COMPLEMENTO TEÓRICO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA

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1 COMPLEMENTO TEÓRICO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA ÍNDICE UNIDAD TEMA Página I Grupos microbianos 1 II Metabolismo microbiano 41 III Taxonomía y crecimiento bacteriano 67 IV Ecología microbiana 79 V Degradación de compuestos orgánicos en el suelo 93 VI Disponibilidad de nutrientes para las plantas 113 VII Fijación biológica de N VIII Fertilizantes biológicos 143 IX Degradación de residuos orgánicos 155 X Microbiología del agua 163 XI Procesos microbianos de la conservación y producción de alimentos 179 XII Microbiología ruminal 203 Personal de la Asignatura que participó en la elaboración y corrección de este Complemento Teórico Ing. Agr. Dr. Enrique Iván Lucini Dra. Carolina Merlo Dra. Laura Belén Noé Dra. Marina Bruno Biol. Carolina Vázquez Ing. Agr. Lucas Dubini Ing. Agr. Aylen Ocampo Ing. Agr. Boris Camiletti Bioq. María Paula Martín Ing. Agr. Soraya Salloum

2 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 1 UNIDAD I: GRUPOS MICROBIANOS Importancia del estudio de la microbiología La microbiología es una ciencia que trata el estudio de los microorganismos, un extenso y variado grupo de organismos microscópicos que existen como células aisladas o que viven formando agrupaciones celulares que se pueden observar a simple vista. La microbiología también incluye el estudio de los virus, ya que son organismos microscópicos, pero que no son considerados células. Por lo tanto, la microbiología como ciencia se centra en dos temas principales: a) la comprensión de los procesos vitales básicos que ocurren en los microorganismos (metabolismos) y b) la aplicación de ese conocimiento para beneficio de la humanidad. El estudio de la microbiología es importante debido a que los microorganismos están implicados en numerosos procesos y conflictos que son importantes en la industria, la medicina y la agricultura. Los microorganismos constituyen en conjunto la biomasa mayor del planeta y realizan numerosos procesos que son necesarios para el desarrollo de otros organismos. En ausencia de microorganismos nunca podrían haber surgido otras formas de vida ni podrían mantenerse en la actualidad. Incluso el oxígeno que respiramos actualmente es consecuencia de la actividad microbiana del pasado. Los microorganismos pueden ser benéficos o perjudiciales para el hombre. Es importante destacar, que algunas de las enfermedades más importantes de humanos, animales y plantas son causadas por microorganismos, pero por otro lado, los microorganismos desempeñan importantes funciones en la fertilidad de los suelos y en la producción animal. Además, muchos procesos industriales a gran escala se basan en el uso de microorganismos. Como el estudio de los microorganismos abarca una gran cantidad de tipos, morfologías, usos y características, la microbiología se encuentra dividida en numerosas subdisciplinas. Particularmente, la Microbiología Agrícola es una subdisciplina de la Microbiología que tiene como objetivo el estudio de los procesos microbiológicos que se producen en el suelo, agua, alimentos, etc. y que involucran a la producción agropecuaria.

3 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 2 Los microorganismos contribuyen de manera global al funcionamiento de los ecosistemas del planeta y ayudan al desarrollo sostenible de la biósfera. En este sentido, desde un punto de vista ecológico, los microorganismos que habitan el suelo (microorganismos edáficos) constituyen el estamento de los descomponedores, que junto a los productores (plantas) y consumidores (herbívoros y carnívoros) son la base del funcionamiento de los ecosistemas. Los organismos descomponedores son los responsables de la degradación de los restos orgánicos muertos y la liberación de nutrientes que servirán de base para la productividad primaria del sistema, cerrando el ciclo de los elementos (Figura 1). Fig. 1: Cadena trófica en ecosistemas naturales La actividad de los microorganismos edáficos es de suma importancia en los sistemas agropecuarios, debido a que existe una elevada extracción de nutrientes provocada por las cosechas y el pastoreo (Figura 2). En la actualidad, el estudio de los microorganismos edáficos cobra especial relevancia teniendo en cuenta que se persigue una productividad agrícola sustentable, la preservación del ambiente y la producción de alimentos orgánicos.

4 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 3 Fig. 2: Cadena trófica en agroecosistemas Desde el punto de vista industrial, los microorganismos son cultivados a gran escala, para obtener productos comerciales o realizar importantes transformaciones químicas. La industria pretende potenciar las reacciones metabólicas que pueden realizar los microorganismos para producir en mayor cantidad (alto rendimiento) el producto de interés. De esta forma, se pueden producir biofertilizantes (inoculantes), productos farmacéuticos (antibióticos), aditivos alimenticios (aminoácidos y vinagre), enzimas, productos químicos (alcohol o ácido cítrico), y bebidas como el vino y la cerveza entre otras. Características de los microorganismos Se denomina microorganismo a la forma de vida que se desarrolla en una sola célula. Aunque el organismo esté compuesto por más de una célula (pluricelular), cada célula es funcionalmente autónoma en sí misma. Los microorganismos no poseen tejidos ni órganos, es decir que no presentan células especializadas en cumplir una única función como sucede en los organismos superiores, por ejemplo células especializadas en el transporte (xilema de las plantas), células especializadas en la absorción de nutrientes en animales (células intestinales), etc.

5 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 4 Hay una serie de características propias de los microorganismos que les confieren particularidades de carácter funcional muy importantes: Tamaño reducido: en general, las células microbianas son muy pequeñas particularmente las procariotas. Cada célula microbiana varía en general entre 1 y 15 m (entre 10 y 100 veces menor que una célula vegetal). Superficie de intercambio muy grande: tener mucha superficie en relación al volumen corporal le otorga a las células alta capacidad de intercambio con el medio. Esto significa que los organismos tienen una alta tasa de absorción (de agua, gases, alimentos) y de excreción. Ser una célula de tamaño pequeño tiene sus ventajas. Las células pequeñas poseen más área superficial en relación al volumen celular que las células más grandes; es decir, tienen una relación superficie/volumen mayor. Además, el hecho que muchos microorganismos presentan células de formas esféricas o cilíndricas les confieren mayor superficie en relación al volumen del cuerpo. Alto metabolismo: es conocido que todos los organismos vivos muestran alguna forma de metabolismo. Dentro del entramado del compartimiento físico que define a una célula, se toman nutrientes del medio externo y se los transforma químicamente. Durante este proceso se produce energía y se eliminan productos de desecho. Una alta tasa de absorción determina una alta disponibilidad de nutrientes, lo que favorece un metabolismo muy activo. Por esta causa, se sabe que los organismos de tamaño reducido tienen una tasa metabólica más elevada que los de mayor tamaño. Reducido tiempo de generación: todo organismo con alta tasa metabólica tiende a tener también una alta tasa reproductiva. Este hecho, sumado a que los microorganismos se reproducen generalmente de manera asexual (por fisión binaria), hace que las divisiones celulares sean muy frecuentes (algunos se dividen cada 15 minutos) y que el aumento de la población sea exponencial. Esto se aprecia muy bien en la aparición y rápida difusión de enfermedades provocadas por los agentes microbianos. Alta diversidad genética: cuando el ADN se duplica frecuentemente, tiene altas probabilidades de sufrir mutaciones. Los microorganismos presentan altas tasas de mutaciones lo cual provoca que la variabilidad genética sea muy alta y

6 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 5 que la variación genotípica en bacterias sea evidente en cortos períodos de tiempo. Distribución muy amplia: el hecho de tener alta variabilidad genética confiere a los microorganismos la posibilidad de adaptarse a ambientes muy diferentes (ubicuidad). Prácticamente no existe ningún lugar en el planeta que no esté habitado por microorganismos (salvo la sangre y órganos de animales sanos). Variabilidad metabólica: esta alta capacidad de adaptación lleva implícito que los microorganismos puedan tener una enorme variedad de metabolismos totalmente diferentes del resto de los organismos vivos. Esa particularidad hace que sean los únicos responsables de procesos clave en los ecosistemas como: la liberación y disponibilidad nutrientes para las plantas, la descomposición y detoxificación de elementos contaminantes, etc. Además, esta amplia variabilidad metabólica permite la utilización de muchos procesos metabólicos microbianos en la industria. Microorganismos: grupos microbianos Desde el punto de vista morfológico-funcional se pueden diferenciar tres grandes grupos de microorganismos: procariotas, eucariotas y virus. Microorganismos procariotas Son microorganismos que poseen células procarióticas. Dentro de este gran grupo se encuentran las eubacterias (bacterias verdaderas), los actinomycetes, las cianobacterias, y otros grupos de menor importancia para la microbiología agrícola (por ejemplo: arqueas, rickettsias, mixobacterias, etc.). Eubacterias Las eubacterias pertenecen al dominio Bacteria y constituyen más del 90% de la biomasa activa del suelo. Las eubacterias son microorganismos unicelulares, Gram positivos o Gram negativos, aeróbicos o anaeróbicos, que pueden presentar forma de cocos, bacilos o espirilos. El grupo de las eubacterias contiene una enorme variedad de procariotas, algunos patógenos y otros no. Muchos son descomponedores de la materia orgánica y responsables de la liberación de nutrientes. Además, muchas especies de eubacterias son patógenas de gran importancia en sanidad animal, humana y vegetal.

7 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 6 Actinomycetes Los actinomycetes forman un grupo de bacterias Gram positivas filamentosas aeróbicas o anaeróbicas. Estas bacterias al crecer y ramificarse forman estructuras en forma de redes semejantes a las de los micelios de los hongos filamentosos pero mucho más pequeños (Figura 3). Son bacterias que forman esporas asexuadas que suelen denominarse conidios y que no son análogas a las de las endosporas (estructuras reproductivas de resistencia) de las bacterias Gram positivas. Si bien pueden existir algunos actinomycetes acuáticos, la mayoría son terrestres y tienen enorme importancia en los suelos, ya que algunos pueden producir enzimas hidrolíticas extracelulares lo cual les permite utilizar grandes moléculas orgánicas como polisacáridos (almidón, celulosa y hemicelulosa), proteínas y lípidos. Algunos pueden descomponer hidrocarburos, lignina y taninos. Causan habitualmente un olor semejante a tierra mojada debido a un compuesto que presentan: la geosmina. Algunas especies de actinomycetes son parásitos de plantas, como el agente de la sarna de la papa (Streptomyces spp.) o de animales, por ej., el causante de la tuberculosis y la lepra (Mycobacterium spp.). Además, pueden producir más de 60 tipos de antibióticos que son habitualmente utilizados en la medicina humana y veterinaria. Fig.3: Actinomycetes.

8 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 7 Cianobacterias Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos uni o pluricelulares (filamentosos) que viven en ambientes terrestres y acuáticos (agua dulce o marinos). La estructura de la pared bacteriana de cianobacterias es similar a la de bacterias Gram negativas. Muchas cianobacterias producen cubiertas mucilaginosas denominadas vainas, que unen entre sí grupos de células o de filamentos (Figura 4). Filogenéticamente, las cianobacterias representan la transición entre las bacterias y las plantas superiores, ya que los orgánulos fotosintéticos de los eucariotas (cloroplastos), están relacionados con las cianobacterias. Las cianobacterias han sido muy importantes para el desarrollo de la vida en la tierra ya que fueron los primeros organismos con fotosíntesis oxigénica (con producción de oxígeno) que aparecieron en la tierra. La producción de oxígeno en la tierra primitiva permitió el posterior desarrollo de organismos superiores como las plantas, animales y el hombre. Las cianobacterias tienen pigmentos fotosintéticos como la clorofila a, ficocianinas y ficobilinas que les otorgan un típico color azul-verdoso. La importancia de las cianobacterias radica en que constituyen un componente muy importante de la productividad primaria en ambientes acuáticos. En la actualidad, estas bacterias tienen relevancia por su desarrollo masivo (sufren explosiones poblacionales de gran magnitud) en ambientes lacustres ricos en nutrientes (eutroficados), como es el caso del Lago San Roque (Córdoba). Las cianobacterias pueden producir toxinas en estos sistemas que afecten al hombre o animales, pero además, generan mal olor en el agua y su desarrollo masivo muchas veces dificulta los procesos de potabilización. Heterocisto Fig. 4: Cianobacterias

9 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 8 Arqueas Son microorganismos extremófilos, siendo capaces de crecer a valores extremos de ph, mayores temperaturas y salinidades que cualquier otro organismo conocido (Figura 5). Las arqueas son microorganismos constituidos por células procarióticas que presentan varias modificaciones morfológicas, principalmente la membrana celular, lo cual les otorgar mayor resistencia para tolerar las condiciones ambientales extremas. Son organismos dominantes en lugares de alta salinidad (salares), alta temperaturas (cráteres de volcanes), baja cantidad de oxígeno (fondos marinos), etc. Algunas arqueas son muy relevantes porque son metanógenas (producen metano) como parte integral de su metabolismo. Fig. 5: Arqueas Microorganismos eucariotas Son microorganismos constituidos por células eucariotas e incluyen a grupos como las algas, protozoos y hongos. Algas Las algas son los típicos organismos eucariotas que realizan fotosíntesis oxigénica y que habitan generalmente en ambientes acuáticos (de agua dulce y marinos). Las algas pueden ser unicelulares microscópicas (constituyendo el fitoplancton) o pluricelulares (filamentosas) y de gran tamaño viviendo fijas o flotantes en el agua (Figura 6). Existen varios tipos y morfologías de algas, sin embargo, las más conocidas son las algas verdes y las rojas. Las algas verdes (clorófitas) crecen principalmente en agua dulce y tienen clorofila a y b pero carecen de ficobilinas. Otras como las algas rojas (rodófitas) tienen clorofila a y

10 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 9 un pigmento llamado ficoeritrina que les otorga el color rojo característico. Estas algas viven predominantemente en hábitats marinos. La importancia de las algas radica en que son productores primarios en ecosistemas acuáticos. Volvox Scenedesmus Micrasterias Rodophyta: Gracilaria Fig. 6: Fotomicrografía de algas verdes unicelulares típicas. Protozoos Los protozoos son microorganismos unicelulares que no presentan pared celular. Pueden ser ameboidales, móviles (ciliados o flagelados) o inmóviles. Pueden ser acuáticos (marinos o de agua dulce) y terrestres (Figura 7). Muchos pueden ser predadores de bacterias, otros son saprofitos y también pueden ser parásitos. Muchos juegan un importante rol en la salud humana ya que son los responsables de importantes enfermedades como la enfermedad de Chagas, donde el protozoo (Trypanosoma cruzi) es transmitido a través de la vinchuca; o la malaria, donde el protozoo (Plasmodium spp.) es transmitido por los mosquitos.

11 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 10 Stentor Vorticella Paramecium Sin pared celular Móviles o inmóviles Ameba Predadores Saprófitos Parásitos Didinium Fig. 7: Protozoos más comunes en suelo y agua Hongos Los hongos constituyen un gran grupo de organismos, diversos y muy extendido que incluye a los mohos, setas y levaduras. La mayoría de los hongos son pluricelulares y forman un entramado de filamentos denominados hifas. Las hifas a menudo crecen juntas formando unos ovillos compactos denominados colectivamente micelios. Las hifas pueden ser septadas (con paredes que la dividen en células separadas) o cenocíticas (muchos núcleos sin formación de septos) (Figura 8). Los hongos forman esporas asexuadas (conidios) a partir de hifas que se extienden desde el micelio. No obstante, algunos hongos pueden formar estructuras reproductivas macroscópicas denominadas setas (cuerpos de fructificación) que también producen esporas. Sin embargo, hay hongos como las levaduras que son unicelulares y microscópicos (Figura 9). Los hongos tienen hábitats muy diversos, sin embargo la mayoría son terrestres. Estos organismos habitan el suelo o sobre la materia vegetal muerta y cumplen una importante función en la degradación de la materia orgánica. Una función ecológica importante de los hongos es la descomposición de la

12 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 11 lignina (constituyente importante de plantas leñosas) y de la celulosa. Algunas especies de hongos establecen simbiosis con algas superiores o con cianobacterias, formando los organismos llamados líquenes. Hifas: a) cenocítica, b) tabicada mononucleada, c) tabicada binucleada Fig. 8: Tipos de hifas de hongos Fig. 9: Hongos uni y pluricelulares. Levaduras y Aspergillus (derecha) Muchos hongos son responsables de enfermedades con relevancia económica de plantas cultivadas. Otros pueden causar enfermedades en animales o en el hombre (micosis). Pero también algunos son importantes para el hombre ya que son utilizados para la síntesis de antibióticos y para algunos procesos fermentativos.

13 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 12 Virus Los virus representan una clase importante de microorganismos, sin embargo, no son considerados células, debido a que carecen de muchos atributos presentes en ellas. Por ejemplo, un virus sólo adquiere el atributo clave de todos los sistemas vivos (reproducción), cuando infecta a una célula. Además, a diferencia de las células, los virus no tienen capacidad metabólica propia. Por lo tanto son considerados parásitos intracelulares obligados de células vivas. Esta característica provoca que sean causantes de importantes enfermedades en plantas, animales y el hombre. Sin embargo, también pueden infectar bacterias (bacteriófagos) (Figura 9) y arqueas. Los virus presentan una amplia diversidad de formas y tamaños y son unas 100 veces más pequeños que las bacterias. Una partícula vírica completa, conocida como virión, consiste en un ácido nucleico rodeado por una capa proteica protectora llamada cápside. Las cápsides pueden tener forma helicoidal o icosaédrica. Además, los virus pueden estar rodeados de una envoltura que es una capa lipídica externa que rodea al virus (Figura 10). Fig. 10: Estructura de bacteriófago

14 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 13 Fig. 10: Diferentes tipos de virus Células microbianas Un análisis detallado de la estructura celular interna de las células microbianas y de otras propiedades permite diferenciar dos tipos de células: las procariotas y las eucariotas. Las células procariotas son las más simples estructuralmente (no presentan orgánulos celulares) y también en general son las más pequeñas. Como toda célula, están delimitadas por una membrana plasmática que contiene pliegues hacia el interior (invaginaciones) que están relacionados con diversas funciones. La célula procariota por fuera de la membrana plasmática está rodeada por una pared celular. En el interior de la célula es posible hallar una región más densa, llamada nucleoide, donde se encuentra el material genético (ADN). Es decir que el ADN no está separado del resto del citoplasma por una membrana nuclear como ocurre en eucariotas. Las células procariotas pueden tener distintas estructuras que le permiten la locomoción y el movimiento (Figura 11). En cambio, las células eucariotas tienen un modelo de organización mucho más complejo que las procariotas (Tabla 1). Su tamaño es mucho mayor y en el citoplasma es posible encontrar un conjunto de estructuras celulares rodeadas por membranas que cumplen diversas funciones y que en conjunto se denominan organelas u orgánulos celulares. Entre las células eucariotas podemos distinguir dos tipos de células que presentan algunas diferencias: células animales y vegetales. Las células animales (Figura 13) no poseen pared celular y las células vegetales presentan por fuera de la membrana plasmática, una pared celular que les brinda protección y que tiene

15 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 14 una composición distinta (celulosa) (Figura 12) a las paredes que se encuentran en las células procariotas (peptidoglicano). Fig. 11: Estructura de una célula procariota típica Fig. 12: Estructura de una célula eucariota vegetal

16 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 15 Fig. 13: Estructura de una célula eucariota animal Tabla 1. Principales diferencias entre células procariotas y eucariotas CELULA PROCARIOTA CÉLULA EUCARIOTA Núcleo no envuelto por membrana envuelto por membrana Cromosomas un cromosoma circular varios cromosomas División celular fisión binaria mitosis Aparato fotosintético en membranas (tilacoides) en cloroplastos Aparato respiratorio en membranas en mitocondrias Tipo de ribosomas 70s 80s Pared celular peptidoglicano sin pared o con pared de celulosa Tamaño <1 y 15 m µm Orgánulos no posee si posee Relaciones evolutivas entre los microorganismos Aunque las células se puedan diferenciar entre procariotas y eucariotas, la estructura celular no implica necesariamente una relación evolutiva. Sin embargo, en la actualidad se pueden determinar relaciones filogenéticas (evolutivas) entre los microorganismos a través de técnicas de la biología molecular. Estos métodos se basan en comparaciones de la secuencia de ácidos nucleicos, particularmente la secuencia del ARN ribosomal. Por lo tanto, los cambios en la secuencia del ARN ribosomal pueden ser usados como una

17 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 16 medida para establecer relaciones evolutivas entre los organismos. En el caso de los microorganismos, a partir de los estudios hechos sobre las secuencias del ARN ribosomal 16S (para células procariotas) y 18S (para células eucariotas), se pueden definir tres dominios o linajes celulares evolutivamente diferentes. Dos de estos linajes presentan células procariotas y uno de ellos presenta células eucariotas (Figura 14). Los grupos o linajes son: - Dominio Bacteria: comprende a organismos unicelulares con células procariotas y pared celular compuesta por peptidoglicano. - Dominio Archaea: organismos procariotas unicelulares y cuya pared celular no presenta peptidoglicano. - Dominio Eukarya: comprende todos los organismos que presentan células eucariotas (entre los Eukarya que son microorganismos encontramos a los hongos, protozoos y algas). Se piensa que estos tres linajes evolutivos se originaron muy pronto en la historia de la vida sobre la tierra por divergencias a través un organismo ancestral en común. Fig. 14: Árbol filogenético de los seres vivos deducido a través de la secuenciación comparativa del gen del ARN ribosomal. El árbol está formado por los tres dominios: Bacteria y Archaea (organismos procariotas) y Eukarya (organismos eucariotas). Solamente se muestran algunos organismos representativos dentro de cada dominio.

18 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 17 Morfología de los procariotas En microbiología, el término morfología hace referencia a la forma de las células. Las células procariotas presentan morfologías variadas. La mayor parte de las bacterias tienen una forma característica, que permanece más o menos constante, aunque puede estar influenciada por las condiciones ambientales. Dentro de las morfologías más comunes encontramos bacterias con formas esféricas u ovoides que se denominan cocos. Cuando las bacterias presentan una forma cilíndrica se denominan bacilos. Algunos bacilos se curvan en forma espiral y entonces se denominan espirilos (Figura 15). Sin embargo, muchas veces, las células de los procariotas se mantienen juntas después de la división celular formando grupos, y estas asociaciones frecuentemente son características de los diversos géneros. En algunos casos, los cocos forman cadenas como resultado de haberse dividido siempre en el mismo plano. La longitud de tales cadenas puede ser corta (2 células) y en ese caso se llaman diplococos o largas (estreptococos). Además, algunos cocos pueden formar conjuntos parecidos a racimos de uva (estafilococos) y otros se disponen en agrupaciones cúbicas tridimensionales llamadas sarcinas (Figura 15). Cocos Otros Bacilos Apendices bacterianos Fig. 15: Morfología Bacteriana

19 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 18 Estructuras celulares de las células procarióticas Los componentes estructurales de las células procariotas pueden dividirse en dos grupos: elementos comunes (invariables), es decir, que se encuentran en todos los procariotas y que son absolutamente esenciales para la vida, y elementos no comunes (variables), que se encuentran en algunas células (no en todas) y que están asociadas a funciones específicas (Tabla 2). Tabla 2: Estructuras celulares de las células procariotas. ELEMENTOS COMUNES Pared celular Membranas Mesosomas Tilacoides Vesículas Zona nuclear Cromosoma Ribosomas ELEMENTOS NO COMUNES Plásmidos Flagelos Pilis Cápsulas Pedúnculos Vainas Sustancias de reserva Vacuolas Pigmentos Endosporas Elementos comunes: Estructuras invariables Pared celular: Mureína (Peptidoglicano) Dada la gran concentración de solutos que se alcanza en el interior de la célula bacteriana (gran presión de turgencia), las células bacterianas desarrollan paredes celulares. Las paredes celulares de procariotas presentan una capa rígida que es la que le otorga resistencia a la pared celular. La pared celular es químicamente diferente a la de células eucariotas, siendo uno de los caracteres distintivos entre los organismos procariotas y eucariotas. La función de la pared, aparte de dar rigidez a la célula, también es brindar protección ya que protege a las membranas de los detergentes y tóxicos que pueden dañar a la células, es sitio diana (donde actúan) además de los antibióticos. La capa que le confiere rigidez a la pared celular se denomina peptidoglicano o mureína. La mureína es un heteropolímero que está formado por dos derivados de azúcares: la N-acetilglucosamina (G) y el ácido N-

20 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 19 acetilmurámico (M) y un pequeño grupo de aminoácidos. La N- acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico están conectados por uniones glicosídicas β-1,4; pero además el ácido N-acetilmurámico se une mediante uniones peptídicas a una cadena de 4 aminoácidos llamada tetrapéptido del glicano: L-alanina, D-alanina, D-glutámico y lisina o ácido diaminopimélico (DAP) (Figura 16). Durante la síntesis de peptidoglicano se generan largas cadenas que forman una lámina que rodea a la célula. Las cadenas se conectan entre sí por enlaces peptídicos que se establecen entre los aminoácidos del tetrapéptido. El tetrapéptido puede variar en un aminoácido (varía en lisina o alternativamente en DAP). La mureína (peptidoglicano) es un compuesto que solo se encuentra en procariotas pertenecientes al dominio Bacteria. Sin embargo, no todos los organismos procariotas tienen DAP en su tetrapéptido. Otro rasgo peculiar es la presencia de dos aminoácidos de configuración D (D-alanina y D-glutámico) ya que en las proteínas los mismos aminoácidos presentan siempre configuración L. Fig. 16: Estructura de la mureína

21 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 20 Pared celular de Gram positivas y Gram negativas Las bacterias suelen dividirse en dos grandes grupos en relación a la estructura y composición química de sus paredes celulares: las bacterias Gram positivas y las bacterias Gram negativas. Es importante destacar que la distinción inicial entre estos dos tipos se basa en una tinción diferencial: la tinción de Gram. Gram positivas La pared de las bacterias Gram positivas es estructuralmente más gruesa y químicamente menos compleja que en Gram negativas. En las bacterias Gram positivas hasta un 90% de la pared celular está constituida por mureina. Estas bacterias pueden tener hasta 25 capas de mureina apiladas unas sobre otras. Muchas bacterias Gram positivas presentan embebidos en su pared celular, polisacáridos ácidos denominados ácidos teicoicos (Figura 17). El término ácido teicoico hace referencia a toda la pared, membrana o polímeros capsulares que contienen glicerolfosfato o residuos de fosfato de ribitol. Estos polialcoholes están unidos por ésteres de fosfato y generalmente se les unen otros azúcares. Algunos ácidos que contienen glicerol están unidos a los lípidos de la membrana de bacterias Gram positivas: la íntima asociación de los ácidos teicoicos con los lípidos justifica la denominación de ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos están cargados negativamente y por lo tanto contribuyen a la carga negativa de la pared celular de las bacterias Gram positivas. También pueden proporcionar soporte estructural a la pared celular. Fig. 17: Diagrama global de la pared celular Gram positiva

22 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 21 Gram negativas En las bacterias Gram negativas la pared celular está compuesta por mureína y una membrana externa. Sólo cerca del 10 % de la pared celular está constituida por mureína y el resto consiste en lípidos, polisacáridos y proteínas que forman una capa exterior que se denomina membrana externa. La membrana externa es una segunda bicapa lipídica pero que además de fosfolípidos y proteínas presenta polisacáridos en su constitución química. Debido a que los lípidos y los polisacáridos se unen formando un complejo se conoce también como capa de lipopolisacárido (LPS) (Figura 18). En la membrana externa la capa de lipopolisacárido se asocia a varias proteínas para formar la hemicapa externa de la misma, mientras que en la hemicapa interna se encuentra el complejo de lipoproteína. Este complejo, son pequeñas proteínas asociadas a lípidos, cuya función es la de anclaje entre la membrana externa y la mureína. En la hemicapa externa de la membrana externa, el LPS sustituye a los fosfolípidos, los que predominan en la hemicapa interna. Fig. 18: Diagrama global de la pared celular Gram negativa Aunque la función de la membrana externa es estructural, una importante propiedad biológica es que resulta tóxica para animales y el hombre debido a que en ella se localizan endotoxinas (toxina no liberada por la célula: puede estar unida a la superficie celular o ser intracelular). Algunos de los efectos tóxicos que provocan algunas de las bacterias patógenas Gram negativas más conocidas (especies de los géneros Escherichia, Salmonella y Shigella) se deben a las toxinas presentes en las membranas externas.

23 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 22 Tinción de Gram: Es un tipo de tinción o coloración diferencial empleada comúnmente en la microbiología para la visualización microscópica de bacterias. Debe su nombre al microbiólogo Danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en Básicamente, la tinción de Gram (se desarrollará completamente en los trabajos prácticos) es una tinción doble ya que se utilizan dos colorantes (cristal violeta y fucsina). El fundamento de la tinción se basa en las diferencias existentes en las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias Gram positivas tienen pared celular muy gruesa con muchas capas de peptidoglicano y las Gram negativas poseen paredes delgadas con menos capas de peptidoglicano. Durante la coloración, primero se agrega el colorante cristal violeta que penetra en todas las células tiñendo a todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) de color azul/violáceo. Luego se agrega lugol que actúa como un mordiente haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El yodo penetra dentro de las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. Posteriormente el alcohol que se agrega sirve para realizar una decoloración, ya que el complejo cristal violeta/lugol es soluble en alcohol. Los organismos Gram positivos no se decoloran, pero sí los Gram negativos. Para poner de manifiesto las células Gram negativas (ya que quedaron decoloradas) se utiliza la fucsina como colorante de contraste. Después de esta decoloración de contraste las células Gram positivas siguen de color azul/violáceo y las Gram negativas adquieren un color rosado. La diferencia en la tinción se observa en la resistencia a la decoloración, esto se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo alcohol. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo cristal violeta/lugol que se formó previamente, y por lo tanto el complejo se escapa de la célula, perdiéndose la coloración azul/violácea. Pero por el contrario, en las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, la célula no es susceptible a la acción del solvente orgánico (alcohol), sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/lugol y mantener de esta forma la coloración azul/violácea.

24 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 23 Células bacterianas que no presentan paredes celulares Si bien la mayoría de las bacterias no pueden sobrevivir sin sus paredes celulares, unos pocos organismos pueden hacerlo: son los micoplasmas. Los micoplasmas constituyen un grupo de bacterias patógenas que causan diversas enfermedades infecciosas en el hombre y otros animales. Estos microorganismos son capaces de vivir sin paredes celulares porque viven como parásitos en hábitats osmóticamente protegidos como el cuerpo humano. Membranas bacterianas La membrana celular o plasmática es una estructura delgada que rodea por completo a la célula. Esta estructura vital es la barrera que separa el interior celular (citoplasma) del exterior y actúa como una barrera selectiva que capacita a la célula para concentrar metabolitos específicos en el citoplasma y para poder excretar sus productos de desecho. Si se destruye la membrana se rompe la integridad de la célula lo cual provoca su muerte. La membrana celular tiene capacidad para sintetizar la pared celular y las cápsulas. La estructura general de las membranas biológicas es la de una bicapa lipídica. La bicapa está compuesta por fosfolípidos y proteínas embutidas dentro de la bicapa. Los fosfolípidos están compuestos por componentes hidrofóbicos (ácidos grasos) e hidrofílicos (glicerol-fosfato). Los fosfolípidos se agregan en bicapas con los ácidos grasos orientados hacia el interior (formando un ambiente hidrofóbico) y las porciones hidrofílicas expuestas a la fase acuosa exterior o al citoplasma. La estructura de la membrana queda estabilizada mediante enlaces puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas (Figura 19). Las proteínas de la membrana plasmática presentan zonas hidrofóbicas en regiones que se incluyen en la membrana y zonas hidrofílicas en las regiones que toman contacto con el medio exterior o con el citoplasma. Las proteínas que se encuentran firmemente asociadas y embutidas a la membrana se denominan proteínas integrales de membrana, mientras que las que se asocian a ella en su superficie se denominan proteínas periféricas de membrana (Figura 19). Por lo general, estas proteínas interaccionan con proteínas integrales de membrana que son importantes en procesos relacionados con el metabolismo energético y el transporte.

25 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 24 Fig. 19: Membrana plasmática Membranas de arqueas Los lípidos de las membranas de los dominios Bacteria y Eukarya son diferentes a los de Archaea. En Bacteria y Eukarya los lípidos presentan enlaces de tipo éster entre el glicerol y los ácidos grasos mientras que los lípidos de Archaea poseen enlaces éter entre el glicerol y las cadenas laterales hidrofóbicas. Además, carecen de ácidos grasos y en su lugar tienen cadenas laterales compuestas de unidades repetidas de isopreno. Pese a estas diferencias en la composición química, las membranas de estos grupos tienen regiones hidrofóbicas internas y regiones hidrofílicas externas. Sin embargo, debido a diferencias químicas en los lípidos que forman las membranas de arqueas, en este grupo las membranas forman una monocapa en vez de una bicapa lipídica (Figura 20). Estas monocapas son muy resistentes a la disgregación razón por la cual por ejemplo las arqueas hipertermófilas pueden soportar elevadas temperaturas.

26 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 25 Fig. 20: Diferencias entre las membranas celulares de los dominios Bacteria y Archaea. Membranas internas Además de la membrana situada en la periferia de la célula, la mayoría de los procariotas poseen membranas internas. Estas membranas internas pueden ser simplemente extensiones o invaginaciones de la membrana celular, o pueden ser estructuras más complejas como por ejemplo: Mesosomas: los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática asociadas con la replicación del ADN. Los mesosomas son los sitios de anclaje del nucleoide bacteriano para empezar la duplicación del ADN y la formación de del septo bacteriano (tabique que separa a las células que se dividieron) en el proceso de fisión binaria o división celular. Vesículas: son estructuras donde se localizan enzimas y pigmentos para la realización de diferentes procesos metabólicos como respiración, fotosíntesis y oxidaciones especiales. Tilacoides: son estructuras en forma de sacos aplanados o vesículas donde se asientan los pigmentos fotosintéticos. Se considera que los tilacoides bacterianos fueron los precursores de los cloroplastos de las células eucarióticas (Figura 21).

27 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 26 Tilacoides Membrana plasmática Fig. 21: Microscopía electrónica de una cianobacteria. Se destacan las membranas tilacoidales dispuestas en forma concéntrica alrededor del citoplasma celular. Citoplasma bacteriano El citoplasma bacteriano es un sistema coloidal formado por un 85% de agua que además contiene minerales y enzimas. En el citoplasma se pueden observar inclusiones, gránulos, vacuolas, etc. Zona nuclear Los genomas (conjuntos de genes de un organismo) presentan una organización diferente en organismos procariotas que en eucariotas. En las células procariotas no hay un núcleo definido (no hay membrana nuclear) por lo cual el ADN de doble cadena se presenta como una larga molécula llamada cromosoma. Los procariotas presentan un único cromosoma circular que se encuentra altamente plegado (superenrollado) conformando una estructura que se denomina nucleoide (Figura 11). La composición química del ADN bacteriano es la misma de las células eucarióticas, salvo que la carga negativa de los grupos fosfatos es neutralizada por magnesio, mientras que en los eucariotas es neutralizada por proteínas básicas llamadas histonas. El ADN posee la información genética de la célula, es sitio diana para la acción de antibióticos, permite establecer relaciones taxonómicas y permite el diagnostico directo a través de técnicas moleculares.

28 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 27 La replicación del ADN en las bacterias también es básicamente muy parecida a la que sucede en células eucariotas. Debido a que el cromosoma es circular, el proceso se inicia en un punto donde se localiza el mesosoma y se desplaza alrededor del anillo. Después de replicado el ADN, el nuevo anillo se traslada hacia una de las células en desarrollo y comienza la formación del septo trasversal que separa las células. La división celular de las bacterias se denomina fisión binaria porque da como resultado dos células hijas idénticas entre sí e idénticas a la célula que les dio origen (Figura 22). En algunos casos la velocidad de duplicación es muy alta y no se completa la separación de las células por lo que se forman cadenas de células y otros agrupamientos celulares. ADN replicación ADN Elongación celular Formación del septo Terminación del septo y formación de paredes Separación celular Fig. 22: División celular en bacterias: fisión binaria

29 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 28 Ribosomas Los ribosomas están constituidos aproximadamente por un 60% de ARN y un 40% de proteínas. A diferencia de la célula eucariota, los ribosomas no se asientan sobre un retículo endoplásmico sino que están libres en el citoplasma. La función de los ribosomas es la misma que en las células de organismos superiores, es decir la síntesis de proteínas funcionales (enzimas) y proteínas estructurales. Cada ribosoma está formado por dos subunidades de diferente tamaño. Los procariotas poseen subunidades ribosómicas 30S y 50S, que al unirse forman ribosomas 70S, mientras que los eucariotas tienen ribosomas 80S. Los valores S se refieren a las constantes de sedimentación de las subunidades ribosómicas (30S y 50S) o del ribosoma completo (70S) cuando se someten a una gran fuerza de centrifugación en una ultracentrífuga. Cada subunidad ribosómica es un complejo ribonucleoproteico formado por ARN ribosómico de distinto tipo y proteínas específicas. La subunidad más pequeña (30S) está compuesta por una molécula de ARNr 16S a la que están unidas más de 20 proteínas. En cambio, la subunidad mayor (50S) se compone de ARNr 23S, 5S y más de 30 proteínas específicas. Se cree que las proteínas de cada partícula están unidas al ARN y que la unidad entera está envuelta dentro de una estructura globular (Figura 23). ARN r Proteínas Subunidades ribosomales Ribosomas Ribosoma Procariota Ribosoma Eucariota Figura 23. Diferencias entre las constantes de sedimentación de los ribosomas de células procariotas y eucariotas

30 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 29 Elementos no comunes: Estructuras variables Plásmidos Muchos procariotas contienen pequeños trozos de ADN extracromosómico dispuestos en forma circular conocidos con el nombre de plásmidos. El número de plásmidos puede variar, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los plásmidos son ADN de doble cadena (igual al ADN del cromosoma) que se replican independientemente del cromosoma bacteriano (Figura 24). Los genes contenidos en los plásmidos codifican para funciones no vitales (propiedades especiales) para la bacteria, como por ejemplo la fijación de nitrógeno atmosférico, la resistencia a antibióticos, etc. Otra característica de los plásmidos es que pueden transmitirse de una bacteria a la otra, esta particularidad hace que sirvan como una importante herramienta en laboratorios de genética e ingeniería genética, donde son comúnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias) un gen en particular. Además, pueden ser utilizados para generar organismos resistentes o con alguna función metabólica especial. Muchos plásmidos ya están disponibles comercialmente para dichos usos. ADN bacteriano Plásmidos Fig. 24: Bacteria con ADN extracromosómico (plásmidos) en su citoplasma Flagelos Los flagelos bacterianos son apéndices largos y finos que se encuentran fijos a la célula por uno de sus extremos y libres por el otro extremo. Los flagelos (flagellum= látigo) permiten la movilidad de las células en medio acuoso. Son tan finos que no es posible visualizarlos con el microscopio óptico y es necesario recurrir a tinciones o microscopios especiales para su visualización. La disposición de los flagelos varía según las bacterias. En la distribución polar,

31 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 30 los flagelos se localizan en un extremo (disposición monotrica) o en ambos extremos de la célula (anfitrica). En ocasiones, de un extremo de la célula puede surgir un penacho de flagelos, disposición que se denomina lofotrica (lofos=penacho, tricos=pelo). En cambio, en la distribución peritrica, los flagelos se insertan en varios lugares alrededor de la superficie celular (peri=alrededor) (Figura 25 y 26). Fig. 25: Disposición de los flagelos en células bacterianas a b Fig. 26: a) Disposición monótrica en Vibrio cholerae. b) Disposición perítrica en Escherichia coli El crecimiento de los flagelos no se produce a partir de la base, sino a partir de la punta. Los flagelos bacterianos están constituidos por una proteína denominada flagelina. Cada flagelo es una estructura semirrígida incapaz de flexionarse que se mueve mediante rotación de su base, como lo hace una hélice. Los organismos de flagelación peritrica se mueven en línea recta y de manera lenta, mientras que los organismos con flagelos polares, se mueven dando giros periódicos (giran sobre sí mismos) y de una manera más rápida e impetuosa.

32 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 31 Como muchos procariotas son móviles aquellas células que puedan desplazarse tienen una ventaja adaptativa en ciertas condiciones ambientales frente a aquellas que no puedan hacerlo. Los procariotas entran en contacto en la naturaleza con numerosos gradientes físico-químicos. El objetivo de las células que presentan movilidad es responder a estos estímulos (en forma positiva o negativa), es decir, dirigiendo el movimiento de la célula alejándose o acercándose a estos gradientes. Los movimientos dirigidos de las células se denominan taxias: la quimiotaxia es la respuesta de los organismos frente a estímulos químicos y la fototaxia es la respuesta de los organismos frente a la luz. En este sentido, muchas bacterias presentan respuestas a diferencias en concentraciones de diferentes sustancias químicas, otras bacterias fotosintéticas responden a la diferencia de intensidad lumínica, pudiendo llegar a distinguir entre dos fuentes de luz que difieran en solo un 5% de intensidad. Algunas veces la respuesta es positiva (hacia las sustancia química o la fuente de luz) y otras veces es negativa (alejamiento o repulsión). Asimismo, existen otras taxias como la aerotaxia donde los organismos se mueven en relación a las diferentes concentraciones de O 2 en el medio (acercándose o alejándose). Fimbrias Las fimbrias presentan una estructura similar a los flagelos y son de naturaleza proteica, pero no participan en la movilidad. Las fimbrias son bastante más cortas que los flagelos y son mucho más numerosas (Figura 27). Su función es favorecer la fijación a superficies (tejidos animales en el caso de algunas bacterias patógenas), la formación de biopelículas (biofilms) o fijación a superficies. Pilis Son estructuralmente similares a fimbrias, pero por lo general son más largos y solamente existen unos o pocos pilis sobre la superficie (Figura 27). Los pilis también participan en la adhesión a superficies y tienen una función muy importante en el proceso de conjugación en procariotas (intercambio genético entre bacterias).

33 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 32 Fimbrias Pili Fig 27: Fimbrias y pilis. Se observan dos bacterias intercambiando material genético mediante un pili Cápsulas, vainas y pedúnculos Algunas bacterias y cianobacterias segregan materiales mucosos o gomosos que les sirven para la adhesión y protección celular. Estas capas mucosas están compuestas por polisacáridos, polipéptidos, o complejos de polisacáridos y proteínas. Se denominan cápsulas (Figura 28) cuando la capa mucosa rodea totalmente la célula de un modo compacto. En cambio, se llama vaina cuando la capa mucosa engloba a varias células y se denomina pedúnculos cuando el mucus se localiza en un extremo de la célula, lo que le permite adherirse a las superficies como si tuviera un pie. Las capas mucosas no son esenciales para la vida de los microorganismos (cepas mutantes sin cápsula son capaces de crecer normalmente), sin embargo les otorga gran poder adaptativo en el ambiente. Las bacterias capsuladas tienen varias ventajas: son más difíciles de fagocitar por los protozoos del suelo o por los leucocitos (glóbulos blancos) de un huésped, tienen mayor resistencia a la desecación, mayor contacto con algún sustrato específico (por ej. las bacterias que producen las caries en los dientes), etc. Además, las cápsulas de las bacterias patógenas son asiento de las toxinas que provocan la enfermedad en el huésped.

34 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 33 Cápsula Fig. 28: Cápsula viscosa de sustancias glucídicas que rodea a una bacteria Sustancias de reserva Muchos procariotas almacenan habitualmente diferentes sustancias en su citoplasma (como gránulos o inclusiones) como mecanismo de reserva energética o como reservorio para la construcción de macromoléculas. En organismos procariotas, una de las sustancias de reserva (cuerpo de inclusión) más frecuentes está compuesto por ácido poli-β-hidroxibutírico (PHB). El PHB es un compuesto lipídico formado por monómeros de ácido β-hidroxibutírico unidos por enlaces éster. La longitud de los monómeros varía entre 4 a 18 C. Los polímeros de PHB se agrupan dentro del citoplasma celular formando gránulos. En menor medida las bacterias pueden acumular glucógeno. El glucógeno es un polímero de subunidades de glucosa. Los gránulos de glucógeno en general son más pequeños que los de PHB. Otras bacterias con metabolismos especiales que utilizan otras fuentes de energía, pueden acumular otras sustancias de reserva, como por ejemplo fósforo y azufre. En este sentido, muchos organismos acumulan grandes reservas de fosfato inorgánico en forma de gránulos de polifosfato. Por otra parte, algunos procariotas son capaces de oxidar los compuestos de azufre reducido. En este caso, estos microorganismos acumulan azufre elemental en el interior de la célula en forma de gránulos. La presencia de gránulos con sustancias de reserva tiene estrecha relación con el estado nutricional de la célula. Cuando la bacteria absorbe más

35 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 34 de lo que metaboliza acumula compuestos químicos como reserva. Este mecanismo es muy útil en condiciones naturales particularmente en el suelo, donde la disponibilidad de recursos no es constante a lo largo del año. Vesículas de gas Las vesículas de gas son estructuras fusiformes, huecas pero rígidas. La membrana de la vesícula gaseosa está compuesta exclusivamente de proteínas que forman una estructura impermeable al agua y a los solutos, pero permeable a los gases (Figura 29). La rigidez de la membrana es esencial para que la estructura resista las presiones ejercidas desde el exterior. Una presión hidrostática elevada puede hacer colapsar la membrana perdiendo la capacidad de flotar. Numerosos microorganismos que flotan en lagos y en el mar presentan vesículas de gas que son responsables de la flotabilidad de las células en el medio. Las vesículas de gas representan una forma de movilidad que permite que las células floten a diferentes alturas en respuesta a diferentes condiciones microambientales. Vesículas de gas Fig. 29: Fotomicrografía electrónica de una cianobacteria Microcystis sp. en sección transversal mostrando las vesículas gaseosas en el interior celular.

36 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 35 Particularmente, las cianobacterias, que son bacterias fotosintéticas que viven en ambientes acuáticos presentan vesículas gaseosas que le permiten ascender al a superficie de los lagos y con la ayuda del viento se convierten en grandes acúmulos masivos (florescencias). En el caso de organismos que realizan fotosíntesis, la presencia de vesículas es esencial ya que les permite ajustar rápidamente su posición en el agua, hacia regiones donde la intensidad de la luz es óptima. Pigmentos En general las bacterias carecen de pigmentos y son transparentes. Las excepciones son las bacterias fotosintéticas que poseen diferentes tipos de pigmentos para la realización de la fotosíntesis (carotenos, bacterioclorofila, ficocianina, ficobilinas, etc.) y algunas bacterias que viven sobre la superficie de las plantas expuestas a la radiación ultravioleta que tienen pigmentos especiales que utilizan como mecanismo protector contra la radiación (melaninas). Endosporas Ciertas bacterias pueden producir en su interior estructuras de resistencia especiales llamadas endosporas o esporas bacterianas. Las endosporas son células diferenciadas (formadas dentro de una célula bacteriana) extraordinariamente resistentes al calor y difíciles de destruir con productos químicos incluso con aquellos extremadamente agresivos. Las endosporas bacterianas son diferentes en su estructura y formación a las esporas producidas por los hongos. El descubrimiento de las endosporas fue trascendental para la microbiología ya que el conocimiento de estas formas bacterianas de alta resistencia al calor fue decisivo para el desarrollo de los métodos de esterilización (eliminación total de los microorganismos). Las bacterias que forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo y se puede decir que cualquier muestra de suelo seguramente contiene endosporas. La estructura de la endospora es mucho más compleja que la de una célula vegetativa porque posee varias capas. La capa más externa llamada exosporium, es una cubierta fina y delicada de naturaleza proteica. Por debajo se encuentra la cúticula formada por proteínas específicas. Por debajo de esta

37 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 36 se encuentra el cortex (corteza), que es una capa compuesta por peptidoglicano con uniones laxas y hacia el interior del cortex está el núcleo que contiene la pared celular, membrana celular, el citoplasma, nucleoide, etc. Una de las sustancias químicas que es característica de las endosporas y que no se encuentran en las células vegetativas es el ácido dipicolínico que se localiza en el núcleo de la espora. Las esporas son ricas en iones de calcio que en su mayoría se combinan con el ácido dipicolínico formando complejos calcio-ácido dipicolínico (llamados dipicolinatos de calcio). Los complejos de dipicolinato de calcio reducen la disponibilidad de agua dentro de las endosporas, favoreciendo su deshidratación. Además, los complejos se intercalan en el ADN, insertándose en las bases, y de esta manera estabilizan el ADN frente a la desnaturalización por el calor. El citoplasma de una endospora madura difiere mucho del de una célula vegetativa de la cual se ha originado. La deshidratación incrementa ampliamente la termoresistencia de la endospora y al mismo tiempo le confiere resistencia a algunas sustancias químicas como el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada). Además, el citoplasma contiene gran cantidad de proteínas pequeñas que se forman durante el proceso de esporulación (formación de la espora) y que le otorgan a la espora resistencia al calor seco, radiación ultravioleta y a la desecación. Sin embargo, otras de las funciones de estas pequeñas proteínas es servir como fuente de C y energía para el desarrollo de una célula a partir de la endospora, un proceso que se denomina germinación. Para que ocurra la germinación de una endospora, primero debe ocurrir la activación de la misma. La activación se acciona por calor y luego se produce la germinación la cual implica una reactivación del metabolismo que rompe la hibernación. Generalmente, un agente ambiental es el que actúa como disparador de la germinación. Por ejemplo, temperaturas de C durante unos pocos minutos en presencia de nutrientes adecuados puede inducir la germinación de la espora. La espora absorbe agua, se hincha y su cutícula se rompe. La nueva célula vegetativa empuja hacia fuera de la cutícula y empieza a dividirse. No todas las bacterias tienen capacidad de formar endosporas. Los dos géneros de bacterias más conocidos que producen esporas son: Bacillus y Clostridium ambos Gram positivos y de amplia distribución en el suelo. Hasta la actualidad no se ha encontrado ninguna arquea formadora de endosporas.

38 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 37 Los factores que intervienen en la formación de las endosporas son complejos, pero se conoce que la falta de alimento es un factor clave para iniciar el proceso de esporulación. El primer paso para la formación de una endospora consiste en que la célula vegetativa madre gasta toda la energía en dividirse y formar las capas externas. El citoplasma queda reducido a un gel de proteínas con escasa cantidad de agua. Aunque son resistentes al calor y a la radiación extremos, las endosporas pueden ser destruidas mediante estos tratamientos. Así, la exposición al calor extremo por periodos largos de tiempo, así como la exposición prolongada a la radiación, (rayos gamma por ejemplo), matan a las endosporas. Las endosporas son difíciles de observar al microscopio debido a la impermeabilidad de su pared que evita la entrada de los colorantes empleados en las tinciones ordinarias. Mientras que el resto de la bacteria puede teñirse, la endospora permanece no coloreada. Debido a esto surgieron varias técnicas de tinción para poder teñir selectivamente las endosporas. Proceso de formación de las endosporas: Esporulación Etapas de la esporulación El proceso de esporulación en bacterias sigue una serie de etapas (Figura 30): 1. Duplicación del material genético (ADN) y división celular asimétrica. 2. Formación del septo de la endospora (se va aislando el ADN recién replicado junto a una pequeña porción de citoplasma). 3. Formación de la pre-espora (el septo de la endospora rodea la porción aislada). 4. Síntesis del exosporio, formación de una capa de peptidoglicano entre las membranas (cortex) y deshidratación. 5. Incorporación de calcio y producción de ácido dipicolínico. 6. La espora se recubre de una cubierta (cutícula). 7. Maduración de la endospora. 8. Lisis de la célula vegetativa y liberación de la endospora.

39 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 38 Condensación del ADN del ADN célula vegetativa ADN pared celular membrana plasmática División celular asimétrica Endospora en formación Invaginación Formación del septo Formación de de la la pre-espora Síntesis Síntesis de de exosporio; formación formación del cortex del cortex entre entre las las dos dos membranas exosporio cortex Incorporación de de dipicolinato de de calcio, deshidratación y y formación de de cutícula cutícula exosporio cortex endospora libre Maduración: desarrollo de de resistencia al al calor calor Lisis de de la la célula célula y y liberación de de la la endospora endóspora Fig. 30:Etapas de la esporulación en el género Bacillus Durante el proceso de esporulación, la posición de la espora dentro de la célula vegetativa varía según la especie de bacteria. En algunas, la endospora es central y en otras es terminal (en los extremos). A veces la espora tiene mayor diámetro que la célula madre por lo que se observa como hinchada (Figura 31).

40 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 39 Central Subterminal Terminal Endospora central Endospora subterminal Endospora terminal 0 Fig. 31: Posición de la endospora dentro de la célula bacteriana El conocimiento de las características de las esporas es de gran importancia práctica, puesto que muchas de las bacterias que forman esporas causan enfermedades muy graves en el hombre y animales (tétano, botulismo, etc.).

41 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 40

42 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 41 UNIDAD II: METABOLISMO MICROBIANO Se denomina metabolismo al conjunto de reacciones químicas que se producen en las células para obtener energía y sintetizar los compuestos vitales para los organismos. Las sustancias nutritivas que las células toman del medio son transformadas mediante una serie de reacciones enzimáticas consecutivas llamadas vías metabólicas. Las vías metabólicas incluyen: a) la hidrólisis y oxidación de sustancias nutritivas que se transforman en compuestos simples, produciendo energía (catabolismo) y b) la utilización de sustancias simples y energía, para sintetizar macromoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos e hidratos de carbono) que constituyen la estructura celular (anabolismo). Los mecanismos de obtención de energía han ido evolucionando desde el comienzo de la vida sobre el planeta. Toda liberación de energía implica una reacción de óxido-reducción entre dos pares redox. La eficiencia metabólica depende de dos aspectos claves: a) de la diferencia de potencial entre los compuestos que se oxidan y los que se reducen y b) de la cantidad de reacciones intermedias entre los pares redox. A mayor cantidad de reacciones intermedias, la liberación de energía se hace más lenta y permite mayor almacenamiento de energía química y menor pérdida de energía calórica. Los hidratos de carbono (CH 2 O) n constituyen las sustancias nutritivas más utilizadas por los organismos vivos para obtención de energía. Los organismos superiores tienen el metabolismo más eficiente que se ha desarrollado hasta el momento: la respiración aeróbica, que consiste en la reacción de óxido-reducción entre los pares (CH 2 O) n -CO 2 y O 2 -H 2 O, con una serie de pasos intermedios (glucólisis, ciclo de Krebs y cadena respiratoria) que permite almacenar gran cantidad de ATP. Las primeras formas de vida en el planeta fueron microorganismos que crecieron en ambientes con una atmósfera sin O 2 y con elevada cantidad de otros gases (NO 2, H 2 S, SO y CO 2 ) provenientes de las erupciones volcánicas que originaron la corteza terrestre. Por tal motivo, los microorganismos poseen además de la respiración aeróbica otros metabolismos con pares redox diferentes (por ej., (CH 2 O) n -CO 2 y H 2 S-SO -2 4 ), con un salto de potencial menor. Otros microorganismos poseen metabolismos con pocos pasos intermedios,

43 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 42 por lo que tienen escasa capacidad de almacenar energía (por ej. las fermentaciones que sólo poseen glucólisis). Para poder analizar los diferentes metabolismos microbianos se recurre a una clasificación nutricional que consiste en agrupar los metabolismos según 3 características básicas: Origen de la energía: luz solar (foto) o reacciones químicas (quimio). Tipo de compuesto que provee el poder reductor: orgánico (órgano) o inorgánico (lito). Tipo de compuesto que provee el C para la biomasa celular: orgánico (heterótrofo) o inorgánico, CO 2 (autótrofo). La combinación de estas tres características permite clasificar a los organismos como: foto-órgano-heterótrofos, quimio-órgano-heterótrofos, quimio-lito-autótrofos, etc. Así las plantas son organismos foto-lito-autótrofos (FLA), es decir, obtienen energía de la luz solar, el poder reductor del agua (lito) y la fuente de C celular del CO 2. Contrariamente los animales son quimioórgano-heterótrofos (QOH), obtienen energía de reacciones químicas y el poder reductor y el C celular de compuestos orgánicos, (CH 2 O) n. Los microorganismos tienen numerosas variaciones metabólicas, combinando estos tres aspectos, por ejemplo quimio-lito-autótrofos (QLA), foto-órganoheterótrofos (FOH), etc. Metabolismos quimio órgano heterótrofos (QOH) Los microorganismos QOH, obtienen la energía de reacciones químicas, y el poder reductor y la fuente de carbono a partir de compuestos orgánicos, por ejemplo la glucosa. Dentro de los metabolismos QOH existe 4 tipos fundamentales teniendo en cuenta cuál es el compuesto que establece el par redox con el par (CH 2 O) n -CO 2, es decir, el compuesto aceptor de los electrones liberados en la oxidación. Todos estos metabolismos parten de la oxidación de una molécula de hexosa. En general, las hexosas provienen de la hidrólisis externa de macromoléculas de (CH 2 O) n mediante la acción de enzimas segregadas por los microorganismos, que posteriormente absorben los monómeros. Los 4 tipos metabólicos QOH fundamentales son:

44 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 43 Respiración aeróbica cuando el aceptor de e - es el O 2. Fermentación cuando el aceptor de e - es un compuesto orgánico (ácidos orgánicos, alcoholes, etc.). Respiración anaeróbica: cuando el aceptor de e - es un compuesto inorgánico diferente al O 2. Oxidación incompleta: cuando los aceptores de e - son compuestos orgánicos. Respiración aeróbica La respiración metabólica se define como la oxidación completa de una molécula orgánica a CO 2 y H 2 O, con la consecuente formación de energía química en forma de ATP. En el caso en que el sustrato oxidable sea la glucosa, la respiración consiste en la oxidación de una glucosa a través de la vía de la glucólisis, originando dos piruvatos (3 átomos de C cada uno). Estos piruvatos sufren decarboxilación oxidativa y forman 2 acetil-coa (2 átomos de C) que se unen al oxalacetato y a través de una serie de reacciones del ciclo de Krebs, se oxidan completamente dando como resultado 2 CO 2, coenzimas reducidas (NADH y FADH 2 ) y GTP. Las coenzimas reducidas que se liberan en los diferentes procesos oxidativos, van a cadena respiratoria donde se reoxidan, dando lugar a la formación de ATP. Vías oxidativas de las hexosas Glucólisis: Es la vía metabólica por la cual la glucosa se oxida a compuestos de menor número de C, originando la formación de 2 moléculas de piruvato (3 C), dando lugar a la formación de 2 NADH y 2 ATP. Esta vía metabólica ocurre cuando la carga energética celular es baja (Fig. 1). ATP ATP Glucosa G6P F6P FDP 2 NADH 2 ATP 2 ATP 2 G3P 2 DPG 2 PG 2 PEP 2 Piruvato Fig. 1: Vía de la Glucólisis

45 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 44 Vía de las pentosas fosfato A(PP) La vía de las pentosas fosfato presenta 2 fases, la fase oxidativa donde la glucosa-6-fosfato se oxida formando fosfogluconato que por decarboxilación oxidativa origina una ribulosa-5-fosfato (Ru-5-P), en ambos pasos ocurre la formación de NADPH. A continuación ocurre la fase no oxidativa que consiste en reacciones de interconversiones entre moléculas de 3, 4, 5, 6 y 7 átomos de C, generando intermediarios utilizados para procesos de biosíntesis, tales como la Ribosa5P y la Eritrosa4P. Los productos finales de la vía de las pentosas se conectan finalmente a la glucólisis. (Fig. 2) Glucosa-6P NADP + NADPH Fosfogluconato Fase Oxidativa NADP + NADPH Ribulosa-5P Ribulosa-5P Xilulosa-5P Sedoheptulosa-7P Gliceraldehido-3P Fase No Oxidativa Xilulosa-5P Eritrosa-4P Fructosa-6P Gliceraldehido-3P Fructosa-6P Fig. 2: Vía de las Pentosas Fosfato Vía Entner-Doudoroff: Esta vía metabólica es de importancia principalmente en los géneros Zymomonas (bacterias fermentadoras de alcoholes) y Pseudomonas. La glucosa-6-fosfato sufre en primer lugar una oxidación, similar a la vía PP, y se convierte en 6-fosfogluconato. Posteriormente pierde una molécula de agua y forma 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, que se divide y origina piruvato y gliceraldehido3p (G3P), el G3P continúa su metabolismo por la vía de la glucólisis (Fig. 3).

46 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 45 Glucosa ATP G6P NADPH Fosfogluconato H 2 O 2 ceto 3 desoxi 6 gluconato Piruvato G3P NADH Glucólisis ATP ATP Piruvato Fig. 3: Vía de Entner Doudoroff La producción de ATP, NADH y NADPH es muy diferente entre las 3 vías de degradación. Por cada mol de glucosa oxidado hasta piruvato se forman: a) 2 moles de ATP y 2 moles de NADH por la glucólisis; b) 2 mol de NADPH y ningún ATP por la vía PP y c) 1 mol de ATP, 1 mol de NADH y 1 mol de NADPH por la vía Entner-Doudoroff. Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos Llamado así porque se ciclan compuestos de 4C con 3 radicales ácidos cada uno. En su función catabólica estos ácidos se combinan con el ácido acético activado (acetil-coa) originado por decarboxilación del piruvato. El acetil-coa se oxida completamente a CO 2, con la generación de poder reductor (NADH y FADH 2 ), este poder reductor va a ser transferido a cadena respiratoria para la generación de ATP. La oxidación de un mol de acetil-coa da lugar a 2 CO 2, 3 NADH, 1 FADH 2 y 1 GTP (Fig. 4)

47 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 46 CoA CO2 Piruvato NADH AcetilCoA NADH OAA Citrato Malato Isocitrato NADH Fumarato FADH 2 Succinato GTP Succinil-CoA CO2 α-cetoglutarato NADH CO2 Fig. 4: Ciclo de Krebs, función catabólica En su función anabólica el Ciclo de Krebs se alimenta por medio de una vía anaplerótica, la que consiste en la síntesis de algún intermediario del ciclo con la finalidad de poder utilizar alguno de los intermediarios del mismo como precursores de procesos anabólicos para la síntesis de esqueletos carbonados (Fig. 5). ATP ADP CO2 Oxalacetato Piruvato NAD + NADH CO2 AcetilCoA Citrato CO2 Isocitrato NAD + NADH NADPH α-cetoglutarato Glutamato NH 4 + Función anabólica de Ciclo de Krebs Fig. 5: Ciclo de Krebs, función anabólica

48 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 47 Cadena respiratoria La cadena transportadora de e - o cadena respiratoria (CR), tiene la función de reoxidar las coenzimas reducidas generadas en los distintos metabolismos, dando lugar a la formación de energía en forma de ATP. La CR está constituida por una serie de transportadores de e -, dentro de los cuales se encuentran algunos de naturaleza proteica (NADH deshidrogenasa, Citocromo reductasa, Citocromo c y Citocromo oxidasa) y uno no proteico, una quinona (ubiquinona) que es altamente hidrofóbica y conjuntamente con el citocromo c actúan como transportadores móviles de electrones (Fig. 6). Los electrones del NADH son cedidos a la NADH deshidrogenasa y se mueven a favor de un gradiente de óxido-reducción a través de los diferentes transportadores hasta el aceptor final de e - que es el oxígeno, el que se reduce para formar H 2 O. De la misma manera se comporta el FADH 2 quien cede los e - a nivel de la ubiquinona. Esta secuencia permite que una parte considerable de la energía se convierta en ATP (energía utilizable bioquímicamente) y sólo se pierda una cantidad mínima en forma de calor. NADH deshidrogenasa Succinato deshidrogenasa Ubiquinona Citocromo reductasa Citocromo c Citocromo oxidasa ATP sintasa Fig. 6: Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa Conjuntamente con ese transporte de e - se produce un bombeo de H + a través de los transportadores fijos de la CR (NADH deshidrogenasa, citocromo reductasa y citocromo oxidasa), dando lugar a la generación de un gradiente de H + a través de la membrana (fuerza protomotriz).

49 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 48 La fuerza protomotriz al disiparse a través de la única parte permeable de la membrana que es la subunidad F 0 (canal de protones) de la ATP sintasa permite la fosforilación del ADP dando lugar a la síntesis de ATP, proceso que se conoce como fosforilación oxidativa. La oxidación completa en condiciones aeróbicas de un mol de glucosa degradada por la vía de la glucólisis genera 38 ATP. Balance energético de la oxidación de un mol de glucosa Glucosa 2 Piruvato 2 NADH 2 ATP 2 Piruvato 2 AcetilCoA 2 NADH 2 CO 2 2 AcetilCoA Ciclo de Krebs CR y fosforilación oxidativa 6 NADH 2 FADH 2 2 ATP 4 CO 2 10 NADH 2 FADH 2 30 ATP 4 ATP 38 ATP Fermentación La fermentación es un proceso catabólico que se da en ausencia de oxígeno (anaerobiosis) y el producto final es un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los distintos tipos de fermentaciones. La fermentación es un proceso de óxido-reducción, equilibrado internamente donde el sustrato fermentable se oxida y reduce a la vez. En la fermentación la síntesis de ATP se realiza mediante la fosforilación a nivel de sustrato, en donde los enlaces fosfato ricos en energía de un intermediario orgánico fosforilado se trasfieren directamente al ADP para sintetizar ATP. El primer paso de toda fermentación es la glucólisis, en donde la glucosa es oxidada hasta formar 2 piruvatos. En condiciones anaeróbicas, el NADH producido por la glucólisis es transferido a productos intermedios o a aceptores especialmente sintetizados para regenerar el NAD +. Estos compuestos orgánicos reducidos son segregados por las células y constituyen el producto de la fermentación. El tipo de producto de secreción predominante define el nombre de las

50 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 49 fermentaciones: a) alcohólica (etílica), b) láctica, c) propiónica, d) ácido mixta, d) butírica, e) acética, etc. Fermentación alcohólica La fermentación alcohólica es una de las más comunes entre los microorganismos y consiste en la fermentación de azúcares simples produciendo etanol, CO 2 y ATP (que es consumido por los mismos microorganismos en su metabolismo). Luego de la glucólisis, la transformación del piruvato a etanol abarca dos procesos: a) la decarboxilación del piruvato dando acetaldehído y CO 2, y b) la reducción del acetaldehído, que acepta los e - del NADH producidos en la glucólisis, y se transforma en etanol. El balance energético es sólo de 2 ATP generados durante la glucólisis (Fig. 7). Glucosa 2 Piruvato 2 NAD + 2 NADH CO 2 2 Etanol 2 Acetaldehido Fig. 7: Fermentación alcohólica Los principales productores del etanol son las levaduras (hongos ascomycotas unicelulares) y algunas bacterias. Fermentación alcohólica por levaduras Las levaduras, como la mayoría de los hongos, son organismos de respiración aeróbica pero que en ausencia de O 2 presentan fermentación alcohólica (por la vía de la glucólisis). Debido a que la fermentación es un proceso de escaso rendimiento energético, las levaduras en condiciones anaeróbicas tienen una alta tasa de fermentación pero casi no se reproducen. Contrariamente, en condiciones aeróbicas la fermentación disminuye hasta reprimirse totalmente y aumenta la respiración aeróbica con alta tasa de reproducción celular. La fermentación en las levaduras constituye un mecanismo de sobrevivencia en condiciones anaeróbicas.

51 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 50 La inhibición de la fermentación por la presencia de O 2 se denomina efecto Pasteur, porque fue descubierto empíricamente por Luis Pasteur al trabajar con cultivos de levaduras para producir vino. Este efecto tiene enorme implicación práctica debido a que el hombre utiliza levaduras desde tiempos históricos para la producción de alimentos y bebidas. Entre los principales procesos industriales en que participan las levaduras se pueden encontrar: panificación, producción de cerveza, producción de vino y de otras bebidas alcohólicas como ser la aloja (chauchas de algarrobo), chicha (maíz), vodka (papa) y el ron (bagazo de la caña de azúcar). Fermentación alcohólica por bacterias En general, las bacterias con fermentación alcohólica utilizan la vía Entner- Doudoroff para el metabolismo de la glucosa (a diferencia de lo que vimos anteriormente que las levaduras lo hacen por la vía de la glucólisis). Fermentación láctica La fermentación láctica consiste en la producción de ácido láctico por reducción del piruvato que acepta los e - del NADH generado en la glucólisis (Fig. 8). Glucosa 2 NAD + 2 NADH Piruvato Lactato Fig. 8: Fermentación Láctica Los microorganismos que tienen fermentación láctica son bacterias de la familia lactobaciláceas. Si bien morfológicamente el grupo no es homogéneo (presenta bacilos largos, cortos y cocos), todas las especies son Gram positivas, no forman esporas, son inmóviles y anaeróbicas (o microaerófilas).

52 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 51 Hay dos vías metabólicas dentro de la fermentación láctica: a) la homofermentativa que produce un único producto fermentativo, el ácido láctico o lactato (Fig. 9) y b) la heterofermentativa donde además de láctico se produce etanol, CO 2 y en algunos casos acético (Fig. 10). Las bacterias lácticas homofermentativas degradan la glucosa por la vía de la glucólisis dando lugar a la formación de 2 lactatos, con la síntesis de 2 ATP. Mientras que las bacterias lácticas heterofermentativas no tienen capacidad de descomponer la fructosa1-6 difosfato (FDP) en triosas-p y oxidan la glucosa por la vía de las pentosas fosfato, generando una pentosa fosfato (xilulosa5p), que se convierte en G3P y acetil fosfato. El G3P se convierte en lactato con la producción de ATP y el acetil fosfato se reduce originando etanol sin producción de ATP. Además, cuando las heterofermentativas decarboxilan el 6-fosfogluconato para formar ribulosa5p dan lugar a la formación de CO 2 (lo que constituye un método sencillo para detectar una heterofermentativa en cultivos de laboratorio). 2 NAD + 2 NADH 2 ADP 2 ATP 2 NADH 2 NAD + Glucosa 2 Piruvato 2 Lactato fermentada Ganancia neta: 2 lactatos y 2 ATP por glucosa Fig. 9: Fermentación Láctica homofermentativa

53 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 52 Glucosa ATP ADP G6P 2 NADP + Fase oxidativa de las PP 2 NADPH CO 2 Ribulosa5P G3P Xilulosa5P Acetil P Ganancia neta: 1 ATP, 1 lactato, 1 etanol, 1 CO 2 y 2 NADPH por molécula NAD + NADH NADH ADP ATP Acetaldehido NAD + NADH Piruvato NAD + NADH Etanol NAD + Lactato Fig. 10: Fermentación Láctica heterofermentativa Las lactobacterias poseen altas exigencias nutritivas en cuanto a vitaminas y otros factores de crecimiento, por lo tanto en la naturaleza nunca se las encuentra en el suelo o el agua. Están presentes en sustratos altamente nutritivos como: a) leche, b) intestino y mucosas animales, c) superficie de las hojas verdes por la presencia de exudados, y d) en hojas en descomposición. Las bacterias lácticas producen gran cantidad de ácido láctico y poseen alta tolerancia a la acidez. Esta particularidad hace que desde tiempos antiguos la fermentación láctica haya sido utilizada por el hombre como proceso para la conservación de alimentos, como leche, vegetales y forrajes, debido a que la acidez impide el desarrollo de otros organismos degradadores.

54 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 53 Fermentación propiónica La fermentación propiónica consiste en la producción de ácido propiónico o propionato a partir del piruvato. La reducción del piruvato se lleva a cabo por un camino poco común. El piruvato es carboxilado hasta oxalacetato que acepta los e - del NADH producidos en la glucólisis y se reduce a succinato, que es decarboxilado generando propionato (Fig. 11). Fig. 11: Fermentación Propiónica A las bacterias que poseen fermentación propiónica se las agrupa dentro de la familia de las propionibacterias. Son Gram positivas, no poseen esporas y son anaeróbicas, aunque pueden soportar bajas presiones de O 2. Las propionibacterias viven en el rumen de los rumiantes (vacas, ovejas, etc.) y participan en la formación de los llamados ácidos grasos volátiles (AGV). También pueden encontrarse en la leche, el suelo y el agua. Fermentación ácido mixta Se llama fermentación ácido mixta al proceso metabólico que incluye la producción de diferentes ácidos con la formación de un compuesto metabólico intermediario: el ácido fórmico. Por tal motivo también se la conoce como fermentación fórmica, aunque este ácido no sea el producto final (Fig. 12). La reducción del piruvato comienza con una hidrólisis originando ácido fórmico y acetato. El ácido fórmico se hidroliza en CO 2 y H 2 y el acetil-coa se reduce utilizando el NADH generado en la glucólisis y pasa a etanol. Otra vía alternativa que la realiza el género Aerobacter consiste en que además de ácido fórmico como producto intermediario, se forma acetoína por la unión de 2

55 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 54 moles de piruvato y una doble decarboxilación. La acetoína (4 C) se reduce aceptando los e - del NADH y forma butirato o butilenglicol. Durante esta vía alternativa se produce gran cantidad de CO 2, (lo que justifica el nombre de la bacteria: Aerobacter aerogenes), debido a la hidrólisis del ácido fórmico y a la doble decarboxilación después de la unión de los 2 piruvatos. (Aerobacter) CO 2 NADH 2 ATP Acetoina Butanodiol Glucosa Piruvato 2 NADH Ácido Fórmico ATP AcetilCoA NADH CO 2 H 2 Acetato Etanol Fig. 12: Fermentación ácido-mixta A las bacterias que poseen fermentación ácido mixta se las reúne en la familia de las enterobacterias debido a que las especies más representativas viven en el tracto intestinal (enterón) de los animales de sangre caliente. Son bacterias Gram negativas, con forma de bacilo, móviles por flagelación perítrica y sin esporas. Las enterobacterias son aeróbicas facultativas, es decir, pueden obtener energía tanto por respiración aeróbica como por fermentación. Géneros y especies de importancia dentro de la familia de las Enterobacterias son: - Erwinia: incluye especies patógenas de vegetales que producen podredumbre blanca en tallos, hojas y raíces. - Klebsiella pneumoniae: responsable de infecciones del aparato - respiratorio (neumonía). - Salmonella typhimurium: causante de gastroenteritis. - Salmonella typhi: agente del tifus. - Shigella dysenteriae: causante de la disentería. - Escherichia coli: indicadora de contaminación fecal. E. coli O157:H7 es causante del Síndrome Urémico Hemolítico (SUH).

56 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 55 Fermentación butírica La fermentación butírica consiste en la producción de cantidades variables de ácidos (butírico, acético y láctico), de alcoholes (butanol, etanol e isopropanol) y gases (H 2 y CO 2 ). En general, las vías metabólicas son muy semejantes a la fermentación ácido mixta, excepto en que: a) se produce CO 2 y H 2 sin formar ácido fórmico como compuesto metabólico intermediario y b) se forma ácido butírico por condensación de 2 acetil-coa y no de 2 piruvatos (Fig. 13). Glucosa NADH ATP Piruvato NADH CO 2 ADP ATP H 2 AcetilCoA Acetato Acetaldehido Acetoacetato AcetoacetilCoA 2 H + 2 H + 2 H + Etanol Acetona CO 2 2 H + ButirilCoA 2 H + 2 H + ADP ATP Butirato Isopropanol 2 H + Butanol Fig. 13: Fermentación Butírica Las bacterias con fermentación butírica se engloban dentro del género Clostridium. Son bacterias con forma de bacilo, Gram positivas, esporuladas y móviles por flagelación perítrica. Son estrictamente anaeróbicas, ya que el O 2 tiene un efecto tóxico: como no poseen cadena respiratoria, en presencia de O 2 los H + del NADH son aceptados directamente por el O 2 formando peróxido de H (H 2 O 2 ) cuya acumulación provoca la muerte celular. Crecen a temperaturas cercanas a 37 C y a un ph entre 7 y 7,4. Fisiológicamente, los clostridios se diferencian de otras bacterias en que no sólo pueden utilizar azúcares simples, sino que también hidrolizan compuestos polimerizados como almidón,

57 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 56 proteínas, etc. Por ese motivo suelen agruparse en clostridios sacarolíticos, proteolíticos, amilolíticos, etc. La degradación de proteínas animales en ambiente anaeróbico produce mercaptanos responsables del olor a huevo podrido por actividad de los clostridios. Muchas especies de clostridios provocan serias enfermedades en animales y en el hombre porque sintetizan toxinas letales. Debido a que estas bacterias viven en el suelo y que son estrictamente anaeróbicas, estas enfermedades prosperan cuando se conjugan condiciones muy particulares. Las clostridiosis se clasifican en 3 grandes grupos: - Gangrena gaseosa - Enterotoxemias - Enfermedades neurotópicas Gangrena gaseosa: Carbunclo sintomático producido por Clostridium chauvoei, es una bacteria Gram positiva y sus esporas pueden permanecer vivas durante años en las pasturas. El animal al alimentarse ingiere los clostridios que llegan al intestino y al hígado, diseminándose rápidamente por sangre al tejido muscular, donde produce lesiones traumáticas, con una deficiente circulación de sangre (falta de oxígeno), lo que produce una rápida multiplicación de C. chauvoei, produciendo la lesión característica. Edema maligno producido por Clostridium septicum, la puerta de entrada de la bacterias son diferentes tipos de heridas (descole, castración, inyecciones de productos veterinarios, etc.), en esos lugares se crea una condición de anaerobiosis permitiendo la multiplicación bacteriana y liberación de las toxinas. Enterotoxemias: Riñón pulposo en ovinos, causada por C. perfringes (tipos A, B, C, D, y E), el tipo D está presente en baja cantidad en el intestino de animales sanos. Cuando se generan determinados cambios en el intestino la bacteria prolifera en grandes cantidades produciendo elevados niveles de toxinas, que terminan generando la enfermedad.

58 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 57 Hepatitis necrótica infecciosa, producida por C. novyi, las bacterias se encuentran en el suelo y en el tubo digestivo de los animales, van a hígado donde permanecen latentes durante largos periodos de tiempo. La muerte de los animales se produce por la proliferación de las bacterias en el hígado, para que esta proliferación ocurra es necesario que el hígado este afectado previamente, por eso esta enfermedad es común en zonas donde prolifera Fasciola hepática (parásito) o donde abundan plantas tóxicas que producen lesiones hepáticas. Enfermedades neurotópicas: Tétanos, producidos por toxinas de C. tetani, la espora es introducida a través de heridas, cuando se cierra la herida se crea una condición de anaerobiosis que produce la proliferación bacteriana y generación de toxinas que son transportadas al sistema nervioso central. Botulismo, producida por C. botulinum, bacilo Gram positivo, esporulado y anaerobio estricto. En condiciones ambientales favorables (humedad, temperatura, ph y concentración de sales) se produce la toxina, esta toxina es relativamente estable y altamente letal. En bovinos la infección se produce por ingestión de huesos, pastos o suplementos contaminados por la toxina. Respiración anaeróbica La respiración anaeróbica consiste en un metabolismo con todas las vías semejantes a la respiración aeróbica (glucólisis, ciclo de Krebs y cadena respiratoria) pero que se desarrolla en ambientes sin O 2. Por tal motivo, al final de la cadena respiratoria los aceptores de e - son compuestos inorgánicos con -2 O combinado (SO 4 y NO - 3 ) que se reducen cuando aceptan los e - del NADH. Este metabolismo constituye un gran avance evolutivo respecto a la fermentación, debido a la alta eficiencia en la obtención de energía en ambientes anaeróbicos. La cantidad de ATP generados depende del compuesto aceptor pero varía entre 15 y 34. Los productos de la respiración anaeróbica son: CO 2 y N 2, NO - 2 o H 2 S, según el aceptor. Respiración anaeróbica con aceptor NO - 3 (denitrificación) La energía que se obtiene utilizando NO - 3 como aceptor de e - es tan sólo un 10% inferior a la que se obtendría utilizando O 2. Las bacterias que tienen

59 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 58 respiración anaeróbica con aceptor NO - 3, son anaeróbicas facultativas, que - - sólo utilizan NO 3 o NO 2 cuando no hay O 2, produciendo N 2 y óxidos de N (N 2 O, NO, etc.). Como todos estos productos de la reducción del nitrato son gaseosos, se pueden perder con facilidad al ambiente, a través de un proceso conocido como denitrificación. Estas bacterias son muy comunes en suelos anegados, donde existe alta cantidad de restos orgánicos en descomposición, - abundancia de NO 3 y escasez de O 2. Las bacterias denitrificantes también se encuentran en ambientes pantanosos, cultivos de arroz y aguas servidas con las mismas características. Los géneros más comunes de bacterias denitrificantes son: Pseudomonas (bacilos Gram negativos con flagelación polar) y Bacillus (bacilos Gram positivos, esporulados y con flagelación perítrica). La volatilización del N por reducción de NO - 3 es un proceso muy útil en la naturaleza porque permite el retorno de N a la atmósfera, cerrando el ciclo del N. En la actualidad, el hombre ha modificado en gran medida el ciclo del N, especialmente por la incorporación de grandes cantidades de fertilizantes en los cultivos. Por tal motivo, el proceso de denitrificación no debe analizarse sólo como pérdidas de N sino también como un mecanismo de descontaminación de suelos y agua. El proceso de denitrificación es beneficioso para el tratamiento de aguas residuales, porque convierte el NO - 3 en N 2 y se disminuye de esta manera la carga de nitrógeno en los vertidos de las aguas residuales tratadas, que de otra forma estimularían el desarrollo de algas. Respiración anaeróbica con aceptor SO -2 4 (desulfatación) -2 La eficiencia energética de la respiración anaeróbica con aceptor SO 4 es - menor que la del aceptor NO 3 debido al menor salto de potencial redox. Los microorganismos que poseen este tipo de metabolismo constituyen un grupo muy reducido de bacterias anaeróbicas estrictas que producen H 2 S en ambientes ricos en materia orgánica en descomposición y permanentemente inundados como son los sedimentos de lagos y pantanos. Los géneros más comunes de bacterias desulfatizantes son: Desulfovibrio (de forma espiralada) y Desulfotomaculum (bacilo Gram positivo, esporulado y flagelado). Oxidaciones incompletas (función anabólica del Ciclo de Krebs) La oxidación incompleta es el proceso metabólico que presenta diferentes aceptores de e -. Los aceptores de e - son diferentes compuestos orgánicos,

60 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 59 muchos de ellos intermediarios de Ciclo de Krebs. Por lo tanto, los productos de este metabolismo son ácidos orgánicos (oxalacetato, fumarato, malato, lactato, acetato, citrato, etc.) y CO 2. La oxidación incompleta es un metabolismo adaptado a las condiciones nutritivas del medio. Generalmente, los microorganismos con capacidad de realizar respiración incompleta, poseen respiración aeróbica completa pero que, frente a una alta disponibilidad de alimentos, especialmente (CH 2 O) n, aumentan la velocidad de degradación y eliminan el excedente desde el ciclo Krebs. Debido a esto, algunos autores lo llaman metabolismo de superávit y lo consideran un mecanismo de reserva para cuando haya escasez de nutrientes en el medio. Además, muchos de los ácidos producidos son derivados a vías anabólicas para formar material celular debido a la alta tasa de crecimiento microbiano cuando las condiciones nutritivas son óptimas. El caso típico de esta adaptación metabólica lo constituyen los hongos del suelo, que cuando caen restos vegetales de manera concentrada (por ej. una cosecha o las hojas de los árboles en otoño), producen gran cantidad de ácidos orgánicos que pasan al suelo y son utilizados por otros microorganismos. La oxidación incompleta es un metabolismo muy utilizado en la industria para la fabricación de ácidos orgánicos. Esto se fundamenta en que el proceso industrial es más simple en comparación a la fermentación, que requiere condiciones de anaerobiosis. Mediante el manejo de las variables ambientales (cantidad de (CH 2 O) n, ph, temperatura, etc.) se pueden obtener industrialmente los diferentes ácidos. Generalmente, en la industria se utilizan diferentes especies de hongos pertenecientes a los Mucorales, Zigomicetes y Ficomycetes (géneros Rhizopus spp, Mucor, Aspergillus, etc). Sin embargo, para la producción de ácido acético para vinagre comercial se utilizan Acetobacterias (Acetomonas y Acetobacter), que son bacilos Gram positivos flagelados. Estas bacterias oxidan el alcohol producido en anaerobiosis por las levaduras y lo transforman en ácido acético cuando las condiciones son aeróbicas. El proceso industrial consiste en utilizar un medio con alto contenido de alcohol (generalmente vino) y someterlo a una fuerte aireación, provocando un metabolismo de superávit que elimina el ácido acético antes de entrar al ciclo de Krebs.

61 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 60 Metabolismos quimio lito autótrofos (QLA) Los microorganismos QLA, obtienen la energía de reacciones químicas, y el poder reductor y la fuente de carbono a partir de compuestos inorgánicos. El metabolismo QLA también es conocido con el nombre de oxidaciones inorgánicas, debido a que la energía se obtiene por oxidación de un compuesto inorgánico. Las vías metabólicas consisten en la liberación de H + de diferentes compuestos inorgánicos (NH + 4, H 2 S, H 2, Fe +2, etc.), que son transportados por el NADH hasta la cadena respiratoria, formando ATP. Los aceptores de e - son: en aerobiosis el O 2 produciendo H 2 O y en anaerobiosis el NO - 3 y el CO 2, produciendo N 2 y metano (CH 4 ), respectivamente. Los organismos que poseen metabolismo QLA aeróbico son de mucha importancia en los ecosistemas y particularmente en los agroecosistemas debido a que muchos de sus productos constituyen la base de la nutrición vegetal (NO - 3 y SO -2 4 ). Todos los organismos QLA utilizan el CO 2 como fuente de C para la síntesis celular. La vía metabólica utilizada para la reducción del CO 2 es la misma de las plantas, es decir el ciclo de Calvin-Bassham. Oxidación del NH + 4 y NO - 2 (nitrificación) La oxidación del NH 4 y el NO 2 produce NO 3 por lo que se denomina nitrificación. Generalmente son dos reacciones en cadena realizadas por bacterias diferentes (nitrificantes o nitrificadoras) en estrictas condiciones de aerobiosis (Fig. 14) Nitrosomonas: NH O 2 NO H 2 O Nitrobacter: NO O 2 NO H 2 O Fig. 14: Proceso de Nitrificación.

62 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 61 Las bacterias nitrificadoras pertenecen a la familia de las Nitrobacterias, son Gram positivas y crecen muy lentamente debido a la escasa eficiencia metabólica en la obtención de energía (reducido salto de potencial entre los pares redox y escasos pasos metabólicos intermedios). Los organismos nitrificadores al realizar el paso de un catión a un anión acidifican el suelo, lo cual incrementa la solubilidad de otros nutrientes inorgánicos (K, Mg, Ca y P). Oxidación del H 2 S (sulfatación) La oxidación del S reducido (H 2 S, S 0 o tiosulfato), se conoce como sulfatación -2 porque produce SO 4 (Fig. 15). Las bacterias que realizan oxidación del S son conocidas como tiobacterias (tio=s), y son Gram negativas, de flagelación polar. El género más conocido es Thiobacillus, que oxida diversos compuestos de S produciendo SO Otras bacterias sulfatadoras son las incoloras y filamentosas del S de los géneros Beggiatoa y Thiothrix. Estas bacterias oxidan el H 2 S sólo hasta S 0 que se deposita en las células como partículas de reserva. Similarmente a la nitrobacterias, la producción de SO -2 4 acidifica el suelo favoreciendo la solubilidad de los nutrientes para las plantas y el lavado de sales calcáreas. H 2 S S o S 2 O 3 SO 4-2 Fig. 15: Proceso de sulfatación A diferencia de la nitrificación, la oxidación del S puede realizarse en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Por ej., T. dentrificans puede vivir en - anaerobiosis, siempre que exista NO 3 en el medio que es utilizado como aceptor de e - de manera similar a la respiración anaeróbica (Fig. 16). a) H 2 S + -2 O 2 SO + 4 H 2 O b) H 2 S + -2 NO 3 SO + 4 N 2 Fig. 16: Sulfatación en condiciones aeróbicas (a) y anaeróbicas (b)

63 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 62 Esta alternativa metabólica generalmente crea confusión en el entendimiento de los procesos microbianos, debido a que un mismo - - metabolismo (QLA) puede producir NO 3 (nitrificación) y consumir NO 3 (denitrifricación) según las condiciones ambientales. En los ecosistemas, los procesos no deben sólo analizarse desde un punto de vista químico estequiométrico debido a que los organismos vivos están influenciados por factores adaptativos y de costo-beneficio. Oxidación del H 2 El H 2 producido en numerosos procesos fermentativos en ambientes anaeróbicos, puede ser oxidado por las bacterias QLA hasta H 2 O en condiciones aeróbicas o hasta metano (CH 4 ) en anaerobiosis, utilizando al CO 2 como aceptor de e - (Fig. 17). Las bacterias oxidadoras de H 2 pertenecen a los géneros Hidrogenomonas (aeróbicas) y Metanomonas (anaeróbicas). a) H 2 + O 2 H 2 O b) H 2 + CO 2 CH 4 Fig. 17: Oxidación del H 2 en condiciones aeróbicas (a) y anaeróbicas (b) En la actualidad, las bacterias del CH 4 son utilizadas para la producción de biogás, que consiste en la fermentación de desechos orgánicos (industriales o agrícolas) en estrictas condiciones de anaerobiosis para que el H 2 y el CO 2 producidos sean transformados en CH 4. En algunas Hidrogenomonas existe una alternativa metabólica que consiste en la obtención del C celular a partir de compuestos orgánicos simples y no a partir del CO 2. Estas bacterias se las considera que poseen metabolismo quimio lito heterótrofas (QLH).

64 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 63 Metabolismos foto lito autótrofos (FLA) Este metabolismo llamado comúnmente fotosíntesis, consiste en que los organismos obtienen energía a partir de la luz, el poder reductor de un compuesto inorgánico y el C celular del CO 2. Existen dos vías metabólicas muy diferentes dentro de la fotosíntesis de los microorganismos dependiendo de: a) cuál es el compuesto inorgánico que da el poder reductor y b) la cantidad de pasos metabólicos intermedios para el almacenamiento de energía. Debido a que en una de ellas no se produce O 2 y en la otra sí, se las denomina: fotosíntesis cíclica o anoxigénica y acíclica u oxigénica, respectivamente. Fotosíntesis cíclica o anoxigénica Es uno de los primeros mecanismos de obtención de energía desarrollado por la vida en el planeta. Consiste en la utilización de la energía solar, mediante la captación en un compuesto sensible a la luz (pigmento) y un sistema proteico muy simple para transformarla en energía química. Como es un sistema poco eficiente produce 1 ATP, y no produce NADPH, por lo que el H para la síntesis de C celular, lo obtienen por oxidación de compuestos inorgánicos de S (H 2 S y S 0 ) (Fig. 18). La síntesis de C celular se lleva a cabo por reducción del CO 2 mediante el ciclo de Calvin. La fotosíntesis cíclica sólo produce un salto de e - por activación del pigmento, ese e - una vez que trasladó la energía al ATP, vuelve desactivado al pigmento cerrando el ciclo. Los compuestos de S eran muy abundantes durante el desarrollo de la corteza terrestre a causa de que la atmósfera era rica en gases de origen volcánico y no tenía O 2. En la actualidad este tipo de fotosíntesis se sigue produciendo en ambientes con alto contenido de H 2 S, originado por la descomposición de restos orgánicos en condiciones anaeróbicas como son los pantanos y fondos de lagos. La fotosíntesis cíclica la realizan arqueas fotótrofas que son Gram negativas y móviles por flagelación polar. Se diferencian dos familias dependiendo del tipo de pigmento que poseen: las Tiorrodáceas o bacterias púrpuras del S (poseen carotenos) y las Clorobiáceas o verdes del S (poseen

65 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 64 bacterioclorofila). 2 H + H + Citosol 4 H + Membrana plasmática 2 H + Espacio periplasmático Citocromo 4 H + Centro de reacción P870 ATP sintasa Citocromo bc1 Fig. 18: Fotosíntesis cíclica u anoxigénica Dentro de las tiorrodáceas se encuentran bacterias de gran tamaño como Chromatium okenii (5 μm de ancho y 20 μm de largo) y Thiospirillum jenense (3.5 μm de ancho y 50 μm de largo) que se caracterizan por depositar el S 0 producido como gránulos de reserva en su citoplasma. En las bacterias, los pigmentos fotosintéticos se hallan ligados a las membranas intracitoplasmáticas que surgen como invaginaciones vesiculares o tubuliformes de la membrana citoplasmática. Fotosíntesis acíclica u oxigénica Esta vía fotosintética también es conocida como sistema II o fotosíntesis acíclica porque la luz del sol activa dos núcleos de pigmentos produciendo dos saltos de potencial redox que generan 2 ATP y 1 NADPH. Los e - necesarios para la síntesis de NADPH provienen de la fotólisis del agua (hidrolisis del agua estimulada por la luz) proceso que además libera los H + (utilizados para la síntesis de ATP) y el O 2 (Fig 19). Los microorganismos que realizan fotosíntesis acíclica son: a) las cianobacterias (procariotas) y b) las algas (eucariotas). Esta fotosíntesis es la más evolucionada y eficiente, siendo el proceso ampliamente utilizado por las plantas superiores. Si bien el proceso metabólico es igual, entre cianobacterias

66 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 65 y algas, las cianobacterias no poseen cloroplastos, por lo que las reacciones se realizan sobre las membranas internas. Estroma 2 H + H + Plastoquinona Membrana tilacoide 2 H + 2 H + Lumen Clorofila P680 Fotosistema II o P680 Citocromo bf Plastocianina Clorofila P700 Fotosistema I o P700 ATP sintasa Fig. 19: Fotosíntesis acíclica u oxigénica Metabolismo foto órgano autótrofo (FOA) Este metabolismo fotosintético consiste en que los organismos obtienen energía a partir de la luz y el C celular del CO 2 mediante el ciclo de Calvin, pero a diferencia de los FLA, el poder reductor proviene de compuestos orgánicos. Las bacterias que poseen metabolismo FOA son conocidas como bacterias purpúreas sin S o Atiorrodáceas, debido a que poseen carotenos (púrpura) pero no utilizan compuestos de S como dadores de H. Distribución de microorganismos fotótrofos Todas las bacterias fotosintéticas (FLA, FOA y FOH) se encuentran en ambientes acuáticos. Las bacterias purpúreas del azufre (tiorrodáceas) forman a menudo una capa de color rojo oscuro que recubre los sedimentos del fondo, mientras que las bacterias púrpuras sin S (atiorrodáceas) no son visibles como una capa pero también están presentes en los sedimentos. La localización en los sedimentos proviene de tres factores clave: a) que en los sedimentos existe gran cantidad de restos orgánicos en descomposición que les provee H 2 S y compuestos orgánicos como poder reductor para ambos grupos (FLA y FOA respectivamente), b) que en el fondo hay condiciones anaeróbicas y c) que los carotenos absorben luz con longitudes de onda larga ( nm) que no

67 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 66 son utilizadas por los organismos fotosintéticos superficiales como algas y cianobacterias. A estas capas de bacterias sobre el fondo se las conoce como epibentos o mat. Las bacterias verdes del S (clorobiáceas) debido a que poseen bacterioclorofila no se localizan en el fondo, sino que flotan en una zona donde se integran condiciones anaeróbicas, H 2 S disuelto y penetración de longitudes de onda de alrededor de nm. Las cianobacterias generalmente son flotantes o pueden estar depositadas en el fondo de zonas poco profundas debido a que poseen ficocianinas además de clorofila a. La ficocianina que otorga el color azulado a estos microorganismos posee un pico de absorción alrededor de los 450 y 500 nm, situado entre los dos picos de absorción de la clorofila a. Por eso a las cianobacterias también se las denomina algas verde-azules. Cuando el mat tiene cianobacterias que producen O 2 toda la capa de bacterias comienza a flotar (por las burbujas del O 2 ) desprendiéndose del fondo. Las cianobacterias son más tolerantes que las algas superiores a condiciones extremas. Por ej. pueden vivir en aguas termales con alto contenido de sales, etc. Esta capacidad adaptativa se debe a que están recubiertas por vainas mucosas que les permiten regular los factores ambientales externos. Muchas cianobacterias viven en ambientes terrestres que se inundan periódicamente formando una capa superficial sobre el suelo conocida como crust.

68 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 67 UNIDAD III: TAXONOMÍA Y CRECIMIENTO BACTERIANO TAXONOMÍA MICROBIANA La taxonomía es la ciencia de la clasificación y está constituida por dos subdisciplinas: la identificación y la nomenclatura. Siguiendo el sistema binomial de nomenclatura, a todos los organismos (incluidas las bacterias) se les asigna un nombre de género y otro de especie. Los nombres de especies y géneros son derivados griegos o latinos de alguna propiedad descriptiva apropiada a la especie en cuestión, y se escriben en cursiva. Una particularidad en taxonomía microbiana es el concepto de cepa que, en general, no se utiliza en organismos superiores. Debido a que los microorganismos se dividen por fusión binaria, una cepa es una población genéticamente idéntica obtenida a partir de una sola célula. Cuando se aísla un nuevo organismo debe publicarse la descripción y el nombre propuesto en la publicación oficial de registro para la taxonomía y clasificación de los microorganismos: International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB), y depositarse en una colección de cultivos aprobada por la World Intellectual Property Organization (WIPO). Los microorganismos depositados se conservan congelados o liofilizados y constituyen la cepa tipo de la nueva especie. El IJSB publica periódicamente la lista de nuevos nombres aprobados en el Manual Bergey s, uno de los principales tratados de taxonomía de los procariotas que está permanentemente actualizado (on line). Este manual es un componente de información clásica y molecular sobre todas las especies reconocidas de procariotas y contiene claves dicotómicas que son útiles para la identificación. Taxonomía bacteriana convencional La taxonomía bacteriana convencional consiste en clasificar las bacterias mediante: a) características morfológicas (carácter Gram, esporas, flagelos, etc.), b) tipo de metabolismo (QOH, QLA, FLA, etc.), c) características bioquímicas (sustratos y productos metabólicos), d) tolerancia a condiciones ambientales (diferentes gases, temperatura, ph, etc.), e) sensibilidad a los antibióticos, f) patogeneidad, g) relaciones simbióticas, h) características inmunológicas, e i) hábitat de origen.

69 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 68 Para identificar un organismo se sigue una secuencia, desde las características más generales a las más específicas, mediante claves dicotómicas hasta llegar a definir la especie. Esta metodología de identificación se emplea de rutina en microbiología clínica, pero a causa de la gran variabilidad y adaptación de los microorganismos en ambientes naturales resulta incompleta cuando se trabaja en condiciones de campo. convencional Ejemplo de una clave dicotómica utilizada en taxonomía bacteriana Eubacterias: Unicelulares, pared rígida, no fotótrofas. o Cocos (Gram+): Lactobaciláceas (bacterias del ácido láctico). Streptococcus, Leuconostoc, Micrococcus. Micrococáceas Aerobios: Sarcina, Micrococcus. Anaerobios: Sarcina, Methanosarcina, Thiosarcina. (Gram-): Neisserláceas. Aerobios: Neisseria Anaerobios:Veillonella o Bacilos No formadores de esporas (Gram+) Aerobios Corynebacterium, Arthrobacter. Anaerobios Propionibacteriáceas, Lactobaciláceas. (Gram-) Flagelación polar pseudomonas, Acetomonas, Acetobacter, Nitrobacteriáceas, Tiobacteriáceas. Flagelación peritrica enterobacteriáceas, Azotobacteriáceas, Rizobiáceas. Inmóviles Parvobacteriáceas, Bacteroidáceas. Formadores de esporas (Baciláceas) Aerobios Bacillus Anaerobios Clostridium, Desulfomaculum. o Espirilos (Espiriláceas) Spirillum, Vibrio, Desulfovibrio. Bacterias próximas a las Eubacterias: o Bacterias fotótrofas: con pigmentos fotosintéticos, luz como fuente de energía. Bacterias purpúreas del azufre (Tiorrodáceas). Bacterias purpúreas (Atiorrodáceas). Bacterias verdes del azufre (Clorobiáceas). o Bacterias pedunculadas: con pedunculos. o Bacterias con vaina: vainas tubulares (Clamidobacterias). o Actinomicetes: con micelios. o Rickettsias: parasitismo obligado. Bacterias que se diferencian de las Eubacterias por características importantes: o Espiroquetas: pared celular delgada y flexible, movilidad por contracción de filamento axial. o Bacterias reptantes: móviles pero nunca por flagelos. o Mixobacterias: pared celular delgada y flexible. o Micoplasmas: sin pared celular.

70 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 69 Taxonomía molecular La taxonomía molecular consiste en clasificar a los organismos mediante las características de las principales biomoléculas orgánicas, particularmente los ácidos nucleicos. Tiene la ventaja de ser muy específica y sensible, por lo que en la actualidad es una metodología excluyente para la identificación taxonómica. Los métodos biomoleculares más utilizados son: a) composición de bases del ADN, b) secuenciación de nucleótidos, y c) hibridación del ADN. Composición de bases del ADN Consiste en establecer la proporción de las bases del ADN, expresadas en porcentajes moleculares (mol%) de Guanina+Citosina (G+C). Este método se fundamenta en que la cantidad relativa de G+C es característica para cada especie y que existe escasa variación en la cantidad de G+C dentro de un mismo grupo taxonómico (entre 3-5%). Además, existe una cierta correlación entre la composición de bases y el tipo fisiológico, por ej. los organismos de respiración aeróbica tienen una proporción de G+C entre 60-75% mientras que los organismos fermentadores poseen valores muy inferiores. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones porque lo que define las características de un organismo no es la cantidad de algunas bases sino la secuencia de las bases dentro del ADN. La determinación del porcentaje de G+C aporta información sobre la proporción de cada nucleótido del ADN de un organismo, pero no revela ningún dato sobre la secuencia de esos nucleótidos. Dos organismos pueden tener idéntica proporción de bases y sin embargo no estar relacionados entre sí (ni taxonómicamente ni filogenéticamente), ya que es posible tener secuencias diferentes con una misma composición global de bases del ADN. Por ejemplo, las especies del genero Bacillus presentan un amplio rango de porcentaje de G+C, mientras que bacterias de diferentes géneros dentro de las Enterobacterias tienen proporciones de G+C prácticamente idénticas.

71 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 70 Secuenciación de nucleótidos El método consiste en establecer el orden en que están colocados los nucleótidos dentro de las moléculas de ácidos nucleicos, basándose en el proceso biológico de replicación del ADN, donde se utiliza un cebador o primer para comenzar la amplificación. Luego de la amplificación se realiza una electroforesis (técnica utilizada para la separación de moléculas cargadas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico) para obtener un patrón de bandas del que se deduce la secuencia del ADN introducido. Esta información es clave para la diferencia entre organismos. Metodológicamente se trabaja con trozos cortos (pocos nucleótidos) tanto de ADN como ARN. Para la taxonomía de bacterias las moléculas más utilizadas son la fracción de 16S del ARN ribosómico (1500 nucleótidos) y el ADN de los plásmidos. Este último es muy importante para organismos de interés funcional como los fijadores de N 2, cuya enzima nitrogenasa se informa en el ADN de los plásmidos. Para establecer la identificación de los microorganismos se aplica un programa de similitud genética entre las secuencias de los nucleótidos analizados y los de otras especies conocidas. En la actualidad, toda la información sobre las secuencias de nucleótidos en especies identificadas está disponible en la Web en lo que se conoce como banco de genes. Células ADN Secuencia de ADN ADN aislado PCR Análisis de las secuencias Árbol filogenético Fig. 1: Pasos de la secuenciación de nucleóticos Hibridación de ADN La hibridación es la construcción artificial de ADN bicatenario a partir de dos monocatenarios y por complementariedad de bases. El método consiste en

72 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 71 poner en contacto moléculas monocatenarias de ADN de organismos diferentes para establecer su similitud a través del porcentaje de hibridación que se produce. Generalmente, el ADN de una cepa desconocida se pone en contacto con trozos de moléculas de una secuencia de nucleótidos conocida denominados primers. Este es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ADN. La proporción de similitud genética que se acepta para asignar el nivel taxonómico a dos organismos es: a) 99% o 100% pertenecen a la misma cepa (clon), b) mayor de 60% pertenecen a la misma especie; c) mayor de 20% pertenecen al mismo género, d) entre 1 y el 5% pertenecen a géneros no relacionados (Fig. 2). Organismos a comparar Organismo 1 Organismo 2 Organismo 3 Organismo 4 Preparación del ADN Cortar y marcar radiactivamente Cortar y marcar ADN cortado ADN cortado ADN cortado Desnaturaliza ción por calor Experimento de hibridación Mezclar ADN de dos organismos y añadir un exceso de ADN no marcado: ADN hibridado ADN hibridado ADN no hibridado ADN hibridado ADN no hibridado ADN hibridado ADN no hibridado Porcentaje de hibridación Resultados e interpretación: ADN control (misma cepa) 1 y 2 son de la misma especie 1 y 3 son del mismo género 1 y son de distintos géneros Fig. 2: Esquema del método de hibridación del ADN

73 Logaritmo del número de células Número de células Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 72 Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano se establece a través del incremento en el número de células de una población y por el consiguiente aumento de la biomasa microbiana. La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo. El tiempo requerido para que, a partir de una célula se formen dos células, se denomina tiempo de generación. El tiempo de generación varía ampliamente entre los microorganismos. Muchas bacterias tienen tiempos de generación de 1-3 horas, pero las de crecimiento rápido pueden hacerlo en 10 minutos, mientras que otras pueden tardar días. Las bacterias tienen crecimiento exponencial debido a que el número de células se duplica cada cierto período de tiempo. Si el crecimiento exponencial se grafica en ejes de escala aritmética, se obtiene una curva en la cual se va incrementando progresivamente la pendiente, lo que dificulta el análisis sobre la velocidad de crecimiento. Generalmente, el crecimiento bacteriano se grafica en escala logarítmica (base 10), que permite visualizar directamente el tiempo de generación (Fig. 3). Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad de incremento en el número de células es lenta inicialmente, para después incrementarse constantemente en una auténtica explosión del número de células Log N bacterias N bacterias Tiempo en horas Fig. 3: Crecimiento bacteriano en función del tiempo.

74 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 73 Cálculo de tiempos de generación El incremento de número de células que tiene lugar en un cultivo creciendo exponencialmente es una progresión geométrica del número 2. Al dividirse dos células (para dar cuatro) podemos expresar esto como Al dividirse 4 para dar 8 se puede poner como y así sucesivamente. Debido a la progresión geométrica, hay una relación directa entre el número de células iniciales y las finales a un tiempo determinado: N = N 0 2 n Donde N = número final de células, N 0 = número inicial de células y n = número de generaciones que han ocurrido durante el período de fase exponencial. El tiempo de generación g de la población celular se calcula como t/n, donde t son las horas o minutos de crecimiento exponencial. Conociendo las poblaciones final e inicial es posible calcular el número de generaciones y a su vez el tiempo de generación. Para expresar la ecuación N= N 0 2 n en términos de n son necesarias las siguientes transformaciones: Se aplica logaritmo log N = log N 0 + n log 2 y se despeja el número de duplicaciones logn - logno n = log 2 También se puede calcular la velocidad de duplicación (v), o sea, el número de duplicaciones en el tiempo, que es la inversa al tiempo de generación: n/t ó 1/g. Los tiempos de generación son a menudo indicadores del estado fisiológico de una población microbiana y es muy utilizado en microbiología industrial para el monitoreo del proceso de obtención de diferentes productos.

75 Logaritmo Logaritmo del del número número de células de Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 74 Curvas de crecimiento El crecimiento de una población no presenta un crecimiento constante en el tiempo. Generalmente la velocidad de duplicación del número de células es muy lenta inicialmente, después se incrementa constantemente y posteriormente disminuye. Por tal motivo la gráfica de la curva de crecimiento presenta diferentes fases (Fig. 4): 1. fase de latencia. 2. fase exponencial. 3. fase estacionaria. 4. fase de muerte. Latencia Exponencial Estacionaria Muerte Latencia Exponencial Estacionaria Muerte Tiempo Tiempo Fig. 4: Fases del crecimiento bacteriano 1- Fase de latencia Cuando se traslada una alícuota de una población microbiana a un medio de cultivo nuevo, no ocurre crecimiento inmediatamente, sino después de cierto tiempo que se llama fase de latencia. Esta fase puede ser más larga o más corta dependiendo de muchos factores. Por ej., será larga si el cultivo iniciador es viejo, si la composición del medio fresco es diferente al original, etc. La fase de latencia se produce porque los organismos deben adaptarse a las nuevas condiciones antes de reproducirse. Generalmente si el cultivo es viejo o en latencia, las células deben comenzar a sintetizar enzimas o factores de crecimiento que ya no poseen. Similarmente, si el medio tiene una composición

76 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 75 diferente la célula debe sintetizar las enzimas necesarias para degradar los nuevos compuestos. Con fines prácticos industriales, se persigue que esta fase sea lo más corta posible para tener mayor eficiencia y productividad del cultivo. 2- Fase exponencial Es la verdadera fase de duplicación celular. La pendiente de la fase exponencial depende de las características genéticas de los microorganismos y de las condiciones del cultivo. En general, los procariotas crecen más rápidamente que los eucariotas y los eucariotas pequeños lo hacen más rápidamente que los grandes. Si en la industria se persigue la obtención de gran cantidad de células (por ej., producción de inoculantes), se manejan las condiciones de producción tendiendo a que la fase exponencial sea larga y de mucha pendiente (medio altamente nutritivo, control del ph, temperatura y aireación, etc.). 3- Fase estacionaria Se denomina fase estacionaria al periodo de tiempo donde no se detecta aumento o disminución en el número de células. Generalmente esta fase se produce por agotamiento de los compuestos nutritivos del medio de cultivo o por la producción de sustancias metabólicas que inhiben el crecimiento celular (por ej., producción de ácido láctico que baja el ph). Que no se detecte crecimiento no quiere decir que las células no se dividan, sino que la tasa de muerte y la de división celular están balanceadas. Cuando se pretende obtener un producto metabólico, se manejan las condiciones para que la fase exponencial sea corta y de mucha pendiente y que el cultivo entre en fase estacionaria rápidamente, donde se registra la mayor concentración del producto buscado. 4- Fase de muerte Cuando se desestabiliza el balance entre muerte y duplicación y se producen más muertes que divisiones, comienza la fase de muerte del cultivo. Esta fase tiene una pendiente exponencial negativa, que puede ser de la misma magnitud que la fase de crecimiento exponencial. En la práctica industrial esta fase es importante para evaluar el desarrollo de productos desinfectantes y esterilizantes, que pueden ser: a) bacteriostáticos, b) bactericidas o c) bacteriolíticos (Fig. 5). El efecto bacteriostático es el que detiene el crecimiento pero no mata a la célula. Los agentes bactericidas matan a la célula pero no se produce la lisis o ruptura de la célula, mientras que los

77 Logaritmo del número de células Logaritmo del número de células Logaritmo del número de células Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 76 bacteriolíticos matan a la célula mediante la lisis lo que se observa como una disminución en el número de células o de la turbidez después de añadir el agente. Tiempo Tiempo Tiempo Bacteriostático Bactericida Bacteriolítico Contaje de células totales Contaje de células viables Fig. 5: Efecto de productos desinfectantes y esterilizantes Tres tipos de acción de agentes antimicrobianos. La flecha indica el tiempo en el que se añadió una sustancia inhibidora del crecimiento a un cultivo en fase exponencial de crecimiento. Productos microbiológicos de carácter industrial Los productos industriales obtenidos por procesos del metabolismo bacteriano son de dos grandes grupos: alimenticios y farmacéuticos. En la actualidad también existe un amplio desarrollo para la obtención de productos para la agricultura como son los inoculantes y los bioinsecticidas como el Bacillus turigiensis. Dentro de los productos alimenticios se incluyen los de consumo directo como pan, cerveza, vino, etc. y los insumos para la industria alimenticia (enzimas, alcoholes, ácidos, etc.). Los productos farmacéuticos más importantes son los antibióticos. El descubrimiento y producción de los antibióticos fue un hito en la lucha por la salubridad humana. Los antibióticos son productos secundarios del metabolismo de algunos microorganismos, sintetizados para poder competir en el suelo frente a las bacterias. Por tal motivo no afectan a las células eucarióticas y pueden ser utilizados en organismos superiores sin dañar las células del enfermo. Los antibióticos típicos son: la penicilina (inhibe la síntesis de la pared celular de las bacterias) producida por el hongo Penicillium y la estreptomicina (inhibe la síntesis de proteínas en bacterias) producida por el

78 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 77 actinomycete Streptomyces. En la actualidad muchos antibióticos son sintetizados artificialmente y no a través de cultivos microbianos. La producción de inoculantes es uno de los objetivos de la Microbiología Agrícola y será extensamente desarrollado en otras unidades. Todos estos procesos microbiológicos industriales se basan en la potenciación de reacciones metabólicas que los microorganismos ya son capaces de llevar a cabo, con el fin de aumentar la producción del compuesto de interés. Cultivos continuos Para la producción industrial de cualquiera de los productos biológicos se han desarrollado tecnologías de alta precisión para evitar contaminaciones y optimizar el rendimiento. Los cultivos son realizados en equipos de fermentación especiales con condiciones controladas estrictamente. Un cultivo continuo es esencialmente un cultivo de volumen constante, y para mantener los cultivos de manera continua en fase exponencial se han desarrollado equipos denominados quimiostatos (Fig. 6), que consiste en evitar la fase estacionaria y de muerte mediante la incorporación de medio de cultivo fresco a medida que se va utilizando el sustrato original. Simultáneamente con la incorporación de medio fresco se retira el cultivo bacteriano ya crecido. Se denomina turbidostato cuando la incorporación de nuevo medio de cultivo se realiza según la tasa de crecimiento, evaluada por densidad óptica. Medio fresco del reservorio Aire estéril u otro gas Regulador del flujo Espacio con aire (gas) Recipiente de cultivo Cultivo Rebosadero Efluente con células microbianas Fig. 6: Métodos de cultivo continuo. Quimiostato

79 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 78 Fig 7: Métodos de cultivo continuo. Turbidostato

80 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 79 UNIDAD IV: ECOLOGIA MICROBIANA La ecología microbiana trata sobre la relación de los microorganismos con el ambiente donde habitan. El suelo superficial (0-20cm) es el ambiente donde ocurren la mayoría de los procesos microbianos que influyen sobre la nutrición de los cultivos, de los cuales se ocupa la Microbiología Agrícola. Desde un punto de vista ecológico, un ambiente está constituido por: 1) una fracción abiótica (el hábitat), y 2) una fracción biótica (los componentes vivos). La fracción abiótica del suelo incluye: a) partículas minerales de diferente tamaño y composición química, b) agua y solutos, c) gases y d) compuestos orgánicos; mientras que la fracción biótica incluye: a) raíces vivas de plantas, b) fauna (detritívoros) y c) microorganismos (descomponedores) (Fig. 1). Materia orgánica 4% Materia viva 1% Fig. 1: Constituyentes de la fracción abiótica del suelo Los diferentes componentes del suelo no forman una masa homogénea sino que están asociados otorgando una estructura particular. La base de la estructura del suelo la constituyen los llamados agregados. Un agregado es un conjunto de partículas minerales ligadas por compuestos orgánicos y organismos vivos. El tamaño de cada agregado es de aproximadamente 2 mm. El espacio que queda entre los agregados son los poros del suelo, donde circulan el aire y la solución del suelo (Fig. 2).

81 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 80 Fig. 2: Estructura de un agregado Componentes vivos del suelo a- Raíces de las plantas: es un componente muy importante en los suelos agrícolas y constituyen el nexo entre el suelo y la planta. Las raíces vivas modifican el ambiente edáfico porque absorben nutrientes y agua de la solución del suelo, respiran e incorporan CO 2 a la atmósfera del suelo, aportan restos orgánicos por exudación y descamación de células epidérmicas, contribuyen a la agregación de partículas minerales, etc. b- Fauna: se considera fauna del suelo a aquellos animales que se alimentan de los restos orgánicos existentes en el suelo. La fauna suele conformar cerca del 15% de la biomasa total del suelo, pero es muy variable dependiendo de las condiciones climáticas y de manejo de cada suelo. La fauna es considerada detritívora, ya que consume restos orgánicos y los metaboliza mediante respiración aeróbica (producen CO 2 y H 2 O). Por lo tanto, a diferencia de los microorganismos, la fauna no posee metabolismos especiales que les permitan liberar nutrientes inorgánicos, vivir en anaerobiosis, degradar moléculas recalcitrantes, etc. La fauna del suelo suele clasificarse según el tamaño de los organismos en: micro, meso y macro fauna (Fig. 3).

82 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 81 Fig. 3: Componentes de la micro, meso y macrofauna del suelo c- Microorganismos: son los verdaderos descomponedores de restos orgánicos transformándolos en compuestos inorgánicos, cerrando el ciclo de los elementos. Constituyen cerca del 85% de la fracción viva del suelo. Debido a que son microscópicos muchas veces es difícil de estimar la significancia del peso absoluto de microorganismos en un suelo. A modo de ejemplo, se puede hacer un cálculo muy general que ayuda a visualizar que, si bien la biomasa individual es muy pequeña, la gran cantidad de individuos hace que la biomasa absoluta sea muy grande. Biomasa microbiana del suelo Biomasa de bacterias Peso de una bacteria = Volumen x Densidad = cm 3 x 1.5g/cm 3 = 1.5 x g Bacterias/g suelo = 10 9 Biomasa de bacterias/g suelo = 10 9 x 1.5 x g = 1.5 x 10-3 g Biomasa por ha Peso de 1 ha = Volumen x Densidad

83 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 82 Volumen = m 2 x 0.2m = m 3 Densidad del suelo = 1 g/cm 3 P = m 3 x kg/m 3 = 2 x 10 6 kg Biomasa de bacterias por ha = 2 x 10 6 kg x 1.5 x 10-3 kg = kg/ha Este ejemplo sólo se refiere a la biomasa de bacterias, sin considerar el resto de los microorganismos de importancia en el suelo como los hongos y actinomycetes. Distribución de los microorganismos en el suelo De manera general se puede afirmar que los microorganismos se distribuyen según las condiciones ambientales y la disponibilidad de alimento. Por ej., en los primeros centímetros del suelo existe mayor cantidad de restos orgánicos y O 2, por lo que allí se dispone la mayor cantidad de organismos con metabolismos aeróbicos. A mayor profundidad los microorganismos aeróbicos se localizan donde se conjugan condiciones óptimas de humedad y aireación. Exceso de humedad satura los poros y se crean condiciones de falta de O 2. En las capas más profundas del suelo superficial existe mayor cantidad de microorganismos tolerantes a la falta de O 2 y/o anaeróbicos que degradan compuestos derivados de la actividad de los microorganismos más superficiales (Tablas 1, 2 y 3). Tabla 1: Distribución de grupos microbianos en el perfil del suelo Horizont e Prof. (cm) Abundancia de microorganismos Bacterias aeróbica s Bacterias anaeróbica s A A 1 A 2 B C Actinomycete s Hongo s Algas Protozoo s

84 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 83 Tabla 2: Abundancia de microorganismos en relación a la humedad del suelo Humeda d (%) % de la capacidad de campo Bacterias totales (miles/g) % relativo a la microflora total Tabla 3: Abundancia de microorganismos en relación a la materia orgánica del suelo Horizonte cm Bacterias Bacterias Materia orgánica aeróbicas anaeróbicas (%) (10 6 /g) (10 6 /g) A A B B C Hay otros factores de importancia que definen la distribución y presencia de microorganismos en el suelo. Uno de ellos es el ph. Es bien conocido que en ambientes ácidos predominan los hongos sobre las bacterias y contrariamente en ambientes alcalinos predominan los actinomycetes. Las bacterias en general están asociadas a suelos neutros (Tabla 4). Tabla 4: Abundancia de microorganismos en relación al tipo de suelo y ph del mismo Suelo ph Bacterias Actinomycetes Hongos Gris margoso Pardo arcilloso Arcilloso rojo Suelo tropical Podzol arenoso

85 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 84 Sin embargo, todos estos patrones generales de distribución son muy rígidos porque en el suelo la distribución de los microorganismos es muy heterogénea debido a la interacción de un sinnúmero de factores bióticos y abióticos y a las prácticas de manejo. Las principales situaciones que definen la distribución de microorganismos son: 1. Presencia de raíces: es bien conocido que la cantidad de bacterias aumenta exponencialmente en las cercanías de las raíces vivas de las plantas. Este efecto denominado "rizosférico" se debe a que las condiciones edáficas creadas por las raíces favorecen la disponibilidad de alimentos para las bacterias (exudados, descamaciones, etc.) y condiciones ambientales más adecuadas (protección, retención de agua, etc.) (Tabla 5). Tabla 5: Abundancia de microorganismos en relación a la proximidad de las raices Descripción de la muestra Suelo distante 15 cm 14.2 Suelo distante 0-15 cm 25.4 Suelo junto a raíces Bacterias (millones/g) Material superficial de la raíz Estructura de agregación: la agregación de partículas define diversos microambientes internos y externos al agregado que poseen características muy diferentes para el desarrollo de los microorganismos. Si un agregado es totalmente cerrado, en su interior se crean condiciones de anoxia, por lo que allí se localizan bacterias anaerobias inmóviles que se fijan sobre la materia orgánica que liga las partículas inorgánicas. Contrariamente, en la superficie exterior de los agregados se asientan organismos aeróbicos móviles en contacto con la solución y la atmósfera del suelo. 3. Prácticas de manejo agrícola: toda práctica agrícola conlleva grandes cambios en las condiciones del suelo que afectan la vida y distribución de los microorganismos. Por ej., el laboreo del suelo favorece la trituración, mezcla e incorporación de los rastrojos superficiales a la vez que aumenta la aireación del suelo. Estos factores determinan un crecimiento exponencial de los microorganismos, especialmente de los aeróbicos. En los últimos años la

86 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 85 adopción de la siembra directa (SD) modificó sustancialmente el funcionamiento del suelo agrícola, acercándolo más a las condiciones no disturbadas. Bajo SD los restos vegetales están localizados superficialmente y van siendo degradados gradualmente por los microorganismos que no sufren un aumento exponencial de su población (Tabla 6). Tabla 6: Abundancia de microorganismos en relación a las prácticas de manejo Microorganismo Relación siembra directa/laboreo convencional Prof Prof Aeróbicos Anaeróbicos facultativos Actinomycetes Nitritadores Nitratadores Hongos Una relación siembra directa/laboreo convencional mayor a uno estaría indicando una mayor abundancia de esos grupos funcionales en la siembra directa, mientras que una relación menor a uno indicaría mayor abundancia en laboreo convencional. Asimismo, debe tenerse en cuenta que el suelo está fuertemente afectado por la heterogeneidad de la vegetación que soporta y por las variaciones estacionales. Ambas situaciones modifican las características del suelo espacial y temporalmente, afectando la distribución de microorganismos. Interacciones biológicas de los microorganismos Los microorganismos del suelo no actúan de manera aislada, sino que establecen relaciones tróficas y ambientales con el resto de la vida del suelo. Desde un punto de vista ecológico, las interacciones pueden ser de carácter positivo (sinergismos) o negativo (antagonismos), según si los componentes de la relación se benefician o perjudican mutuamente.

87 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 86 Interacciones entre microorganismos Sinergismos 1. Comensalismo: se denomina comensalismo a la interacción en la cual un individuo se beneficia mientras que el otro no es afectado por la relación, por ej. bacterias que utilizan como alimento compuestos producidos mediante el metabolismo de otras. También se considera comensalismo cuando la actividad metabólica de un individuo elimina sustancias inhibitorias (remoción de sustratos), produce factores de crecimiento específicos o cambia las condiciones ambientales, favoreciendo el crecimiento de otros microorganismos. Un ejemplo de comensalismo es la relación entre los grupos de bacterias Nitrosomonas y Nitrobacter en medio rico en amonio. Dentro del ciclo biogeoquímico del nitrógeno, el proceso de nitrificación es la transformación del amonio en nitratos. Estas oxidaciones se dan por la actividad conjunta de bacterias autótrofas comunes en el suelo (Nitrosomas y Nitrobacter).En una primer etapa, Nitrosomas toma el amonio (NH + 4 ) presente en el suelo oxidándolo a nitrito (NO - 2 ). En una segunda etapa, Nitrobacter toma el nitrito (producto del metabolismo de Nitrosomas) para oxidarlo a nitrato (NO - 3 ). Nitrobacter es comensal de Nitrosomas, ya que se beneficia del producto de su metabolismo. Actinomycetes - hongos micorrícicos: existen microorganismos rizosféricos que promueven la formación de micorrizas. Ciertos acminomycetes (Rhodococcus, Streptomyces, Arthrobacter) han sido identificados como bacterias que se asocian al micelio de hongos ectomicorrícicos (comensal) y mejoran la formación de la micorriza. Estos microorganismos presentan una alta especificidad, dado que una misma bacteria puede ser benéfica para un hongo y negativa para otros. Algunos de los mecanismos por lo que benefician la micorrización son: promoción del establecimiento de la simbiosis por estimulación de la extensión micelial; incremento del contacto y colonización raíz hongo; reducción del impacto de factores ambientales adversos sobre el micelio del hongo. 2. Mutualismo: es la interacción entre individuos en la cual ambos aportan un factor que beneficia al otro. Se establece una relación de costobeneficio que perdura mientras sea conveniente para ambos. Hay muchos

88 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 87 ejemplos de relaciones mutualistas entre microorganismos, el más notable es la degradación de la pared celular de los restos vegetales donde actúan simultáneamente microorganismos que rompen enlaces químicos diferentes de las grandes moléculas y ambos se benefician con la liberación de los monómeros. En biodigestores anaerobios, la asociación de microorganismos asegura la degradación de la materia orgánica y la liberación final de metano. Un grupo de organismos (Syntrobacter) libera hidrógeno, necesario para el accionar del otro grupo que lo consume (Methanospirillum). A su vez, el segundo grupo mantiene concentración baja de H 2 y promueve la fermentación de los ácidos grasos y la producción de H 2 que regula el funcionamiento del biodigestor. Syntrobacter ác. Propiónico acetato + CO 2 + H 2 Methanospirillum 4 H 2 + CO 2 CH H 2 O Otro ejemplo común de mutualismo son Streptococcus faecalis y Lactobacillus arabinosus (organismos aislados de la leche). Cada una produce el factor esencial / factor de crecimiento requerido por el otro. Así, en un medio exento de ácido fólico y fenilalanina L. arabinosus produce el ácido fólico requerido por S. faecalis, y L. arabinosus utiliza fenilalanina, que es producida por S. faecalis.

89 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Simbiosis: a diferencia del mutualismo, esta interacción no es casual sino que perdura en el tiempo y generalmente posee especificidad entre los miembros. El ejemplo más claro de simbiosis entre microorganismos lo constituyen los líquenes, que es una simbiosis entre un hongo y un alga (o cianobacteria) en un grado de estrechez tan estricto que suele considerárselos como un solo organismo. Los líquenes son simbiosis microbianas entre un hongo y un alga (o cianobacteria). El alga es el asociado fotótrofo y produce la materia orgánica de la que se alimenta el hongo. El hongo, incapaz de fotosintetizar, proporciona anclaje al alga protegiéndola de la desecación; y además excreta ácidos y compuestos orgánicos que estimulan la disolución y quelación de nutrientes inorgánicos que el alga necesita. Es por ello, que los líquenes se establecen comúnmente en hábitats secos como rocas desnudas o troncos de árboles, superficies donde otros organismos no crecen, y ellos son capaces de colonizar gracias a su asociación. Antagonismos 1. Competencia: es la interacción mediante la cual un individuo se beneficia en desmedro de otro. En esta interacción se engloban muchos mecanismos que utilizan los microorganismos para acceder al alimento y a mejores condiciones de vida. Se considera que los microorganismos mejor adaptados para competir son aquellos que presentan alta tasa reproductiva, mayor tolerancia a factores abióticos, bajos requerimientos nutritivos, capacidad de almacenar reservas y capacidad de movilizarse. Competencia por nutrientes El hongo, Fusarium oxysporum y la bacteria Agrobacterium radiobacter, son microorganismos del suelo que compiten naturalmente por carbono, uno de los principales factores limitantes en el suelo. Cuando los requerimientos de carbono son cubiertos por el agregado de sustancias carbonadas fácilmente degradables, se manifiesta competencia por otro factor esencial limitante, el nitrógeno.

90 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 89 Botrytis cinerea y Penicillium expansum son dos hongos de poscosecha dependientes de los nutrientes de origen orgánico. Como hongos necrotróficos colonizan la superficie de frutas heridas, ya que sus esporas requieren de estas sustancias para germinar y comenzar el crecimiento de las hifas antes de penetrar al sustrato. Aquí, la competencia microbiana puede resultar en la inhibición del desarrollo de estos patógenos. Competencia por espacio Las levaduras son eficaces colonizadoras de la superficie de plantas, produciendo materiales extracelulares (especialmente polisacáridos) que restringen el espacio para la colonización por otros microorganismos. 2. Amensalismo: muchos lo consideran un tipo especial de comensalismo debido a que un organismos perjudica a otro mediante la producción de sustancias tóxicas biocidas. Las sustancias biocidas más comunes sintetizadas por los microorganismos son tanto inorgánicas (H 2 O 2, NH + 4, NO - 2, etc.) como orgánicas. Dentro de estas últimas se incluyen los ácidos y alcoholes producidos en las fermentaciones (biocidas débiles) y los antibióticos de alta toxicidad. Muchos hongos y actinomycetes producen antibióticos que controlan las poblaciones bacterianas, lo cual favorece el avance de otros organismos de menor tasa reproductiva y escasa eficiencia metabólica. Bacterias y hongos de la rizósfera pueden producir sustancias aleloquímicas o antibióticos que impiden el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos edáficos en las plantas. Las bacterias producen quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía. Así, algunas bacterias quitinolíticas, son agentes potenciales para el

91 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 90 control biológico de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos, ya que degradan la quitina presente en la pared celular del hongo. En algunos casos, también las bacterias fitopatógenas pueden ser controladas por estas enzimas quitinasas, pudiendo degradar la pared bacteriana. Bacteria productora de toxinas: Agrobacterium radiobacter K84 produce la toxina Agrocina 84, efectiva en el control de Agrobacterium tumefaciens (agente causal de la agalla de corona). Se trata de una bacteriocina, sustancia que las propias bacterias elaboran para el control de las poblaciones, y por lo tanto, inhibe el crecimiento de las cepas patógenas. Bacteria productora de antibióticos: La bacteria Pseudomonas cepacia es colonizadora de las raíces de muchos cultivos. Ésta produce antibióticos, que son efectivos contra un diverso rango de hongos patógenos de las plantas. Cuando se aplica a semillas, la bacteria coloniza el sistema de raíces en desarrollo y por la producción de antibióticos protege las semillas de hongos y nematodos patógenos para la planta. 3. Parasitismo: es la interacción entre dos organismos en los cuales uno utiliza el material vivo del otro por largos periodos de tiempo, llevándolo en algunos casos a la muerte. El ejemplo más significativo de parasitismo entre microorganismos lo constituyen los virus, que necesitan bacterias vivas para reproducirse (bacteriófagos). Bacteria bacteria: es el caso de Bdellovibrio bacteriovorus, una bacteria gram negativa que habita en los suelos, especialmente en la zona rizosférica de plantas y parasita otras bacterias. B. bacteriovorus forma un poro en la pared celular de su huésped, penetra en ella y se desarrolla hasta colapsarla; provoca desorganización de la zona nuclear y de la pared de mureína de la célula huésped, digiriendo su contenido celular. Es por ello que B. Bacteriovorus es utilizada para control biológico de enfermedades provocadas por agentes bacterianos. 4. Predación: consiste en que un organismo se alimenta de otro organismo vivo. En el ecosistema suelo, la predación más importante es la de los protozoarios sobre las bacterias. Esta interacción está regulada por el número de presas (bacterias) y el costo de energía para su captura. Es decir que la predación cesa cuando el predador gasta más energía en buscar y capturar una presa que la que gana por ingerirla.

92 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 91 Dentro del ecosistema ruminal, se establecen numerosas relaciones entre los microorganismos involucrados en el proceso metabólico. Una de ellas es la predación de los protozoos sobre bacterias y hongos. Interacciones microorganismo-planta (efecto rizosférico) Las plantas y los microorganismos del suelo establecen casi las mismas interacciones ecológicas que los microorganismos entre sí. Sinergismos: 1. Comensalismo: es la interacción más conocida en la cual los microorganismos se benefician con: a) los productos de exudación y descamación de las raíces (aminoácidos, polisacáridos, etc.) y b) la regulación de las condiciones ambientales alrededor de la raíz (ph, humedad, relación CO 2 /O 2, etc.). 2. Mutualismo: es la situación más común en la zona rizosférica, debido a que si bien los microorganismos se benefician con la presencia de la raíz, las plantas se benefician con la actividad microbiana de la rizosfera. Muchos microorganismos rizosféricos fijan N 2, producen fitohormonas que favorecen el crecimiento vegetal, producen antibióticos que controlan organismos fitopatógenos, degradan fitotoxinas, solubilizan nutrientes, etc. 3. Simbiosis: es una interacción muy estrecha en la cual los microorganismos viven dentro de la raíz a expensas del aporte de fotosintatos de la planta, produciendo un beneficio que justifica la relación costo-beneficio. Los ejemplos más conocidos son: a) las micorrizas, donde el hongo que vive dentro de la raíz contribuye al crecimiento vegetal mediante la solubilización, absorción y concentración de nutrientes (particularmente P), y b) la simbiosis rizobium-leguminosa, donde la bacteria alojada en un nódulo radicular aporta N atmosférico en forma utilizable por la planta. Antagonismos: Muchas de las relaciones sinérgicas de la rizósfera pueden transformarse en antagónicas cuando las condiciones ambientales se vuelven limitantes. Bajo condiciones de estrés, la planta compite con los microorganismos por agua y nutrientes y en algunos casos los microorganismos producen fitotoxinas (amensalismo) para disminuir el crecimiento vegetal.

93 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 92

94 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 93 UNIDAD V: DEGRADACION DE COMPUESTOS ORGANICOS EN EL SUELO La actividad de los microorganismos del suelo depende de los restos orgánicos que ingresan al suelo que son la fuente de energía y C para la mayoría de los organismos edáficos. Los restos orgánicos en los ecosistemas terrestres y, más particularmente en los agroecosistemas, son mayoritariamente (95%) de origen vegetal (hojas, tallos, frutos, raíces, etc.) y en menor medida de origen animal (cuerpos de organismos muertos y excrementos). Tipos de materia orgánica del suelo (MO) No existe un acuerdo general sobre la denominación de los diferentes tipos de materia orgánica que se encuentra en el suelo y que pueden ser sustrato para los microorganismos. La forma de denominación más difundida es la siguiente: 1- MO fresca: son los restos orgánicos en lo cuales, por su tamaño y estado de conservación, es posible identificar su estructura y origen (por ej. si es una hoja, un tallo, excrementos, etc.). En general la mayoría de la MO fresca se localiza de manera superficial en el suelo, pero además existe un aporte de MO fresca a partir de raíces, los cuerpos de los microorganismos y los compuestos orgánicos exudados por las raíces vivas. 2- MO en descomposición o no humificada: también llamada biodisponible (se denomina así por el hecho de ser soluble y de bajo peso molecular). En este tipo de MO se incluyen los compuestos orgánicos solubles de bajo peso molecular originados de la degradación de la MO fresca superficial y que se incorporan al suelo con el agua de lluvia o riego. Es la fracción más fácilmente degradable por los microorganismos y por lo tanto de poca persistencia en el suelo, por lo que se encuentra en la porción del perfil con actividad biótica, principalmente en la superficie. La MO no humificada por su característica de solubilidad se encuentra asociada a la fracción líquida del suelo (en solución) en permanente circulación entre los poros, principalmente desde la superficie hacia abajo. 3- MO nativa o humus: es la materia orgánica que se sintetiza en el suelo a partir de los productos resistentes a la degradación de la MO fresca, por lo que constituye una fracción muy estable. Es la fracción responsable de las

95 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 94 características de fertilidad del suelo. Debido a que la MO nativa esta asociada a la fracción inorgánica (arcillas), formando los agregados, se localiza en todo el perfil del suelo, generalmente con un gradiente de concentración desde la superficie (mayor concentración) hacia la profundidad (menor concentración). Composición química de la MO fresca Los compuestos orgánicos más abundantes en la MO fresca son: 1- Compuestos simples: sustancias solubles que provienen del citoplasma de las células vivas. Por ej. aminoácidos, péptidos, azúcares, fenoles, etc. 2- Compuestos polimerizados, pueden provenir de : el citoplasma: proteínas, ácidos nucleicos, almidón, enzimas, etc. la pared celular: celulosa, hemicelulosas, pectina, lignina, quitina, mureína, etc. 3- Compuestos hidrófobos: provienen de los tejidos de reserva de las células y de la cutícula de las hojas (ceras, grasas, aceites, etc.) La proporción de los distintos compuestos depende del origen (animal o vegetal), de la especie, edad y estado fenológico de planta, de las condiciones climáticas del lugar, etc. Por ej., hay mayor cantidad de compuestos simples cuando en los restos orgánicos hay alta proporción de células vivas (abonos verdes), contrariamente hay mayor cantidad de compuestos de la pared celular en rastrojos y ramas de leñosas, en rastrojos de maíz más que en los de soja, etc. (Fig. 1 y Tabla 1).

96 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 95 Tabla 1: Composición química de distintos vegetales Constituyentes Centeno joven % de materia seca Alfalfa Acículas de pino Grasas y ceras Solubles en agua Hemicelulosas Celulosa Lignina Proteínas Cenizas Fig. 1: Composición química de la cebada en diferentes estados fenológicos Descomposición de la MO fresca Los compuestos orgánicos solubles de bajo peso molecular son fácilmente utilizados por los microorganismos que los incorporan directamente en la célula, entrando en las vías catabólicas. Contrariamente, los compuestos polimerizados, deben ser hidrolizados previamente fuera de la célula para poder ser incorporados como monómeros (Fig 2).

97 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 96 A: Fenoles B: Ceras C: Lignina D: Celulosa E: Hemicelulosas F: Azúcares Fig 2: Velocidad de degradación de diferentes compuestos orgániccos de la materia orgánica fresca Muchos microorganismos producen exoenzimas o enzimas extracelulares, que son excretadas sobre las grandes moléculas para producir su ruptura. Las exoenzimas tiene cargas eléctricas positivas por lo que pueden quedar retenidas en las arcillas o ácidos húmicos con lo cual pierden su funcionalidad. Asimismo las exoenzimas pueden sufrir degradación por otros microorganismos. Por tal motivo muchas bacterias localizan las exoenzimas en las cápsulas mucosas con las que además se adhieren a las grandes moléculas a degradar. Existen enzimas específicas para cada tipo de polímero. En general no todos los microorganismos segregan todas las enzimas, sino que es un carácter funcional que los diferencia. Los microorganismos suelen denominarse según la capacidad de hidrolizar compuestos polimerizados (por ej. amilolíticos, proteolíticos, celulolíticos, etc.) Hidrólisis de polímeros Proteínas: son compuestos esenciales para la vida celular, tanto de carácter estructural como funcional (enzimas). Son polímeros de aminoácidos ligados por uniones peptídicas (OC-NH). Las enzimas proteolíticas (proteasas) son muy comunes entre los microorganismos, sin embargo algunas proteínas son difíciles de degradar debido a que poseen estructuras muy complejas, por

98 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 97 ej., la queratina (pelos y uñas) presenta su estructura cuaternaria ligada por puentes disulfuro de difícil ruptura. Almidón: es un polímero muy común en la naturaleza. Constituye la sustancia de reserva de las plantas y muchos microorganismos. Es un homopolímero de glucosas ligadas por uniones glicosídicas α 1-4 (lineal) y α 1-6 (ramificación) (Fig. 3). Las enzimas amilolíticas (amilasas) son muy comunes en los organismos vivos, por lo que los microorganismos amilolíticos (bacterias, hongos y actinomicetes) son muy diversos y abundantes en todos los rastrojos y suelos. Amilopectin Amilosa Fig. 3: Estructura del almidón Celulosa: es el polímero esencial de la pared celular de las plantas y algunos hongos y algas. Es un homopolímero de glucosas que, a diferencia del almidón, están ligadas por uniones glicosídicas β 1-4 (Fig. 4). La enzima que puede provocar la hidrólisis de las uniones β, es muy poco frecuente en la naturaleza. Solamente algunos microorganismos tienen la posibilidad de sintetizar celulasas. Los más comunes son algunos hongos superiores, los actinomycetes y algunas bacterias deslizantes (mixobacterias) cuyas vainas les permiten adherirse a las moléculas de celulosa para su degradación. Antes se afirmaba que algunos protozoarios que habitan el rúmen eran celulolíticos, sin embargo ha sido demostrado que la degradación de la celulosa por algunos protozoarios se debe a que poseen bacterias celulolíticas endosimbióticas.

99 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 98 Pared celular Fibrillas de celulosa Célula vegetal Fibrilla de celulosa Microfibrilla de celulosa Molécula de celulosa Fig. 4: Estructura de la celulosa Microorganismos celulolíticos Tabla 2: Especies de microorganismos celulolíticos Clasificación Eubacterias Vibrio spp. Cellvibrio spp. Pseudomonas spp. Mixobacterias Cytophaga spp. Sporocytophaga spp. Actinomycetes Micromonospora spp. Phanerochaete spp. Nocardia spp. Streptomyces spp. Características Aerobios, mesófilos, espiralados Aerobias Gram -, bacilos, pigmentados Aerobias Gram +, bacilos Anaerobias Gram +, suelos inundados, turbas Aerobias, bacilos, suelos con abonos orgánicos Aerobias, cocos Crecen en agar mineral y celulosa, con pigmentos, halo alrededor de la colonia Entre los hongos celulolíticos podemos encontrar: Trichoderma reesei: hongo filamentoso y mesófilo. Utilizado industrialmente por su capacidad de secretar gran cantidad de enzimas celulolíticas. Fusarium solani: comúnmente aislado del suelo y detritos vegetales. Penicillium funiculosum: hongo tolerante a la acidez, que crece en suelos con ph ácido (ph 2), temperatura óptima de crecimiento C (rango de crecimiento 8 45 C).

100 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 99 Hemicelulosas: son polímeros que forman una matriz entre las fibras de celulosa de la pared celular. Existen varios compuestos diferentes englobados dentro de las hemicelulosas, pero todos son heteropolímeros de diferentes azucares ligadas por uniones glicosídicas α 1-4. Los azucares más comunes son xilosa y arabinosa (dentro de las pentosas) y manosa, galactosa y ácidos urónicos (dentro de las hexosas) (Fig. 5). Según su composición, las hemicelulosas se suelen denominar: xilanos, galactanos, mananos, etc. Los organismos hemicelulolíticos son muy comunes y abundantes en todos los suelos. Fig. 5: Azúcares que forman parte de las hemicelulosas Tabla 3. Especies de microorganismos hemicelulolíticos Clasificación Eubacterias Hemicelulosas Manano Galactomanano Xilano Galactano Arabano Bacillus spp Cytophagaspp. + Erwinia spp. + Actinomycetes Streptomyces spp. + + Hongos Alternaria spp. + Penicilium spp. + + Glomerella spp. + Polyporus spp Aspergillus spp. + + Fusarium spp. Trichoderma spp

101 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Pectina: es el polímero que une las paredes celulares de una célula vegetal con otra (laminilla media). Químicamente la pectina es un homopolímero de ácido galacturónico con uniones glicosídicas α 1-4. La enzima pectinolítica (pectinasa) es sintetizada por los organismos no solamente para utilizar los ácidos urónicos, sino también como mecanismo para acceder a las células vivas de las plantas, principalmente en los microorganismos parásitos y simbiontes. Dentro de los microorganismos pectinolíticos se pueden Figura 6. Estructura de la pectina Quitina: es un compuesto polimerizado que se encuentra en la pared celular de los insectos y de algunos hongos superiores. Es un homopolímero de n-acetilglucosamina ligadas por uniones glicosídicas β 1-4 (Fig. 7). La enzima responsable de degradar la quitina (quitinasa) es poco común en la naturaleza y es secretada exclusivamente por algunos microorganismos específicos. Por esta causa los exoesqueletos de insectos persisten por largos períodos de tiempo en el suelo. n-acetilglucosamina Fig. 7: Estructura de la quitina

102 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Mureína: es el compuesto característico de la pared celular de las bacterias. Es un heteropolímero de n-acetilglucosamina y ácido murámico ligados mediante uniones glicosídicas β 1-4, más un tetrapéptido (ver pared celular capítulo 1). Al igual que la quitina es un compuesto de lenta degradación. Generalmente la cadena de aminoácidos es degradada rápidamente (uniones peptídicas) mientras que las uniones β 1-4 son más persistentes. Lignina: es el compuesto típico de las paredes secundarias de los vegetales y de gran importancia en la constitución de leño (15-30%). La lignina es una molécula muy compleja formada por diferentes monómeros de estructura aromática (sustancias fenólicas: coniferol, sanapinol, cumarol) unidos por varios tipos de enlaces y gran cantidad de cadenas laterales de 3 a 5 C. En los vegetales los anillos aromáticos constituyen la base química de muchas hormonas, vitaminas, antibióticos y compuestos antiherbívoros (fenoles, taninos). La lignina otorga rigidez a los tallos de las plantas permitiéndoles elevarse sobre el suelo y constituye una adaptación evolutiva al pasar del ambiente acuático al terrestre (las plantas acuáticas no poseen lignina). Los microorganismos son los únicos seres vivos que sintetizan enzimas capaces de degradar totalmente la lignina. Debido a la complejidad química de la molécula, existen al menos tres procesos de degradación de la lignina: a) la hidrólisis de anillos aromáticos b) degradación de cadenas laterales y c) ruptura de los anillos aromáticos. Los dos primeros procesos liberan sustancias fenólicas solubles y son procesos rápidos que lo realizan numerosos microorganismos del suelo. Contrariamente, la ruptura de los anillos aromáticos es un proceso lento, específico de un grupo reducido de microorganismos, incluyendo algunos hongos superiores y actinomycetes. Por esta causa los anillos perduran largo tiempo en el suelo (Tabla 4).

103 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Tabla 4: Especies de microorganismos ligninolíticos Clasificación Hidrólisis de anillos aromáticos Efecto sobre la lignina Degradación de radicales libres Eubacterias Bacillus spp. + + Azotobacter spp. + + Pseudomonas spp. + + Ruptura de anillo aromático Actinomycetes Streptomyces spp Nocardia spp Hongos Basidiomycetes Pleurotus spp Phanerochaete spp Coriolus spp Polyporus spp Hongos Ascomycetes Xylaria spp Libertella spp Hypoxylon spp Sustancias grasas: forman el tejido de reserva en la mayoría de los organismos vivos, incluyendo bacterias y hongos. Son sustancias de alto poder energético por el elevado contenido de C y escaso O. Están formadas por un alcohol y cadenas de ácidos grasos de diferente cantidad de C y tipos de uniones. En los microorganismos la composición química de los ácidos grasos es muy variable por lo que actualmente se la utiliza como un carácter taxonómico molecular. En general las sustancias grasas simples son muy fáciles de degradar por los microorganismos, sin embargo algunas ceras poseen moléculas de hidrocarburos saturados que hacen que sean de lenta descomposición en el suelo. Sucesiones microbianas de la descomposición de la MO fresca La degradación de los residuos orgánicos es un proceso gradual donde intervienen numerosas especies de organismos de alta diversidad funcional, que actúan interrelacionados, extrayendo el máximo rendimiento energético posible. En el suelo se establece una cadena trófica en base a la sucesión de poblaciones microbianas con características metabólicas propias, de tal manera que los productos metabólicos de un grupo de organismos son utilizados sucesivamente por otros. En base a estas sucesiones se observan diferentes etapas en la descomposición de la MO fresca del suelo.

104 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Utilización de compuestos solubles de la MO fresca: las primeras poblaciones que actúan sobre la MO fresca son las que habitan la superficie de las hojas vivas (filosfera), que comienzan utilizando los compuestos solubles del citoplasma celular. La presencia de paredes celulares con elevado contenido de fibras insolubles (celulosa y lignina) y cutículas gruesas (sustancias hidrófobas), dificulta la accesibilidad de los microorganismos a los compuestos solubles. Por esta causa, en una primera etapa de descomposición, la fauna edáfica detritívora cumple un rol muy importante fragmentado los restos lo que posibilita una mayor superficie para la acción microbiana. El acceso microbiano a las paredes celulares se logra principalmente por la acción de hongos pectinolíticos que disuelven las laminillas medias. Una vez logrado el contacto con las paredes celulares los microorganismos obtienen los compuestos solubles del citoplasma que difunden desde las células muertas. La mayoría de los organismos metabolizan los compuestos solubles mediante respiración aeróbica hasta CO 2 y H 2 O. Sin embargo, y debido a que en esta etapa existe gran cantidad de alimento disponible, muchos hongos sacarolíticos (generalmente Zigomycetes) metabolizan los azúcares solubles mediante oxidaciones incompletas produciendo gran cantidad de ácidos orgánicos (Fig. 8). 2. Degradación de polímeros: en general la degradación de las paredes celulares es un proceso lento donde actúan varios grupos microbianos de manera sinérgica trozando los polímeros y utilizando los monómeros liberados. Como las paredes celulares son muy complejas se establecen las siguientes sucesiones: a) degradación de las hemicelulosas (proceso rápido), b) ruptura de los puentes de H que soportan la estructura de la fibra de celulosa, c) ruptura de los enlaces β1-4 (enzimas celulolíticas) con liberación de glucosas (proceso lento), d) ruptura de las uniones y consumo de radicales de la lignina con liberación de anillos aromáticos. Los microorganismos que hidrolizan los polímeros no consumen todos los monómeros liberados sino que la mayor parte pasa al medio donde son metabolizados por un gran número de organismos. Simultáneamente a la ruptura de la pared celular, otros grupos de microorganismos acceden al citoplasma hidrolizando los compuesto insolubles (almidón, ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y liberando gran cantidad de monómeros (glucosas, aminoácidos, etc.) (Fig. 8).

105 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Degradación de monómeros en el suelo: Una importante proporción de los compuestos solubles liberados de la MO fresca (ácidos orgánicos, glucosas, fenoles, aminoácidos, etc.), percolan y se incorporan a la solución que circula en los poros del suelo constituyendo la MO no humificada. En el suelo, los monómeros son metabolizados por los microorganismos localizados en la zona externa de los agregados. En esta situación, predominan organismos de respiración aeróbica, muy activos y de rápido crecimiento que acumulan gran cantidad de C en su biomasa. A medida que la disponibilidad de O 2 del suelo disminuye, a causa de la actividad respiratoria, estas poblaciones son reemplazadas por organismos fermentadores que producen ácidos orgánicos y alcoholes. Cuando en los poros del suelo se restituye la disponibilidad de O 2, los productos de la fermentación son oxidados hasta CO 2 y H 2 O. Ambos mecanismos, respiración y fermentación, se dan de manera sucesiva o simultánea en el suelo, dependiendo de las condiciones ambientales. Los cambios en la concentración de O 2 provocan gran mortandad de individuos, cuya biomasa se transforma en una importante fuente de MO fresca que es degradada internamente en el suelo mediante procesos similares a la MO superficial (primero los compuestos solubles, después los polímeros más simples y luego la mureína, quitina, etc.). Si la disponibilidad de O 2 no se restituye en el suelo (por ej. en suelos anegados), pero persiste gran cantidad de MO no humificada o biodisponible, actúan microorganismos con - respiración anaeróbica, que utilizan NO 3 y SO -2 4 como aceptores de H, produciendo CO 2 y N 2, N 2 O y H 2 S que se volatilizan (denitrificación y desulfatación) (Fig. 8). 4. Degradación de compuestos recalcitrantes (resistentes al ataque microbiano): cuando disminuye la cantidad de C fácilmente degradable (MO no humificada), las poblaciones microbianas declinan en mayor o menor grado dependiendo de la capacidad de adaptación y resistencia. Muchas bacterias esporulan, pero otras sobreviven mediante estados de latencia y cambios en la estructura de la pared celular. Bajo estas condiciones, organismos poco competitivos que se han visto relegados frente al alto crecimiento de otros microorganismos, tienen posibilidad de acceder a las fuentes de energía remanentes. Estas fuentes son compuestos de difícil descomposición (anillos aromáticos, grasas, ceras, quitina, mureína, etc.), que son metabolizados lentamente. Por este motivo, los microorganismos que actúan en esta etapa

106 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C son de crecimiento lento, poco numerosos y son responsables de la síntesis y condensación de las grandes moléculas orgánicas que constituyen la MO nativa o humus del suelo (Fig. 8). Descomposición de MO fresca COMPUESTOS SOLUBLES POLÍMEROS (almidón, celulosa, lignina) amilolisis celulolisis percolación ligninolisis, etc humificación HUMUS MONÓMEROS (glucosa, aminoacido, fenol) deshumificación Fermentacion ácidos orgánicos + alcoholes + gases oxidación incompleta ácidos orgánicos + H 2 O+ CO 2 respiración aeróbica CO 2 + H 2 O respiración anaeróbica SO -2 4 NO - 3 SO 4-2 SH 2 N 2 O/ N 2 volatilización Procesos bióticos (microbianos) Procesos abióticos Fig. 8: Proceso de descomposición de la materia orgánica Materia orgánica nativa o humus El humus del suelo está formado por polímeros muy complejos originados por condensación y polimerización de moléculas orgánicas recalcitrantes (fenoles) unidas por productos del metabolismo microbiano. Además de los anillos aromáticos provenientes de la degradación de la lignina, muchos microorganismos sintetizan sustancias fenólicas. Por ej., las melaninas (producidas por los hongos) otorgan la típica coloración oscura al humus (tierra negra). Muchos elementos minerales forman parte de las moléculas de humus. El más importante es el N que puede presentarse dentro de grupos aromáticos (pirroles) y como grupos amina en las cadenas laterales. Debido a la presencia de radicales de carácter ácido, el humus se encuentra estrechamente asociado a la fracción inorgánica del suelo, formando los agregados. Entre ambas fracciones se establecen uniones

107 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C catiónicas (unión de un catión entre las cargas negativas de las arcillas y los radicales ácidos del humus) y otras ligaduras más débiles como los puentes H, interacciones de Van der Vaals, enlaces polivalentes (Fig. 9). Arcilla Fenol Ácido húmico Pirrol con N M Catión Fig. 9: Estructura de un ácido húmico mostrando las interacciones físicoquímicas con una partícula de arcilla La formación de agregados beneficia la fertilidad edáfica ya que otorga mayor porosidad, aumenta la capacidad de retención de agua y favorece el intercambio calórico y la circulación del aire en el suelo. Asimismo, los radicales ácidos de las moléculas de humus contribuyen a la capacidad de intercambio catiónico, la regulación del ph, y actúan como reserva de nutrientes (NH + 4, Ca +2, Mg +2, etc.). Las sustancias húmicas son insolubles, con alta proporción de C y baja cantidad de O. Son escasamente biodegradadas por los microorganismos, lo que hace que sean muy estables en el suelo. La estabilidad de las sustancias húmicas varía según el tamaño de la molécula y el tipo de uniones químicas. Generalmente estas características están asociadas al grado de madurez del humus. Normalmente se distinguen dos tipos de sustancias húmicas: ácidos húmicos (Fig. 10) y ácidos fúlvicos (Fig. 11). Los ácidos húmicos poseen moléculas de elevado peso molecular ( a ) y uniones de alta complejidad resultado de largos procesos de maduración. Contrariamente, los ácidos fúlvicos son de menor peso molecular (1000 a ), mayor proporción de cadenas laterales y con

108 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C uniones químicas menos estables, lo que los hace más susceptibles a la degradación microbiana. Cuando en el suelo existe déficit de MO no humificada o biodisponible, los microorganismos recurren a las sustancias húmicas como fuente de C y energía. Bajo esas condiciones los microorganismos utilizan los ácidos fúlvicos y solo degradan los ácidos húmicos en situaciones de alto impacto productivo. Fig. 10: Composición elemental de los ácidos húmicos Fig. 11: Composición elemental de los ácidos fúlvicos Tabla 5: Composición química de los ácidos fúlvicos y húmicos Constituyentes Ácidos fúlvicos Ácidos húmicos C (%) H (%) N (%) S (%) O (%) Cenizas (%) OCH 3 (%) COOH (%) Fenoles (%) Acidez total (%)

109 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Balance humificación deshumificación La cantidad de humus de un suelo es resultado del balance que se establece entre la síntesis y la degradación de las moléculas complejas. Estos procesos pueden ser sucesivos o simultáneos y son afectados por numerosos factores ambientales. Entre los más importantes se incluyen: a) Cantidad de MO fresca aportada: el ingreso de MO al sistema suelo es muy variable dependiendo de tipo y estructura de la vegetación. Por ej. las leñosas caducas aportan mayor cantidad de residuos que las perennes, el cultivo de maíz mas que el de soja, etc. Generalmente el aporte de MO fresca se produce a manera de pulsos debido a que existen épocas del año con mayor aporte (cosecha, defoliación, etc.). Por tal motivo, hay mayor humificación cuando existe MO no humificada o biodisponible y mayor deshumificación en las épocas de escasez de MO fresca. b) Composición química de la MO fresca: es un factor de suma importancia debido a las grandes diferencias en los procesos de degradación de los compuestos de la MO fresca. Restos orgánicos con alta concentración de lignina y celulosa tienen alto potencial de humificación (por ej. tallos secundarios de leñosas, cañas de gramíneas, etc.). Contrariamente, hojas frescas de plantas jóvenes aportan gran cantidad de compuestos solubles de fácil degradación y bajo potencial de humificación. Se suele utilizar un índice de calidad para establecer el potencial de humificación de la MO fresca, el cual se calcula relacionando la cantidad de compuestos fácilmente descomponibles con los más recalcitrantes: compuestos solubles + hemicelulosas + proteínas celulosa + lignina + ceras a) Condiciones climáticas: en ambientes cálidos y húmedos (selvas tropicales) se favorece la actividad microbiana, por lo que se consume toda la MO fresca y no se produce humificación. Contrariamente, en ambientes fríos o muy secos (tundras y desiertos), con escasa o reducida actividad microbiana, los restos vegetales se acumulan sin degradar favoreciendo la humificación.

110 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C b) Prácticas de manejo: toda práctica de manejo que modifique la cantidad y calidad de MO fresca que ingresa al suelo, altera los procesos de humificación - deshumificación (por ej. talas, sobrepastoreo, monocultivos, etc.). Algunas prácticas de manejo son de muy alto impacto y colocan al suelo en situaciones de extremo estrés, lo cual desencadena procesos de deshumificación irreversibles. La labranza continua en suelos agrícolas ocasiona grandes pérdidas de humus debido a que el laboreo incorpora, mezcla y tritura la MO fresca (rastrojo), activa la primera etapa de la degradación de los residuos, destruye los agregados e impide la descomposición gradual y la condensación de moléculas recalcitrantes formadoras de humus. Otra de las prácticas de alto impacto es la quema de la vegetación: el fuego elimina toda la MO superficial y, dependiendo de la intensidad y duración, provoca la combustión de la MO nativa. Para poder estimar la tendencia de un suelo a humificar o perder MO, se suele utilizar un índice, denominado Índice de mineralización, que relaciona la producción de CO 2 (indicador de actividad microbiana) y la cantidad de MO del suelo (MO fresca, en descomposición y nativa): C-CO 2 /C-MO. Los valores de este índice varían entre 0.5 y 3.5. Valores = 1 indican un suelo con un equilibrado balance humificación-deshumificación, valores inferiores a 1, indican procesos de humificación, mientras que valores superiores a 1 indican pérdidas de C por deshumificación. Índice de mineralización = CO 2 / MO CO 2 : dióxido de carbono liberado por respiración microbiana MO: materia orgánica fresca, no humificada y humificada. Tasa de descomposición de la MO fresca El proceso de descomposición representa el principal flujo de C y nutrientes en muchos ecosistemas terrestres, por lo que cuantificar la tasa de pérdida de la MO fresca y los cambios en los nutrientes asociados a la MO fresca es un aspecto importante para evaluar el funcionamiento del ecosistema. La descomposición de la MO fresca juega un rol importante en la acumulación de C y nutrientes, como así también en la tasa y sincronización de la liberación de nutrientes en forma disponible para ser utilizado por las plantas y la biota

111 peso remanente (%) Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C del suelo. La descomposición de la MO fresca es controlada por la cantidad de MO fresca (morfología y química de los restos vegetales principalmente), condiciones abióticas (temperatura, humedad, textura del suelo, etc.) y la actividad biótica (microbiana y fauna). Los procesos de descomposición pueden servir como una variable integradora para la evaluación del funcionamiento del ecosistema, para la comparación de diferentes ecosistemas y para evaluar las prácticas de manejo u otras influencias antrópicas. La descomposición involucra no sólo la pérdida de biomasa, sino también involucra el lixiviado o lavado de compuestos orgánicos solubles e inorgánicos, la degradación de la MO y la trituración o fragmentación física de la MO fresca. Teniendo en cuenta la gran cantidad de factores que inciden sobre la degradación de los residuos orgánicos, la tasa de descomposición no es un valor constante a lo largo del año. Generalmente la curva de descomposición tiene una fase corta de máxima pendiente cuando la MO fresca ingresa al suelo (cosecha, defoliación), y luego una fase larga de menor pendiente. Estas fases se corresponden con las etapas de degradación de compuestos fácilmente descomponibles y de compuestos recalcitrantes respectivamente (Fig.12) meses Fig. 12: Curva de descomposición teórica o convencional Este patrón de curva convencional puede diferir sustancialmente dependiendo del clima y las condiciones de manejo. Por ejemplo en zonas áridas con inviernos secos y con caída de MO fresca durante el otoño, la curva presenta dos fases de pendiente pronunciada: una correspondiente al

112 perdida de peso (%) lluvia (mm) Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C ingreso de MO y la otra mayor cuando las condiciones de humedad y temperatura activan los procesos de degradación microbiana (primaveraverano)(fig. 13) Activación de procesos microbianos por temperatura y humedad inicila i invierno primavera verano otoño Fig. 13: Curva de descomposición en ambiente zona árida La velocidad de descomposición anual de denomina tasa de descomposición (k), y generalmente es un valor constante en ecosistemas no modificados por el hombre. Se calcula mediante la siguiente ecuación: Xt Xo e - k. t Xt = peso remanente al tiempo t Xo = peso inicial. k= pendiente. En base a la constante k se puede calcular la tasa de retorno de C al suelo: t r = 1 k

113 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Generalmente los ecosistemas de climas tropicales y los altamente estacionales poseen tasas de descomposición altas, mientras que los de climas fríos y/o desérticos tienen tasas muy bajas, lo que implica tasas de retorno de C muy altas y muy bajas respectivamente. Tabla 6. Tasas de descomposición de distintos ecosistemas: Ecosistema k t r (años) Chaco Árido (Argentina) Sabana seca (Sudáfrica) 0.10/ 0.35 Bosque subtropical seco (India) 0.43/ / 1.64 Bosque tropical seco (Costa Rica) 0.43 / 1.02 Bosque deciduo tropical (México) Bosque seco tropical (Belize) Bosque seco subtropical (Puerto Rico) Bosque subtropical húmedo (Argentina) 0.47/ 0.79 Desierto Chihuahuan (México) 0.48 / 0.64 Chaparral arbustivo (USA) 0.20/ / 4.55

114 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD VI: DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES PARA LAS PLANTAS El término nutriente disponible se aplica a los minerales que están solubles en la solución del suelo y que pueden ser absorbidos por las plantas. Los nutrientes solubles en el suelo se originan de reacciones químicas inorgánicas a partir de la roca madre o mediante procesos biológicos (reacciones bioquímicas). La mayoría de los procesos microbianos involucrados en la disponibilidad de nutrientes están relacionados con la liberación de los elementos minerales durante el proceso de descomposición de los restos orgánicos que se depositan en el suelo. Muchas moléculas orgánicas poseen elementos minerales mayoritariamente N, P y S, por ej. proteínas, ácidos nucleicos, vitaminas, etc. Durante el proceso de descomposición las cadenas carbonadas de dichas moléculas orgánicas son utilizadas como fuente de energía y C, mientras que los componentes minerales son liberados siguiendo diferentes vías según el mineral de que se trate. El proceso de liberación de minerales de las moléculas orgánicas se denomina mineralización (Fig. 1). N 2 SO 4-2 / SO 2 Fijación Biológica Precipitación Descomposición de MO fresca Precipitación volatilización NH 3 SH 2 asimilación (microorganismos y plantas) COMPUESTOS SOLUBLES POLÍMEROS mineralización NH 4 + SH 2 PO 4-3 amilolisis celulolisis adsorción (arcillas) solubilización percolación ligninolisis, etc sulfoxidación nitrificación SO 4-2 MONÓMEROS HUMUS NO 3 - Fermentacion oxidación incompleta respiración aeróbica respiración anaeróbica asimilación (microorganismos y plantas) lixiviación y/o escorrentía sedimentación desulfatación H 2 S volatilización denitrificación N 2 - N 2 O Procesos bióticos (microbianos) Procesos abióticos Fig. 1: Procesos microbianos de la liberación de nutrientes (N, F y S) asociados a la degradación de materia orgánica fresca.

115 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Disponibilidad de Nitrógeno El N es el elemento mineral más importante en la constitución de las moléculas orgánicas. El N presente en el suelo proviene mayoritariamente de la materia orgánica de los restos incorporados al suelo ya que el N no es un componente geoestructural del suelo (no hay minerales con N en la roca madre). La atmósfera constituye el mayor depósito de N en la naturaleza, el aire tiene un 78% de N gaseoso en forma de N 2, NO y N 2 O. El N atmosférico puede ingresar al suelo por precipitación atmosférica y fijación biológica. Debido a la gran versatilidad química del N (actúa con valencias desde -3 a +5) los procesos biológicos que involucran al N son muy variados permitiendo la oxidación y reducción de varios compuestos. Los estados de oxidación más comunes del N son: -3 en el amoníaco (o su ion amonio) y en las aminas de las moléculas orgánicas; 0 en el gas biatómico en la atmósfera; +3 en el nitrito; y +5 en el nitrato. En menor cantidad está como +1 y +4 en los óxidos de N gaseoso proveniente de la quema de combustibles fósiles. (OXIDACIÓN) NITRIFICACIÓN NH 3 N 2 H 4 N 2 H 2 N 2 N 2 O NO NO 2 - NO 2 NO 3 - (REDUCCIÓN) ASIMILACIÓN (vegetales y m.o.) FIJACIÓN DENITRIFICACIÓN Degradación de compuestos nitrogenados La mineralización del N de los restos orgánicos en descomposición incluye varios pasos: Amonificación La amonificación consiste en la ruptura del enlace amina y la consecuente liberación de amonio. Los microorganismos amonificadores no

116 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C obtienen energía por la ruptura del enlace sino que la obtienen de la oxidación de las cadenas carbonadas (metabolismos quimio-órgano-heterótrofos). Mucho del amonio liberado es reutilizado por los microorganismos para sintetizar sus proteínas estructurales y funcionales y el excedente es liberado al medio. Los microorganismos que realizan amonificación son muy numerosos y diversos: hongos, actinomycetes y bacterias aeróbicas y anaeróbicas, esporuladas o no, etc. Dependiendo del tipo de microorganismo varía la relación entre el N incorporado al citoplasma y el N liberado al medio. Por ej. los hongos tienen menor proporción de N citoplasmático (C/N=10) por lo que requieren proporcionalmente menor cantidad de N y liberan más N al medio que las bacterias (C/N=5). Los compuestos orgánicos con N más abundantes en el suelo son: proteínas, urea, ácidos nucleicos, aminoácidos, quitina (pared celular de hongos y exoesqueletos de insectos), mureína (pared celular de bacterias) ácidos húmicos (en grupos pirroles y cadenas aminadas), etc. El amonio liberado por los microorganismos en la solución del suelo puede ser (Fig. 3): Asimilado por las plantas y otros microorganismos Fijado a la superficie de las arcillas (las arcillas poseen cargas negativas) Incorporado a los ácidos húmicos (ver composición de los ácidos húmicos en la Unidad V). Oxidado por algunos microorganismos para obtener energía (metabolismo quimio-lito-autótrofos) Volatilizado como amoníaco en condiciones de sequía en el suelo Si bien a la planta le significa menor gasto energético utilizar amonio en vez de nitrato (no necesita ser reducido para incorporarlo a los aminoácidos), la gran capacidad de las arcillas para fijar amonio a sus cargas negativas hace que en la solución del suelo haya escasa cantidad de amonio disponible para las plantas. Debido a la gran diversidad de organismos amonificadores, la amonificación es un proceso que no tiene factores limitantes en el suelo.

117 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Siempre habrá algún microorganismo capaz de amonificar en las condiciones ambientales o de manejo que se presenten (Fig 1). Nitrificación La nitrificación consiste en la oxidación del amonio produciendo nitrito y nitrato. Esta oxidación la realizan organismos de metabolismo quimio-litoautótrofo, es decir obtienen energía de la oxidación de un compuesto inorgánico y sintetizan C orgánico a partir del CO 2 del aire (por el ciclo de Calvin). Los microorganismos capaces de oxidar el amonio (Nitrobacterias) son estrictamente aeróbicos muy poco abundantes y de escasa diversidad. Las Nitrobacterias tienen forma de bacilos, cocos o espirilos, son Gram positivas, flageladas, no forman esporas y presentan gran cantidad de membranas intracitoplasmáticas. Debido a que la oxidación del amonio genera escasa cantidad de energía, los microorganismos nitrificadores se reproducen muy lentamente (tiempos de generación de 40 hs.), lo que hace que sea un grupo funcional muy sensible a las variaciones ambientales y de manejo y que cualquier cambio en el suelo afecte su abundancia y actividad. La nitrificación la realizan dos grupos de microorganismos: los nitritadores (gen. Nitrosomonas) que oxidan amonio a nitrito y los nitratadores (gen. Nitrobacter) que oxidan nitrito a nitrato. Debido a las diferencias en el salto de potencial redox, el primer grupo obtiene mayor cantidad de energía que el segundo. Se estima que para fijar un mol de CO 2 por el ciclo de Calvin los nitritadores requieren 35 moles de N, mientras que los nitratadores requieren 100 moles de N. Los microorganismos nitritadores soportan amplios rangos de ph (entre 5 y 9) debido a que transforman un catión en anión, mientras que los nitratadores tienen rangos muy estrechos y son afectados por el ph alto. Este aspecto es de suma importancia debido a que la alcalinización del suelo (por ej. inmediatamente después de aplicar urea) puede hacer que el proceso de nitrificación se interrumpa en su última etapa y se acumulen nitritos en el suelo que son compuestos tóxicos para la mayoría de los organismos. El nitrato originado por nitrificación es altamente soluble en la solución del suelo y puede ser (Fig. 3):

118 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Asimilado por las plantas y microorganismos Utilizado como aceptor de protones por microorganismos de respiración anaeróbica y transformado a gases de N (denitrificación) Lixiviado hacia horizontes profundos del suelo y napas de agua. Lavado por escorrentía Acumulado en el suelo cuando hay escasa humedad y falta de consumo por las plantas Contrariamente a lo que sucede con el amonio, el nitrato debido a su alta solubilidad, es la fuente nitrogenada más accesible para la planta aunque su asimilación requiera un gasto energético (enzima nitrato reductasa). La disponibilidad de nitrato en el suelo es muy variable y heterogénea debido a su alta movilidad y es muy dinámica en el tiempo porque puede transformarse rápidamente (lixiviarse, denitrificarse, ser asimilado, etc.). Por tales motivos, cuando se requiere evaluar el contenido de nitratos en el suelo se deben hacer muestreos periódicos y tomar gran cantidad de muestras. Asimismo cuando se fertiliza con compuestos amoniacales debe tenerse muy en cuenta la sincronización entre el momento de producción de nitrato y los requerimientos del cultivo Los factores clave para la disponibilidad de nitratos en el suelo son: a) abundancia de amonio, b) presencia de O 2 (los nitrificadores son estrictamente aeróbicos) y c) humedad (60% de capacidad de campo). Debido a que la cantidad de amonio disponible depende de los procesos de amonificación, un factor de suma importancia es la presencia de restos orgánicos nitrogenados en descomposición (Fig. 1). Pérdidas de nitrógeno del suelo El N disponible puede ciclarse dentro del suelo pero también puede perderse. Los mecanismos más comunes de pérdida de N del suelo son: a) volatilización del amoníaco (ver amonificación); b) lixiviación de nitrato (ver nitrificación) y c) denitrificación de nitrato (Fig.3). Denitrificación Se llama denitrificación al proceso biológico de reducción de nitrato con producción de N 2 y óxidos de N gaseosos. Este proceso lo realizan microorganismos con metabolismo quimio-órgano-heterótrofo de respiración

119 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C anaeróbica, es decir el nitrato (o nitrito) actúa como aceptor de e - al final de la cadena respiratoria. Este metabolismo es típico de ambientes con escasez de oxígeno como son los suelos anegados y los ecosistemas acuáticos. Los microorganismos denitrificantes son muy eficientes en la obtención de energía (aproximadamente 34 ATP/ glucosa), se reproducen rápidamente y son muy competitivos. Las bacterias que poseen la enzima para reducir el nitrato a N 2 u óxidos de N son muy variadas y pertenecen a diversas familias taxonómicas. Se pueden diferenciar las bacterias denitrificantes estrictas que viven generalmente en ambientes acuáticos (Pseudomonas denitrificans, Microccocus denitrificans y Thiobacillus denitrificans) y de las que denitrifican de manera alternativa cuando falta oxígeno en el suelo (especies de los géneros Bacillus, Azospirillum y Rhizobium). Estas últimas son muy abundantes y si hay oxígeno en el suelo tienen metabolismo de respiración aeróbica. El factor clave para que se produzca pérdida de N por denitrificación es la falta de oxígeno. Esta situación se produce cuando la humedad del suelo supera el límite de saturación y en micrositios donde existen transitoriamente condiciones de anoxia. Estos sitios son: el interior de los agregados del suelo y la zona que rodea las raíces de las plantas (las raíces respiran y diminuye el O 2 para la actividad microbiana). Otros factores muy importantes para la denitrificación son: la presencia de restos orgánicos en descomposición (que proveen energía) y la abundancia de nitratos. Si un suelo está permanentemente anegado la denitrificación se detiene cuando todo el nitrato se ha transformado en gases de nitrógeno. Por tal motivo, la situación en la que se produce mayor pérdida de N por denitrificación es la que se conoce como ciclo de inundación y sequía. En condiciones de sequía hay oxígeno en los poros del suelo y se produce nitrificación y cuando hay exceso de humedad, falta oxígeno y se denitrifica el nitrato formado (Fig. 2).

120 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C H 2 O limitante O 2 limitante Denitrificación Nitrificación Amonificación Espacio de poro ocupado por agua (%) Fig. 2: Relación entre los procesos de amonificación, nitrificación y denitrificación según el grado de saturación de agua de los poros del suelo Si bien desde un punto de vista agronómico, la denitrificación puede ser negativa, desde la perspectiva ambiental es un proceso imprescindible para el ciclado de N en la naturaleza. Debido a que el mayor depósito de N es el aire, el N que ingresa al suelo (por fijación y deposición) debe retornar en la misma medida. En la actualidad se ha producido un desbalance en el retorno de N a la atmósfera: ingresa mucho N por la aplicación de fertilizantes y retorna muy poco debido a que se han eliminado muchas áreas inundadas (humedales) donde naturalmente se produce la denitrificación. Además, el conocimiento de los mecanismos de denitrificación es de suma utilidad para el tratamiento de efluentes y residuos orgánicos. La eliminación de los compuestos nitrogenados se realiza mediante tratamientos anaeróbicos para favorecer la denitrificación. Sin embargo hay que considerar que, previo al tratamiento anaeróbico debe necesariamente haber un proceso aeróbico para que exista abundancia de nitratos en el agua de los efluentes. En síntesis, en el caso del N, debido a su origen atmosférico predominan los procesos de intercambio con la atmósfera: volatilización, precipitación y fijación. Además a causa de la alta solubilidad del nitrato, es muy importante la lixiviación (Fig. 3).

121 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C ATMOSFERA N 2 Fijación Biológica Precipitación NH 3 Denitrificación N 2 - N 2 O Volatilización COMPUESTOS ORGANICOS NITROGENADOS Mineralización = Amonificación Asimilación (plantas/microorganismos) COMPUESTOS INORGANICO Incorporación NH 4 + Nitrificación Escorrentía Adsorción (arcillas) SUELO HUMUS NO 3 - Procesos bióticos (microbianos) Procesos abióticos Lixiviación y escorrentía Mineralización: liberación de nutrientes de las moléculas orgánicas (proceso biótico: microorganismos). Asimilación: incorporación de minerales en las moléculas orgánicas (proceso biótico: plantas y microorganismos). Volatilización: transformación de compuestos solubles en gases (proceso biótico y abiótico). Precipitación atmosférica: transformación de gases en compuestos solubles (proceso abiótico). Fijación: transformación de gases en compuestos orgánicos (proceso biótico). Lixiviación: movimiento de compuestos solubles hacia horizontes profundos del suelo y acuíferos (proceso abiótico). Escorrentía: movimiento de compuestos solubles y sedimentos por corrientes de agua superficial (proceso abiótico). Fig. 3: Procesos bióticos (microbianos) y abióticos involucrados en la Disponibilidad de Fósforo disponibilidad de nitrógeno A diferencia del N, el P disponible para las plantas proviene mayoritariamente de reacciones químicas inorgánicas y en menor medida de la actividad de los microorganismos (procesos biológicos) del suelo. Esto se debe a que el mayor depósito de P en la naturaleza lo constituyen los minerales que componen la roca madre (apatitas) que liberan P durante los procesos de meteorización y formación del suelo. Por tales motivos, la cantidad de P disponible depende en gran medida de la geomorfología de cada suelo. Si bien el P tiene los mismos estados de oxidación que el N (-3 a +5), en el suelo se encuentra mayoritariamente como +5 (PO -3 4 ): en las moléculas orgánicas, en la solución del suelo y en la mayoría de los componentes sólidos

122 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C inorgánicos. El PO -3 4 es poco soluble por lo que una gran proporción se encuentra precipitado en los sedimentos o ligado a las partículas del suelo. Por tal motivo, la cantidad de P disponible depende fuertemente del ph del suelo que regula su solubilidad: ph menores de 6.5 favorecen que el P se ligue al Al y al Fe, mientras que mayores de 8 provoca la precipitación como Ca 3 (PO 4 ) 2 Degradación de compuestos orgánicos fosforados Durante el proceso de descomposición de restos orgánicos que se depositan en el suelo, los microorganismos liberan P al consumir las cadenas carbonadas de las moléculas que poseen P en su composición química (ATP, ácidos nucleicos, fosfolípidos, etc.). Debido a que el P siempre tiene el mismo estado de oxidación, ningún microorganismo oxida P para obtener energía. Esto hace que el proceso de mineralización del P sea muy simple y lo realizan numerosos microorganismos quimio-órgano-heterótrofos que poseen la enzima fosfatasa (ruptura de la unión PO -3 4 ). El PO -3 4 liberado de las moléculas orgánicas puede ser (Fig. 4): Asimilado por las plantas y microorganismos Incorporado al humus del suelo como fitatos Precipitado en los sedimentos como Ca 3 (PO 4 ) 2 (ph > 8) Ligado con Al o Fe (ph < 6.5) El PO -3 4 es muy poco móvil en la solución del suelo a causa de su escasa solubilidad y por lo tanto es poco afectado por los procesos de lixiviación, aunque puede ser arrastrado por escorrentías. Además de la mineralización del PO -3 4 los microorganismos juegan un importante rol en la disponibilidad de P a través de procesos de solubilización. Los microorganismos pueden producir ácidos orgánicos (mediante procesos fermentativos y oxidaciones incompletas) y ácidos inorgánicos (quimio-lito autótrofos) que bajan el ph del suelo favoreciendo la solubilización del Ca 3 (PO 4 ) 2 precipitado. Esta disminución del ph se localiza en microambientes con alta actividad microbiana, por lo que la mayor dinámica en la disponibilidad de P se produce en la zona rizosférica en estrecho contacto entre los microorganismos y las raíces. Los hongos son los principales

123 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C microorganismos que participan de la dinámica del P en interacción con las raíces de las plantas. En síntesis y contrariamente al N, el P no tiene participación con la atmósfera y los procesos más importantes son los relacionados con los sedimentos y rocas del suelo: solubilización y sedimentación (Fig. 4). ATMOSFERA Mineralización de P COMPUESTOS ORGANICOS FOSFORADOS Asimilación (plantas/microorganismos) Incorporación COMPUESTOS INORGANICO PO 4-3 Escorrentía Ligado Al o Fe SUELO HUMUS Sedimentación Solubilización Ca 3 (PO 4 ) 2 Procesos bióticos (microbianos) Procesos abióticos Mineralización: liberación de nutrientes de las moléculas orgánicas (proceso biótico: microorganismos). Asimilación: incorporación de minerales en las moléculas orgánicas (proceso biótico: plantas y microorganismos). Escorrentía: movimiento de compuestos solubles y sedimentos por corrientes de agua superficial (proceso abiótico). Sedimentación: precipitación de compuestos solubles (proceso abiótico). Solubilización: liberación de nutrientes disponibles desde los sedimentos y roca madre (proceso biótico y abiótico) Fig. 4: Procesos bióticos y abióticos involucrados en la disponibilidad de P Micorrizas Se conoce como micorriza a la estrecha relación simbiótica que se establece entre algunos hongos y las raíces de las plantas (mico = hongo; riza = raíz). Como toda interacción positiva, las micorrizas se mantienen mientras existe un costo beneficio equivalente para ambos integrantes de la simbiosis. El hongo se localiza dentro y fuera de la raíz lo cual facilita el intercambio de fotosintatos (de la planta al hongo) y nutrientes (del hongo a la planta). El P es el nutriente más involucrado en la relación micorrítica debido a su escasa solubilidad y movilidad. Los mecanismos por los cuales los hongos favorecen la nutrición fosfatada de las plantas hospedadoras son:

124 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Exploración del suelo: las hifas cubren una área mucho más extensa que los pelos radicales llegando a los lugares donde está el PO -3 4 (Fig. 4). Solubilización: los hongos micorríticos poseen metabolismo de oxidación incompleta, debido a la alta disponibilidad de C, por lo que producen ácidos orgánicos que solubilizan el P precipitado Mineralización: los hongos micorríticos poseen enzimas fosfatasas Concentración: los hongos pueden polimerizar los PO -3 4 dentro del citoplasma (ácidos pirofosfóricos) constituyendo una reserva para la planta Fig. 5: Raíces con y sin micorrizas Se pueden diferenciar varios tipos de micorrizas según el grado de interacción simbiótica y las especies de hongos y plantas involucradas. Los tipos de micorrizas más conocidos son: a) Ectomicorrizas: las hifas se localizan de manera externa modificando la morfología de la raíz (raíces blancas, cortas y bifurcadas) y penetran solo en los espacios intercelulares de la corteza radicular. Generalmente este tipo de micorriza es la interacción entre hongos superiores (basidiomicotas) y árboles de bosques templados (pinos, robles, etc.). Debido a que las condiciones climáticas de los bosques templados hacen que los procesos de descomposición sean lentos, la función principal de las hifas de las ectomicorrizas es mineralizar y transportar los nutrientes desde la hojarasca (restos vegetales que forman parte de la materia orgánica fresca) hasta las raíces de las

125 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C planta. Las ectomicorrizas se reproducen mediante cuerpos de fructificación que emergen en la base de los árboles hospedadores (hongos de sombrero) (Fig. 6) b) Endomicorrizas: las hifas no forman una capa externa ni modifican la raíz pero penetran en las células corticales formando estructuras llamadas arbúsculos (formas dendroides que facilitan el intercambio con el hospedador) y vesículas donde se almacenan sustancias de reserva (pirofosfato). Por tal motivo, también se las conoce con el nombre de micorrizas vesículo-arbusculares (MVA). Este tipo de micorriza es muy común entre los vegetales y participan especies de hongos inferiores (zygomycotas) y se establecen principalmente en suelos alcalinos o con bajo contenido de fósforo disponible. Las endomicorrizas se reproducen mediante esporas localizadas en el suelo sobre las hifas externas (no forman cuerpos de fructificación) (Fig 7). manto hifas Fig. 6: Corte de una raíz con Ectomicorrizas. iculares pelos radiculares Arbúsculos Arbúsculos ulos e arbúsculos manto Apresorio (punto Apresorio (punto de entrada) de entrada) Hifa intercelular Hifa intercelular xternas e hifas externas Hifas externas Hifas externas Hifa intracelular Hifa intracelular Vesícula Vesícula Arbúsculos Arbúsculos ber las vesículas Esporas de paredes Esporas de paredes gruesas gruesas Fig. 7: Corte de una raíz con Endomicorrizas.

126 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Tabla 1: Diferencias entre ectomicorrizas y endomicorrizas ECTOMICORRIZAS ENDOMICORRIZAS Presencia de manto Presente Ausente Modificación de la raíz Se acorta y ensancha No se modifica Invasión de la raíz Formación de vesículas y arbúsculos Crecimiento en cultivo puro Penetra en los espacios intercelulares Ausente Crece pero no fructifica Penetra dentro de la célula Presente No crece Disponibilidad de Azufre El S es el tercer elemento de importancia en la nutrición de las plantas. Los procesos de disponibilidad de S presentan semejanzas tanto con los del N como con los del P. Los estados de oxidación del S son muchos (-2 a +6) pero solo tres tienen importancia en la naturaleza: -2 (sulfidrilo: SH - ), 0 (S elemental) y +6 (sulfato: SO -2 4 ). El mayor depósito de S está en los minerales de la roca madre como sulfatos (yeso: CaSO 4 ) y sulfuros (pirita: FeS 2 ), pero también el S forma parte de los gases de la atmósfera como H 2 S y SO 2, producto de las erupciones volcánicas y la quema de combustibles fósiles. Por tales motivos, el S disponible para las plantas proviene en igual medida de reacciones químicas inorgánicas y de la actividad de los microorganismos. El S puede ingresar al suelo por precipitación atmosférica, por meteorización de la roca madre y por descomposición de los restos orgánicos. Degradación de compuestos orgánicos azufrados Las principales moléculas orgánicas que poseen S en su composición química son los aminoácidos (metionina y cisteina), las vitaminas (biotina, tiamina) y las proteínas en los puentes disulfuro (queratina). Debido a los diferentes estados de oxidación del S, la mineralización a partir de los restos orgánicos en descomposición incluye varios pasos:

127 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Sulfidrilación La sulfidrilación consiste en la ruptura del enlace sulfridilo y la consecuente liberación de H 2 S. Los microorganismos que realizan la sulfidrilación no obtienen energía por la ruptura del enlace sino que la obtienen de la oxidación de las cadenas carbonadas (metabolismos quimio-órganoheterótrofos). A semejanza de los microorganismos amonificadores, los microorganismos que realizan sulfidrilación son muy numerosos y diversos: hongos, actinomycetes y bacterias, aeróbicas y anaeróbicas, esporuladas o no, etc. El H 2 S liberado de las moléculas orgánicas puede ser: volatilizado a la atmósfera (es un gas) precipitado en los sedimentos como FeS 2 (ph < 7) oxidado por algunos microorganismos para obtener energía (metabolismo quimio-lito-autótrofo) Sulfoxidación La sulfoxidación consiste en la oxidación del H 2 S produciendo S elemental y sulfato. Esta oxidación la realizan microorganismos quimio-litoautótrofos (obtienen energía de la oxidación de un compuesto inorgánico y sintetizan C orgánico a partir del CO 2 ) y foto-lito-autótrofos (obtienen energía de la luz, el poder reductor es un compuesto inorgánico y sintetizan el C celular del CO 2 ). Los microorganismos capaces de oxidar el H 2 S son muy diversos y abundantes e incluyen tres grupos muy diferentes: Thiobacterias: son bacilos Gram positivos, no esporulados y móviles por flagelación polar. Presentan metabolismo quimio-lito-autótrofo tanto aeróbico como anaeróbico y son muy comunes en el suelo. Sulfobacterias: son bacterias deslizantes filamentosas. Poseen metabolismo quimio-lito-autótrofo estrictamente anaeróbico y habitan ambientes acuáticos. Thiorrodaceas y Chlorobiaceas: bacterias fotótrofas púrpuras y verdes con metabolismo foto-lito autótrofo que viven en ambientes acuáticos anaeróbios. Este grupo oxida el H 2 S hasta S elemental

128 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C (sólido), el cual es almacenado fuera o dentro del citoplasma como gránulos. Los gránulos de S constituyen la sustancia de reserva de las bacterias ya que cuando hay déficit de H 2 S completan la oxidación pasando el S a sulfato. Debido a la gran versatilidad de los microorganismos sulfoxidantes, el proceso de liberación de sulfato casi no tiene condiciones limitantes. Se realiza con muy variados valores de ph, de disponibilidad de oxígeno, de humedad, etc. Por lo que es improbable que en un suelo no se realice sulfoxidacion y exista deficit de sulfato disponible para las plantas. El sulfato producido por oxidación del H 2 S puede ser: asimilado por las plantas y microorganismos precipitado en los sedimentos como CaSO 4 utilizado como aceptor de protones por microorganismos de respiración anaeróbica y transformado a gases de S (desulfatación) lixiviado hacia horizontes profundos del suelo y napas de agua lavado por escorrentía acumulado en el suelo cuando hay escasa humedad y falta de consumo por las plantas Desulfatación Se llama desulfatación al proceso biológico de reducción de sulfato con producción de H 2 S gaseoso. Este proceso lo realizan microorganismos con metabolismo quimio-órgano-heterótrofo de respiración anaeróbica, es decir el sulfato actúa como aceptor de e - al final de la cadena respiratoria. Las bacterias que poseen la enzima para reducir el sulfato a H 2 S son muy escasas y pertenecen a especies de los géneros Desulfovibrio y Desulfomaculum. Ambos géneros son anaeróbicos estrictos y viven tanto en ambientes acuáticos como en suelos anegados. Los factores condicionantes para que se produzca desulfatación son: escasez de oxígeno, alta concentración de sulfatos y presencia de compuestos orgánicos en descomposición. Como la liberación de sulfatos es el suelo puede realizarse con o sin oxígeno, la desulfatación en suelos anegados es un proceso continuo y no necesita pulsos de humedad y sequia como la denitrificación. En ambientes

129 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C acuáticos salinos con alto contenido de sales de S, como es la Laguna Mar Chiquita de Córdoba, existe una elevada actividad desultatadora, que también se ve favorecida por la presencia de gran cantidad de restos orgánicos depositados en el fondo de la laguna donde existen fuertes condiciones de anoxia (el agua salada es más densa y posee muy poco oxígeno disuelto). En síntesis, el S es uno de los nutrientes más complejos, porque participa de la atmósfera y la roca madre, por lo que presenta casi todos los procesos mencionados excepto la fijación biológica a partir de la atmósfera (Fig. 8). ATMOSFERA SO 4-2 / SO 2 Precipitación H 2 S Volatilización Desulfatación H 2 S COMPUESTOS ORGANICOS con AZUFRE SUELO Mineralización = sulfidrilación Asimilación (plantas/microorganismos) Solubilización COMPUESTOS INORGANICO H 2 S sedimentación Sulfoxidación FeS 2 SO 4 ( o S 0 ) Procesos bióticos (microbianos) Procesos abióticos sedimentación CaSO 4 Lixiviación y escorrentía Mineralización: liberación de nutrientes de las moléculas orgánicas (proceso biótico: microorganismos). Asimilación: incorporación de minerales en las moléculas orgánicas (proceso biótico: plantas y microorganismos). Volatilización: transformación de compuestos solubles en gases (proceso biótico y abiótico). Precipitación atmosférica: transformación de gases en compuestos solubles (proceso abiótico). Lixiviación: movimiento de compuestos solubles hacia horizontes profundos del suelo y acuíferos (proceso abiótico). Escorrentía: movimiento de compuestos solubles y sedimentos por corrientes de agua superficial (proceso abiótico). Sedimentación: precipitación de compuestos solubles (proceso abiótico). Solubilización: liberación de nutrientes disponibles desde los sedimentos y roca madre (proceso biótico y abiótico) Fig. 8: Procesos bióticos (microbianos) y abióticos involucrados en la disponibilidad de S.

130 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD VII: FIJACIÓN BIOLÓGICA DE N 2 La fijación biológica de N 2 (FBN) consiste en la transformación del N 2 en NH + 4, el cual se incorpora inmediatamente a compuestos orgánicos (aminoácidos). Es un proceso exclusivamente biológico realizado solo por algunos organismos procarióticos que poseen la enzima Nitrogenasa (Nasa) conocidos como diazótrofos, es decir consumidores de N 2 (di=dos; azoto=n; trofo=comer). La mayoría de los organismos diazótrofos tienen metabolismo quimio-órganoheterótrofo (aeróbicos y anaeróbicos), aunque también hay organismos fotolito-autótrofos (oxigénicos y anoxigénicos). La FBN es un proceso reductor que consume gran cantidad de energía (se estima entre 12 a 24 ATP por mol de N 2 fijado) por lo que constituye una vía metabólica alternativa para los microorganismos: solo la realizan si no tienen otras fuentes de N que requieran menor costo energético, por ej. NH + 4. La FBN es la forma más importante de incorporación del N a la superficie de la tierra. Se estima que del total de N ingresado solo el 10% proviene de precipitación atmosférica (tormentas eléctricas) y el resto es por proceso biológico. Sin embargo, en la actualidad mucho N atmosférico es incorporado al suelo a través de los fertilizantes químicos. El mecanismo de producción de fertilizantes se basa en una reacción química similar a la FBN pero que en vez de utilizar la Nasa, se cataliza mediante altas temperatura (1000 C) y presión (250 atmósferas). Este proceso industrial se conoce con el nombre de Haber-Bosch y requiere un enorme gasto energético. Enzima nitrogenasa La enzima Nasa está integrada por dos sulfo-ferro-proteínas: Unidad I (KP I): llamada dinitrogenasa o molibdo-ferro-proteína está formada por 4 subunidades peptídicas con 24 átomos de Fe, 28 de S y 2 de Mo. Tiene un peso molecular aproximadamente de 300 kda. Esta unidad constituye el sitio catalítico del N 2 (ruptura del triple enlace N N) (Fig. 1). Unidad II (KP II): llamada nitrogenasa reductasa es una ferro-proteína posee dos subunidades peptídicas con 4 átomos de Fe y 4 de S. Tiene un peso molecular de 60 kda y participa en el transporte de e - desde las ferredoxinas a la unidad I, donde se acoplan al N formando NH 3 (Fig. 1)

131 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Ambas unidades de la Nasa están codificadas en un gen llamado nif que se localiza en un plásmido de las bacterias diazótrofas. El gen nif es un complejo de varios genes que codifican la síntesis de ambas unidades de la Nasa (nifd y nifk para la unidad I y nifh para la unidad II) y otros genes que tienen funciones de regulación y control de la expresión de los genes fijadores. El hecho de que los genes que codifican la FBN estén dentro de un plásmido ha facilitado su manipulación genética lo que ha permitido grandes avances en el conocimiento de las bases bioquímicas de la FBN y la generación de organismos diazótrofos transgénicos. Unidad II Unidad I Transporte de e - NH 3 Fe Mo ATP N 2 Fig. 1: Estructura de la nitrogenasa La presencia de O 2 es el principal factor que regula la actividad de la Nasa debido a que los e- transferidos desde la ferredoxina pueden ser captados por el O 2 (Fig. 3) y no llegar a la unidad II de la Nasa. Además, una característica constante de la FBN es que cierta cantidad de los H + transferidos son reducidos por la Nasa antes de llegar al N y se transforman en H 2 (gas). La proporción de H 2 formado varía según la cantidad de ATP y poder reductor que tenga disponible la célula. Se menciona que con baja disponibilidad es mayor la proporción de H 2 y que, contrariamente, con alta disponibilidad predomina la formación de NH4 +.

132 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Mecanismo de acción de la nitrogenasa Mo Ferredoxina reducida (Poder reductor) KP II KP II Mg +2 KP I * Mo N N ADP + Pi e - 2 NH 4 + ATP-Mg ATP-Mg Mo Ferredoxina oxidada KP II * KP II * ATP-Mg KP II * KP I * Mo N N KP I * ATP Mg +2 N 2 Mo Mo Mecanismo de acción de la nitrogenasa Fig. 2: Mecanismo de acción de la enzima Nitrogenasa. La subunidad KP II (ferro-proteína), es la responsable de captar el poder reductor a partir de la ferredoxina reducida, en este caso la ferro-proteína se reduce y eso produce una disminución de su potencial redox que le permite captar el complejo ATP-Mg +2, quien le permitirá acoplarse con la subunidad KP I (molibdo-ferro-proteína). La molibdo-ferro-proteína, tiene un grupo prostético molibdeno a quien se une el N 2, al tomar los electrones provenientes de la ferro-proteína, los transfiere al N 2 que se reduce para formar NH + 4, que queda disponible para la planta. La ecuación general más aceptada es: N ATP + 8e H + 2 NH H ADP + 16 Pi El NH 4 + formado por fijación inmediatamente se incorpora a cadenas carbonadas, generalmente provenientes del ciclo de Krebs, formando aminoácidos. Los procesos más comunes son: α-cetoglutarato + NH NADPH Glutamato + NADP + Esta reacción se encuentra altamente restringida porque la enzima responsable del proceso (Glutamato dehidrogenasa), tiene un Km para el amonio muy elevado, necesitando concentraciones muy elevadas del mismo para poder actuar y en esas concentraciones el amonio es tóxico para la mayoría de los organismos.

133 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Km (Constante de Michaelis-Menten), es la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la reacción. Es una medida de la afinidad de una enzima por un sustrato y a menor Km mayor afinidad por el sustrato. Esta reacción de fijación de NH 4 + amidación o síntesis de Glutamina es sustituida por el proceso de Glutamato + NH ATP Glutamina Glutamina + α-cetoglutarato 2 Glutamato + Por tal motivo la presencia de NH 4 actúa como un fuerte inhibidor de la fijación ya que provee los grupos amino para la formación de los aminoácidos sin el gasto energético de la fijación. Este aspecto es de sumo interés práctico debido al efecto de los fertilizantes químicos amoniacales sobre la FBN (Fig. 3). N 2 Disturbio antrópico Estacionalidad Ecosistema Tipo de sustrato vegetación humificación/ deshumificación textura de suelo precipitación humedad calidad/cantidad de MO mineralogía ph calidad/cantidad de MO fresca calidad/cantidad de MO nativa humedad mineralización asimilación intercambio catiónico respiración aeróbica textura de suelo MO NH 4 + O 2 (+) (-) (-) NH 4 + Factores distales o secundarios Factores proximales o principales Fig. 3: Factores reguladores de la fijación biológica de N 2. Signo positivo (+) indica que activa o favorece la FBN y signo negativo (-) la inhibe o retarda.

134 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Organismos fijadores de N 2 Como ya ha sido mencionado, los organismos diazótrofos pertenecen a grupos bacterianos muy variados. En general la FBN es un carácter muy primitivo y altamente adaptativo. Los primeros organismos vivos sobre la superficie del planeta, sólo disponían del N atmosférico para sus funciones metabólicas, por lo que la fijación era una condición imprescindible para la vida. Por tal motivo, lo genes nif están presenten en muchas Archaeas y en otras bacterias que evolucionaron a partir de ellas. Sin embargo, dadas las condiciones actuales, la FBN pasó a ser un carácter alternativo que generalmente se expresa cuando existe déficit de NH + 4 en el ambiente. Además, teniendo en cuenta que en la atmósfera primitiva del planeta no existía O 2, las bacterias diazótrofas actuales tuvieron que desarrollar muy variados mecanismos de regulación de la tensión de O 2 para permitir el funcionamiento de la Nasa. Los principales grupos que presentan bacterias diazótrofas son: Bacterias fotótrofas Son organismos con metabolismo foto-lito-autótrofo, con fotosíntesis anoxigénica. Es decir, utilizan la energía de la luz, el poder reductor del SH 2 y fijan el CO 2 del aire sin producir O 2. Se considera que estas bacterias fueron los primeros habitantes de la tierra debido a su capacidad de vivir solo a partir de los gases atmosféricos producto de las erupciones volcánicas: CO 2, N 2 y SH 2. Este grupo de diazótrofos no posee ningún mecanismo adaptativo de protección de la Nasa porque viven en ambientes totalmente anaeróbicos con alto contenido de SH 2, como son los sedimentos y aguas profundas de lagos y mares. En estos ambientes, las bacterias fotótrofas son los principales organismos productores ya que realizan fotosíntesis y FBN. Cianobacterias Las cianobacterias también tienen metabolismo foto-lito-autótrofo pero con fotosíntesis oxigénica (producen O2 a partir del poder reductor del agua). Debido a la producción de O2, la fotosíntesis es totalmente incompatible con la FBN, por lo que algunas cianobacterias filamentosas han desarrollado células especiales para contener la Nasa en condiciones de baja tensión de O2. Estas células especiales se denominan heterocistos y consisten en células más grandes que las vegetativas, rodeadas por una pared celular multicapa. La

135 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C composición química de esta pared es muy variada: capas muy gruesas de glicolípidos, mureína y polisacáridos que impiden la difusión del O 2. Los heterocistos se conectan mediante poros con el resto de las células del filamento para el intercambio de fotosintatos y compuestos nitrogenados (Fig. 4). Fig. 4: Cianobacteria filamentosa Las cianobacterias viven superficialmente en ambientes acuáticos o inundados periódicamente (como por ej. en cultivos de arroz y costras de suelo arcilloso). Generalmente son de vida libre aunque algunas especies establecen simbiosis con plantas inferiores (helechos y gimnospermas) y con otros microorganismos (hongos). Es bien conocida la asociación de la cianobacteria Anabaena con el helecho acuático del género Azolla. La cianobacteria se aloja dentro de las hojas del helecho en cámaras que contienen aire para flotación. El helecho le provee de fotosintatos y la cianobacteria libera los compuestos nitrogenados que absorben las hojas del helecho. La asociación con hongos (líquenes) es muy común en ambientes con condiciones extremas y con déficit de N disponible para el hongo, por ej. rocas y arenales. El hongo provee las condiciones de humedad y protección y la cianobacteria aporta fotosintatos y compuestos nitrogenados. La simbiosis con las Cycadaceas (gimnosperma primitiva) es muy visible ya que la cianobacteria forma estructuras semejantes a nódulos en el cuello de la planta. Las cianobacterias pierden su capacidad de fotosintetizar, utilizan los fotosintatos de la planta y a cambio le proveen compuestos nitrogenados.

136 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Actinomycetes Las bacterias de este grupo son Gram positivas, tienen forma de hifa y poseen metabolismo quimio-órgano-heterótrofo de respiración aeróbica, por lo que las especies fijadoras de N 2 han desarrollado estructuras especiales para aislar a la enzima Nasa del O 2. A semejanza con las cianobacterias, las especies diazótrofas poseen células de paredes engrosadas llamadas vesículas donde se realiza la FBN. Todos los actinomycetes fijadores de N 2 viven en simbiosis con plantas leñosas no leguminosas y se los agrupa dentro del género Frankia. Las bacterias se alojan en grandes nódulos leñosos en estrecho contacto con el sistema vascular de la raíz a través del cual se realiza el intercambio: la planta provee fotosintatos y Frankia los compuestos nitrogenados. En un corte de nódulo se puede ver claramente la presencia del micelio y las vesículas que contienen la Nasa (Fig. 5). La simbiosis es muy importante en ambientes de desierto, dunas y suelos muy rocosos donde las plantas con actinomycetes (actinorrizas) son pioneras en las sucesiones vegetales ya que pueden soportar condiciones extremas de sequía, elevado ph y escasez de N en el suelo. Las plantas con actinorrizas más conocidas son árboles de los géneros Casuarina y Alnus y arbustos de los géneros Colletia, Ceanothus y Discaria. Fig. 5: A) el árbol Casuarina glauca, B) aspecto morfológico de la bacteria Frankia en cultivo puro, C) actinorrizas de C. glauca

137 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Eubacterias Hay muchas especies de bacterias verdaderas capaces de fijar N 2, todas son quimio-órgano-heterótrofas (respiración aeróbica y fermentación) y viven tanto libres como en simbiosis. Dentro de las bacterias de vida libre que viven en el suelo es importante diferenciar las condiciones ambientales en que se desarrollan por su relación con los mecanismos de protección de la Nasa. 1) Bacterias diazótrofas aeróbicas de vida libre: son muy comunes y están ampliamente distribuidas en el suelo. Generalmente se las agrupa dentro del género Azotobacter y se caracterizan por ser bacterias Gram negativas, móviles y de respiración aeróbica, por lo que para poder realizar FBN poseen adaptaciones morfológicas y fisiológicas muy importantes. En general son bacterias de gran tamaño con gran cantidad de membranas intracelulares y capas mucosas externas. Se cree que estas características ayudan a regular el paso del O 2 desde el exterior y crear condiciones de baja tensión en el centro de las células donde se localiza la Nasa. La mayor adaptación fisiológica de Azotobacter es la presencia de ciclos de respiración-fijación. Se conoce que la bacteria cuando tiene O 2 disponible respira muy activamente lo cual baja la tensión del O 2 y puede actuar la Nasa. Por tal motivo, la FBN en Azotobacter es muy variable y depende de la disponibilidad de compuestos orgánicos fácilmente degradables que le permitan tener una alta tasa de respiración. Además, teniendo en cuenta el alto costo energético de la FBN, es muy común detectar gran cantidad de bacterias fijadoras pero escasa actividad Nasa, lo cual indica que no existen las condiciones adecuadas para la fijación (baja disponibilidad de NH + 4 y alta cantidad de compuestos carbonados lábiles). A causa de la gran variabilidad en la actividad fijadora, es muy difícil de estimar la importancia de la FBN por diazótrofos de vida libre en el suelo. En general se acepta que la cantidad de N fijado es de escasa magnitud pero se ha podido detectar fijación de N 2 en las hojas de las plantas y en los restos vegetales en descomposición donde sería de mayor importancia debido a la menor cantidad de N disponible. 2) Bacterias diazótrofas micro-aeróbicas de vida libre: también son muy comunes en el suelo pero se localizan exclusivamente en zonas donde existe

138 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C baja tensión de O 2, particularmente la rizósfera de las plantas. El género más conocido es Azospirillum que como su nombre lo indica, es una bacteria espiralada curva, muy móvil y Gram negativa. Su alta movilidad le permite localizarse en los lugares con la tensión de O 2 más adecuada para la fijación. Debido a ello, Azospirillum no posee mecanismos adaptativos para la regulación de la tensión de O 2, por lo que en condiciones aeróbicas no fija y consume N orgánico (aminoácidos) o inorgánico (NH + 4 ). Azospirillum es considerado un organismo mutualista a causa de que depende de los exudados de la raíz para su nutrición carbonada y porque el N fijado puede quedar disponible para la planta. Aunque hay que destacar que Azospirillum fija N para su célula y el N solo puede pasar a la planta cuando muere la bacteria y es mineralizado por otros organismos rizosféricos. Por esta causa, la cantidad de N que puede aprovechar la planta es muy relativa debido a que el N mineralizado queda libre en el suelo y la planta debe competir con otros microorganismos para poder asimilarlo. 3) Bacterias diazótrofas anaeróbicas de vida libre: son poco abundantes en el suelo porque se localizan dentro de los agregados bajo estrictas condiciones de anaerobiosis. Por tal motivo, no necesitan mecanismos de regulación de la tensión de O 2. Las especies más comunes pertenecen al género Clostridium: bacilos Gram positivos, esporulados y con metabolismo fermentativo (butírico). Debido a su capacidad de esporular, son muy abundantes en los compost (con proceso termófilo) y son colonizadores en suelos recientemente quemados. 4) Bacterias diazótrofas simbióticas: son los organismos fijadores de N 2 más conocidos por su importancia en cuanto a la cantidad de N fijado. Salvo escasas excepciones, estas bacterias establecen simbiosis sólo con plantas leguminosas (fabáceas y mimosáceas) y se las agrupa con el nombre general de rizobios que engloba a muchos géneros taxonómicos. Los rizobios son bacterias Gram negativas que viven en el suelo, flageladas, no esporuladas, con gran cantidad de sustancias de reserva (ácido polihidroxibutírico) y capas mucosas. Como no poseen mecanismos para regular la tensión de O 2, solo fijan N 2 cuando están en simbiosis con las plantas.

139 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Interacción simbiótica rizobio-leguminosa La interacción simbiótica rizobio-leguminosa es una de las más completas y eficientes que se conoce, ya que no solo se produce un intercambio nutritivo sino que también existe un estrecho acoplamiento genético entre ambos organismos para la codificación de los procesos de infección, formación de nódulos y protección de la Nasa. Por tal motivo la mayoría de estas simbiosis son altamente específicas (una especie de rizobio para una especie de leguminosa). Infección El proceso de infección comienza con la síntesis y excreción de una serie de productos por parte del rizobio (exopolisacáridos y fitohormonas). Estos productos están codificados en los llamados genes nod que solo se expresan en presencia de lectinas específicas sintetizadas por la leguminosa. La función de estos productos es hacer que se debilite la epidermis del pelo radicular (curvatura) y pueda penetrar la bacteria. Una vez dentro de la corteza de la raíz, las bacterias forman el conocido cordón de infección que consiste en la formación de un canal por disolución de la laminilla media (pectina) debido al avance de los rizobios. Cuando los rizobios llegan a las células cercanas a la endodermis, comienza una activa división de las células radicales y se diferencia un primordio de nódulo. Este proceso es codificado por genes de la planta que controlan la cantidad, tamaño y tipo de nódulo según la posición del meristema radical (Fig. 6). Fig. 6: Proceso de formación del nódulo

140 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Estructura del nódulo Los nódulos maduros están compuestos por células radicales infectadas por rizobios, rodeadas por el tejido vascular y el meristema de la raíz. Dentro de las células corticales los rizobios sufren fuertes modificaciones morfológicas y fisiológicas y se transforman en morfotipos llamados bacteriodes. Estas modificaciones se producen debido a que la bacteria se especializa sólo en fijar N perdiendo todas las otras funciones vitales como son la reproducción (no sintetizan pared celular por eso se deforman) y la nutrición (pasa a depender de los fotosintatos de la planta). Sin embargo, los bacteroides mantienen las enzimas del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria para obtener el poder reductor y los ATP necesarios para la FBN (Fig. 7). Fig. 7: Estructura de un bacteroide

141 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Los bacteriodes se encuentran rodeados por una membrana proveniente de la célula vegetal, donde se asienta una enzima reguladora de la tensión de O 2 : la leghemoglobina. Esta enzima es sintetizada en parte por la bacteria y en parte por la planta. La planta forma los grupos prostéticos hemo (con Fe) y la bacteria sintetiza los 4 componentes peptídicos codificados por los genes fix. La leghemoglobina transporta el O 2 desde el citoplasma de la célula vegetal hasta la cadena respiratoria del bacteroide, impidiendo que llegue a la Nasa. La forma de los bacteroides y la cantidad de bacteroides envueltos por la membrana es muy variable entre las especies. Por ej. en alfalfa hay muchos bacteroides envueltos por una sola membrana y los bacteroides son ramificados y hasta 50 veces más grandes que las bacterias libres. Contrariamente en soja solo hay un bacteroide por membrana y de tamaño y forma muy semejantes a las bacterias libres. Funcionamiento del nódulo Desde la célula entran al bacteroide: a) fotosintatos de la planta que van al ciclo de Krebs y cadena respiratoria del bacteroide para producir el poder reductor y los ATP necesarios para la FBN, b) N 2 y c) O 2 regulado por la leghemoglobina. Del bacteroide salen: a) CO 2 producido en el ciclo de Krebs, b) H 2 formado por reducción de H +, y c) NH + 4 formado por actividad de la Nasa (Fig. 7). El NH + 4 que pasa a través de la membrana se une a cadenas carbonadas existentes en el citoplasma de la célula vegetal y forma aminoácidos. Estos compuestos nitrogenados pasan al sistema vascular de la raíz y se distribuyen por toda la planta a través del xilema. Algunas especies como la soja pueden sintetizar compuestos nitrogenados con más de dos grupos aminas (ureidos) para facilitar el transporte de N a la parte aérea de la planta (Fig. 7). Como toda simbiosis, esta interacción se mantiene siempre que haya un costo-beneficio compartido entre las partes. Por lo tanto el hospedador tiene mecanismos de control muy estrictos para que se mantenga un balance entre costo (fotosintatos) y beneficio (compuestos nitrogenados). Los mecanismos de regulación y control determinan el número de nódulos que depende de: a) la eficiencia de fijación de las bacterias, b) la disponibilidad de N en el suelo y c) los requerimientos nitrogenados de la planta. De tal manera, si las bacterias

142 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C son poco eficientes para fijar N la planta tendrá elevado número de nódulos pequeños y si existe N disponible en el suelo o la planta no requiere más N para su desarrollo, no enviará fotosintatos a los nódulos provocando su senescencia y desprendimiento. Taxonomía de los rizobios En los últimos años y debido al avance de las técnicas biomoleculares, la taxonomía de los rizobios ha sufrido grandes modificaciones, proceso que sigue en permanente avance y revisión. La clasificación mas aceptada en la actualidad comprende 4 familias y 6 géneros. 1. Fam: Rhizobiaceae - gen: Rhizobium. R. leguminosarum (simbionte de poroto, vicia, arveja) - gen: Sinorhizobium. S. meliloti (melilotus) y S. medicae (alfalfa) 2. Fam: Bradyrhizobiaceae - gen: Bradyrhizobium. B. japonicum (soja) 3. Fam: Phyllobacteriaceae - gen: Mesorhizobium. M. ciceri (garbanzo) y M. chacoense (algarrobo) - gen: Allorhizobium. A. undicola (Neptunia sp.) 4. Fam: Hyphomicrobiaceae - gen: Azorhizobium. A. caulinodans (Sesbania sp.) En general las especies de la fam. Rhizobiaceae agrupa a rizobios que viven en zonas templadas, que poseen alta tasa de crecimiento (tiempo de generación entre 3-4 hs) y que realizan oxidación incompleta cuando hay exceso de fuente carbonada en el medio. Esto hace que produzcan ácidos orgánicos y bajen el ph del medio. Contrariamente la fam. Bradyrhizobiaceae agrupa a especies de rizobios de zonas tropicales, de crecimiento lento (tiempos de generación entre 6 y 8 hs) y que no acidifican el medio. Las especies de la fam. Phyllobacteriaceae presentan características intermedias, se encuentran en muy variados lugares y presentan tiempos de generación entre 4-5 hs. Por último la fam. Hyphomicrobiaceae agrupa a las escasas especies de rizobios que forman nódulos en tallos de plantas tropicales.

143 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 142

144 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD VIII: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS Se denomina fertilizante biológico a aquellos productos formulados con organismos vivos que se utilizan para favorecer la nutrición de las plantas. Se consideran fertilizantes no biológicos a los formulados con compuestos químicos orgánicos (por ej. urea, compost, lombricompuesto, estiércol, abonos verdes, etc.) o inorgánicos (por ej. fosfato de amonio, nitrato de amonio, etc.). El término inoculante se utiliza en la práctica para referirse a un fertilizante biológico que se aplica a la semilla en el momento de la siembra. Esta es la forma más común de aplicar un fertilizante biológico porque las bacterias adheridas al tegumento de la semilla infectan la radícula inmediatamente a su emergencia, por lo que se favorece la nutrición de la planta desde etapas fenológicas muy tempranas. El uso de fertilizantes biológicos tiene muchas ventajas respecto a los químicos debido a que no poseen riesgo de contaminación ambiental, su efecto está fuertemente sincronizado con los requerimientos de la planta y generalmente son de menor costo. Si bien los fertilizantes biológicos son conocidos desde hace mucho tiempo, en la actualidad se han difundido en mayor medida debido a la aplicación de nuevos criterios productivos como son la agricultura sustentable y los cultivos orgánicos (sin uso de agroquímicos). Microorganismos utilizados comof ertilizantes biológicos Los microorganismos que se utilizan para la fabricación de fertilizantes biológicos son aquellos que establecen interacciones positivas con las plantas y que son de fácil manejo en condiciones industriales (medios de cultivo baratos, crecimiento rápido, etc.). Dentro de los fertilizantes biológicos se diferencian aquellos producidos con microorganismos que fijan N 2 y los conocidos como PGPR (promotores del crecimiento) que favorecen la nutrición vegetal por otras vías, por ej. solubilización y traslado de P, producción de hormonas de enraizamiento para mayor absorción de nutrientes, control de patógenos, etc.

145 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Fertilizantes biológicos en base a microorganismos fijadores de N 2 Los microorganismos de mayor uso son: a) Rizobios: este grupo incluye a los microorganismos más utilizados para la fabricación de inoculantes. En Argentina, los rizobios más comercializados son los que se aplican en cultivos de soja (Bradyrhizobium japonicum), y en mucha menor escala en alfalfa y otras leguminosas forrajeras. Es muy difícil de estimar cuanto puede aumentar el rendimiento de un cultivo por efecto de la aplicación de un inoculante a base de rizobios. Generalmente se estima que una soja bien nodulada puede fijar entre 100 y 150 kg de N ha, sin embargo esto es ampliamente variable debido a las condiciones ambientales, las técnicas de manejo del cultivo, la calidad del inoculante, la forma de comercialización y aplicación del producto, etc. De cualquier manera, los fertilizantes biológicos a base de rizobios son los de efecto más contundente e indiscutido para los cultivos, debido a la alta eficiencia de la simbiosis. b) Azospirillum spp: en Argentina, la comercialización de fertilizantes biológicos formulados con bacterias del género Azospirillum sigue en orden de importancia después de los rizobios, principalmente para cultivos de trigo y maíz. En los últimos años aumentó considerablemente la demanda de este tipo de inoculantes debido a que se difundió que los Azospirillum en cultivos de gramíneas provocan un efecto similar a los rizobios en leguminosas. Sin embargo, no hay que olvidar que la interacción de las bacterias diazótrofas rizósfericas con las plantas, es totalmente diferente a las simbióticas, por lo que no es esperable obtener resultados equivalentes. Es prácticamente imposible estimar la ganancia de N en los cultivos por efecto de la aplicación de Azospirillum, debido a que el N fijado no se trasloca directamente a la planta. La bacteria incorpora el N a su citoplasma por lo que primeramente tiene que morir, dejar disponible el N a los organismos mineralizadores para que recién pueda ser tomado por la planta. Estos pasos implican riesgos de pérdidas de nitratos por lixiviación y fuerte competencia por el N con el resto de los microorganismos del suelo. Por tales motivos, no puede esperarse un mayor rinde de los cultivos de manera directa como en el caso de los rizobios con las leguminosas. La principal ventaja de usar Azospirillum en gramíneas radica en el aporte extra de N al suelo que puede ser utilizado por un cultivo posterior y en una mayor expansión radicular debido a la producción de hormonas vegetales por parte del microorganismo.

146 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C c) Anabaena: los fertilizantes biológicos en base a esta cianobacteria simbiótica tienen una difusión muy regional y específica para cultivos de arroz. Los inoculantes consisten en un cultivo de los microorganismos al cual se le agregan las esporas del helecho acuático (Azolla) con el que establece la simbiosis. Cuando el cultivo de arroz está inundado, el helecho se desarrolla sobre la superficie del agua y la cianobacteria fija N para el helecho. Cuando se seca el cultivo, el helecho muere y sus compuestos nitrogenados son mineralizados y el N puede ser utilizado por el cultivo de arroz. Mundialmente la azolización es una práctica muy común y en nuestro país se realiza con bastante frecuencia en la zona arrocera de la mesopotamia. Fertilizantes biológicos en base a microorganismos PGPR Los microorganismos PGPR son bacterias de vida libre de gran importancia agrícola, muestran un amplio rango de beneficios relacionados con el crecimiento y la sanidad vegetal. El mecanismo de acción de estos microorganismos es suprimiendo enfermedades causadas por patógenos, acelerando la asimilación y disponibilidad de nutrientes o actuando sobre las hormonas vegetales (responsables del crecimiento de las plantas). Además pueden ayudar a compensar la presencia de malezas, el estrés hídrico, estrés salino y otras situaciones desfavorables. Entre los mecanismos de acción de los microorganismos PGPR podemos mencionar: acción antagónica con hongos, producción de sideróforos, fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos, producción de AIA (ácido indol acético, hormona vegetal del grupo de las auxinas) y giberelinas, activación del sistema inmunitario de la planta y producción de enzimas (Fig. 1).

147 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Microorganismos fitopatógenos Microorganismos fitopatógenos Microorganismos benéficos Activacion de M.O. benéficos Producción de componentes inhibidores de patógenos Referencias IR: sistema inmunitario de la planta Fig. 1: Actividad de microorganismos PGPR en la rizósfera. Funciones de los microorganismos PGPR Biofertilizantes: los microorganismos PGPR colonizan la zona de la rizósfera (zona de influencia de la raíz, rica en microorganismos y nutrientes), incrementando la superficie de la rizósfera, mejorando la disponibilidad de nutrientes al alcance de las plantas. Productores de vitaminas: una gran proporción de las bacterias (benéficas) del suelo requieren de la presencia de vitaminas del grupo B, algunas PGPR son capaces de sintetizar tiamina y/o biotina (vitaminas del complejo B), permitiendo o facilitando la colonización de numerosas bacterias. Productores de fitohormonas: los microorganismos PGPR, producen fitohormonas responsables entre otros de inducir el enraizamiento, tasa respiratoria de la raíz, metabolismo y crecimiento de la misma, aumentando con ello la captación de agua y nutrientes; además pueden promover el crecimiento vegetativo. Entre esas fitohormonas tenemos auxinas, giberelinas y el etileno.

148 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Las auxinas (principalmente el AIA: ácido indolacético) influyen en el crecimiento radical, elongación celular y en el crecimiento de la planta en respuesta de la luz y la gravedad. Ejemplo de PGPR productores de auxinas Bacillus megaterium, Azospirillum spp y Pseudomonas spp. Las giberelinas son un tipo de fitohormonas capaces de influir en la germinación de las semillas, la elongación del tallo y en procesos tales como la floración y el desarrollo de los frutos. Por ejemplo Azotobacter produce ácido giberélico. El etileno, es un gas regulador del crecimiento, responsable entre otras cosas de la absición (caída) de hojas y frutos. Producción de sideróforos: estos compuestos, de bajo peso molecular, son capaces de capturar y secuestrar el hierro del suelo. El hierro es indispensable para la síntesis de numerosas enzimas necesarias tanto para la planta como para el microorganismo. Cada bacteria genera una clase distinta de sideróforo y cuando este secuestra el hierro, tan solo la bacteria que genero el sideróforo podrá recuperarlo, de esta manera, los microorganismos PGPR retiran el hierro impidiendo que los patógenos y oportunistas puedan desarrollarse en la rizósfera y en algunas ocasiones colocan el hierro disponible para la planta. Fijadores de nitrógeno: existen microorganismos fijadores de nitrógeno que no son endosimbiontes como Rizobium, como por ejemplo Azotobacter y Azospirillum. Solubilización de fósforo inorgánico: el fosfato (fósforo inorgánico) está poco disponible para las plantas, los microorganismos PGPR son capaces de solubilizar el fósforo dejándolo disponible para el cultivo. Biocontrol: el potencial de los microorganismos PGPR como biocontroladores deriva de varios mecanismos, desde el control antagónico de microorganismos hasta la producción de antibióticos, sideróforos o mejorando la sanidad de la planta por medio de hormonas vegetales. Por ejemplo bacterias metanógenas que actúan como nematicidas, mediante la producción de compuestos volátiles biocidas, como por ejemplo la acetoína. Un ejemplo es la producción de un antibiótico 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG)

149 Severidad de la enfermedad Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C producido por algunas Pseudomonas (PGPR). En la Fig. 2 se puede observar que cuando los microorganismos PGPR se establecen en el cultivo de trigo, aunque el patógeno (Gaeumannomyces graminis) está en todo el campo, en la zona derecha se ha realizado monocultivo que ha permitido la permanencia de la Pseudomona evitando que el patógeno ataque, mientras que en la zona izquierda la rotación de cultivos ha variado el equilibrio, permitiendo que el patógeno ataque a la planta. Años de monocultivo de trigo Fig. 2: Efecto de Pseudomona para el control de patógenos en cultivo de trigo En Argentina, la oferta comercial de estos fertilizantes es muy variada y cambiante, aunque en los últimos años muestra una tendencia a un mayor uso. Los microorganismos PGPR más utilizados en la producción de inoculantes son: Hongos micorríticos: son los inoculantes con microorganismos PGPR de efecto más comprobado y reconocido. Sin embargo hay que hacer una clara distinción si están formulados con hongos ectomicorríticos o endomicorríticos, debido a las particularidades de cada uno de ellos. Los inoculantes con ectomicorrizas son relativamente fáciles de producir porque los hongos crecen muy rápidamente en medios de cultivos simples y baratos y porque las esporas son muy fáciles de conservar en cualquier sustrato y envase. Su uso está restringido a la producción de plantines en viveros forestales, aunque muchos productores no compran estos productos debido a que pueden obtener inóculos muy fácilmente

150 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C (esporas y restos de tejidos de los cuerpos de fructificación, micelio en el suelo y mantillo de especies micorrizadas, etc.). La eficiencia de la inoculación con ectomicorrizas es fácilmente comprobable por observación de las raíces (blancas, cortas y gruesas con crecimiento dicotómico) (Ver Unidad VI: Micorrizas). Los inoculantes con endomicorrizas son muy difíciles de producir comercialmente. En la actualidad todavía no se ha conseguido cultivar endomicorrizas en medios artificiales de manera industrial. Además la obtención de inóculos en gran escala es prácticamente imposible debido a que las esporas están distribuidas en el suelo y no en cuerpos de fructificación. Debido a ello en algunos países se comercializan inoculantes con endomicorrizas en base a trozos de raíces infectadas con el hongo, solo utilizables en cultivos de huertas hortícolas en pequeña escala. Sin embargo en nuestro país, suelen aparecen en el mercado inoculantes para cultivos extensivos (trigo) en cuyos marbetes se menciona que poseen hongos endomicorríticos (a veces combinados con Azospirillum). La eficiencia de la inoculación es muy difícil de comprobar porque no existen cambios morfológicos visibles en las raíces. Microorganismos solubilizadores de P de vida libre: en algunos lugares del mundo (Canadá y Francia) se están comercializando fertilizantes biológicos formulados con bacterias y hongos solubilizadoras de P de vida libre. En nuestro país es una tecnología todavía muy incipiente y solo algunas fábricas de inoculantes están tratando de incluirlos dentro de sus productos. Mezcla de microorganismos no definidos: son productos conocidos vulgarmente como biofertilizantes y que se fabrican por enriquecimiento y/o percolado de compost o vermicompost. Por tal motivo, poseen una enorme cantidad y tipos de microorganismos no identificados en un medio con alta proporción de compuestos orgánicos. A este tipo de fertilizante se les adjudica una serie de beneficios para las plantas, como control de patógenos, activación del crecimiento radicular, etc. Muchos de estos productos son recomendados para aplicación foliar y en el suelo.

151 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Normas de calidad para los fertilizantes biológicos Debido a que los fertilizantes biológicos están formulados con organismos vivos, la calidad del producto cobra muy especial relevancia. No es lo mismo producir, conservar, comercializar y aplicar un compuesto químico que organismos vivos, de cuya sobrevivencia depende el éxito del producto. Además, tampoco es posible que el comprador pueda comprobar la calidad del inoculante a simple vista. Por tales motivos, el control de calidad por parte de organismos estatales es imprescindible para evitar la comercialización de productos engañosos o de calidad dudosa. En nuestro país la ley de fertilizantes y enmiendas (N ) normatiza sobre la calidad y comercialización de inoculantes. Esta ley ha sido reglamentada por última vez en el año 1980 por lo que una gran cantidad de diferentes productos más modernos no están considerados dentro de las normativas. En la actualidad, solo se exige a las fábricas de inoculantes que se registren (artículo 1) y que, para autorizar el producto, envíen una muestra a analizar a Senasa para constatar la cantidad de bacterias del inoculante (artículo 4). Sin embargo, no existen controles ni en las fábricas, ni en los negocios que comercializan los inoculantes, para verificar si se cumplen las normas de calidad del producto y del envase (artículo 6). Asimismo, no hay instrumentado un servicio de policía para decomisar los inoculantes vencidos que están a la venta (artículo 7). MINISTERIO DE ECONOMÍA Secretaría de Estado de Agricultura y Ganadería LEY N : (fertilizantes y enmiendas) DECRETO N : 4830/73 (reglamentación de la ley ) DECRETO N 1624/80 (modifica el 4830/73) Resolución sobre Fertilizantes Biológicos: Artículo 1 : inscripción en la Dirección Nacional de Fiscalización comercialización Agrícola, para importar, exportar, elaborar, fraccionar y/o distribuir inoculantes. Artículo 4 : prohíbe la comercialización de inoculantes que no tengan 10 x 10 6 bacterias por gramo de inoculantes sólido a la fecha del vencimiento de 180 días y que no sean efectivas y específicas para la especie vegetal del envase. Artículo 5 : para otros soportes deben garantizar, a la fecha del vencimiento establecido 1000 bacterias por semilla. Artículo 6 : la fecha de vencimiento debe estar visible y resaltada en el envase Artículo 7 : Se deben retirar de la comercialización los inoculantes vencidos o serán decomisados.

152 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Por tales motivos, es imprescindible que los Ingenieros Agrónomos posean criterios claros no solo para asesorar sobre el uso de los inoculantes sino también sobre aspectos prácticos que ayuden a elegir un producto de buena calidad. Características de un buen inoculante Los inoculantes están compuestos por las bacterias y el soporte en el que vienen incluidas. Las bacterias: deben ser específicas para el cultivo donde se va a utilizar. Este aspecto es de suma importancia en el caso de los rizobios (especificidad rizobio-leguminosa) y es el de mayor dificultad de comprobar. Solo se puede determinar si la bacteria es específica mediante un ensayo en planta que demanda al menos 45 días. Otro aspecto de calidad muy importante es que las bacterias a utilizar como inoculante hayan sido previamente seleccionadas por su capacidad de fijar N o su potencial PGPR. Generalmente los cultivos industriales se inician a partir de cepas provistas por el Banco de Cepas de Microorganismos del INTA Castelar, que vende las cepas ya seleccionadas. Si por ej. se necesita controlar su capacidad fijadora de N de la cepa de un inoculante, deben realizarse ensayos en planta donde se evalúa la cantidad, tipo, color y peso de los nódulos, la actividad de la enzima Nasa y la cantidad de N fijado. También es muy importante conocer si las cepas de los inoculantes están adaptadas a las condiciones ambientales del lugar del cultivo. Es muy común que las fábricas trabajen con cepas seleccionadas bajo las condiciones de la pampa húmeda y los productores apliquen ese producto en suelos del norte argentino. En la actualidad algunas fábricas producen inoculantes con cepas de soja seleccionadas por INTA Castelar para zonas subtropicales. El factor más importante para el éxito de la inoculación es que el inoculante posea un número adecuado de bacterias que garanticen una buena nodulación. Este factor es relativamente fácil de controlar (recuento en medio sólido) y se recomienda hacer analizar una muestra antes de comprar una gran cantidad de inoculante. Un problema muy común es que desde la fábrica salga un producto con el número correcto de bacterias pero que en la cadena de comercialización no se tengan los cuidados necesarios y que haya gran

153 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C mortandad de bacterias. De esta manera cuando llega al productor el inoculante ha perdido su calidad original. Una práctica muy recomendable es que los inoculantes se comercialicen con cadena de frío (como las vacunas y productos lácteos), por lo que es importante ver si el proveedor almacena los inoculante en heladera antes de su despacho. Cuando se realiza el análisis de inoculantes para establecer la abundancia de bacterias es muy importante que se solicite el informe sobre la presencia y cantidad de bacterias contaminantes. Es común que las fábricas tengan problemas de asepsia y que, sumados a la mala conservación en la cadena de comercialización, hacen que al momento de aplicación el producto pueda estar altamente contaminado. El soporte: es el sustrato que provee los elementos imprescindibles para la vida de las bacterias (alimento, oxígeno y humedad). Por tal motivo debe tener compuestos orgánicos simples, alta difusión de O 2 y capacidad de retener humedad. Los soportes más adecuados son aquellos a base de turba (suelo orgánico) que cumplen con todas estas características. Sin embargo, debido a las dificultad que implica en una fábrica el manipuleo de la turba (esterilización, molido, corrección de ph, etc.), en la actualidad la mayor cantidad de los inoculantes que se comercializa son en base líquida. El problema del soporte líquido es la escasa difusión del O 2, por lo que deben elegirse envases con volumen reducido y con cámara de aire que facilitan la mezcla y aireación del producto. Son totalmente contraindicados soportes de material inorgánico (por ej. dolomita) porque no poseen alimento y son altamente desecantes, ni soportes orgánicos como por ej. cáscaras de arroz, debido a que la celulosa no puede ser utilizada como alimento por los rizobios. Frecuentemente, se encuentran en el mercado inoculantes mezclados con fungicidas y/o insecticidas. Esto se debe a que a los productores les resulta muy práctico aplicar el inoculante y el curasemillas en una sola operación, sin embargo está totalmente comprobado que los agroquímicos utilizados provocan alta mortandad de bacterias a partir de las 48 hs. de haber sido realizada la mezcla. Otro aspecto muy difundido en la actualidad es la incorporación de sustancias conservantes en el soporte con la finalidad de preservar la sobrevivencia de las bacterias por largos periodos de tiempo. Si bien se garantiza el número de bacterias, los conservantes suelen retrazar la liberación

154 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C de los rizobios en el suelo y por ende demorar la infección. Esto provoca que en los estadios tempranos no haya FBN y la planta deba proveerse de N del suelo. El envase: no es un aspecto menor para la calidad de un inoculante. Un producto puede ser muy bueno pero su envase no ser lo suficientemente adecuado para permitir la vida de las bacterias. La condición imprescindible es que el envase permita el paso del O 2, pero que impida la entrada de contaminantes y la pérdida de humedad. Además, es recomendable que posean filtros para los rayos UV. Debido a todo esto, los envases no pueden ser de materiales plásticos comunes sino de algunos especiales que posean la porosidad adecuada para cumplir con estos requisitos (polipropileno biorentado mas polietileno blanco con aditivos para oxigenación). Verificación a campo de la eficiencia de la inoculación Es muy importante evaluar a campo el resultado de la aplicación de un inoculante. Para ello deben tomarse muestras en el momento que la planta tiene mayores requerimientos de N (al 50% de floración del lote). Si los muestreos son tempranos, habrá escaso desarrollo nodular y si son tardíos (por ej. a cosecha) los nódulos estarán muertos o se habrán desprendido. Debe tenerse especial cuidado en no arrancar la planta sino extraerla con todo el pan de tierra y luego lavarla suavemente para que no se desprendan los nódulos. Los aspectos a observar son: a) lugar de formación de los nódulos (los nódulos provenientes del inoculante se localizan en el cuello y raíz principal), b) número de nódulos en raíz principal y raíces secundarias (provenientes del suelo), c) color de los nódulos (el color rojo indica actividad de la leghemoglobina), y d) relación entre peso de raíz y parte aérea de la planta. Si es una leguminosa forrajera se recomienda realizar un análisis de contenido de N en las hojas. Cuando existen dudas acerca de la cantidad de nódulos originados por el inoculante se pueden realizar pruebas serológicas con antígenos específicos. Esta prueba da una certeza muy alta sobre el grado de competitividad de la cepa del inoculante frente a los rizobios nativos del suelo.

155 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Cuando se evalúa la nodulación a campo debe tenerse muy en cuenta la historia del lote y la forma de aplicación del inoculante. Por ej. lotes recién desmontados o que hayan tenido un cultivo de leguminosa incorporado (vicia, alfalfa, etc.) tendrán alta disponibilidad de N en el suelo y la planta presentará escasa nodulación, aunque el inoculante y las técnicas de inoculación hayan sido los adecuados.

156 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD IX: DEGRADACIÓN DE RESIDUOS ORGÁNICOS La acumulación de residuos de origen doméstico, agrícola e industrial es uno de los más graves problemas ambientales de la actualidad debido a que la tasa de degradación natural siempre es inferior a la tasa de generación de residuos. Además, esta acumulación se ve agravada en mayor medida por el hecho de que una gran proporción de residuos son productos sintéticos (plásticos y otros polímeros) que no se degradan naturalmente. Los tratamientos de residuos persiguen la aceleración de los procesos de degradación natural con la finalidad de reducir la masa de residuo, eliminar contaminantes y alternativamente producir energía (biogás) y otros compuestos de interés (por ej. abonos orgánicos). Los tratamientos de residuos involucran procesos físicos, químicos y/o biológicos. Estos últimos se utilizan en la degradación de residuos orgánicos y consisten en la aplicación controlada de procesos microbianos. Los residuos generados en establecimientos agrícolas (tambos, criaderos de cerdos, aves, etc.) y en industrias agroalimentarias tienen alto contenido de restos orgánicos lo que favorece la utilización de mecanismos de degradación microbiana. Tratamiento de residuos sólidos Hay dos tipos de tratamientos biológicos de residuos sólidos según se utilicen procesos aeróbicos o anaeróbicos: Tratamientos aeróbicos de residuos sólidos Compostaje: consiste en manejar un proceso aeróbico-termófilo de degradación microbiana con la finalidad de: Reducir el residuo en un 50-80% del material original Degradar sin producir olor ni gases de fermentación Obtener un abono estable, con alto contenido de materia Orgánica humificada y nutrientes disponibles Eliminar los microorganismos patógenos que pudiera tener el material de origen

157 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Generalmente el compostaje se realiza en pilas al aire libre manejadas con riego y ventilación. Las pilas deben tener dimensiones aproximadas de 30 m de largo x 1.5m de alto y 2m de ancho (no pueden ser más grandes para no generar condiciones anaeróbicas que provoquen fermentaciones, olores y gases). El proceso puede requerir entre 3 a 6 meses de tiempo. Menos común es la obtención de compost dentro de reactores cerrados con un control estricto de aireación, humedad y temperatura. En estos sistemas el proceso demora solo 5 a 7 días. Durante el compostaje se produce una sucesión microbiana en la cual actúan hongos, bacterias y actinomycetes de metabolismo respiratorio que degradan los compuestos lábiles del residuo. En la práctica se establecen dos fases en la sucesión microbiana: a. Fase hidrolítica: en la cual hay alta actividad microbiana (metabolismo de respiración aeróbica) que provoca aumento de temperatura (puede llegar hasta 75 C). Esta elevación de la temperatura hace que la degradación continúe solo mediante organismos termófilos provocando la muerte de los organismos patógenos propios de los residuos. La fase finaliza cuando se agotan los compuestos lábiles y solo sobreviven bacterias esporuladas. b. Fase de maduración: consiste en la recolonización del compost por organismos mesófilos del ambiente que degradan muy lentamente la materia orgánica recalcitrante lo que favorece la formación de humus. En la actualidad, existen inoculantes formulados con bacterias termófilas que se incorporan a los compost para acelerar y controlar el proceso. Sin embargo se menciona que los resultados son poco evidentes. El control más eficiente de la producción de compost se logra mediante la regulación de las condiciones ambientales. Manejo de la pila de compostaje Al hacer la pila, generalmente se realizan mezclas de diferentes tipos de residuos, con la finalidad de obtener un proceso más uniforme. En las mezclas se busca que exista un balance entre compuestos lábiles y recalcitrantes y suficiente cantidad de N (C/N = 30). Las mezclas más comunes incluyen residuos de cosecha (paja), virutas de aserraderos, estiércol y orín de diferentes animales, orujos de industrias frutícolas, etc. También se suele

158 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C mezclar tierra arcillosa cuando la C/N es muy baja para que el exceso de NH 4 sea retenido en las arcillas y no se volatilice como NH 3. Otros factores que se controlan en el proceso de compostaje son: a) tamaño del material (las mezclas se muelen), b) ph, c) humedad y d) temperatura. Si el ph es muy bajo (menor a 6) suele agregarse cal pero cuidando que no supere ph 8. Mientras que la humedad óptima debe estar entre 50% y 60 % del peso del material al iniciar el compostaje y el 30% en la etapa de maduración. Para lograr estos valores la pila se riega si falta humedad y se remueve para que evapore si tiene humedad en exceso. Además, al remover la pila se incorpora O 2 que favorece la respiración microbiana en la primera fase del compostaje. El control de temperatura es muy importante porque indica la eficiencia del proceso: si las temperaturas son bajas indica que hay poca actividad microbiana y si se eleva mucho hay riesgo que se arruine el compost debido a la coagulación de proteínas. En esos casos hay que ventilar la pila. Utilización de los compost Los compost se utilizan mayoritariamente como abono en cultivos intensivos (hortícolas) porque deben colocarse altas dosis por ha para obtener resultados evidentes, lo cual hace que sea muy dificultoso la movilización del material en cultivos extensivos. También es muy utilizado en suelos pobres con la finalidad de aumentar el contenido de materia orgánica y en cultivos orgánicos en reemplazo de los fertilizantes químicos. Debido a las normativas que se aplican para cultivos orgánicos, existen normas de calidad de compost que incluyen mayoritariamente aspectos químicos (contenido de nutrientes, humedad, ph, presencia de metales pesados, etc.). Los requisitos de calidad microbiológica se refieren exclusivamente a aspectos de carácter sanitario (presencia de coliformes y salmonelas), sin especificar las características y abundancia de los microorganismos responsables de la fertilidad y estabilidad del compost. Vermicompostaje: es una variación de la tecnología de compostaje donde se utilizan lombrices para acelerar la degradación de los residuos en condiciones mesófilas. La lombriz realiza importantes procesos físicos sobre los residuos (tritura, mezcla, humedece, lubrica con mucus, incorpora sus excreciones

159 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C urinarias e intestinales formando agregados de partículas: coprolitos, etc.) que favorecen la actividad microbiana y la retención de la humedad en el abono. En general el vermicompost es un abono de mejor calidad que el compost y se obtiene en menor tiempo, sin embargo requiere mayor cantidad de mano de obra debido a que se debe controlar permanentemente que no aumente la temperatura para evitar la muerte de las lombrices. En contraposición a los fertilizantes químicos, el compost y el vermicompost actúan como fertilizantes de liberación lenta y de acción prolongada, lo cual favorece la sincronización con los requerimientos de los cultivos. Tratamientos anaeróbicos de residuos sólidos Producción de biogás: consiste en la degradación de los compuestos orgánicos en digestores herméticos sin aire y sin luz con la finalidad de obtener metano.los biodigestores poseen un conducto para la entrada de material fresco y otro para la salida del residuo digerido con dispositivos de hermeticidad para impedir la entrada de aire y una campana captadora del gas para facilitar la salida del metano producido. El biogás se produce por la actividad de microorganismos QOH y QLA en dos etapas. En la primera etapa actúan QOH de fermentación butírica y ácido mixta. En la segunda etapa los productos de dichas fermentaciones (CO 2 y H 2 ) son utilizados por bacterias QLA oxidadoras de H 2 (metanogénicas) produciendo metano (gas). El metano es una alternativa energética útil y barata particularmente en establecimientos rurales donde se produce gran cantidad de estiércol (por ej. tambos, feedlots, etc.) y que no disponen de fuentes de combustibles accesibles. De esta manera se soluciona la eliminación de los residuos y a la vez se utiliza la energía del biogás para calefaccionar y calentar el agua de lavado del tambo. Además, en la mayoría de los casos el material digerido (barros) es utilizado como abono en las pasturas del ganado.

160 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Fig. 1: Biodigestor Tratamientos de efluentes líquidos Los residuos líquidos con alta carga de compuestos orgánicos provienen del uso domiciliario (efluentes cloacales) y agroindustrias. Los tratamientos aplicados a este tipo de efluentes persiguen la eliminación de riesgos sanitarios y la recuperación de la calidad original del agua para que pueda ser reutilizada o vertida a causes superficiales o subterráneos. Para ello los tratamientos deben reducir el contenido de materia orgánica y nutrientes a un nivel tal que impida el crecimiento bacteriano. Se utilizan diferentes tipos de sistemas de tratamiento que suelen llamarse primario, secundario y terciario. Un tratamiento altamente eficiente debe tener los tres tipos de sistemas: Sistema primario: consiste solo en un tratamiento físico del efluente ya que mediante filtración y decantación se elimina el material grueso y pesado (lagunas de estabilización). No se produce reducción del contenido de nutrientes ni de materia orgánica en solución, ni disminuye la carga de microorganismos de riesgo sanitario. El volcamiento a diferentes cursos de agua de este tipo de tratamiento no está permitido en las normativas ambientales.

161 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Sistema secundario: consiste en la degradación aeróbica de la materia orgánica del efluente mediante mecanismos de aireación forzada para favorecer la respiración microbiana. No elimina los nutrientes minerales. Después de la aireación, el efluente se decanta para depositar el material en suspensión (barros) que contiene alta cantidad de bacterias floculadas. Una cierta proporción de estos barros se reincorpora a la pileta de aireación (como inóculo) para acelerar el proceso, mientras que el resto se lo trata como residuo sólido para la obtención de biogás y/o compost o se coloca a secar en piletas con fondo de grava y arena. El volcamiento del agua de salida del sistema secundario solo se autoriza si recibe un tratamiento de Cl para eliminar todos los microorganismos y oxidar los restos de materia orgánica soluble que pudieran haber persistido. En las normas de calidad de efluentes suele controlarse la cantidad de Cl residual que indica si se ha realizado la cloración. Como el Cl se consume según la cantidad de compuestos orgánicos oxidados, en el volcamiento siempre debe quedar un excedente para garantizar la eliminación total de los microorganismos.

162 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Sistema terciario: es el proceso menos difundido en nuestro país porque son sistemas caros y complejos. Sin embargo solo mediante este sistema se logra eliminar los nutrientes del agua y se evita el crecimiento de organismos vivos. Básicamente hay dos mecanismos dentro del sistema terciario: el que somete al agua a condiciones estrictamente anaeróbicas para favorecer la volatilización de los nutrientes (denitrificación y desulfatación) y el que utiliza los llamados biofilms. Los biofilms son partículas (plásticas o grava) recubiertas por microorganismos autótrofos (cianobacterias unicelulares) por donde se hace pasar el efluente. Las cianobacterias producen gran cantidad de biomasa (debido a la alta carga de nutrientes) y cuando todas las partículas están cubiertas por biomasa se retiran, se lavan y las bacterias son secadas y utilizadas como abono orgánico. Biorremediación Los sistemas convencionales de tratamiento de efluentes implican infraestructura, procesos costosos y descarga a acuíferos o cursos de agua superficial. En los últimos años se han desarrollado tecnologías alternativas para el tratamiento de efluentes, conocidas como biorremediación. Mediante este tipo de tratamientos no quedan barros ni agua residual que requieran ser retratados o volcados en cursos superficiales o subterráneos. Asimismo, se mejora considerablemente el valor paisajístico del lugar debido a que no hay ningún signo visible de que sea una planta depuradora de efluentes. La biorremediación es el uso deliberado de la capacidad de organismos vivos para eliminar contaminantes. Las prácticas de biorremediación más difundidas son la incorporación de bacterias degradadoras y la fitorremediación. Con la incorporación de bacterias altamente seleccionadas y/o mejoradas genéticamente se pretende aumentar la velocidad de degradación del contaminante. Mientras que la fitorremediación consiste en utilizar vegetales como filtros depuradores teniendo en cuenta la capacidad de las plantas para remover nutrientes.

163 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C El fundamento de la biorremediación es utilizar la actividad de bacterias aeróbicas y anaeróbicas del agua, el suelo y la rizósfera de las plantas, para eliminar la materia orgánica y los nutrientes del efluente. Además, se aprovecha la capacidad del humus y las arcillas para neutralizar compuestos tóxicos como los metales pesados. El éxito de los tratamientos de biorremediación depende no solo de la introducción de especies (bacterias o plantas) sino también del manejo integrado del ecosistema. Por tal motivo las metodologías deben adaptarse a las condiciones ecológicas de cada ambiente en particular manejando las especies, el nicho ecológico y el estado fenológico de las plantas. Generalmente los sistemas de biorremediación incluyen lagunas y canteros de inundación rodeados de vegetación palustre y ribereña por donde circula el agua del efluente. Por tales motivos se adapta muy bien para al tratamiento de efluentes de establecimientos rurales debido a que utiliza prácticas agrícolas para la instalación del sistema (siembras, borduras, etc.) y el manejo de las condiciones de aireación del suelo (laboreos). Los sistemas de biorremediación tienen las siguientes limitaciones: a) se requiere una amplia superficie de terreno, b) se debe esperar un cierto tiempo para que funcionen a pleno, c) son poco adecuados para tratar grandes volúmenes de efluentes y d) no pueden ser utilizado en lugares con condiciones climáticas adversas (particularmente bajas temperaturas). Sistema de biorremediación de efluentes en una fábrica de electrodomésticos en Luque Provincia de Córdoba.

164 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD X: MICROBIOLOGÍA DEL AGUA El agua en nuestro planeta se encuentra en una variedad de ambientes, en diferente estado, cantidad y calidad. La mayor parte del planeta está cubierta por agua, sin embargo la mayor parte de la misma se encuentra en formas no disponibles para los ecosistemas terrestres o dulceacuícolas. Menos de un 3% es agua dulce para beber o regar cultivos y, de ese total, más de dos tercios esta retenida en glaciares y cascos polares. Por lo tanto, a escala global el agua de lagos y ríos es de un diez milésimo de toda el agua del planeta (Fig 1). Fig 1: Distribución del agua en el planeta Ciclo hidrológico La distribución del agua sobre el continente depende del ciclo hidrológico, en el cual la evaporación oceánica es contrarrestada por las precipitaciones sobre la tierra. La energía solar conduce el ciclo hidrológico, evaporando el agua de la superficie de los océanos, lagos y ríos, así como de los suelos y las plantas (evapotranspiración). El vapor de agua se eleva hacia la atmósfera donde se enfría, se condensa y eventualmente cae de nuevo como lluvia, nieve o granizo. Las precipitaciones pueden ser interceptadas o transpiradas por las plantas, pueden ser transportadas por escorrentía hacia lagos o ríos, o pueden

165 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C infiltrarse en el suelo. El agua infiltrada se puede almacenar temporariamente como humedad del suelo antes de ser evaporada y una parte del agua puede infiltrarse hacia zonas más profundas para ser almacenada en las napas (tiempo medio de renovación 300 años). La mayor parte del agua que se evapora en los océanos retorna como precipitaciones a los océanos y el resto cae sobre los continentes. Debido a que la cantidad de lluvia que cae sobre la tierra es mayor que la cantidad que se evapora de ella, el agua extra retorna a los océanos a través de los ríos y acuíferos subterráneos (Figura 2). La renovabilidad del agua es diferente en los distintos ambientes hidrológicos debido a los diferentes tiempos de residencia, por lo que la sustentabilidad en el uso del agua está basada en respetar las tasas de renovación. El agua subterránea se recambia más lentamente que otras reservas de agua, frecuentemente en cientos o decenas de miles de años, aunque la variación en las tasas de recambio es grande. Ciertamente, la mayoría del agua subterránea no se recambia o recarga del todo desde la superficie de la tierra. En vez de esto, el agua subterránea existente es agua fósil un relicto de las condiciones climáticas más húmedas de la antigüedad y de la fundición de las láminas de hielo del Pleistoceno que se acumularon durante decenas de miles de años. Una vez usadas, no pueden ser fácilmente reabastecidas. Fig. 2: Ciclo hidrológico

166 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Microorganismos en los ecosistemas acuáticos Entre los ecosistemas microbianos de agua se encuentran los océanos, aguas subterráneas, lagos, ríos, etc. Estos ecosistemas pueden variar enormemente en la estructura física, los recursos y las condiciones (Tabla 1), y todos estos factores pueden influir en la diversidad y la abundancia de los microorganismos presentes. Tabla 1: Principales recursos y condiciones que gobiernan el crecimiento microbiano en la naturaleza. Recursos Carbono (orgánico, CO 2 ) Nitrógeno (orgánico, inorgánico) Otros macronutrientes (S, P, K, Mg) Micronutrientes (Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Mn, Ni) O 2 y otros aceptores de electrones (NO 3 -, SO 4 2-, Fe 3 +, etc.) Donadores de electrones inorgánicos (H 2, H 2 O, Fe 2+, NH 4 +, NO 2 -, etc.) Condiciones Temperatura: frío templado caliente ph: O 2 : óxico microóxico anóxico Luz: brillante atenuada oscuridad Condiciones osmóticas: agua dulce agua marina - hipersalinidad En los ecosistemas acuáticos superficiales la energía entra en el ecosistema en forma de luz solar, carbono orgánico y sustancias inorgánicas reducidas. Los fotótrofos utilizan la luz para fabricar ATP y sintetizar nueva materia orgánica que además de carbono contiene N, azufre, fósforo, hierro y otros bioelementos. Los fotótrofos oxigénicos en suspensión libre en el agua se llaman fitoplancton e incluyen algas y cianobacterias que viven en la columna de agua (Figura 3). Los fotótrofos adheridos al fondo o a los lados de un lago o corriente son especies bentónicas. Los procariotas fotosintéticos anoxigénicos pueden también fijar el CO 2 y formar materia orgánica pero no forman O 2. Este material orgánico recién sintetizado por los fotótrofos, junto con la materia orgánica que penetra en el ecosistema desde el exterior (materia orgánica alóctona) impulsa las actividades catabólicas de los organismos heterótrofos. A continuación la materia orgánica se oxida a CO 2 mediante la respiración o se fermenta en diferentes sustancias reducidas. Si están presentes y metabólicamente activas en el ecosistema, los organismos QLA

167 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C obtienen energía de los donadores de electrones inorgánicos como H, Fe, S o NH + 4 y contribuyen a la síntesis de nueva materia orgánica a través de sus actividades autótrofas (Figura 3). Aunque el O 2 es uno de los gases más abundantes en la atmósfera es poco hidrosoluble y el intercambio con la atmósfera es lento. La producción fotosintética significativa del O 2 se produce solo en las capas superficiales donde llega la luz. La materia orgánica que no se consume en las capas superficiales va a parar al fondo, donde se descompone por la acción de los organismos QOH anaerobios (Figura 3). Tanto los organismos productores de O 2 como los consumidores están presentes en los ambientes acuáticos, y el equilibrio entre la fotosíntesis y la respiración controla el O 2 y el ciclo del C en la naturaleza. Fig. 3: Comunidades microbianas de los ecosistemas acuáticos naturales

168 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Contaminación de los ecosistemas acuáticos Los ecosistemas acuáticos son particularmente vulnerables a la contaminación antrópica y actualmente muchos están severamente degradados. Las actividades humanas pueden alterar el balance de C, el ingreso de nutrientes y los procesos microbianos, afectando al ecosistema de manera global. Las fuentes de contaminación pueden ser naturales (generadas por el ambiente) o artificiales (crecimiento demográfico, desarrollo industrial, urbanización) y los compuestos contaminantes que ingresan a los ecosistemas lóticos provienen de fuentes no puntuales (actividades agrícolas, urbanas e industriales) y puntuales (descargas de efluentes industriales, pluviales y domésticos). Los ingresos no puntuales de contaminantes son en general intermitentes y difíciles de medir. Contrariamente, las fuentes puntuales de contaminación incluyen descarga de efluentes que suelen ser continuas. Es ampliamente conocido que la contaminación produce grandes cambios en las condiciones biológicas alterando la estabilidad de los ecosistemas. Una de las principales causas es el ingreso de altas cantidades de materia orgánica y nutrientes por actividades agrícolas y urbanas. Los desechos orgánicos que ingresan a los ríos se dispersan en el agua y/o depositan en los sedimentos. En el agua los compuestos orgánicos son metabolizados por microorganismos heterótrofos aeróbicos que aumentan su biomasa y consumen el O 2 disuelto liberando CO 2 y nutrientes. El aumento de nutrientes (alóctonos o provenientes de la degradación microbiana) en los cursos de agua provoca eutrofización y consecuente proliferación de algas que cuando mueren son degradadas por microorganismos aeróbicos. El resultado de estos procesos es una marcada disminución de O 2 disuelto en la columna de agua. La descarga de efluentes domésticos es una de las principales fuentes puntuales de contaminación de los ecosistemas acuáticos ya que presenta gran cantidad de materia orgánica lábil, nutrientes y microorganismos patógenos. La contaminación de origen cloacal implica alto riesgo para la salud humana, no obstante la mayoría de los ríos presentan elevada cantidad de indicadores de contaminación cloacal en los sedimentos y el agua. Sin embargo, los ecosistemas acuáticos pueden autodepurarse de manera natural mediante la descomposición de materia orgánica y la remoción de contaminantes por actividad microbiana. El tiempo requerido para depurar el

169 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C agua depende del grado de contaminación y de las características del ecosistema. Los ríos de aguas rápidas y turbulentas pueden autodepurarse en menor tiempo que los de aguas lentas a causa del mayor ingreso de O 2 disuelto. No obstante, incluso aunque en un río se mezcle profusamente el O 2 debido al flujo rápido y las turbulencias, los aportes orgánicos elevados pueden conducir a un notable déficit de O 2 debido a la respiración bacteriana. A medida que el agua se aleja del lugar donde se produce la descarga la materia orgánica se consume gradualmente y la concentración de O 2 regresa a la normalidad. Si a medida que un río empieza a recuperarse existen nuevas entradas de contaminación, se supera la capacidad de autodepuración y se revierten las condiciones aeróbicas. El agotamiento del oxígeno en los ecosistemas acuáticos es indeseable porque muchos animales acuáticos mueren incluso en intervalos breves de anoxia. Además la anoxia provoca el crecimiento de bacterias anaerobias que producen compuestos odoríferos (aminas, H 2 S, mercaptanos, ácidos) algunos de los cuales también son tóxicos para los organismos superiores. Las aguas subterráneas suelen ser más difíciles de contaminar que las superficiales, pero cuando esta contaminación se produce es más difícil de eliminar. Sucede esto porque las aguas del subsuelo tienen un ritmo de renovación muy lento. Se calcula que mientras el tiempo de permanencia medio del agua en los ríos es de días, en un acuífero es de cientos de años, lo que hace muy difícil su purificación. Cada ecosistema lótico no disturbado posee una determinada cantidad de materia orgánica resultado del balance entre los procesos de incorporación y descomposición microbiana. Por lo tanto el ingreso de mayor cantidad de materia orgánica (y/o diferente calidad) y nutrientes por contaminación antrópica puede hacer variar drásticamente la abundancia, actividad y estructura de la comunidad microbiana y como consecuencia alterar los ciclos biogeoquímicos a nivel global y particular. La urgente necesidad humana de agua de razonable calidad requiere del análisis y manejo de los recursos hídricos maximizando la eficiencia del uso. Para lograr un uso eficiente se debe interpretar el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos ya que la calidad del agua depende fuertemente de procesos biológicos.

170 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Carga microbiana del agua según su origen Los microorganismos del agua pueden ser característicos de la masa de agua natural, o transitorios cuando entran al agua en forma intermitente procedentes del suelo, aire, procesos industriales, agrícolas o domésticos. En general los ecosistemas naturales de agua dulce (ríos, lagos y aguas subterráneas) sin contaminar presentan escaso contenido de carbono orgánico y nutrientes por lo que la abundancia de los microorganismos es baja. Por otro lado los efluentes domésticos, de origen pecuario y en algunos casos industriales, presentan una elevada abundancia de microorganismos. Es por esto que los microorganismos son ampliamente utilizados como indicadores de contaminación biológica. Sanidad y calidad de agua La calidad del agua no es una característica absoluta, sino que es más un atributo definido socialmente en función del uso que se le piense dar; cada uso requiere un determinado estándar de calidad. Por esta razón, para evaluar la calidad del agua es necesario considerar el contexto del uso probable que tendrá. Las estimaciones de disponibilidad del agua no reflejan por completo el problema de las necesidades de este recurso, ya que en la mayor parte del mundo la calidad del agua está lejos de ser la adecuada. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), 1100 millones de personas no tienen acceso a una fuente de agua potable, particularmente en áreas rurales donde no existe posibilidad de que el agua tenga un tratamiento previo que mejore su calidad y posibilite su uso general. El agua libre de contaminantes biológicos y químicos es esencial para la salud pública y, por lo tanto resultan necesarios procedimientos para controlar y comprobar la calidad del agua. El agua es con frecuencia una fuente potencial de enfermedades infecciosas y también de intoxicaciones químicas. Esto se debe a que a menudo una única fuente de agua sirve para un gran número de personas, como ocurre por ejemplo en las grandes ciudades. La pureza del agua es, por consiguiente, el factor individual más importante para asegurar la salud pública. Los métodos que normalmente se emplean para determinar la calidad de agua dependen de técnicas microbiológicas y químicas estandarizadas.

171 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Bacterias indicadoras de contaminación Incluso cuando el agua parece totalmente limpia y transparente puede estar contaminada con microorganismos patógenos y constituir un serio problema para la salud. No resulta práctico analizar el agua para cada organismo patógeno que pueda estar presente en un determinado abastecimiento de agua, por lo tanto se utilizan microorganismos indicadores cuya existencia señala una posible contaminación con patógenos. Los microorganismos indicadores de contaminación deben cumplir los siguientes requisitos: a) fáciles de aislar y crecer en el laboratorio, b) ser relativamente inocuos para el hombre y animales y c) presencia en agua relacionada (cuali y cuantitativamente) con la de otros microorganismos patógenos de aislamiento más difícil. Tres tipos de bacterias califican a tal fin: Coliformes fecales: indican contaminación fecal. Aerobias mesófilas: determinan efectividad del tratamiento de aguas. Pseudomonas: señalan deterioro en la calidad del agua o una recontaminación. Desde el punto de vista bacteriológico, para definir la potabilidad del agua, es preciso investigar bacterias aerobias mesófilas, coliformes totales y fecales. La gran sensibilidad de las bacterias aerobias mesófilas a los agentes de cloración, las ubica como indicadoras de la eficacia del tratamiento de potabilización del agua. Las bacterias coliformes habitan el tracto intestinal de mamíferos y aves, y se caracterizan por su capacidad de fermentar lactosa a C. Los géneros que componen este grupo son Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter y Edwardsiella. Todas pueden existir como saprofitas independientemente, o como microorganismos intestinales, excepto el género Escherichia cuyo origen es sólo fecal. Esto ha llevado a distinguir entre coliformes totales (grupo que incluye a todos los coliformes de cualquier origen) y coliformes fecales (término que designa a los coliformes de origen exclusivamente intestinal) con capacidad de fermentar lactosa también a 44,5 C. La existencia de una contaminación microbiológica de origen fecal se restringe a la presencia de coliformes fecales, mientras que la presencia de coliformes totales que desarrollan a 35 C, sólo indica existencia de contaminación, sin asegurar su origen. El agua no constituye un buen medio de

172 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C cultivo por lo que la supervivencia y multiplicación de los microorganismos patógenos es escasa, es por eso que la presencia en una muestra de agua de coliformes fecales y especialmente de Escherichia coli indica contaminación fecal que hace el agua no apta para consumo humano. Código alimentario argentino El Código Alimentario Argentino regula en todo el territorio de Argentina a todos los alimentos, condimentos, bebidas o sus materias primas y los aditivos alimentarios que se elaboren, fraccionen, conserven, transporten, expendan o expongan, así como a toda persona, firma comercial o establecimiento que lo haga. Tiene una serie de leyes que se deben cumplir para que un producto elaborado se comercialice, de lo contrario el producto no puede ser consumido ya que podría ser un elemento adulterado además de ser ilegal. El Código Alimentario Argentino fue puesto en vigencia por la Ley , reglamentada por el Decreto 2126/71, y cuyo Anexo I es el texto del Código. Se trata de un reglamento técnico en permanente actualización que establece las normas higiénico-sanitarias, bromatológicas, de calidad y genuinidad que deben cumplir las personas físicas o jurídicas, los establecimientos, y los productos que caen en su órbita. Esta normativa tiene como objetivo primordial la protección de la salud de la población y la buena fe en las transacciones comerciales. Definición de agua potable según CAA (Código Alimentario Argentino) AGUA POTABLE: Artículo (Resolución Conjunta SPRyRS y SAGPyA N 68/2007 y N 196/2007) Con las denominaciones de Agua potable de suministro público y Agua potable de uso domiciliario, se entiende la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud. Deberá presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente. El agua potable de uso domiciliario es el agua proveniente de un suministro público, de un pozo o de otra fuente, ubicada en los reservorios o depósitos domiciliarios. Ambas deberán cumplir con las características físicas, químicas y microbiológicas siguientes:

173 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Características físicas: Turbiedad: máx. 3 N T U Color: máx. 5 escala Pt-Co Olor: sin olores extraños Características químicas: ph: 6,5-8,5 ph sat.: ph ± 0,2. Sustancias inorgánicas: Amoníaco (NH + 4 ) máx.: 0,20 mg/l Antimonio máx.: 0,02 mg/l Aluminio residual (Al) máx.: 0,20 mg/l Arsénico (As) máx.: 0,01 mg/l Boro (B) máx.: 0,5 mg/l Bromato máx.: 0,01 mg/l Cadmio (Cd) máx.: 0,005 mg/l Cianuro (CN - ) máx.: 0,10 mg/l Cinc (Zn) máx.: 5,0 mg/l Cloruro (Cl - ) máx.: 350 mg/l Cobre (Cu) máx.: 1,00 mg/l Cromo (Cr) máx.: 0,05 mg/l Dureza total (CaCO 3 ) máx.: 400 mg/l Fluoruro (F - ): para los fluoruros la cantidad máxima se da en función de la temperatura promedio de la zona, teniendo en cuenta el consumo diario del agua de bebida: - Temperatura media y máxima del año ( C) 10,0-12,0, contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), límite inferior: 0,9: límite superior: 1, 7. - Temperatura media y máxima del año ( C) 12,1-14,6, contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), límite inferior: 0,8: límite superior: 1,5. - Temperatura media y máxima del año ( C) 14,7-17,6. contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), límite inferior: 0,8: límite superior: 1,3.

174 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Temperatura media y máxima del año ( C) 17,7-21,4, contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), Límite inferior: 0,7: límite superior: 1,2. - Temperatura media y máxima del año ( C) 21,5-26,2, contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), límite inferior: 0,7: límite superior: 1,0. - Temperatura media y máxima del año ( C) 26,3-32,6, contenido límite recomendado de Flúor (mg/l), límite inferior: 0,6; límite superior: 0,8. Hierro total (Fe) máx.: 0,30 mg/l Manganeso (Mn) máx.: 0,10 mg/l Mercurio (Hg) máx.: 0,001 mg/l Níquel (Ni) máx.: 0,02 mg/l Nitrato (NO - 3,) máx.: 45 mg/l Nitrito (NO - 2 ) máx.: 0,10 mg/l Plata (Ag) máx.: 0,05 mg/l Plomo (Pb) máx.: 0,05 mg/l Selenio (Se) máx.: 0,01 mg/l Sólidos disueltos totales, máx.: 1500 mg/l Sulfatos (SO = 4 ) máx.: 400 mg/l Cloro activo residual mín.: 0,2 mg/l. La autoridad sanitaria competente podrá admitir valores distintos si la composición normal del agua de la zona y la imposibilidad de aplicar tecnologías de corrección lo hicieran necesario. Para aquellas regiones del país con suelos de alto contenido de arsénico, se establece un plazo de hasta 5 años para adecuarse al valor de 0,01 mg/l. (Modificado por Resolución Conjunta SPReI N 34/2012 y SAGyP N 50/2012): Prorrogase el plazo de cinco (5) años previsto para alcanzar el valor de 0,01 mg/l de arsénico hasta contar con los resultados del estudio Hidroarsenicismo y Saneamiento Básico en la República Argentina Estudios básicos para el establecimiento de criterios y prioridades sanitarias en cobertura y calidad de aguas cuyos términos fueron elaborados por la Subsecretaría de Recursos Hídricos del Ministerio de Planificación Federal.

175 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Contaminantes orgánicos: THM, máx.: 100 ug/l Aldrin + Dieldrin, máx.: 0,03 ug/l Clordano, máx.: 0,30 ug/l DDT (Total + Isómeros), máx.: 1,00 ug/l Detergentes, máx.: 0,50 mg/l Heptacloro + Heptacloroepóxido, máx.: 0,10 ug/l Lindano, máx.: 3,00 ug/l Metoxicloro, máx.: 30,0 ug/l 2,4 D, máx.: 100 ug/l Benceno, máx.: 10 ug/l Hexacloro benceno, máx: 0,01 ug/l Monocloro benceno, máx.: 3,0 ug/l 1,2 Dicloro benceno, máx.: 0,5 ug/l 1,4 Dicloro benceno, máx.: 0,4 ug/l Pentaclorofenol, máx.: 10 ug/l 2, 4, 6 Triclorofenol, máx.: 10 ug/l Tetracloruro de carbono, máx.: 3,00 ug/l 1,1 Dicloroeteno, máx.: 0,30 ug/l Tricloro etileno, máx.: 30,0 ug/l 1,2 Dicloro etano, máx.: 10 ug/l Cloruro de vinilo, máx.: 2,00 ug/l Benzopireno, máx.: 0,01 ug/l Tetra cloro eteno, máx.: 10 ug/l Metil Paratión, máx.: 7 ug/l Paratión, máx.: 35 ug/l Malatión, máx.: 35 ug/l. Características Microbiológicas: Bacterias coliformes: NMP a 37 C- 48 hs. (Caldo Mc Conkey o Lauril Sulfato), en 100 ml igual o menor de 3. Escherichia coli: ausencia en 100 ml. Pseudomonas aeruginosa: ausencia en 100 ml.

176 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C En la evaluación de la potabilidad del agua ubicada en reservorios de almacenamiento domiciliario deberá incluirse entre los parámetros microbiológicos a controlar el recuento de bacterias mesófilas en agar (APC - 24 hs. a 37 C): en el caso de que el recuento supere las 500 UFC/ml y se cumplan el resto de los parámetros indicados, sólo se deberá exigir la higienización del reservorio y un nuevo recuento. En las aguas ubicadas en los reservorios domiciliarios no es obligatoria la presencia de cloro activo. Los tratamientos de potabilización que sea necesario realizar deberán ser puestos en conocimiento de la autoridad sanitaria competente. Calidad de agua para riego La calidad del agua para riego afecta tanto a los rendimientos de los cultivos como a las condiciones físicas del suelo, incluso si todas las demás condiciones y prácticas de producción son favorables/óptimas. Además, los distintos cultivos requieren distintas calidades de agua para riego. Los parámetros que determinan la calidad del agua para riego se dividen en tres categorías: químicos, físicos y biológicos. El principal problema relacionado con la calidad del agua para riego es la salinidad del agua. La salinidad del agua se refiere a la cantidad total de sales disueltas en el agua, pero no indica que sales están presentes, y se originan por disolución y erosión de las rocas y minerales. El nivel alto de sales en el agua de riego reduce la disponibilidad del agua para el cultivo (debido a la presión osmótica), aunque el suelo puede parecer mojado, y causa la reducción del rendimiento. El contenido de sodio es la variable más negativa para los suelos seguida de la alcalinidad. El parámetro utilizado para determinar el riesgo de sodio es el RAS (Relación de Adsorción de Sodio). Este parámetro indica la cantidad de sodio en el agua de riego, en relación con el calcio y el magnesio. El calcio y el magnesio tienden a contrarrestar el efecto negativo de sodio. Valores elevados de RAS (sodicidad) y ph (alcalinidad) conducen a la pérdida de estabilidad estructural de los suelos que se produce fundamentalmente por la dispersión y/o hinchamiento de las arcillas sensibles a estos procesos. Esta pérdida de estabilidad de los suelos reduce su capacidad para transmitir agua, se deterioran las condiciones físicas del suelo, ya que estas partículas son arrastradas a pocos centímetros de profundidad, acumulándose y formando

177 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C una capa pesada u horizonte de acumulación, de estructura prismática o columnar, poco permeable. La calidad del agua de riego también puede ser determinada por la toxicidad de iones específicos para la planta como el boro, cloro y sodio. En cuanto a los parámetros biológicos se utilizan a las coliformes fecales como indicadoras, particularmente cuando el agua para riego proviene de aguas residuales las cuales contienen una gran cantidad de patógenos si no son previamente tratadas adecuadamente. Tratamiento de efluentes de origen pecuario La intensificación de la producción animal se inició durante la década del cincuenta y, en esencia, implica la concentración de animales por unidad de superficie y el aumento en el uso de insumos. En Argentina la producción lechera desde 1990 mostró una tendencia de reducción del número de tambos, con un aumento en el tamaño del rodeo y producción por vaca. Asimismo, la producción intensiva de ganado como los feedlots, generalmente consiste en alimentar un gran número de animales en pequeñas áreas. Esta gran concentración de animales genera una enorme cantidad de residuos. Los residuos originados en las áreas de ordeñe y en los feedlots contienen excretas, orina (materia orgánica y nutrientes), microorganismos patógenos, agua de lavado de las instalaciones, además de restos de leche, detergentes y otros productos químicos utilizados en la limpieza e higiene. Debido a ello, la composición de los residuos es elevada en sólidos, nutrientes, materia orgánica y microorganismos. Además, los residuos pueden ser colonizados con microorganismos mesófilos provenientes del ambiente. Por lo tanto si los residuos no son manejados correctamente afectan la calidad de aguas superficiales y subterráneas, de los suelos, y la salud humana y animal. El manejo de las excretas es un aspecto fundamental en la sustentabilidad ambiental de los sistemas de producción animal intensivos o en proceso de intensificación. El diseño de cualquier sistema de tratamiento debe considerar la cantidad de estiércol producido y recolectable, su concentración final en el efluente (incluyendo el agua de lavado) y las precipitaciones locales, dado que por lluvias pueden colapsar las lagunas. Para comprender esta situación, basta decir que un tambo de 400 vacas en ordeño genera una contaminación localizada equivalente a 500 seres humanos. El tratamiento de las excretas, en general, consiste en disminuir la carga orgánica que contienen.

178 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C El tratamiento de estos residuos se puede realizar bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Cuando se realiza en condiciones aeróbicas y se separan los sólidos de la fase líquida, el estiércol resultante puede ser estacionado en pilas o compostado, lo cual permite aumentar la proporción de materia seca y la disponibilidad de nutrientes, y remover organismos patógenos. Los líquidos pueden ser sometidos a tratamiento en lagunas aeróbicas (con aireación forzada), donde los microorganismos aeróbicos oxidan la materia orgánica. Si el tratamiento resulta exitoso, estos líquidos pueden ser utilizados para su aplicación en cultivos y pasturas o vertirse a cuerpos de agua. En el caso que aún fuese necesaria su depuración, se debería continuar con un tratamiento terciario como filtros biológicos organizados en franjas implantadas con especies forrajeras, plantas acuáticas o árboles. Cuando se realiza tratamiento anaeróbico se produce biogás (metano) que puede colectarse y utilizarse. Además, disminuyen la materia orgánica, los nutrientes (remoción de N entre 62 y 72% y de P entre 50 y 75%) y los patógenos. Los nutrientes de los estiércoles también pueden ser reciclados aplicando el estiércol en las tierras agrícolas. Sin embargo, la cantidad de estiércol generado en los sistemas de ganadería concentrada a menudo excede la capacidad de usar y retener estos nutrientes de las tierras agrícolas cercanas. Por ej. se requiere un área agrícola cerca de veces más grande que el área de feedlot en sí misma para distribuir los nutrientes del estiércol a un nivel igual al que puedan ser utilizados por los cultivos. Muchos cultivos pueden no estar disponibles y el exceso de estiércol termina siendo aplicado en áreas agrícolas pequeñas. Entonces el exceso de nutrientes se incorpora al suelo, se va por escorrentía o se infiltra en las napas de agua o, en el caso del N, puede entrar a la atmósfera.

179 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C - 178

180 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C UNIDAD XI: MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS: PROCESOS MICROBIANOS DE LA CONSERVACIÓN Y PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS Los microorganismos pueden utilizar nuestros alimentos como fuente de nutrientes para su propio crecimiento, lo que puede ocasionar una alteración de los mismos. La alteración del alimento puede ocurrir porque los microorganismos se multiplican en él, porque utilizan sus nutrientes, porque producen modificaciones enzimáticas o porque le producen sabores desagradables mediante el desdoblamiento de determinadas sustancias o mediante la síntesis de nuevos compuestos. Los principales factores de la composición de los alimentos que influyen en la actividad microbiana son: a) ph, b) humedad, c) potencial de óxido-reducción, d) nutrientes y e) presencia de sustancias inhibidoras o barreras. ph (concentración de iones hidrógeno) Cada microorganismo tiene un ph mínimo, un ph óptimo y un ph máximo de crecimiento. Las células microbianas son muy afectadas por el ph, debido a que al parecer, carecen de mecanismos que les permita regular su ph interno. En general, los hongos y las levaduras toleran mejor la acidez que las bacterias, quienes se desarrollan mejor a ph cercanos a la neutralidad. Sin embargo, algunas bacterias como las lactobacterias crecen bien a ph entre 4 y 4,5 o las bacterias con actividad proteolítica que se pueden desarrollar a ph básico. Todo alimento que tenga un ph intrínsecamente bajo, tendería a ser más estable desde el punto de vista microbiológico, que un alimento neutro. Humedad (actividad agua) Los microorganismos se caracterizan por la necesidad de agua para su crecimiento, sin embargo la cantidad de agua que necesitan es variable. Esta demanda de agua se expresa como agua disponible o actividad agua (a w ). El a w se define como la presión de vapor de la solución (sustancias disueltas en agua en la mayoría de los alimentos) dividida por la presión de vapor del disolvente (generalmente agua). El agua pasa a quedar no disponible por: los solutos e iones que fijan el agua de la solución, los coloides hidrófilos (agar) y la cristalización del agua. Cada microorganismo tiene una a w mínima, una a w óptima y una a w máxima.

181 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C siguientes: Los factores que influyen sobre la a w de los microorganismos son los Tipo de soluto utilizado para reducir la a w Valor nutritivo del medio de cultivo: cuanto más apropiado es el medio para el crecimiento del microorganismo menor es la a w limitante del crecimiento. Temperatura: cuando la temperatura esta próxima a la temperatura óptima de crecimiento los microorganismos son más resistentes a valores bajos de a w. Aporte de oxígeno: en condiciones aeróbicas la multiplicación de los microorganismos aeróbicos ocurre a valores de a w menores que cuando lo hacen en un medio anaeróbico. ph: a valores próximos a la neutralidad la mayoría de los microorganismos son más tolerantes a una escasa a w. Potencial de óxido-reducción El potencial redox es una medida de la actividad de los electrones. El poder oxidante o reductor de un alimento influye en el tipo de microorganismo que crece sobre él y por lo tanto en las modificaciones que tendrán lugar en el alimento. El potencial redox de un alimento está definido por: el potencial redox del alimento originario y por la capacidad de compensación del alimento, es decir, su resistencia a modificar su potencial, por la presión de oxígeno de la atmósfera existente en torno al alimento y por el contacto que la atmósfera tiene con el alimento. Un potencial redox elevado (oxidante) favorece el crecimiento de los microorganismos aerobios, aunque permitirá el crecimiento de los facultativos, mientras que un potencial redox bajo (reductor) favorece el crecimiento tanto de los microorganismos anaerobios como facultativos. El crecimiento de un determinado microorganismo sobre el alimento puede modificar el potencial redox del mismo impidiendo el desarrollo de otros microorganismos, así por ejemplo, el desarrollo de microorganismos anaerobios puede reducir el potencial redox que impediría el crecimiento de los aerobios.

182 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Por lo general, la mayoría de los alimentos frescos, ya sean de origen vegetal o animal, tienen en su interior un potencial redox bajo y bien equilibrado. Así los vegetales poseen sustancias reductoras como por ejemplo el ácido ascórbico y azúcares reductores, y mientras que los animales poseen radicales sulfhidrilo y otros grupos reductores. Esto conjuntamente con la presión de oxígeno existente en torno al alimento, crea condiciones aerobias en la superficie y sus proximidades, pudiendo permitir el crecimiento de bacterias aerobias productoras de viscosidad o bacterias acidificantes, mientras que en el interior se llevan a cabo procesos de putrefacción anaeróbica. Nutrientes Para determinar qué tipo de microorganismo puede crecer sobre un alimento es necesario tener en cuenta la clase y la cantidad de nutrientes presentes en el alimento. En base a ello tenemos que distinguir: a) alimentos energéticos, b) alimentos plásticos y c) sustancias accesorias de los alimentos o vitaminas. Alimentos energéticos: los hidratos de carbono normalmente representan la fuente más comúnmente utilizada como energía por los microorganismos. Un reducido número de microorganismos pueden utilizar lípidos (grasas) como fuente de energía, siempre que no dispongan de un alimento energético más fácilmente utilizable. En general, en la descomposición de las grasas intervienen principalmente microorganismos aeróbicos, al igual que para la descomposición de las proteínas. Alimentos plásticos: también conocidos como formadores, son aquellos que tienen altos contenidos proteicos. Los microorganismos se diferencian por su capacidad de utilizar los diferentes compuestos nitrogenados como fuente de nitrógeno para satisfacer sus necesidades de crecimiento. Algunos microorganismos son incapaces de utilizar las proteínas, por ello necesitan que previamente estas sean hidrolizadas por microorganismos proteolíticos (por ejemplo algunos mohos). Otros microorganismos utilizan como fuente de nitrógeno los péptidos, los aminoácidos, la urea, el amoníaco u otros compuestos nitrogenados más sencillos. Sustancias accesorias de los alimentos o vitaminas: algunos microorganismos son incapaces de sintetizar algunas o todas las vitaminas que necesitan, por eso se las deben suministrar los alimentos. Los distintos tratamientos a los que se somete el alimento pueden reducir su contenido

183 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C vitamínico e incluso el almacenamiento por periodos prolongados (sobre todo a temperaturas relativamente altas) puede disminuir la concentración de vitaminas en el mismo. Cada una de las especies de microorganismos tiene una escala definida de necesidades nutritivas. Para algunas especies la escala es amplia y pueden crecer sobre una cantidad de sustratos muy diferentes, como por ejemplo las bacterias coliformes y los clostridios, mientras que para otras como por ejemplo las bacterias patógenas (Pseudomonas) ese rango es bastante estrecho y estos microorganismos solo son capaces de crecer en un escaso número de tipos de sustratos. Sustancias inhibidoras: Las sustancias inhibidoras existentes en el alimento original añadidas a él o producidas en él, ya sea debidas al crecimiento de microorganismos o a los distintos sistemas de tratamiento, pueden impedir el crecimiento de todos los microorganismos o como ocurre más frecuentemente pueden impedir el crecimiento de determinadas especies de microorganismos. Ejemplos de inhibidores naturales son las lacteninas y el factor anticoliforme de la leche recién ordeñada, la lisozima de la clara de huevo y el ácido propiónico producido por las bacterias propiónicas en la elaboración del queso suizo que inhibe el crecimiento de los mohos sobre la superficie del mismo. Grupos de bacterias importantes en microbiología los alimentos Las bacterias que tienen importancia en los alimentos se suelen agrupar en base a alguna propiedad común, sin tener en cuenta su clasificación sistemática. Bacterias que producen ácido láctico o bacterias lácticas La propiedad más importante de estos microorganismos es la capacidad para fermentar los azúcares con producción de ácido láctico. Esta propiedad puede ser beneficiosa para la elaboración de alimentos como conservas y quesos, en el proceso de ensilado, pero puede ser perjudicial cuando produce alteraciones en los vinos. Estas bacterias al producir cantidades importantes de ácido láctico provocan una significativa disminución del ph, impidiendo el desarrollo de otros microorganismos competitivos. Dentro de este grupo encontramos géneros como Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus y Pediococcus.

184 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Bacterias que producen ácido acético o bacterias acéticas Dentro de este grupo encontramos principalmente dos géneros: Acetobacter y Gluconobacter que oxidan el alcohol etílico a ácido acético, posteriormente las bacterias del género Acetobacter oxidan el ácido acético a CO 2. Este grupo de microorganismos es muy importante por su capacidad de oxidar el etanol a ácido acético, importante en la fabricación de vinagres y bebidas alcohólicas. Bacterias que producen ácido butírico o bacterias butíricas La mayoría de las bacterias de este grupo son anaeróbias esporógenas y pertenecen al género Clostridium. Estas bacterias son responsables de los olores desagradables que suelen aparecer en los silos de forrajes, cuando durante el proceso de ensilado el contenido de azúcares en el forraje no es lo suficientemente grande como para producir una cantidad de ácido láctico como para garantizar un ph de 5 o menos. Bacterias que producen ácido propiónico o bacterias propiónicas La mayoría de las bacterias de este grupo pertenecen al género Propionibacterium. Son Gram positivas, anaeróbicas, fermentan el ácido láctico, carbohidratos y otros alcoholes, produciendo principalmente ácido propiónico, pero también CO 2 y ácido acético. Fueron descubiertas en los quesos suizos, en los que produce, debido al CO 2, los típicos agujeros, siendo la presencia de estas bacterias la responsable del sabor de estos quesos. Bacterias proteolíticas Son un grupo heterogéneo de bacterias que producen proteasas extracelulares (enzimas que difunden al exterior de la célula). Se las divide en aquellas que son aerobias o facultativas, pudiendo ser esporógenas (Bacillus cereus) o asporógenas (no producen esporas) (Pseudomonas fluorescens), y en aquellas que son anaeróbicas y esporógenas (Clostridium sporogenes). Bacterias lipolíticas Es un grupo heterogéneo de bacterias que generan lipasas que catalizan la hidrólisis de los triglicéridos en glicerol y ácidos grasos. Muchas de las bacterias proteolíticas son también lipolíticas como por ejemplo Pseudomonas fluorescens. Las lipasas producidas por estas bacterias son responsables de la

185 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C rancidez y consiguiente deterioro de alimentos lipídicos. Estas bacterias también son importantes en la elaboración de quesos, como por ejemplo el queso Cotija (de origen mejicano), en el cuál estas bacterias son responsables en gran parte del olor y sabor característico del mismo. Bacterias sacarolíticas Estas bacterias son responsables de la hidrólisis de polisacáridos o disacáridos a azúcares más sencillos. Algunas especies como Bacillus subtilis y Clostridium butyricum son amilolíticas, dado que producen una amilasa que puede producir la hidrólisis extracelular del almidón. Bacterias pectinolíticas Las pectinas son carbohidratos complejos, responsables de la rigidez de la pared celular de frutas y hortalizas, algunas pectinas se pueden utilizar como gelificantes de diferentes productos. Estas bacterias producen enzimas pectinolíticas o pectinasas que son responsables del ablandamiento o pérdida de consistencia de los tejidos vegetales, como así también de la pérdida del poder gelificante. Bacterias termófilas Estas bacterias cuya temperatura óptima de crecimiento es 55 C o más (mínimo45 C) tienen importancia en aquellos alimentos que se mantienen a temperaturas elevadas. Entre las bacterias termófilas se encuentran Bacillus stearothermophilus y Clostridium thermosaccharolyticum. Bacterias termodúricas Son aquellas que son capaces de resistir el proceso de pasteurización. Algunas especies de Bacillus son capaces de sobrevivir en los huevos líquidos sometidos a pasteurización. Bacterias psicotróficas Estas bacterias pueden crecer a temperaturas normales de refrigeración. A diferencia de las psicrófilas, la temperatura óptima de las bacterias psicotróficas no coincide con las temperaturas de refrigeración. Normalmente la temperatura óptima está entre los 25 y 30 C. La mayoría de las bacterias causantes de la

186 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C pérdida de calidad de los alimentos refrigerados no estériles, excepto pescados y mariscos, son psicotróficas. Dentro de este grupo se encuentran bacterias pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, y Alcaligenes. Bacterias halófilas Estas bacterias para poder crecer necesitan concentraciones mínimas de NaCl disuelto. Las bacterias halófilas pueden ser (1) débilmente halófilas: que crecen en medios con concentraciones salinas entre 0,5 y 3 %, y se aíslan a partir de pescados y mariscos (Pseudomonas, Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter y Vibrio), (2) medianamente halófilas: se aislan en carnes y hortalizas en salmuera y crecen mejor en medios con concentraciones salinas entre 3,0 y 15 % (Bacillus, Micrococcus, Vibrio, Acinetobacter y Moraxella). (3) extraordinariamente halófilas: crecen en alimentos conservados en salmueras de elevada concentración salina (entre 15 y 30 %) (Halobacterium y Halococcus) y (4) halotolerantes: crecen en medios con o sin sal, (Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium, Streptococcus y Clostridium). Bacterias osmófilas o sacarófilas Son aquellas que crecen en concentraciones elevadas de azúcar, sin embargo la mayoría de las bacterias denominadas osmófilas son simplemente tolerantes al azúcar, como es el caso de las especies de Leuconostoc. Bacterias productoras de pigmentos El color de los pigmentos producidos por bacterias que crecen en la superficie o dentro del alimento abarca todo el espectro visible e incluye el blanco y el negro. En algunos géneros, todas las especies producen pigmento, como es el caso de los géneros Flavobacterium (pigmento de un color que varía de amarillo a naranja) y Serratia (pigmento rojo). Bacterias coliformes y grupo de coliformes fecales Son bacterias aerobias o anaerobias facultativas que fermentan la lactosa con producción de gas. Las principales especies de bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El grupo de coliformes fecales incluye a los coliformes capaces de crecer a temperatura elevada (44.5 o 45 C). Algunas de las características que determinan que las bacterias coliformes

187 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C sean importantes en las alteraciones que experimentan los alimentos son: (1) su capacidad de crecer en sustratos muy distintos y utilizar como fuente de energía algunos hidratos de carbono y otros compuestos orgánicos y como fuente de nitrógeno algunos compuestos nitrogenados muy sencillos, (2) su capacidad para sintetizar la mayoría de las vitaminas que necesitan, (3) la capacidad de crecer dentro de un intervalo de temperaturas bastante amplio, desde temperaturas inferiores a 10 C hasta una temperatura próxima a los 46 C, (4) su capacidad para producir cantidades importantes de ácido y gas a partir de azúcares, y (5) su capacidad para producir sabores desagradables. Aplicaciones biotecnológicas de las fermentaciones La elaboración de productos fermentados se cree que se inició en pueblos nómades de Turquía, Asia Central y Bulgaria que transportaban leche fresca dentro del estómago de cabras. Por la acción de enzimas y bacterias presentes en la leche se obtenía una masa coagulada que facilitaba el transporte y la conservación de la misma. Con el transcurso de los años, el hombre intentó conservar de alguna forma los alimentos que eran obtenidos en gran cantidad en las épocas de abundancia, para poder ser consumidos en las épocas de escasez. La fermentación de la leche y otros alimentos contribuyó a satisfacer estos requerimientos. Luego, con la modernidad se realizaron numerosas investigaciones de los microorganismos que intervienen en estos procesos y se fueron desarrollando técnicas cada vez más complejas para la elaboración de diferentes tipos de leche y sus derivados (leches ácidas, diferentes tipos de yogur, quesos, etc.), la conservación de frutas y hortalizas, granos, forrajes, etc. Leche y sus derivados Leche La leche es el producto fresco del ordeñe completo e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de animales sanos, descansados y bien alimentados, recogida higiénicamente y sin calostro. La leche es un líquido blanco, opaco, más viscoso que el agua y de sabor ligeramente azucarado. Químicamente, se puede considerar a la leche como una emulsión de materia grasa en solución acuosa que contiene numerosos elementos, algunos en disolución y otros en estado coloidal.

188 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C La leche está compuesta principalmente por: materia grasa, lactosa, proteínas (caseína y otras), minerales, sales, agua, vitaminas, enzimas y otros componentes. La leche para ser comercializada debe cumplir con todas las características físicas y bacteriológicas que se establecen en la legislación. Caseína Las caseínas son complejos proteicos fosforados de gran tamaño y que constituyen la parte nitrogenada más característica de la leche. No existe ninguna sustancia parecida en la sangre ni en los tejidos de mamíferos. La caseína precipita solo cuando se acidifica la leche a ph 4,5; razón por la cual se la ha llamado proteína insoluble de la leche. Lactosa La lactosa es el único glúcido libre que existe en cantidad importante en todas las leches. La lactosa se sintetiza en la mama a partir de glucosa sanguínea y es el componente de la leche más lábil frente a la acción microbiana. Numerosas bacterias realizan la transformación por fermentación de la lactosa a ácido láctico, proceso que provoca la acidificación de la leche. Bacterias ácido- lácticas Son un grupo de bacterias Gram positivas, comúnmente no móviles, capaces de crecer en un rango de ph de entre 4 y 4,5; no esporuladas y que producen ácido láctico como producto principal o único del metabolismo fermentativo. Todas las bacterias del grupo son anaeróbicas facultativas o microaerófilas (Tabla 1). Las bacterias ácido lácticas son microorganismos auxótrofos, es decir que requieren una serie de componentes (aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y péptidos) que no pueden ser sintetizados por ellos mismos, por lo cual estos compuestos deben encontrarse en el medio en el cual están creciendo. El elevado requerimiento nutritivo de estos microorganismos, los condicionan a poder vivir solo en hábitats que le sean propicios: como la leche, el intestino de animales (incluso el hombre), mucosas de animales o sobre plantas intactas o en descomposición. Con respecto a las temperaturas a las cuales se desarrollan estos microorganismos, los hay mesófilos y termófilos.

189 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Las bacterias ácido lácticas son fermentadoras y dependiendo de si el producto de su metabolismo es solamente ácido láctico, o si el ácido láctico está acompañado por otros productos se las denominan homofermentativas o heterofermentativas, respectivamente. Las bacterias lácticas homofermentativas generan como producto principal de su fermentación el ácido láctico. Con respecto a las bacterias heterofermentativas, durante la fermentación, además de ácido láctico producen: CO 2, etanol y algunas acetato (VER unidad metabolismo). Tabla 1: Principales géneros de bacterias lácticas. Género Morfología Temperatura de crecimiento Tipo de fermentación Streptococcus cocos mesófilos homofermentativa Leuconostoc spp cocos mesófilos heterofermentativa Lactobacillus spp bacilos largos y delgados o cortos y curvos mesófilos o termófilos homofermentativa o heterofermentativa Lactococcus spp cocos mesófilos homofermentativa Pediococcus spp cocos mesófilos homofermentativa o heterofermentativa Carga microbiana de la leche La calidad de la leche para producción de alimentos es muy importante desde el punto de vista técnico y depende del número y naturaleza de los microorganismos que contiene. Los microorganismos presentes en la leche pueden provenir: Del interior de la ubre: si la ubre está sana la leche obtenida es prácticamente estéril. En cambio, si la ubre presenta mastitis (infección bacteriana) se incrementa en gran cantidad el número de microorganismos presentes en ella. De los pezones: esta contaminación es peligrosa porque en la piel de los pezones se encuentra un alto número de microorganismos esporulados.

190 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Cuando el sistema de producción es a campo, la carga microbiana total suele ser baja. De equipos y elementos de ordeñe: contaminación producida por limpieza deficiente de los mismos. De la conservación o el transporte: por conservación o transporte de la leche a temperaturas inadecuadas. Pasteurización La pasteurización es un proceso térmico que recibe su nombre gracias a Louis Pasteur, quien al desarrollar este proceso permitió mejorar la calidad de vida al hacer posible que productos alimenticios básicos, como la leche, se pudieran transportar largas distancias sin ser afectados por la descomposición microbiana. La pasteurización es un proceso realizado a líquidos (generalmente alimentos), que se utilizó por primera vez para controlar la contaminación por microorganismos en el vino. Uno de los objetivos de la pasteurización es la eliminación de los microorganismos patógenos (especialmente los organismos causantes de la Brucelosis, Tuberculosis, entre otros) y otro de los objetivos es disminuir la carga microbiana presente en la leche cruda (disminuye aproximadamente el 95%). Además, la pasteurización retrasa el crecimiento de organismos alterantes, lo cual incrementa la vida útil de los líquidos perecederos y no altera las características nutricionales del producto. Sin embargo, la pasteurización no es sinónimo de esterilización, puesto que en ella no se destruyen todos los microorganismos (excepto en el caso de la ultrapasteurización). Los dos objetivos principales de la pasteurización, se consiguen a través de procesos industriales de distinta complejidad, en los cuales las temperaturas de calentamiento son inferiores a 100 C. Una vez realizados estos procesos no es necesario hervir la leche, aunque debe conservarse siempre en un lugar frío y consumirse antes de la fecha de vencimiento indicada. La pasteurización de la leche se realiza habitualmente pasando la leche a través de un intercambiador de calor: la leche se bombea a través de un tubo que está en contacto con una fuente de calor.

191 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Existen varios tipos de pasteurización según el tipo de tratamiento empleado: La pasteurización baja fue el primer método empleado, aunque la industria alimentaria lo ha ido renovando por otros sistemas más eficaces. La pasteurización alta es el método actualmente utilizado en la industria. Además, también en la actualidad se utiliza mucho el método de ultrapasteurización que comprende la esterilización de la leche. En general, cuando la leche es calentada a más de 100 C se producen reacciones indeseables, sin embargo la ultrapasteurización al exponer a la leche a tan cortos tiempos de calentamiento, produce una mínima degradación del alimento. La leche según el Código Alimentario Argentino Las empresas productoras que se encargan de la elaboración y envasado de leche y sus derivados para consumo realizan, además del proceso de pasteurización, controles sanitarios que garantizan que el producto final cumpla con reglamentaciones correspondientes establecidas por el Código Alimentario Argentino (CAA). Para cada tipo de leche o alimento lácteo, el CAA indica diferentes normas específicas en cuanto a las características físicas, químicas y microbiológicas del producto. En este punto es importante destacar que para cada producto existen límites y parámetros microbiológicos que nos indicarán si la leche o alguno de sus derivados es apto para el consumo humano. Según el CAA está prohibido comercializar leche cruda y numerosos organismos oficiales (Ministerio de Salud y otros) recomiendan no consumir la leche sin pasteurizar. La leche cruda sin control sanitario puede ser perjudicial para la salud (en especial por la presencia de microorganismos patógenos) y también cuando la misma es recogida en envases que no son aptos para contener alimentos. Derivados de la leche La fermentación láctica acidifica el medio a valores de ph menores que 5, lo cual elimina la posibilidad de crecimiento de los microorganismos que alteran los alimentos. Esta práctica se emplea para la conservación y producción de alimentos, y a estos alimentos se los denomina en conjunto derivados de la

192 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C leche. Si bien, existen numerosos derivados de la industria láctea a continuación se desarrollan los más relevantes: Yogur De los derivados lácteos fermentados el yogur es el que presenta mayor consumo a nivel mundial. El yogur es el producto obtenido por fermentación de la leche pasteurizada, a través de la acción de los microorganismos Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus y Streptococcus salivarius subespecie thermophillus. Estos dos microorganismos homofermentativos constituyen el cultivo iniciador del yogur (los que se presentan en más alta proporción). S. salivarius se desarrolla acidificando fuertemente el medio y se utiliza para la producción de ácido láctico y L. delbrueckii es mucho menos acidificante que el anterior. Este último contribuye fundamentalmente al sabor y al aroma del producto. Ambos microorganismos son microaerófilos y soportan muy bien los ph ácidos. En el yogur estas bacterias conviven en estrecha simbiosis. Cuando se cultivan conjuntamente aumenta más rápido el número de células viables y el contenido de ácido láctico. Para la fabricación del yogur el objetivo principal es mantener un equilibrio adecuado entre el desarrollo de ambos microorganismos con el objeto de obtener un producto final suficientemente ácido y aromático. Al comienzo de la preparación el ph de la leche es favorable a S. salivarius, razón por la cual inicialmente la acidificación es llevada a cabo principalmente por estos microorganismos poniendo en marcha la fermentación láctica. Además, L. delbrueckii también favorece el desarrollo de este microorganismo ya que obtiene un aminoácido (valina) a partir de la caseína el cual estimula el desarrollo de S. salivarius. Luego del aumento de la acidez por acumulación de ácido láctico el ph se vuelve poco favorable para S. salivarius, la relación se invierte y progresivamente pasan a ser más dominantes L. delbrueckii. Cuando el ph se acerca a 4,6 las caseínas se aglomeran formando la red tridimensional responsable de la textura del producto y se obtiene un coágulo que retiene el suero. Los yogures firmes (consistencia semisólida) se preparan con leches concentradas y se fermentan directamente en los recipientes de envasado. El

193 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C yogur líquido se incuba a una temperatura más baja y por un tiempo mayor, luego se mezcla y se enfría antes del envasado. Los yogures batidos (menor consistencia que los firmes) se obtienen al romper el coágulo antes del envasado. Los yogures con frutas son preparados, batidos en frío a los cuales se les agrega pulpa de diversas frutas previamente pasteurizadas. Quesos Los quesos son concentrados de proteínas especialmente caseínas, que se obtienen por un proceso de coagulación de estas a ph ácido y un posterior proceso de deshidratación. La coagulación de las caseínas resulta en la generación de un gel en el que quedan retenidos la materia grasa, vitaminas y minerales. En general, el proceso ocurre por la acción del cuajo. El cuajo consiste en un extracto enzimático de proteinasas ácidas como la renina que hidrolizan la caseína. La acción enzimática, en conjunto con la acidificación desarrollada por los microorganismos de la flora nativa de la leche o de cultivos iniciadores, se denomina coagulación mixta. El producto resultante es la concentración de la materia seca de la leche por coagulación a través de la acción microbiana. Luego de la coagulación, se produce el proceso de deshidratación o desuerado del queso que se inicia con el corte del gel formado por coagulación. En este momento ocurre la liberación de lactosuero. Luego del desuerado, se procede a moldear y prensar el queso. El moldeado le da forma a los quesos y el prensado ayuda a eliminar el lactosuero remanente. El proceso de elaboración se detiene en este punto en el caso de los quesos frescos, mientras que en el caso de los demás quesos el proceso sigue mediante dos partes: el salado y la maduración. El salado favorece la disminución de la actividad del agua y actúa controlando el crecimiento microbiano y la actividad enzimática. Además, favorece la formación de la corteza del queso al seguir deshidratando. La maduración se realiza en cámaras con temperatura y humedad relativa controladas. En esta etapa ocurren procesos de lipólisis, proteólisis y glucolisis que generan compuestos que otorgan sabor y aroma a los quesos y también hay evaporación de agua, por lo cual se termina de formar la corteza del queso. En esta etapa intervienen en forma más relevante los

194 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C microorganismos no iniciadores (aquellos que no intervienen en forma directa en la acidificación). En el caso de los quesos frescos estos no presentan una coagulación mixta, sino que tienen una coagulación de tipo láctica. En estos quesos se utilizan pequeñas cantidades de cuajo y se opera a bajas temperaturas para evitar las condiciones óptimas de acción de la enzima. Estos quesos son siempre muy húmedos (60-80% de agua). A causa de su gran contenido de agua son muy poco conservables. Estos quesos precisan de una previa pasteurización de la leche, ya que si existen microorganismos patógenos en la leche, estos quedan intactos ya que no tienen un proceso madurativo. En el caso de los quesos con ojos, estos se deben o bien al dióxido de carbono que se genera al fermentar la lactosa o en algunos tipos especiales de quesos al empleo de cultivos especiales del género Propionibacterium que producen dióxido de carbono a partir de lactato. Estas bacterias también producen ácido propiónico y acético a los cuales se les adjudica el sabor dulce y picante de estos quesos. Existen, además, innumerables variedades de queso que se clasificación por su textura, contenido de humedad, de materia grasa, etc. Otras variedades de queso son los que tienen hongos en su superficie como los quesos azules que presentan vetas azuladas debido al crecimiento de hongos del género Penicilium. Las vetas azul-verdosas observadas corresponden a las hifas del hongo en crecimiento sobre el queso. Manteca Es el producto graso obtenido de la leche o nata de vaca pasteurizada. La manteca se considera una emulsión de agua en aceite. Su preparación es en parte microbiológica ya que es necesario un agriado inicial (acidificación) de la leche por microorganismos del género Streptococcus. Luego, para la producción del aroma se utilizan otros microorganismos que producen pequeñas cantidades de acetoína (compuesto inodoro y sin sabor) que es oxidada a diacetilo, compuesto responsable del aroma. Estos microorganismos solo producen acetoína en medios ácidos por lo cual es necesaria la acidificación previa.

195 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C Conservación de frutas y hortalizas por fermentación láctica Encurtidos A través de la fermentación ácida se pueden conservar hortalizas de hoja, hortalizas subterráneas y frutas. Los productos más utilizados son: pepinos, zanahorias, repollos, cebollas y tomates verdes. El producto final se denomina pickle o encurtido. La fermentación es llevada a cabo por bacterias lácticas que se encuentran sobre la superficie de los vegetales. Durante el proceso se procura favorecer el desarrollo de las bacterias lácticas e impedir el desarrollo de otros microorganismos que puedan alterar la calidad del alimento. Las condiciones que favorecen el desarrollo de la flora láctica son: anaerobiosis y una concentración de sal del 5%. En estas condiciones el proceso es el siguiente: primero se realiza un proceso heterofermentativo a través del cual se produce CO 2, que desaloja el oxígeno del medio y se consigue de esta forma la anaerobiosis. El ácido láctico generado baja el ph del medio, lo cual inhibe la actividad de los demás microorganismos presentes en los vegetales. Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cereviseae, Lactobacilllus plantarum y Lactobacillus brevis son algunos de los microorganismos que realizan este proceso. Ensilados Las explotaciones ganaderas pueden conservar los forrajes mediante técnicas conocidas como heno y ensilado. El principio de cualquier conservación de forraje está basada en tratar de obtener un producto lo más semejante posible al material original a procesar en cuanto a cantidad (volumen) y calidad nutricional. Heno: consiste en la deshidratación del forraje hasta niveles de 14-15% de humedad para inhibir el crecimiento microbiano. Un heno puede confeccionarse de diferentes maneras y dependiendo de ello se los denomina fardos, rollos o megafardos. Silo: El ensilado es una técnica de conservación de forraje en estado húmedo, sin luz ni oxígeno. El ensilado está basado en la inhibición de procesos enzimáticos y microbianos no deseados a través de la disminución del ph del medio. Dicha disminución es producida por la fermentación láctica

196 Microbiología Agrícola F.C.A. U.N.C de los azúcares que presenta el material original o forraje (maíz, sorgo, alfalfa, caña de azúcar, etc.), en condiciones de anaerobiosis. Existen múltiples factores a tener en cuenta para lograr un silo de buena calidad. Dependiendo la especie forrajera (material original), se determina el momento fenológico óptimo para realizar la confección, en este punto se busca el mayor volumen posible por hectárea, sin dejar de tener en cuenta la calidad nutricional. En general, los mejores resultados se observan cuando los vegetales tienen % de materia seca y un contenido mínimo de 6 a 12% de hidratos de carbono solubles para garantizar la fermentación láctica. Luego, se procede al corte y picado del material original, procesos que normalmente son simultáneos. Es importante el tamaño del picado ya que interviene en la compactación del silo. Tamaños de picado muy grandes son difíciles de compactar dejando cámaras de aire, lo que provoca un mayor tiempo de respiración aeróbica (pérdida de valor nutritivo) e impide inicialmente los procesos de fermentación deseados y en casos extremos la pérdida del material ensilado. Por otra parte, debe haber una proporción mínima de trozos de vegetal (no menor a 2 cm) para estimular la motilidad ruminal. En caso que esto no suceda, se pueden ocasionar trastornos a nivel de rumen en el animal. Esto puede suceder en aquellas dietas donde el silaje es el principal componente y no intervienen otras fuentes de forrajes fibrosos como por ejemplo heno de alfalfa. En aquellos forrajes que al momento de ensilar poseen granos (maíz o sorgo), es importante lograr una ruptura de esos granos (craker). Esto se logra