Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

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1 Seminario de Guadalupe, diciembre 2004 Las Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la Memoria Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira Mª del Carmen Portillo Guisado Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla Consejo Superior de Investigaciones Científicas Sevilla CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Introducción Objetivos Materiales y Métodos Métodos para el estudio microbiológico Comparaciones de perfiles moleculares Conclusiones 1

2 Introducción Introducción La cueva de Altamira se encuentra en Cantabria Descubierta en 1868 por Modesto Cubillas Marcelino Sanz de Sautuola en 1879 descubre las pinturas Introducción Entrada Actual Cocina La cueva de Altamira tiene unos 250 m de longitud Se ha dividido en distintas salas La sala con mayor concentración de pinturas es la Sala de los Polícromos El animal más representado es el bisonte Sala de los Muros Sala de Polícromos Sala de la Hoya Gran Sala Sala del Pozo Cola de Caballo mt 2

3 Introducción La cueva de Altamira posee pinturas paleolíticas de ± 500 años. La conservación de estas pinturas es muy importante. Presumiblemente, las visitas masivas son el factor desencadenante del deterioro progresivo que sufre este ambiente hipogeo. En la actualidad la cueva se encuentra cerrada al público desde Estudio multidisciplinar: arqueología, geología, microclima, hidrogeoquímica, microbiología, Introducción Los microorganismos pueden desarrollarse en cualquier habitat del planeta, natural o artificial. Las acciones de los microorganismos pueden traducirse en una alteración del sustrato en el que desarrollan que puede dar lugar su deterioro. Importancia de conocer los componentes de un ecosistema para determinar el papel que desempeña cada uno y el funcionamiento global. Colonizaciones blancas 3

4 Introducción Moonmilk Ejemplos Colonizaciones verdes Leopard spots Colonizaciones amarillas y grises Objetivos Objetivos Análisis de las comunidades microbianas que se desarrollan en la Cueva de Altamira. Determinar los microorganismos más representativos en las principales colonizaciones observadas. Análisis en profundidad de grupos específicos y su distribución en la cueva. Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira 4

5 Materiales y Métodos Análisis de las comunidades microbianas Materiales y Métodos Materiales y Métodos Análisis de las comunidades microbianas Métodos tradicionales Métodos moleculares Basados en cultivo Basados en ácidos nucleicos (ADN y ARN) 5

6 Materiales y Métodos Cultivos Muestra microorganismos presentes Amplificación PCR o MDA ADN Extracción ARN Trascripción inversa microorganismos metabólicamente activos ADN amplificado ADNc DGGE Selección Clonación Comparación de perfiles Secuenciación Estimación de abundancia Búsqueda de homólogos Perfil de la comunidad e identificación de microorganismos 1. Determinación de los grupos de microorganismos más representativos en las principales colonizaciones y otras muestras. 2. Detección de grupos de microorganismos que no habían sido detectados en la Cueva de Altamira ni en otras cuevas con pinturas rupestres. 3. Análisis de grupos específicos de microorganismos en la Cueva de Altamira. 4. Determinación de los microorganismos presentes y los que están metabólicamente activos en las muestras analizadas. 5. Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira 6

7 1. Determinación de los grupos de microorganismos más representativos en las principales colonizaciones y otras muestras Colonizaciones blancas Colonizaciones amarillas Colonizaciones grises Depósitos moonmilk Colonizaciones blancas ADN Cyanobacteria (90%)* Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (94%)* Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (99%)* Pseudonocardia (Actinobacteria) (92%) Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (98%)* Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (97%) Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (94%) Rhodothermus (Bacteroidetes) (92%)* Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (98%) * Actinobacteria (89%) * Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (94%) Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (92%) Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (97%) * Rhodothermus (Bacteroidetes) (92%) * Cyanobacteria (89%) * Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (97%) * Firmicutes (99%) * Microbacterium (Actinobacteria) (91%) Methylocaldus (Gamma-Proteobacteria) (92%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (92%) Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (93%) * Planctomycetes (93%)* Rhodobacter (Alpha-Proteobacteria) (90%)* Planctomycetes (91%)* Gordonia (Actinobacteria) (97%) Plactomycetes (91%) Actinobacteria (98%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (98%) Plactomycetes (93%) Beta-Proteobacteria (94%) Acidobacteria (99%) * Actinobacteria (99%) * Planctomycetes (97%) ARN

8 Colonizaciones blancas A ADN ARN B Alpha-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria Delta-Proteobacteria Actinobacteria Firmicutes Planctomycetes Acidobacteria Verrucomicrobia Bacteroidetes Cyanobacteria Cloroplastos Chloroflexi SPAM Colonizaciones amarillas ADN Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (98%) * Streptococcus (Firmicutes) (99%) * Beta-Proteobacteria (97%)* Ectothiorhodospiraceae (Gamma-Proteobacteria) (91%) * Acidobacteria (94%) * Gamma-Proteobacteria (98%) * Lysobacter (Gamma-Proteobacteria) (92%) * Delta-Proteobacteria (90%) * Beta-Proteobacteria (91%) Gamma-Proteobacteria (98%) * Desulfovibrio (Delta-Proteobacteria) (90%) * Actinobacteria (98%)* Gamma-Proteobacteria (98%)* Beta-Proteobacteria (93-95%) Delta-Proteobacteria (98%) * Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (100%) Acidobacteria (98%) * Gamma-Proteobacteria (93%) * Delta-Proteobacteria (98%)* Actinobacteria (95%) Microbacterium (Actinobacteria) (92%) Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (100%) Acidobacteria (97%) Sphyngomonas (Alpha-Proteobacteria) (100%) * Hyphomicrobiaceae (Alpha-Proteobacteria) (94%)* Nitrospirae (97%) * Gamma-Proteobacteria (94%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (98%) Delta-Proteobacteria (90%) Nostocoida (Actinobacteria) (97%) Actinobispora (Actinobacteria) (94%)* Acidobacteria (91%)* ARN

9 Colonizaciones amarillas ARN Alpha-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria Delta-Pproteobacteria Actinobacteria Firmicutes Acidobacteria Nitrospirae Gemmatimonadetes Colonizaciones grises ADN ARN Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (98%)* Beta-Proteobacteria (93%) Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (99%) Enterobacteaceae (Gamma-Proteobacteria) (99%) Gamma-Proteobacteria (98%) * Delta-Proteobacteria (90%) * Enterobacteraceae (Gamma-Proteobacteria) (98%) Beta-Proteobacteria (89%) Enterobacteraceae (Gamma-Proteobacteria) (99%) Beta-Proteobacteria (95%) Gamma-Proteobacteria (98%)* Alpha-Proteobacteria (95%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (94%) Alpha-Proteobacteria (98%)* Thauera (Beta-Proteobacteria) (96%)* Myxococcus (Delta-Proteobacteria) (98%)* Delta-Proteobacteria (100%) * Acidobacteria (97%)* Acidobacteria (93%) * Acidobacteria (97%) * Pseudonocardia (Actinobacteria) (94%) Acidobacteria (94%) *

10 Colonizaciones grises A ADN B Alpha-Proteobacteria β Beta-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria Delta-Proteobacteria A Actinobacteria Acidobacteria ARN Depósitos de moonmilk Gamma-Proteobacteria (98%) Acinetobacter (Alpha-Proteobacteria) (99%) Enterococcus (Firmicutes) (96%) Streptococcus (Firmicutes) (98%)) Moraxella (Gamma-Proteobacteria) (99%) Staphylococcus (Firmicutes) (99%) Bdellovibrio (Delta-Proteobacteria) (98%) Moraxella (Gamma-Proteobacteria) (99%) Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (97%) Herbaspirillum (Beta-Proteobacteria) (97%) Taxeobacter (Bacteroidetes) (87%) Synechocystis (Cyanobacteria) (99%) Gamma-Proteobacteria (98%) Hydrogenophaga (Beta-Proteobacteria) (93%) Hyphomicrobium (Alpha-Proteobacteria) (90%) Aquabacterium (Beta-Proteobacteria) (98%) Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (96%) Verrucomicrobia (97%) Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (98%) Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (94%) Tsukamurella (Actinobacteria) (99%) Propionibacterium (Actinobacteria) (99%) Hydrogenophilus (Beta-Proteobacteria) (98-99%) Propionibacterium (Actinobacteria) (99%) 10

11 Depósitos de moonmilk ADN ARN A B αalpha-proteobacteria βbeta-proteobacteria γgamma-proteobacteria δdelta-proteobacteria Actinobacteria Firmicutes Planctomycetes Acidobacteria Verrucomicrobia Bacteroidetes Cloroplastos Chloroflexi SPAM TM8 TM6 OP1 2. Detección de grupos de microorganismos que no habían sido detectados en la Cueva de Altamira ni en otras cuevas con pinturas rupestres. Crenarchaeota Fusobacteria Nitrospirae Verrucomicrobia Gemmatimonadetes 11

12 Grupos bacterianos detectados Acidobacteria: sólo tres especies descritas, aunque muchas subdivisiones determinadas por secuencias consegudas de muestras ambientales. Actinobacteria (Propionibacterium y Pseudonocardia): formación de esporas en suelos participan en la descomposición de materia orgánica, algunos pueden fijar N2 atmosférico y otros producen metabolitos secundarios que han servido para la producción de antibióticos. Bacteroidetes (Flavobacterium): aeróbico y heterótrofo en ambientes terrestres o acuáticos Chloroflexi: frecuentes componentes de films microbianos y ambientes acuáticos. Algunos fototrofos y poseen morfología filamentosa y pigmentos (bacterioclorofila d) Firmicutes (Bacillus, Clostridium y Paenibacillus): formación de esporas Grupos bacterianos detectados Nitrospirae: quimioorganotrofos aerobios, oxidan nitrito a nitrato. Planctomycetes: la mayoría conocidos a través de secuencias, carecen de pared de Peptidoglicano, reproducción por gemación e implicados en el ciclo del Nitrógeno (oxidación anaeróbica del amonio). Proteobacteria: todos los tipos de metabolismos (Pseudomonas y Escherichia) normalmente aerobios y heterótrofos, aunque Escherichia puede ser anaerobio facultativo. Verrucomicrobia: aerobios estrictos, heterótrofos y anaerobios o endosimbiontes de nematodos. Otros grupos detectados: microorganismos fototrofos (cianobacterias y microalgas unicelulares) y euciarotas heterótrofos (hongos). 12

13 3. Análisis de grupos específicos de microorganismos en la Cueva de Altamira Bacterias Reductoras de Sulfato (SRB) Crenarchaeota de baja temperatura Ninguno ha sido detectado en estudios previos SRB y Crenarchaeota suelen ser abundantes en suelos SRB pueden ser originar efectos negativos en las pinturas De las Crenarchaeota no se conoce su metabolismo Bacterias Reductoras de Sulfato (SRB) Anaerobias estrictas Metabolismo: Reducción de sulfatos produciendo sulfuros Utilizan una amplia gama de sustratos orgánicos de bajo peso molecular Sulfatos son abundantes en suelos Posibles efectos negativos de las SRB: - Alcalinización - Sulfuros metálicos - Precipitación de carbonatos Importancia de su metabolismo, ecología, actividad corrosiva y producción de H 2 S. 13

14 Identificación de las bandas que se han asignado a bacterias reductoras de sulfato en perfiles moleculares de muestras de suelo A B Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfomicrobium (90%) Desulfomicrobium hypogeium (97%) Desulfovibrio (99%) Desulfomicrobium hypogeium (97%) Desulfovibrio (96%) Desulfovibrio desulfuricans (99%) Desulfovibrio desulfuricans (96%) Desulfomicrobium (98%) Desulfomicrobium hypogeium (99%) Desulfomicrobium hypogeium (93%) Desulfomicrobium hypogeium (98%) Anaeromyxobacter (98%) Desulfomicrobium hypogeium (98%) Desulfomicrobium (99%) Desulfomicrobium escanbiense (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio (92%) Desulfovibrio vulgaris (97%) Desulfovibrio vulgaris (94%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Desulfovibrio vulgaris (98%) Árbol filogenético de bacterias reductoras de sulfato AY960257, clon 875, cueva de Altamira OTU1, cueva de Altamira OTU2, cueva de Altamira AJ853587, clon GZKB93, Residuo urbano sólido 88 AY328748, clon DSSD50, agua potable AF175636, clon WJGRT-118, acuífero contaminado EF188717, cueva de Altamira EF188720, cueva de Altamira 98 EF188751, cueva de Altamira 69 EF188718, cueva de Altamira EF188475, cueva de Altamira AF132738, Desulfomicrobium hypogeium cepa CN-A AJ277896, Desulfomicrobium baculatum cepa DSM1742 U64865, Desulfomicrobium apsheronum cepa DSM AJ237604, Desulfobacterium macestii cepa DSM4194 DQ069214, clon MAB1, ambiente subterráneo AF280859, clon mle1-31, agua residual 71 EF188721, cueva de Altamira U42221, Desulfovibrio fairfieldensis cepa FH 26001/95 78 AJ295680, Desulfovibrio intestinalis cepa JG-G12 EF188723, cueva de Altamira 92 EF188474, cueva de Altamira 52 EF188478, cueva de Altamira DQ092636, Desulfovibrio desulfuricans cepa F28-1 DQ093951, clon ga89, suelo EF188749, cueva de Altamira EF188470, cueva de Altamira 65 EF188736, cueva de Altamira DQ122124, Desulfovibrio vulgaris subsp. oxamicus cepa DSM X87409, Desulfovibrio termitidis cepa HI1 AE017319, Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris cepa Hildenborough EF188746, cueva de Altamira 97 EF188745, cueva de Altamira 91 DQ173816, clon F4P35, marisma salada AY960231, cueva de Altamira AY651813, clon 3ML-89, agua subterránea AY491577, clon oc34, pozo petrolífero AJ306780, clon SHA-100, suelo AY960234, cueva de Altamira AY960226, cueva de Altamira AY960239, cueva de Altamira AY960232, cueva de Altamira AY960225, cueva de Altamira M34407, Desulfosarcina variabilis cepa DSM 2060 EF188779, cueva de Altamira AJ421896, clon Alt9-K55, cueva de Altamira AJ421200, clon C3-K4, cueva de Tito Bustillo AJ421892, clon Alt9-K47, cueva de Altamira DQ022161, clon HKT 546, agua residual AF097803, clon 1959, agua residual AY592087, clon Kazan-1B-10/BC19-1B-10, fango de volcán DQ123792, clon PAH-Feed-72, suelo AJ504432, Anaeromyxobacter subgroup (O. Myxococcales), cepa FAc12 86 AF382400, Anaeromyxobacter dehalogenans cepa 2CP-3 53 OTU17, cueva de Altamira 10% 72 AY374745, clon PI_r120_c2, marisma salada 14

15 Crenarchaeota de baja temperatura Miembros del dominio Archaea Presentes también en ambientes moderados, como los suelos Hasta muy recientemente, ningún miembro perteneciente a Crenarchaeota de baja temperatura había sido cultivado. En 2005 ha sido propuesta la primera especie cultivada de Crenarchaeota de baja temperatura: Nitrosopumulus maritimus quimiolitotrofa y oxidadora de amonio) Perfil de la comunidad de Archaea pertenecientes a una muestra RNA Crenarchaeota de baja temperatura 15

16 Árbol filogenético de Archaea AB050241, agua continental, SAGMA-11 U87518, sedimento de agua continental, LMA AF201367, sedimentos de estuario, DOURO AJ294881, sedimentos marinos, 19a-27 DQ085099, Nitrosopumilus maritimus AJ715802, agua marina, ECS4A AY820231, piedra, CCSD_RK1930_A9 72 AF316803, agua continental, CL500-AR1 95 U87519, sedimentos de agua continental, LMA AB113625, agua subterránea, HAuD-MA13 86 AY972858, cueva de Altamira, AY972859, cueva de Altamira, 939 AJ567622, sedimentos marinos, MBAA16 90 AF083071, Candidatus Cenarchaeum symbiosum AY972865, cueva de Altamira, 935-E, AY AY972857, cueva de Altamira, AY972860, cueva de Altamira, 858 U62814, suelo, SCA1154, 66 AF418934, agua continental, HTA-D6 67 AY972855, cueva de Altamira, AY972856, cueva de Altamira, 905 AF418938, agua continental, HTA-G6 81 U62816, suelo, SCA1166 U62820, suelo, SCA11 AY972861, cueva de Altamira, 908 Crenarchaeota de baja temperatura AY972862, cueva de Altamira, 936 AJ535120, subsuelo, Gitt-GR D85505, Acidianus infernus 96 Acidianus brierleyi, U38359 AY247901, Sulfolobus islandicus 89 X03235, Sulfolobus solfataricus X14835, Thermofilum pendens M35966, Thermoproteus tenax M21087, Pyrodictium occultum M366474, Desulfurococcus mobilis Crenarchaeota cultivadas de alta temperatura 10% 4. Determinación de los microorganismos presentes y los que están metabólicamente activos en las muestras analizadas. A Alpha-Proteobacteria Beta-Proteobacteria Proporción de los distintos grupos bacterianos encontrados en la Cueva de Altamira a partir de ADN (A) y ARN (B) B Gamma-Proteobacteria Delta-Proteobacteria Actinobacterias Acidobacterias Firmicutes Planctomycetes Verrucomicrobia Bacteroidetes Cloroplastos Otros 16

17 5. Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira A Representación de los clones analizados frente a los grupos bacterianos encontrados (A) y frente a las especies diferentes encontradas (B) B Divisiones Número de clones OTUs Número de clones Conclusiones Las comunidades microbianas pueden ser caracterizadas por perfiles moleculares que permiten su comparación y la cuantificación de los grupos principales. Se han determinado los microorganismos más característicos de las principales colonizaciones y muestras en base al ADN y al ARN. El principal grupo microbiano detectado tanto en base del ADN como en base del ARN es Proteobacteria. Se han detectado grupos microbianos que no se habían detectado previamente. Se ha estimado que la diversidad total de los microorganismos de la Cueva de Altamira es mucho mayor a la observada y obtenida en este estudio. 17

18 MC Portillo Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC) RED TEMATICA 18