Tecnología de ADN recombinante

Transcripción

1 Tecnología de ADN recombinante Garrido, A., Villaverde, C., Blanco, M., Teijón, J., Mendoza, C., Ramírez, J. (2006). Tema 25: Tecnología de ADN recombinante. En Fundamentos de Bioquímica Metabólica (3a Ed., Pág ). Madrid: Editorial Tébar. Espacio de Formación Multimodal

2 TEMA 25 Tecnología de ADN recombinante Fundamentos de la clonación. Vectores de clonación. Estrategia de la clonación. Aplicaciones a las ciencias médicas. La tecnología del ADN recombinante comprende una serie de métodos para identificar un gen (o segmentos concretos de ADN) en un organismo, aislarlo, analizarlo, si es preciso, modificarlo y reinsertarlo dentro de otro organismo consiguiendo que se exprese con normalidad. Los objetivos de este conjunto de técnicas son, principalmente: 1. Obtener grandes cantidades del producto del gen. 2. Conocer las consecuencias de una determinada modificación del gen en el funcionamiento celular. 3. Sustituir un gen defectuoso por otro normal. Estas técnicas han permitido un avance considerable de la biología y genética molecular, la medicina, la agricultura y la ecología. En medicina están proporcionando nuevos métodos de diagnóstico, de agentes terapéuticos y revelando el mecanismo molecular de diversas enfermedades. FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN El conjunto de bacterias que surgen de una bacteria aislada en una placa de cultivo, y que se conoce como colonia, es, sencillamente, un clon. Clonar es hacer copias idénticas de unos organismos, células, virus o moléculas de ADN derivadas de la replicación de un único progenitor genético. Mediante la clonación se puede disponer de cantidades suficientes de un único tipo de células.

3 338 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Etapas de la clonación: 1. Corte del ADN genómico por sitios específicos. 2. Elección de moléculas de ADN (vectores) capaces de autorreplicarse. 3. Unión de los fragmentos de ADN a los vectores. 4. Introducción de los fragmentos de ADN-vector en células huésped. 5. Selección e identificación de células huésped con el vector e inserto adecuado. Las enzimas de restricción reconocen y cortan ADN de doble cadena por sitios específicos. La clonación de un gen o un fragmento de ADN implica la separación del resto del genoma, la unión a una molécula portadora y la inserción en un organismo para poder amplificarlo muchas veces. Con este procedimiento se pueden obtener miles e incluso millones de copias del gen o fragmento de ADN inicial. La clonación requiere básicamente las siguientes etapas: 1. Corte del ADN genómico por sitios específicos y obtención de los fragmentos de ADN. 2. Elección de moléculas de ADN (vectores) capaces de autorreplicarse y corte específico de las mismas. 3. Unión de los fragmentos de ADN a las moléculas autorreplicativas (recombinación). 4. Introducción de ambas en una célula huésped. 5. Selección e identificación de células huésped que contienen el ADN recombinante. El corte del genoma para obtener fragmentos de ADN se realiza mediante enzimas de restricción o endonucleasas de restricción. Estas sustancias reconocen secuencias específicas de ADN de doble cadena y cortan ambas en lugares específicos. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, esto es, poseen simetría rotacional respecto a un eje. Los cortes son de dos tipos: uno en que se cortan las cadenas simétricamente respecto a un eje y otro en que se cortan en el mismo punto. El primero deja extremos cohesivos o adhesivos y el segundo extremos romos (Fig. 25.1). Las palabras o frases palindrómicas son aquellas que son iguales se comience por la primera o por la última letra: Radar. Dábale arroz a la zorra el abad. Figura Especificidad de las enzimas de restricción. La Ban H1 y la Eco RI dejan extremos cohesivos y la HhaI romos.

4 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 339 Figura Fragmentos de ADN obtenidos de un genoma con diferentes enzimas de restricción. Los fragmentos de mayor tamaño son los de parte superior. El tamaño de los fragmentos se conoce comparando con fragmentos patrones de longitud conocida. Se han caracterizado y purificado cientos de enzimas a la que se denomina por una abreviatura correspondiente a la especie bacteriana de la que derivan. Así, Bam de Bacillus amgloliquefaciens, Eco de Escherichia coli, Hal del Haemophilus aegyptius, etc. Los fragmentos de ADN resultantes dependiendo del tamaño, se pueden separar por electroforesis en geles de poliacrilamida o agarosa; los geles de poliacrilamida separan fragmentos de unos mil pares de bases y los de agarosa de a pares de bases. Los fragmentos se separan en bandas que se pueden visualizar añadiendo a la disolución de los geles colorantes como bromuro de etidio, que a la luz ultravioleta presenta una intensa fluorescencia de color naranja. La longitud o tamaño de los fragmentos de ADN se puede conocer mediante la comparación de las bandas con fragmentos patrones de longitud conocida (marcadores). Cada fragmento de ADN se puede purificar cortando la banda correspondiente del gel, eliminando la matriz del gel y el colorante.

5 340 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Una sonda es un fragmento de ADN (o ARN) monocatenario con el fosfato final marcado con 32 P. Para identificar en cuál de las bandas se encuentra el gen o la secuencia de ADN de nuestro interés se suele realizar una hibridación. Esta técnica consiste en desnaturalizar los fragmentos de ADN que aparecen en el gel después de la eletroforesis y transferirlos a membranas de nitrocelulosa o nylon. Las posiciones de los fragmentos en el gel se mantienen en la membrana. Después la membrana se introduce en una disolución que contiene una sonda radiactiva marcada con 32 P (Fig. 25.3). Posteriormente se observa por autorradiografía el fragmento o fragmentos de restricción que posean una secuencia complementaria a la sonda y que, por consiguiente, haya hibridado con ella. Esta técnica se denomina trasferencia Southern (Sout- Figura Transferencia e hibridación de ADN (o Southern blotting). Cada banda radiactiva en la película corresponde al fragmento de ADN de interés.

6 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 341 hern blotting) en honor a su diseñador E. M. Southern. De forma similar se pueden separar moléculas de ARN por electroforesis en gel e identificar secuencias concretas por hibridación. En este caso se denomina transferencia Northern. También se puede aplicar esta técnica para detectar una proteína determinada uniéndola a un anticuerpo específico y entonces se denomina transferencia Western. Resumiendo, las técnicas Southern, Northern y Western se corresponden respectivamente con las transferencias de ADN, ARN y proteína. VECTORES DE CLONACIÓN En E. coli, el microorganismo que más se emplea en clonación y el mejor conocido molecular y funcionalmente, se utilizan tres vectores o vehículos de clonación: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos. Los plásmicos son moléculas de ADN circular de doble cadena extrageniomales y que se replican independientemente del cromosoma bacteriano. Su tamaño oscila entre 2 y 400 kilopares de bases (Kpb), transportan genes para la inactivación de antibióticos, producción de toxinas y degradación de productos naturales. Los plásmidos no son imprescindibles para la vida de las bacterias, algunas no contienen ninguno y otras pueden contener hasta veinte. Se pueden clasificar en conjugativos y no conjugativos dependiendo de si llevan o no un conjunto de genes de transferencia, denominados trans, que favorece la conjugación bacteriana es decir, la transferencia de material genético de una bacteria a otra. Los plásmidos también se pueden introducir sin el concurso de ningún elemento por transformación. Tanto en el proceso de conjugación como en el de transformación para detectar el ADN plásmidico, se necesita un método de selección. La estrategia más común es introducir en el plásmido un gen que la célula huésped necesita para crecer bajo determinadas condiciones o un gen que confiera resistencia frente a un antibiótico, en este caso sólo aquellas células bacterianas que porten el plásmido serán resistentes al antibiótico y podrán crecer en medios que lo contengan. Uno de los plásmidos más utilizados es el pbr322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina. El plásmido contiene una serie de sitios específicos que pueden ser cortados por enzimas de restricción para introducir fragmentos de ADN. La inserción de ADN en el punto de corte de EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de corte a los Hind III, Pal 1I o Ban HI inactiva el gen de resistencia a la Vectores de clonación: Plásmidos: pbr322 pbr328 Bacteriófagos: Fago l, T 2, Fago m. Cósmidos. Conjugación bacteriana. Una bacteria transfiere a través de un pili un cordón de su genoma a otra bacteria.

7 342 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Figura Plásmido pbr322. Se indican los puntos de corte de algunas enzimas de restricción y las zonas que codifican resistencia a tetraciclina y ampicilina. Figura Transducción o infección por fagos de una bacteria. El ADN del fago controla el sistema metabólico y replicativo bacteriano y termina por destruirla. En algunos casos el ADN del fago se inserta en el de la bacteria.

8 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 343 tetraciclina, y el PstI resistencia a amplicilina. Las células bacterianas que contengan pbr322 con un fragmento de ADN insertado en el punto de corte de, por ejemplo, Hind III, son resistentes a la ampicilina y sensibles a la tetraciclina, y se pueden seleccionar fácilmente observando las colonias que crecen en amplicilina y no aparecen en la placa que contiene tetraciclina. Las células que no portan el plásmido son sensibles a los Figura Identificación de la colonia bacteriana que porta el vector con el fragmento de ADN de interés.

9 344 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Figura Esquema de clonación de un fragmento de ADN procariótico en E. coli con pbr322 (amp R ampicilina resistente, tet R tetraciclina resistente). dos antibióticos, mientras los que lo portan, pero no llevan insertado el ADN, son resistentes a ambos. El bacteriógrafo más utilizado como vector es el fago. Este bacteriógrafo tiene un mecanismo muy eficaz para introducir más de 48 Kpb de ADN en la bacteria. El procedimiento general para clonar ADN en el fago se basa en dos características de su genoma: 1) Cerca de un tercio de su genoma puede ser reemplazado por ADN foráneo.

10 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 345 2) El ADN se empaqueta en partículas de fago de alrededor de Kpb. Cuando los fragmentos de ADN de un tamaño adecuado se ligan al ADN del fago, los ADN resultantes se pueden empaquetar dentro de partículas de fago, por adicción de extracto crudo de células bacterianas que contienen todas las proteínas necesarias para ensamblar un fago completo. Ese proceso se denomina empaquetamiento in vitro. Los fagos pueden infectar bacterias de E. coli bien destruyéndolas o insertando su ADN en el genoma de la bacteria. En este último caso el ADN del fago se replica junto al ADN de la célula durante muchas generaciones. Ciertos cambios ambientales pueden poner en marcha la expresión del ADN del fago y desencadenan los procesos que conducen a la lisis de la bacteria. Los cósmidos están construidos a partir de plásmidos y genes. Los cósmidos son moléculas de ADN pequeñas (5-7 Kpb), circulares y con las siguientes características: 1) Un origen de replicación plasmídico. 2) Uno o más marcadores seleccionables. 3) Varios sitios de restricción donde se puede insertar el ADN exógeno y 4) Un sitio cos, que es una secuencia de ADN del bacteriófago que se necesita en el equipamiento. Genotecas. Una genoteca es una colección de fragmentos derivados del genoma de un organismo insertados en un vector de clonación. El vector se introduce en microorganismos (generalmente bacterias o levaduras) de tal forma que cada célula contenga un fragmento del ADN recombinante. El procedimiento se basa en romper el ADN en muchos fragmentos y, posteriormente, clonarlos todos. Esto es, la información contenida en un organismo está representada en el conjunto de fragmentos de la genoteca. Los fragmentos se insertan en el ADN de un vector previamente tratado en la misma enzima de restricción que se ha utilizado para la rotura del ADN. La mezcla (fragmento ADN-vector) se usa para transformar las células bacterianas o se empaqueta en partículas de fago. El resultado final es una serie de bacterias o fagos en que cada portador de una molécula de ADN recombinante es diferente. Al conjunto de todos ellos se le denomina genoteca, librería genómica o biblioteca genómica. Para identificar el gen de interés en una genoteca se hacen crecer las bacterias en medio sólido de forma que en las placas se puedan apreciar colonias bacterianas individuales. Los cósmidos están construidos a partir de plásmidos y genes l. Las genotecas son colecciones de fragmentos obtenidos del genoma de un organismo e insertados en vectores de clonación.

11 346 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Posteriormente, se procede como anteriormente, esto es, se tratan las bacterias con álcali para desnaturalizar su ADN y se transfieren las células a una membrana de nitrocelulosa o nylon. Posteriormente, las placas se sumergen en una disolución que contiene una sonda de ADN marcada radiactivamente que hibrida con el ADN del gen complementario. Se lava la placa y se expone a una película de rayos X, las manchas que aparecen en la película indican la posición de las colonias portadoras del inserto de ADN de interés. ESTRATEGIA DE LA CLONACIÓN La clonación de genes eucariotas no se puede realizar directamente del ADN, ya que éste está constituido por exones e intrones. Los intrones no se traducen y las bacterias no tienen mecanismos para eliminarlos. La transcriptasa inversa sintetiza ADN partir de ARNm. El ADN obtenido se denomina ADNc (ADN complementario). La clonación de un gen es un procedimiento en teoría relativamente sencillo. Si el ADN procede de una célula bacteriana, una vez extraído y purificado se trata con una enzima de restricción que deje extremos cohesivos. Si se elige como vector de clonación, un plásmido (pbr322) se corta con la misma enzima de restricción para que queden extremos que se complementen con los de los fragmentos de ADN. Ambos elementos se unen mediante la ADN ligasa. Los plásmidos con el inserto sufren una primera selección en placas con antibióticos a los que son resistentes. Posteriormente, bien con una sonda, de forma semejante a como se identifican los fragmentos de ADN, o bien extrayendo el plásmido, cortándolo en la misma enzima de restricción y realizando electroforesis se pueden seleccionar aquellas células bacterianas que llevan el plásmido con el inserto de ADN de interés. La clonación de genes eucarióticos (vegetales o animales) planteó, al principio, serios problemas, puesto que la mayoría de sus genes son un conjunto de intrones y exones. Por ello, estos genes no pueden ser expresados en bacterias que carecen de la maquinaria necesaria para cortar los intrones y eliminarlos del transcrito. Esta dificultad se supera introduciendo en la bacteria plásmidos con fragmentos de ADN complementario (ADNc) del ARNm. Esto es, existe una enzima denominada transcriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de un ARNm. Para su acción la enzima requiere: a) Los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dntp); b) ARNm purificado. Posteriormente, se forma un doble cordón ADN-ARN que se somete a degradación alcalina para hidrolizar el ARN. El ADN monocatenario o de simple cordón se trata con ADN polimerasa que requiere los 4 dntp, un cebador o primer y la cadena de ADN que le sirve de molde. El resultado es un fragmento de ADN bicatenario que se denomina ADNc.

12 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 347 Figura Síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir de ARNm de un órgano de mamífero. A partir de este ADNc el procedimiento sigue el mismo camino que la clonación de fragmentos de ADN de células procarióticas. Técnicas en ingeniería genética: PCR y secuenciación de ADN. Existen dos técnicas que han supuesto un avance espectacular en la investigación sobre el ADN genómico: a) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). b) La secuenciación de fragmentos de ADN. Anteriormente hemos estudiado que la clonación del ADN genómico permite lograr dos objetivos importantes: Primero separa cada fragmento de ADN de los demás del genoma, y segundo, amplifica segmentos de ADN seleccionados. Después de que el ADN o región particular del ADN ha sido clonado, debe conocerse su secuencia. La técnica de PCR permite obtener millones e incluso miles de millones de copias de cualquier secuencia seleccionada del ADN genómico en unas pocas horas. Una propiedad importante de esta técnica es que no hace falta que el segmento de ADN elegido sea separado del ADN genómico antes de comenzar el procedimiento de amplificación. Sin embargo, una vez que se ha amplificado, el segmento puede separarse fácilmente del resto de ADN (que no se ha amplificado) mediante la electroforesis en gel. La técnica de PCR permite obtener millones de copias de un fragmento de ADN sin necesidad de separarlos previamente del genoma.

13 348 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA Una mezcla de reacción de PCR contiene: 1. Genoma o fragmento de ADN. 2. Los cuatro desoxirribonucleósido trifosfato. 3. Un primer o cebador. 4. La enzima taq. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza en un tubo de plástico de pequeña capacidad (0,2 ml) al que se añaden los siguientes componentes: El fragmento de ADN de doble cadena que se desea amplificar, las cuatro dntp, el primer o cebador y un ADN, polimerasa estable al calor. Esta ADN polimerasa (taq) procede de la bacteria termófila Thermus acuaticus y es estable y activa a 72 ºC. Un ciclo de PCR consta de 5 etapas, dos de ellas, la inicial y final, se realizan solamente una vez y las tres intermedias un número prefijado de veces que se denominan ciclos (entre 25 y 40) (Fig. 25.9). Figura Esquema de la etapa cíclica de la reacción en cadena de la ADN polimerasa. Después de un ciclo se amplifica el ADN dos veces; después de 25 el fragmento de ADN se puede amplificar unas 10 6 veces.

14 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 349 Las tres etapas intermedias son: a) Separación de las cadenas de ADN por calentamiento (94-95 ºC) durante unos segundos. b) Hibridación de los cebadores. La disolución se enfría (52-54 ºC) para que se unan las cadenas de ADN separadas. c) Síntesis de ADN. Se calienta la disolución (72 ºC) para que la ADN polimerasa sintetice nuevas cadenas de ADN a partir de los cebadores. Estas tres etapas (separación de las hebras, hibridación de los cebadores y síntesis de ADN) se llevan a cabo repetitivamente cambiando únicamente la temperatura de la mezcla de reacción. No es necesario añadir ningún reactivo después del primer ciclo. El fragmento de ADN se puede ampliar según 2n, siendo n el número de ciclos; esto es, después de 25 ciclos se puede amplificar unas de 10 6 veces (Fig ). 2', 3'- didesoxirribonucleósido trifosfato. El compuesto impide el crecimiento de la cadena porque carece de grupos hidroxilo en los carbonos 2' y 3'. Figura Diagrama de una reacción de PCR típica. Los números por encima de la línea indican la temperatura y por debajo el tiempo en minutos: segundos. El análisis de la estructura del ADN se puede realizar por varios métodos, pero el que se utiliza casi con exclusividad en los últimos años es el desarrollado por F. Sanger y colaboradores y que se denomina método por interrupción controlada de la replicación enzimática. El método para secuenciar un fragmento de ADN se basa en copiar uno de los cordones de ADN mediante la ADN polimerasa. El cebador para la síntesis es un fragmento complementario que se puede obtener por digestión con una enzima de restricción o por síntesis química. La reacción contiene además los cuatro desoxirribonucleósido trifosfato, un análogo, 2, 3 -didesoxirribonucleósido trifostato, de una base, el cual impide, cuando se introduce en la cadena, un crecimiento posterior de esta. Como el compuesto entra en la cadena al azar, se producen fragmentos de distinta longitud. El proceso se repite con otra muestra del fragmento original y el análogo cargado con otra base diferente. Los cebadores se marcan con una sus- 3'AGTAGACATGAC GA5' 5'TC3' 3'AGTAGACATGAC GA5' 5'TCATC3' 3'AGTAGACTGAC GA5' 3'TCATCT6AC3' 3'AGTAGATGAC6G A5' 5'TCATCTGAC3' Fragmentos de ADN de distintos tamaños obtenidos en la síntesis de una cadena cuando en la mezcla de reacción se incorpora 2,3-didesoxicitidin trifosfato.

15 350 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA tancia con diferente color según sea la base terminal, así, azul para adenina, rojo para citosina, verde para timina y amarillo para guanina. Las mezclas de reacción se juntan y se someten a electroforesis. Las bandas separadas de ADN se detectan por fluorescencia al salir del gel, y la secuencia de colores se corresponde con la de las bases. El método se realiza en un aparato automático de secuenciación que puede determinar de una vez cerca de un millar de bases. APLICACIONES A LAS CIENCIAS MÉDICAS Aplicaciones de la Ingeniería genética a las ciencias médicas: Conocer la función y expresión de los genes. Obtener substancias con fines terapéuticos en cantidades adecuadas. Diagnóstico precoz de enfermedades. Obtención de animales transgénicos. Terapia génica. Aplicaciones de la técnica del PCR. Detectar virus y bacterias en los tejidos. Detectar cánceres en estadios precoces. Determinar el parentesco entre individuos. Identificar individuos mediante la huella dactilar del ADN. Los descubrimientos producidos en los últimos años utilizando las técnicas de ADN recombiante o Ingeniería genética y los relacionados con ellas han permitido obtener un mejor conocimiento de la estructura, organización y expresión de los genes, y han posibilitado su aplicación en diferentes campos de las ciencias. En medicina la aplicación de estas técnicas ha abierto nuevas esperanzas en el diagnóstico, prevención, detección y terapia de varias enfermedades. Las técnicas de ADN recombinante han permitido la inserción y expresión de genes, que codifican productos de interés biomédico en bacterias, levaduras, y el crecimiento a escala industrial ha facilitado la obtención de cantidades apreciables de proteínas y péptidos humanos de gran utilidad para el tratamiento de determinadas enfermedades que hasta entonces se obtenían sólo en pequeñas cantidades de tejidos animales o de cadáveres. La mayor parte de las enfermedades genéticas no tienen un tratamiento eficaz, y las que lo tienen se basan tanto en el aporte periódico de sustancias que el organismo no puede fabricar, como en evitar la acumulación de un producto nocivo provocado por la carencia de la enzima necesaria para su metabolismo. Una solución terapéutica sería la inserción del gen normal en las células defectuosas del individuo enfermo y su expresión correcta; este proceso se denomina terapia génica. Para aplicar esta clase de terapia es necesario, principalmente, conocer el gen defectivo y clonar el gen homólogo normal. Posteriormente, hay que saber en qué células suele estar activo, éste es punto clave del proceso porque un gen sólo puede ser insertado en células accesibles, por ejemplo, células de la sangre o de la piel. Actualmente se están ensayando varios protocolos clínicos para el tratamiento de enfermedades genéticas como la carencia de adenosina desaminasa (ADA), la fibrosis quística, las anemias hemolíticas, la hemofilia, etc.

16 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 351 La obtención de animales transgénicos mediante la microinyección de embriones con el gen o por transducción con retrovirus ha permitido obtener fundamentalmente ratones transgénicos que tienen gran interés como modelos de enfermedades génicas como la enfermedad de Tay-Sachs y la Diabetes mellitus. Por otra parte, la técnica de PCR también está proporcionando una ayuda valiosa a las ciencias médicas. Mediante esta técnica se pueden detectar la presencia de bacterias y virus en la sangre y tejidos de un individuo antes de que éste desarrolle una respuesta inmune. También se pueden detectar cánceres en un estadio temprano. En medicina forense esta técnica permite conocer el parentesco de personas. Un simple cabello, una pequeña mancha de sangre o de semen suelen ser suficientes para obtener cantidades adecuadas de ADN para un análisis posterior. Otra aplicación interesante es en el transplante de órganos. En este proceso el aceptor rechaza el órgano cuando los antígenos HLA del donante no son suficientemente parecidos a los del aceptor. La amplificación de los genes por PCR permite determinar los tipos de HLA y comprobar sus diferencias o analogías. RESUMEN La tecnología del ADN recombinante o Ingeniería genética ha supuesto un desarrollo extraordinario en el conocimiento de las bases moleculares de la vida. El diseño y construcción de moléculas recombinantes se basa en el conocimiento de los mecanismos de replicación del ADN, de la estructura, de la organización y de la regulación de la expresión génica. La clonación de un gen o fragmento de ADN de células procariotas requiere un corte específico del ADN genómico por enzimas de restricción, y la elección de un vector adecuado para unir el gen. Los vectores más utilizados son los plásmidos, los baceteriofagos y los cósmidos. El vector con el gen se introduce en células hospedadoras para su multiplicación. La identificación de las células con el inserto de interés se suele realizar mediante sondas radiactivas según la técnica de transferencia de Southern. La clonación de genes de células eucarióticas requiere la obtención previa del ADN a partir de ARNm mediante la transcriptasa inversa.

17 352 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA La información contenida en el ADN de un organismo se puede fragmentar, unirse a vectores de clonación y almacenarse. Al conjunto de todos ellos se denomina genoteca o librería de genes. Dos técnicas han permitido un avance espectacular de la Ingeniería genética: La de la reacción en cadenada de la polimerasa (PCR) y la secuenciación automática de nucleótidos. La aplicación de las técnicas de ADN recombinante está mostrando su valiosa utilidad en el diagnóstico y prevención de varias enfermedades y en las nuevas terapias a aplicar. APLICACIONES CLÍNICAS La terapia génica en las enfermedades hereditarias se aplicó por primera vez en 1990 a una niña de cuatro años que padecía carencia de adenina desaminasa (ADA). Esta enzima del sistema inmunológico y su deficiencia expone a los pacientes a contraer fácilmente enfermedades infecciosas. El gen que codifica la ADA suele estar activo en los linfocitos, por lo que fue relativamente fácil extraer esas células de la sangre del paciente e identificarlo. Posteriormente, se introdujo el gen correcto en células precursoras de los linfocitos utilizando vectores basados en retrovirus. Este proceso permitió la corrección de la enfermedad debido a la deficiencia de ADA. Otros casos susceptibles de aplicar una terapia génica son aquellos en los que el gen alterado es el responsable de la producción de una sustancia presente en la sangre, donde su función es necesaria, por ejemplo, en las enfermedades hemofílicas debidas a la carencia de un factor de coagulación. En estos caso se puede insertar el gen correcto en cualquier tipo de célula del mismo organismo con tal de que éste pueda sintetizar el producto e introducirlo en la sangre. Hay bastantes tipos de células capaces de realizar esta función, como las células del tejido conjuntivo subcutáneo, de la epidermis o de los músculos.