RESOLUCION OIV-OENO

Transcripción

1 RESOLUCION OIV-OENO REVISIÓN DE LA MONOGRAFÍA SOBRE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD Β-GLUCANASA (ß 1-3, ß 1-6) EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS (OIV-OENO ) LA ASAMBLEA GENERAL Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, Teniendo en cuenta los trabajos realizados por el grupo de expertos Especificación de los productos enológicos Considerando la resolución OIV-OENO adoptada por la OIV, DECIDE, por propuesta de la Comisión II Enología, modificar la resolución OIV-OENO publicada en el Codex Enológico Internacional según las siguientes modificaciones señaladas: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ß-GLUCANASA (ß 1-3, ß 1-6) EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS Especificaciones generales Estas actividades enzimáticas están presentes a menudo en las preparaciones enzimáticas complejas. En la degradación de los ß-glucanos de Botrytis cinerea intervienen actividades endo-ß-glucanasas del tipo endo-ß-1,3 y exo-1,6 ß-glucosidasas así como actividades del tipo exo-ß-1,3. Todas estas se denominan comúnmente ß-glucanasas. Dichas preparaciones enzimáticas son capaces de degradar los ß-glucanos en las paredes celulares de las células moribundas de la levadura Saccharomyces, lo que contribuye al proceso conocido por el nombre de élevage de vin sur lie (crianza de vino sobre lías). En este proceso intervienen actividades endo-ß-1,3 y endo-ß-1,6, así como actividades exo-ß- 1,3 y exo-ß-1,6. Salvo indicaciones contrarias, las especificaciones deben ajustarse a la resolución OE- NO relativa a las especificaciones generales para preparaciones enzimáticas que figuran en el Codex Enológico Internacional. 1. ORIGEN Se recomienda consultar el párrafo 5 Fuente de la enzima y medio de fermentación de la monografía general sobre las preparaciones enzimáticas. Las preparaciones enzimáticas que contienen actividades ß-glucanasas se producen por fermentaciones dirigidas, por ejemplo, de Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum (T. reesei) y Penicillium funiculosum. 1

2 2. ÁMBITO DE APLICACIÓN Se recomienda consultar el Código Internacional de las Prácticas Enológicas, OENO 11/04; 12/04; 15/04 y 3/85. Las preparaciones enzimáticas que contienen actividad ß-glucanasa (ß 1-3, ß 1-6) son capaces de hidrolizar los glucanos producidos por Botrytis cinerea (podredumbre noble y gris). Este polisacárido es la causa de muchos problemas durante la clarificación y la filtración del vino. Por lo tanto, dichas beta glucanasas se utilizan específicamente para la clarificación y la filtración de los vinos obtenidos a partir de uvas botritizadas. Los glucanos de las paredes celulares de las levaduras también están hidrolizados por dichas ß- glucanasas. Estas pueden utilizarse para mejorar el procedimiento de crianza sobre lías y la filtrabilidad. 3. FUNDAMENTO El método de análisis se basa en la determinación cuantitativa de la glucosa liberada por la enzima, a partir de una solución patrón de glucano Schizophyllum sp. común como sustrato. 3.1 Definición de las unidades: La unidad β-glucanasa (β-glu-u) se define como la cantidad de azúcares reductores (en forma de glucosa) que se liberan en condiciones de laboratorio con 1 gramo (o 1 mililitro) de enzima por minuto. 3.2 Papel de la enzima Durante el desarrollo de Botrytis cinerea sobre las uvas infectadas, lo que se conoce como podredumbre gris o noble, el hongo excreta un β-1,3-glucano en el que cada tres unidades de glucosa hay una glucosilada en β-1,6. (fig. 1). Este glucano es muy similar al glucano sintetizado por Schizophyllum sp. común. 2

3 3.3 Fundamento de la medida La actividad enzimática libera glucosa que, en medio básico, produce la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. El fenol aumenta la sensibilidad de la reacción. El hidrogenosulfito de sodio fija la coloración. 4. EQUIPO 4.1 Espectrofotómetro y cubetas de 1 cm de paso óptico 4.2 Baño María 40 C, 100 C 4.3 Agitador magnético estándar 4.4 Agitador magnético múltiple, a 300 rpm 4.5 Recipientes de medida (matraces aforados, vasos de precipitados, matraces de Erlenmeyer, etc.) 4.6 Becher 4.7 Micropipetas 4.8 Cronómetro 4.9 Baño de ultrasonidos 3

4 4.10 phmetro 5. REACTIVOS Y PRODUCTOS 5.1 Sustrato Disolución madre de glucano facilitada por la Universidad de Braunschweig 1 y cuya concentración de glucano ha sido determinada por dicha institución. 5.2 Sustancias puras Ácido cítrico (monohidrato) (núm. CAS: ) Hidróxido de sodio (núm. CAS: ) Tartrato de sodio y de potasio (núm. CAS: ) Metabisulfito de sodio Na2S2O5 (núm. CAS: ) Fenol (núm. CAS: ) Glucosa anhidra Ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico (3,5-dinitrosalicílico) (núm. CAS: ) Agua destilada 5.3 Disoluciones Disolución de hidróxido de sodio 1 M En un matraz aforado de 100 ml, disolver 4,0 g de hidróxido de sodio (5.2.2) con agua destilada (5.2.8) y enrasar Disolución tampón de citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l En un matraz aforado de 500 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (5.2.1) con 400 ml de agua destilada. Ajustar el ph a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1) y enrasar con agua destilada (5.2.8) Disolución tampón de citrato (ph 4,0), 0,1 mol/l En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (5.2.1) con 900 ml de agua destilada (5.2.8). Ajustar el ph a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1) y enrasar con agua destilada (5.2.8) Disolución de titulación: reactivo de color ácido dinitrosalicílico (DNS) con fenol. Se prepara a partir de las disoluciones A, B y C siguientes: Disolución A Pesar 154,2 g de tartrato de sodio y de potasio (5.2.3) en un vaso de precipitados de 800 ml y disolver totalmente en 500 ml de agua destilada (5.2.8). Añadir 9,7 g de hidróxido de sodio (5.2.2) Disolución B En un vaso de precipitados de 2000 ml, disolver totalmente 5,3 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico (5.2.7) en 500 ml de agua destilada (5.2.8). Los mejores resultados se obtienen con el baño de ultrasonidos. 1 Prof. Dr. Udo Rau, Universidad Técnica de Braunschweig, Departamento de Bioquímica y Biotecnología. Spielmannstr. 7, Braunschweig - Alemania 4

5 Disolución C En un vaso de precipitados de 100 ml, disolver 4,2 g de fenol (5.2.5) en 50 ml de agua destilada (5.2.8). Añadir 1 g de hidróxido de sodio (5.2.2) y, una vez disuelto totalmente, 4,2 g de bisulfito de sodio (5.2.4) y volver a disolver Disolución de glucosa al 0,3 % Poner 300 mg de glucosa (5.2.6) en un matraz aforado de 100 ml, disolver en agua destilada (5.2.8) y enrasar con esta Reactivo DNS con fenol Mezclar las disoluciones A y C con la B en un vaso de precipitados de 2000 ml y tapar con papel de aluminio. Antes de utilizar, conservar al resguardo de la luz durante al menos 3 días. Trasvasar el reactivo a un frasco de vidrio ámbar. Puede conservarse durante un mes en un lugar oscuro y a una temperatura de entre 15 C y 20 C. Cada vez que se vuelve a preparar un reactivo y antes de cada medición, deberá realizarse hay que realizar un calibrado antes de proceder al análisis de la enzima. Antes de cada uso, se han de añadir 3 ml de glucosa al 0,3 % ( ) a 200 ml del reactivo DNS con fenol Glucano en disolución al 0,1 %, ph 4,0 Pesar la cantidad exacta de disolución madre de glucano (5.1) necesaria para obtener una concentración final de 1 g/l. La disolución final de sustrato debe contener un 50 % de solución tampón de citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (5.3.2). Para obtener 100 ml de disolución a partir de una disolución madre de glucano (5.1) que contenga 5,2 g/l, se toman 19,2 g y se pesan en un vaso de precipitados de 100 ml. Se añaden 50 ml de la solución tampón de citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (5.3.2). Para obtener una mezcla homogénea, se remueve durante al menos 15 minutos. Una vez la disolución esté bien homogeneizada, se ajusta el ph a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (5.3.1). Posteriormente, se transfiere la disolución a un matraz aforado de 100 ml y se enrasar con agua destilada (5.2.8). Las disoluciones madres de glucano se almacenan a temperatura ambiente. Si se utiliza una nueva disolución madre de glucano, se ha de determinar el factor de sustrato (Gf o factor de glucano) mediante la enzima estándar. El factor Gf resulta indispensable para comparar los resultados obtenidos con disoluciones madres distintas. El factor Gf se calcula a partir de una fórmula con los valores medidos teniendo en cuenta que la actividad enzimática estándar es de β-glu U/g (véase el apartado correspondiente al cálculo de la actividad enzimática). 5.4 Preparaciones enzimáticas Disolución enzimática estándar de glucanasa: Se disuelven 0,5 g de la preparación enzimática estándar de glucanasa en 25 ml de la disolución tampón de citrato (ph 4,0; 0,1 mol/l) (5.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (5.2.8) Para el resto de preparaciones enzimáticas: Se toma 1 ml de la preparación enzimática, o 0,5 g si se trata de una preparación sólida en polvo o granulado. Se disuelve en 25 ml de la disolución tampón de citrato (ph 4,0; 0,1 mol/l) (5.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (5.2.8). Si los valores de absorción son demasiado altos o demasiado bajos, deberá realizarse una dilución adecuada. La disolución de enzimas deberá contener un 25 % de disolución tampón de citrato (5.3.3). 5

6 6. PROCEDIMIENTO 6.1 Ensayo en blanco del reactivo En un matraz aforado de 50 ml, añadir 7 ml de reactivo DNS con fenol (5.3.4) a 3 ml de agua destilada (5.2.8) y calentar durante 10 minutos en un baño María en ebullición. Enfriar el matraz durante 5 minutos en hielo. Introducirlo después en el baño María a 20 C y añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 C. 6.2 Curva de calibrado de la glucosa (con reactivo DNS con fenol) Disolver 2,00 g de glucosa (5.2.6) en un matraz aforado de 200 ml y enrasar con agua destilada (5.2.8). A partir de esta disolución, preparar la serie de disoluciones siguiente: N. V solución patrón / glucosa (µg) en la muestra glucosa/100 ml 100 ml (0,5 ml) 1 2 ml 20 mg 100 µg 2 5 ml 50 mg 250 µg 3 10 ml 100 mg 500 µg 4 15 ml 150 mg 750 µg 5 20 ml 200 mg 1000 µg 6 30 ml 300 mg 1500 µg 7 40 ml 400 mg 2000 µg Pipetear 0,5 ml de cada disolución de la serie y ponerlos en matraces aforados de 50 ml. Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (5.3.4) y 2,5 ml de agua destilada (5.2.8). Calentar los matraces durante 10 minutos exactos en un baño María en ebullición. Enfriar durante 5 minutos en un baño de hielo. Introducir los matraces en un baño María a 20 C y añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones a 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene solo reactivo). Representar en una gráfica la cantidad de glucosa en cada disolución de la serie frente a los valores de absorción a 515 nm (fig. 2). La curva de calibrado se debe elaborar el mismo día, antes de cada análisis de la enzima. 6

7 µg Glucosa Calibrado mediante el reactivo DNS de color con fenol Figura Ensayo en blanco de las enzimas Pipetear 0,5 ml de las disoluciones enzimáticas (5.4.1 o 5.4.2) y ponerlos en matraces aforados de 50 ml. Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (5.3.4). Mezclar con esmero y añadir 2,5 ml de la disolución de sustrato (5.3.5). Mezclar bien agitando los matraces con la mano. Calentarlos en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos. Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 C. Añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones a 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene solo reactivo). 6.4 Medida de la actividad de las preparaciones enzimáticas Para cada muestra, disponer 10 ml de sustrato (5.3.5) en un matraz de Erlenmeyer y calentar durante 5 minutos en un baño María a 40 C. Para homogeneizar las muestras se ha de utilizar un agitador magnético múltiple a 300 rpm. Transcurridos 5 minutos, se añaden 2 ml de las disoluciones enzimáticas (5.4.1 o 5.4.2) al primer matraz e inmediatamente después se pone en marcha un cronómetro. A continuación, añadir las disoluciones enzimáticas restantes a los demás matraces espaciando las adiciones 30 segundos. Agitar las muestras a 300 rpm a lo largo de toda la reacción. Tras exactamente 15 minutos, se pipetean 3 ml de la primera mezcla y se transfieren a un matraz aforado de 50 ml con 7 ml de reactivo DNS con fenol (5.3.4). Repetir la operación con todas las mezclas, dejando transcurrir 30 segundos entre cada transferencia. 7

8 Calentar en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos, respetando los 30 segundos de diferencia entre muestra y muestra. Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 C. Añadir agua destilada (5.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene solo reactivo). La diferencia de absorbancia entre el blanco de las enzimas y el valor obtenido tras la reacción debe estar entre 0,1 y 0,6 unidades. Si los valores quedan por encima del intervalo de la curva de calibrado, repetir el experimento realizando diluciones que se adapten a las enzimas. Para cada muestra, proporcionar la medida del blanco de la enzima y los dos valores obtenidos al medir por duplicado la absorbancia tras la reacción. Estos dos valores han de ser cercanos. 7. CÁLCULOS Para calcular la actividad se utiliza la media. La actividad enzimática de una preparación enzimática se calcula con la fórmula siguiente: Actividad β-glu-u por gramo o mililitro = (G 200)/(15 E) 1/Gf Nkat/g o ml = (Actividad β-glu-unidad/g o ml) X (1000/60) G es la cantidad de azúcares reductores liberados, es decir, la media de los azúcares reductores liberados (que se calcula a partir de los dos valores de absorbancia obtenidos tras la reacción) menos el blanco (expresado en microgramos de glucosa a partir de la curva de calibrado). E es la cantidad (en gramos o mililitros) de enzima diluida en 100 ml 200 corresponde al factor de dilución 15 corresponde al tiempo de reacción en minutos Gf es el factor de glucano (a calcular) Ejemplo: Enzima Valor β-glu-u Blanco Glucosa medido E gramo (enzima) (µg) 1 2 miligramo Enzima utilizada 0,621 0,618 0,415 0, β-glucanasa de Penicillium 0,417 0,416 0, funiculosum por o Cálculo del Gf: 1 realizar la medición con el primer sustrato y la enzima estándar (valor 1) 2 realizar la medición con el nuevo sustrato y la enzima estándar (valor 2) Cálculo: valor 1 / valor 2 8

9 8. BIBLIOGRAFÍA Bertrand A. Determinación de la actividad β-glucanasa de Botrytis en las preparaciones enzimáticas. OIV FV