, grandes cantidades de inhibidores naturales (lactoferrina e inmunoglobulinas) que pueden interferir en el crecimiento del microorganismo del método incrementando el porcentaje de resultados falsos positivos o falsos no conformes. Por tanto, el objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de la presencia de calostro en la leche de oveja sobre la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores en leche más utilizados en España. Materiales y métodos Se utilizó una muestra de leche de mezcla, libre de sustancias inhibidoras, con una composición y calidad higiénica estándar para la leche de oveja. Esta muestra se dividió en 3 alícuotas y a cada una de ellas se adicionaron cantidades crecientes de diferentes tipos de calostro hasta obtener 12 concentraciones de ensayo. Las muestras de calostro utilizadas en el estudio procedían de 12 ovejas de raza Manchega y fueron obtenidas a las 0-12, 24 y 48 horas postparto. La composición química de las muestras de calostro y leche se determinó con un espectrofotómetro de infrarrojos (MilkoScan FT120. Foss. Hillerod, Dinamarca) previamente calibrado para la leche de oveja y el recuento de células somáticas, se calculó según el método fluoro-opto-electrónico con el equipo automático Fossomatic 5000 (Foss. Hillerod, Dinamarca). El ph se midió con un ph-metro comercial (Crison. Mod. Basic Barcelona, España) y la concentración de inmunoglobulinas (IgG) siguiendo el procedimiento descrito por Rodríguez y col. (2009) mediante la utilización de un kit comercial ELISA (Bethyl Laboratories, Inc. Montgomery, USA). Todas las muestras de leche adicionadas de calostro se analizaron con tres métodos microbiológicos: BRT AiM (Analytik in Milch Produktions-und Vertriebs-GmbH. Munich, Alemania), Delvotest MCS (DSM Food Specialties. Delf, Holanda) y Eclipse 100 (Zeu-Inmunotec. Zaragoza, España) siguiendo las indicaciones del fabricante. Para cada una de las concentraciones se ensayaron un total de 16 repeti- 452 XXXV CONGRESO DE LA SEOC VALLADOLID 2010

3 ciones. La lectura de resultados se realizó de manera visual por tres personas entrenadas, clasificando los resultados como negativos ( conformes ) y positivos ( no conformes ). Para el tratamiento estadístico de los datos se aplicó un procedimiento de regresión logística mediante el programa estadístico SAS (2001). A partir de los datos obtenidos se calculó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de calostro, definida como el porcentaje de calostro que provoca la aparición de un 95% de resultados positivos, para cada tipo de calostro y método considerado en el estudio. Resultados y discusión Las características fisicoquímicas de las muestras de calostro y leche utilizadas en el experimento (Tabla 1) son similares a las indicadas por otros autores para el calostro y la leche del ganado ovino (Molina y col., 1995). Tabla 1. Características fisicoquímicas de las muestras de calostro y de leche utilizadas. Muestra ph RCS Principales componentes (%) IgG (x10 3 cel/ml) G P L ST (mg/ml) Calostro 0-12 horas 6, ,86 21,63 1,71 35,2 51,52 Calostro 24 horas 6, ,80 15,36 2,52 29,68 39,43 Calostro 48 horas 6, ,95 8,06 4,12 22,06 10,30 Leche 6, ,11 4,96 5,25 18,32 4,55 RCS= recuento de células somáticas; G= grasa, P= proteína; L= lactosa; IgG= inmunoglobulina G. En la Tabla 2 se presentan las frecuencias de resultados positivos obtenidos con los tres tipos de calostro (0-12, 24 y 48 horas postparto) en los distintos métodos microbiológicos de control. Como se puede observar, con concentraciones del 5%, 12,5% y 22,5% de calostro en la leche, se obtienen un 37,5%, 25% y 6,3% de resultados positivos para los métodos BRT AiM, Delvotest MCS y Eclipse 100, respectivamente. 5. CALIDAD DE PRODUCTOS 453

4 Tabla 2. Frecuencia de resultados positivos según la concentración y el tipo de calostro añadido. Método analítico BRT AiM Delvotest MCS Edad Concentración calostro (%) calostro 0 1 2,5 5 7, , horas ,5 37,5 56, horas ,3 43, horas horas Concentración calostro (%) 0 2, , , horas , , Eclipse horas Cuando se adiciona a la leche calostro de 24 horas se observa que son necesarias mayores concentraciones para provocar la aparición de un resultado positivo en todos los métodos utilizados (BRT AiM=10%, Delvotest MCS= 15% y Eclipse 100=30%) siendo nuevamente el método BRT AiM el más afectado por la presencia de esta secreción en la leche. Sin embargo con el calostro de 48 horas, no se observan interferencias con ninguno de los métodos utilizados, hasta una concentración del 50%, ya que los resultados obtenidos fueros negativos para todas las concentraciones de ensayo en todos los métodos de control. Estos resultados podrían estar relacionados con el marcado descenso de la concentración de IgG en el calostro ovino que se produce en las primeras 48 horas después el parto (Raynal-Lujtac y col., 2005) y que explicarían la normalización de los resultados analíticos transcurrido este tiempo. En la Tabla 3 se presentan las ecuaciones de predicción obtenidas a partir del modelo de regresión logística que en todos los casos, presentan elevados coeficientes de concordancia (>91%). A partir de estas ecuaciones se calculó la CMI de calostro para cada uno de los métodos y tipo de calostro utilizado que, como puede observarse, depende del tipo de calostro y del método considerado. En general, se incrementa a medida que aumenta el tiempo transcurrido tras el parto en todos los métodos utilizados siendo el BRT AiM el más afectado por la presencia de secreción calostral en la leche, al presentar la CMI más baja en todos los momentos considerados. 454 XXXV CONGRESO DE LA SEOC VALLADOLID 2010

5 Tabla 3. Ecuación de regresión y Concentración mínima inhibitora (CMI) de calostro. Método L=Logit [P]=b 0 +b 01 [T 1 ]+b 02 [T 2 ]+b 2 [Cal] C CMI (%) (%) 12 h 24 h 48 h BRT AiM L=-5,1049-2,5217[T 1 ]-42,1017[T 2 ]+0,6382 [Calostro] 91,06 12,61 16,56 78,58 Delvotest L=-7,9546-1,5359[T 1 ]-35,0601[T 2 ]+0,5276[Calostro] 91,28 20,66 23,57 87,11 Eclipse L=-29,4168-4,6043[T 1 ]-43,6274[T 2 ]+1,1344[Calostro] 93,79 28,53 32,58 96,98 L= ln (probabilidad de resultado (+)/1-probabilidad resultado (+)); Tipo calostro: Calostro 12 h T 1 =0 y T 2 =0; Calostro 24 h T 1 =1 y T 2 =0; Calostro 48 h T 1 =0 y T 2 =1; C: coeficiente de concordancia porcentual Conclusiones La presencia de calostro en la leche de oveja puede interferir en la respuesta de los métodos microbiológicos de detección de inhibidores aunque su efecto depende del tipo de calostro (horas postparto) y del método considerado. En general, estas interferencias se presentan a concentraciones relativamente elevadas en la leche de oveja (5-25%) especialmente con el calostro más próximo al parto (0-12 horas postparto). Transcurridas 48 horas postparto, son necesarias concentraciones muy elevadas de calostro en la leche (>50%) para provocar la aparición de un resultado positivo en los métodos microbiológicos de con- Bibliografía ALTHAUS, R.L.; TORRES, A., PERIS, C., BELTRAN, M.C., FERNANDEZ, N. y MOLINA M.P. (2003). Accuracy of BRT and Delvotest microbial inhibition tests as affected by composition of ewes milk. J. Food Prot., 66: ANDREW, S.M. (2001). Effect of composition of colostrum and transition milk from Holstein heifers on specificity rates of antibiotic residue tests. J. Dairy Sci., 84: RODRIGUEZ, C., CASTRO, N., CAPOTE, J., MORALES DE LA NUEZ, A., MORENO INDIAS, I., SANCHEZ MACIAS, D. y ARGÚELLO, A. (2009). Effect of colostrum inmunoglobulin concentration on inmunity in Majorera goat kids. J. Dairy Sci., 92: EGAN, J. y MEANEY, W.J. (1984). The inhibitory effect of mastitis milk and colostrum on test methods used for antibiotic detection. Ir. J. Fd. Sci. Technol., 8: MOLINA, P., MUELAS, R., FERNANDEZ, N., TORRES, A., CAJA, G. y GALLEGO, L. (1995). Change of colostrum composition and factors affecting the level of production and composition of colostrum from dairy ewes. J. Dairy Sci. 78(1): 228 RAYNAL-LJUTOVAC, K., GABORIT, P. y LAURET, A. (2005). The relationship between quality criteria of goat milk, its technological properties and the quality of the final products. Small Rum. Res., 60: TSIOULPAS, A., GRANDINSON, A.S. y LEWIS, M.J. (2007). Changes in physical properties of bovine milk from the colostrum period to early lactation. J. Dairy Sci. 90: CALIDAD DE PRODUCTOS 455