BIOLOGIA MOLECULAR. 04 de septiembre de 2017 Dra. Silvana Petrocelli

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Aarón Blanco Rey
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1 CLASE DE PROBLEMAS: CLONADO BIOLOGIA MOLECULAR Lic. en Biotecnología 04 de septiembre de 2017 Dra. Silvana Petrocelli

2 Problema 1-Clonado en fase-guía de problemas 2017 Se desea expresar un gen de superóxido dismutasa (SOD) de plantas para aislar suficiente cantidad de proteína, con el objeto de obtener anticuerpos mediante la inmunización de conejos. Se dispone de un plásmido que contiene la secuencia de ~1 kb de dicho gen bajo el control de un promotor de plantas (CaMV35S), insertada en los sitios EcoRI/PstI. Ud. desea expresar el gen bajo el control de un promotor bacteriano, como una proteína de fusión a fin de poder purificarla. A continuación se dan las secuencias de las regiones 5' y 3' del gen sod en donde están señalados los sitios de restricción y se encuentran subrayados los codones de iniciación y terminación de la traducción. El número entre paréntesis indica la posición de la base adyacente. Eco RI 1kbp 35SCaMV 5' 3' Sma I Eco RI Pst I

3 a- En el laboratorio se dispone de vectores del tipo pgex. Diseñe una estrategia de clonado para expresar dicho gen en Escherichia coli y poder purificar la proteína de fusión. PASO 1. Analizar vector e inserto para determinar con que enzimas se va a realizar el clonado. INSERTO EcoRI 5' AAA CCA GAT CGT GGG AAT TCA ATG ACT ATT (30)... SmaI (900) CCC GGG CTC CTG CTT CCG CGT GAA ATC CTG ATC CAG AAA GAT CTG AAT TCG TAA CTG CAG CCC 3' EcoRI PstI Posibles enzimas a utilizar: EcoRI y PstI

4 VECTOR Enzima a usar: EcoRI

5 PASO 2. Determinar que versión del vector vamos a utilizar para que el inserto quede en fase para la expresión de la proteína de interés como fusión a la proteína GST. Gen sod AAA CCA GAT CGT GGg aat tca ATG ACT ATT (30) pgex1 STOP CCA AAA TCG GAT CCC CGG GAA TTC ATC GTC ACT GAC TGA CGA TCT G BamHI SmaI EcoRI EcoRI pgex2t STOP CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTG BamHI SmaI EcoRI pgex3x STOP CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG BamHI SmaI EcoRI

6 pgex1 CCA AAA TCG GAT CCC CGG gaa ttc AAT GAC TAT T (30) GGT TTT AGC CTA GGG GCC ctt aag TTA CTG ATA A pgex2t CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG Gga att caa TGA CTA TT (30) GGT TTT AGC CTA GAC CAA GGC GCA CCT AGG GGC Cct taa gtt ACT GAT AA pgex3x CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGg aat tca ATG ACT ATT (30) GGT TTT AGC CTA GAC TAG CTT CCA GCA CCC TAG GGG CCc tta agt TAC TGA TAA Para que el gen sod quede en fase para la expresión como fusión a la proteína GST debemos usar la versión del vector pgex3x

7 Que sucede con el extremo 3 del gen? Gen sod GAT AAA CTg aat tcg TAA pgex3x STOP CCA AAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGg aat tca TCG TGA CTG STOP GAT AAA CTg aat tca TCG TGA CTG CTA TTT GAc tta agt AGC ACT GAC Cada versión del pgex tiene codones de stop en cada uno de los marcos de lectura

8 b- Se realiza la transformación con la mezcla de ligación conteniendo pgex más inserto, digeridos con las enzimas de restricción que Ud. eligió. De qué manera puede comprobar si las colonias obtenidas en la transformación tienen el plásmido con inserto? Indique cuáles de las construcciones obtenidas permitirán expresar la SOD. Exprese los tamaños de los fragmentos de restricción con números aproximados. 1. Para comprobar la presencia de inserto: Liberar el inserto por digestión con EcoRI Hacer una PCR en colonia con oligonucleótidos específicos Secuenciar 2. Para comprobar la orientación del inserto: analizar el patrón de restricción generado por digestión con la enzima SmaI ~4900 pb ~5600 pb 900 pb

9 Estrategia de clonado completa 1. Analizar el inserto y el vector a utilizar para determinar con qué enzima/s se va a realizar la digestión 2. Si el clonado se va a realizar en un vector de expresión, determinar cuál versión del mismo se va a utilizar para que el inserto sea clonado en fase 3. Digerir inserto y vector con la/s enzima/s elegida/s 4. Realizar la reacción de ligación 5. Trasformar con la mezcla de ligación células de Escherichia coli apropiadas 6. Seleccionar las células transformantes que recibieron el vector. Puede ser posible la selección por blancas y azules 7. Realizar los controles correspondientes para verificar que las transformantes seleccionadas tengan el inserto deseado y en la orientación correcta para la expresión 8. Sobre-expresar la proteína de interés por inducción de los cultivos con un inductor adecuado (generalmente IPTG) 9. Analizar la expresión de la proteína por SDS-PAGE y western blot 10. Purificar la proteína por Cromatografía de afinidad

10 pet-28 pet-28a(+) pet-28b(+) pet-28c(+) BamHI 5 GCAATCCCggatccTTATGGCGGGGACGGGGGTGTTCGCGGACGTGCTGGA (1420 nt) TAAACCTCCCATCTCCGTCgaattcCATGGGCTGAGCggatccCGATTCACAGCCGTAATC3 EcoRI BamHI

11 pet-28a pet-28b pet-28c pet-28a pet-28b pet-28c ATG GGT CGC GGA TCC GAA TTC BamHI EcoRI GGT CGG GAT CCG AAT TCG BamHI EcoRI GGT CGG ATC CGA ATT CGA BamHI EcoRI ATG GGT CGC gga tcc TTA TGG CGG GGA C TAC CCA GCG cca agg AAT ACC GCC CCT G GGT CGg gat cct TAT GGC GGG GAC G CCA GGc cta gga ATA CCG CCC CTG C GGT Cgg atc ctt ATG GCG GGG A CCA Gcc tag gaa TAC CGC CCC T Para que el gen quede en fase para la expresión de la proteína fusionada a una cola de His amino terminal debemos usar la versión del vector pet28c

Selección de colonias por blancas y azules: α complementación Sito de múltiple clonado (SMC): interrumpe la secuencia del gen lac Z (péptido α de la β-galactosidasa).

12 Selección de colonias por blancas y azules: α complementación Sito de múltiple clonado (SMC): interrumpe la secuencia del gen lac Z (péptido α de la β-galactosidasa). β-galactosidasa activa: se forma cuando el péptido α se complementa con el fragmento ω. El fragmento ω está codificado en el plásmido F o en el cromosoma de la bacteria que vamos a transformar. Colonias azules: sin inserto de ADN Colonias blancas: se interrumpió la secuencia del gen lac Z con inserto de ADN En un background lac Z-

13 Transformación con una mezcla de ligación 1. Mezcla de ligación: vector cortado + inserto cortado + enzima ligasa 2. Controles: Control de religación: vector cortado + enzima ligasa Control de corte: vector cortado Control positivo: plásmido cerrado (para calcular la eficiencia de transformación) Control negativo: sin ADN 3. Transformar las células y seleccionar por resistencia a un antibiótico, codificada en el plásmido 4. Para la selección se suplementan las placas con un inductor del promotor Lac (IPTG: isopropiltiogalactósido) y con un análogo de la lactosa, X-GAL (5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-d-galactopiranósido) que al ser degradado por la enzima produce un precipitado color azul PROBLEMAS POSIBLES: - No se cortaron correctamente vector y/o inserto - No tratamos el vector con fosfatasa alcalina (si clonamos cortando con una sola enzima es necesario tratar el vector con fosfatasa alcalina para evitar la religación del vector) - No funciona la ligasa - Hay alguna contaminación (bacterias o plásmido con resistencia) - No se suplementaron las placas los reactivos adecuados para la selección

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