REFERENCIAS Para mayor entendimiento del tema, se sugiere conocer los siguientes documentos publicados por el OIRSA:

Transcripción

1 Manual de procedimiento para la colecta, envío y procesamiento de muestras para el diagnóstico del HLB ( Candidatus Liberibacter spp ) en hojas y la presencia de la bacteria asociada en el insecto vector. Abril 2013.

2 Contenido. A. Información general. B. Objetivos del manual. C. Referencias D. Aspectos a considerar antes del muestreo. E. Métodos de Diagnóstico de HLB F. Muestreo del Psílido Asiático de los Cítricos para la detección de HLB. G. Procesamiento de muestras de Psílidos. H. Muestreo de material Vegetal Distribución irregular de la bacteria. Toma de muestras vegetales. Muestreo en unidad de producción de cítricos. Envío de muestras. Recepción de muestras. I. Metodología de diagnóstico para la detección de HLB. J. Referencias K. Anexos. 1. Aspirador Manual. 2. Formato de solicitud de Diagnóstico. 3. Extracción de ADN de Psílidos y plantas. 4. PCR convencional y PCR tiempo Real.

3 INFORMACIÓN GENERAL. El Huanglongbing (HLB) es una enfermedad destructiva que afecta a los cítricos y que representa una gran amenaza a la industria citrícola en el mundo porque está invadiendo rápidamente las áreas de producción. Causa la muerte de las plantas infectadas y todavía no existe un método efectivo de control. La presencia de HLB fue reportada por primera vez en Asia y posteriormente en África. En el continente Americano, la primera detección fue en el 2004 y a partir de esa fecha se ha expandido rápidamente. Actualmente, el HLB está presente en algunas áreas de México 1, Brasil, EEUU 2, Belice, Costa Rica, Cuba, Guatemala, Puerto Rico, Honduras, Jamaica, Nicaragua y República Dominicana. Refiriéndonos a los países que integran la región OIRSA, hasta esta fecha (abril 2013) sólo El Salvador y Panamá no tienen registros de la presencia de la enfermedad. Candidatus Liberibacter asiaticus y Ca. L. americanus son los patógenos consistentemente asociados a la enfermedad del HLB de los cítricos, reportados en el continente americano. Se tienen registros de Candidatus Liberibacter africanus sólo en el continente Africano. Estos patógenos colonizan el floema y son diseminados en el campo por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri, presente en todos los países de la Región del OIRSA 3. El HLB afecta a todos los cultivares de cítricos, independientemente de los patrones y la edad de la planta. El patógeno también se ha detectado en árboles de Murraya paniculata (naranja jazmín, limonaria o mirto) en áreas urbanas y rurales. El HLB es considerado una de las enfermedades más importantes en los cítricos, porque una vez presente en la región es necesario implementar medidas de control regional. Los esfuerzos individuales encaminados al control del insecto vector y a la reducción del inoculo no son exitosos y sólo representan un incremento considerable en los costos de producción. Las regiones que se encuentran aún libres de HLB, centran sus esfuerzos en conocer las razones de tal dispersión, en identificar las formas más probables de su ingreso en las distintas áreas y en tomar medidas eficaces para evitar su introducción. Estas acciones se generan frente al hecho constatado de que vastas áreas citrícolas del mundo no han podido evitar el ingreso de esta enfermedad en los últimos años, como es el caso de Sao Pablo en Brasil, de Florida en EEUU y en general, en la citricultura centroamericana (Mara y Reyrou, 2010). Considerando los mecanismos de dispersión de la enfermedad, en las regiones citrícolas donde no se tienen registros de la presencia de HLB se realizan inspecciones constantes encaminadas a la búsqueda de síntomas en material vegetal y a la colecta del Psílido Asiático de los Cítricos (PAC) para conocer si es portador de la bacteria. Por otro lado, en las regiones citrícolas con presencia de HLB, se ha establecido como una estrategia de manejo de la enfermedad, eliminar los árboles de cítricos infectados para reducir la cantidad de inoculo y evitar así la dispersión de la enfermedad a otras áreas. Estas estrategias requieren métodos de diagnóstico sensibles y confiables para poder justificar las acciones de eliminación de plantas y/o control del insecto vector. Actualmente la combinación de PCR convencional y PCR cuantitativa (qpcr) son las técnicas más empleadas para la detección de HLB. Los métodos de muestreo y el adecuado envío de las muestras vegetales y del insecto vector, son esenciales para la detección y cuantificación de las variantes de Candidatus Liberibacter. 1 En México, HLB está presente en 13 de los 23 estados productores de cítricos. 2 Florida (2005), Louisiana (2008), South Carolina (2009), Texas (2012) y California (2012). 3http://

4 OBJETIVOS DEL MANUAL. Considerando que la detección temprana de árboles infectados o de poblaciones del vector portando a la bacteria, es de vital importancia para reducir las fuentes de inoculo y mitigar la dispersión de HLB a través del psílido vector, se ha elaborado este documento con los siguientes objetivos: a. Proporcionar información relevante a considerar antes del muestreo de psílidos y material vegetal. b. Describir el procedimiento de toma y envío de muestras de psílidos y material vegetal. c. Describir el procedimiento de Diagnóstico para la detección de HLB en muestras vegetales y en muestras de psílidos. d. Realizar recomendaciones generales para el trabajo dentro del laboratorio de diagnóstico. REFERENCIAS Para mayor entendimiento del tema, se sugiere conocer los siguientes documentos publicados por el OIRSA: Manual de la campaña contra el HLB y su vector. Protocolo de monitoreo del Psílido Asiático de los Cítricos. Guia de síntomas de Huanglongbing. Protocolo del Sistema de Información Geográfica para HLB y su vector. Norma Regional de Sanidad Vegetal Lineamientos de Armonización Normativa de Certificación Fitosanitaria de Material Propagativo de Cítricos Asimismo, según el país de que se trate, deberá conocerse el programa de certificación y la normativa relacionada con el HLB y su vector. ASPECTOS A CONSIDERAR ANTES DEL MUESTREO. Para determinar la presencia de HLB en una región citrícola, se han establecido dos actividades fundamentales: Búsqueda de síntomas característicos en plantas y/o la colecta del insecto vector. Véase del Manual de la campaña contra el HLB y su vector, publicado por el OIRSA. Cuando no se tiene registros de la presencia del insecto vector ni de la enfermedad, es importante realizar monitoreo continuo e intensivo para detectar adultos del PAC. El empleo de trampas pegajosas, puede ser útil para la detección de adultos del PAC. Si el PAC es identificado, deberán colectarse insectos para analizarlos y determinar si son portadores de Candidatus Liberibacter spp, así como tejido de la o las plantas donde éstos se colecten. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE HLB. La baja concentración y distribución irregular de la bacteria en plantas infectadas con HLB dificultan la detección de forma consistente. Diversos métodos de detección se han desarrollado, incluyendo el indexado biológico, microscopía electrónica, PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) convencional y PCR cuantitativa (qpcr). No obstante, para la aplicación de estrategias de manejo es necesario desarrollar metodologías de diagnóstico más sensibles que permitan la detección de la bacteria en tejidos asintomáticos. La eliminación temprana de las plantas infectadas en el campo y en los viveros protegidos, además de impactar en el control de la enfermedad, reducirá el riesgo de diseminación de ésta.

5 La técnica de PCR emplea iniciadores específicos que amplifican secuencias de la región 16S del ADN ribosomal de la bacteria e iniciadores basados en genes proteínicos (operon-β) (Jagoueix et al., 1996; Tian et al., 1996; Hocquellet et al., 1999, Teixeira et al., 2005, Li et al., 2006) que permiten detectar a las tres variantes de Ca. Liberibacter. La distribución irregular del patógeno y los títulos bajos en las plantas hospederas, así como los inhibidores de la PCR presentes en los extractos de cítricos, han dificultado la detección consistente del patógeno. La PCR tiempo real o qpcr es mucho más sensible que la PCR convencional. La qpcr, basada en la amplificación de la región del gen 16S ribosomal de Ca. Liberibacter spp, es el método aceptado por las entidades regulatorias y no regulatorias para detectar la presencia del patógeno tanto en muestras vegetales de cítricos y muestras de psílidos (Hall et al., 2011). Li et al., (2006) desarrollaron el ensayo de qpcr para la detección de HLB y lo validaron utilizando ADN de tejidos diferentes de distintas especies de cítricos, procedentes de diversas regiones geográficas. La combinación de PCR convencional y la qpcr son los métodos empleados por los laboratorios oficiales para la detección y confirmación del HLB. En el proceso de Diagnóstico, la toma de la muestra, la conservación de ésta y el envío de la misma, son de gran importancia para obtener resultados confiables, todo ello encaminado a toma de decisiones sobre el manejo de la enfermedad y del insecto vector. MUESTREO DEL PSÍLIDO ASIATICO DE LOS CITRICOS PARA LA DETECCIÓN DE HLB. El análisis de psílidos colectados en huertas comerciales, viveros, zonas residenciales urbanas y rurales, es una estrategia que se ha planteado para anticipar la llegada de Ca. Liberibacter spp., o bien para delimitar la presencia de HLB en la zona (véase el Manual de la campana contra el HLB y el Protocolo de monitoreo del psílido asiático de los cítricos, ambos publicados por el OIRSA). En ese sentido, el resultado positivo de un análisis de psílidos es útil para llevar a cabo decisiones adecuadas de manejo. Las ninfas de psílidos, que no se mueven de una planta a otra, pueden adquirir a Ca. Liberibacter spp, sólo del árbol en el que viven. Una muestra de ninfas positiva, indicaría que la planta de origen está infectada, mientras que un adulto con HLB puede indicar la presencia árboles infectados en la zona (Manjunath et al., 2008). Si bien es cierto, esta estrategia es costosa, por la presencia de altas poblaciones de Diaphorina citri en algunas regiones y la consecuente necesidad de analizar un número importante de muestras de psílidos 4, la investigación muestra que los psílidos positivos aparecen en lugares inesperados. 5 Ca. Liberibacter asiaticus se ha detectado en muestras de árboles visualmente sanos en sitios sin registro de la presencia de HLB. Esta información es de gran utilidad porque generalmente nos guía hacia las plantas enfermas que son la fuente de inoculo. En México por ejemplo, se realizan muestreos periódicos en las huertas comerciales para determinar si los psílidos son portadores de la bacteria, de igual forma, se han establecido rutas urbanas que abarcan diferentes poblaciones o localidades, que se recorren mensualmente para colectar psílidos, ya sea en cítricos o bien en limonaria (M. paniculata). En California, a raíz de la reciente detección de HLB en cítricos residenciales en Los Ángeles, se estableció un sistema de monitoreo intensivo por medio de trampas para detectar la presencia del insecto en los condados 6 con registros previos de la presencia del psílido. 4 México procesó más de 2500 muestras de psílidos antes de detectar una muestra positiva a Ca. Liberibacter asiaticus. 5 Technical Working Group (TWG) Report: HLB in Texas 6 San Diego, Imperial, Orange, Los Ángeles, Riverside, San Bernardino y Ventura

6 Manjunath et al., (2008) publicaron un estudio en el que reportan la detección de Ca. Liberibacter asiaticus en una muestra de psílidos colectada en un huerto de cítricos de 3 años de edad. Ningún síntoma de HLB fue observado durante todo el periodo de colección (junio a septiembre), 9 meses después de la detección de HLB en los psílidos encontraron arboles sintomáticos y confirmaron la presencia de Ca. Liberibacter por PCR. Estos resultados sugieren que esos árboles, de tres años de edad, pudieron permanecer asintomáticos por más de 9 meses. Por otro lado, existe evidencia que altas temperaturas en el verano puede suprimir la bacteria en el PAC, pero no se tienen registros consistentes sobre este comportamiento. En Florida, se han observado porcentajes altos de PAC positivos detectados en otoño y al inicio del invierno. En México tampoco no se tienen registros consistentes sobre la tasa de psílidos positivos detectados en los muestreos realizados durante todo el año, sin embargo existe un reporte que señala un incremento en la detección de psílidos positivos a partir del mes de noviembre hasta marzo, cuando la temperatura promedio mensual es de C con un porcentaje de humedad relativa de 70-75% (Félix et al., 2011). Recientemente Yulu et al., (2011) reportaron en China la presencia de otro psílido potencialmente vector de HLB, Cacopsylla (Psylla) citricola (pendiente de confirmación taxonómica definitiva), ya que al colectar los ninfas de esta especie de psílidos de árboles sintomáticos a HLB, resultaron positivos a Ca. Liberibacter asiaticus. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE PSÍLIDOS De acuerdo a lo establecido en el Manual de la campaña contra el HLB y su vector, así como el Protocolo de monitoreo del Psílido Asiático de los Cítricos, la colecta de psílidos se puede realizar en huertos comerciales, zonas residenciales y en zonas de alto riesgo que se determinen en cada región. Es muy importante registrar los datos sobre la ubicación (anexo 2) de la huerta o bien de las zonas residenciales, de acuerdo a lo establecido en el Protocolo del Sistema de Información Geográfica para HLB y su vector. La finalidad es poder localizar el sitio específico de coleta, ya que en caso de tener un resultado positivo a HLB será necesario realizar un segundo muestreo más exhaustivo para localizar o detectar material vegetal sintomático. Para realizar la toma de muestras de psílidos se deberá tomar en cuenta lo siguiente: A. Los psílidos pueden colectarse con un aspirador manual (anexo 1) y se colocarán de inmediato para su conservación en frascos viales con alcohol etílico al 95% o al 75%. B. No recolectar todos los psílidos de una misma planta. C. Etiquetar los frascos que contengan los psílidos. Es recomendable asignar un número consecutivo a las muestras para simplificar el manejo y rastreabilidad a las muestras. Para etiquetar las muestras se recomienda utilizar lápiz y evitar así que la etiqueta se borre (figura 1). Una muestra sin etiqueta carece de valor para el laboratorio porque no podrá determinar la procedencia. D. Asegurar que los frascos que contienen las muestras no presenten fugas de alcohol y de preferencia no emplear frascos de vidrio, que pueden sufrir rupturas si se utiliza servicios de mensajería. E. Es importante registrar la información de cada una de las muestras en un formato (anexo 2) que contenga los datos necesarios para identificar sin problema la procedencia de la muestra. Éste se deberá anexar al realizar el envío de las muestras o bien deberá remitirlo al laboratorio de forma electrónica. F. Las muestras deberán enviarse al laboratorio lo antes posible, a fin de lograr la detección oportuna del HLB. NOTA: Para detección de la bacteria no deben utilizarse psílidos colectados en trampas pegajosas.

7 Los psílidos colectados pueden conservarse en alcohol al 75% o al 95% a temperatura ambiente, sin comprometer la detección de Ca. Liberibacter spp. El ADN se conserva estable en estas condiciones hasta por dos meses (59 días) (Hall, et al., 2011). Figura 1. Muestras de Psílidos enviadas para diagnóstico de HLB. A y B) Frasco con etiqueta borrada. C) Muestras etiquetadas con lápiz, sin fugas de alcohol. MUESTREO DE MATERIAL VEGETAL PARA LA DETECCIÓN DE HLB. La observación de síntomas característicos en el campo es una herramienta útil para reconocer las plantas posiblemente infectadas con la bacteria. El entrenamiento de los técnicos para llevar a cabo el reconocimiento eficientemente de la sintomatología es de gran importancia dentro de las estrategias de manejo de la enfermedad (Collazo et al., 2008). Se han descrito diversos síntomas asociados a la presencia de HLB. El moteado asimétrico de las hojas es el síntoma más característico de la enfermedad. Este síntoma se manifiesta en forma diferente dependiendo de la especies, ejemplo, en los cítricos ácidos como el limón persa, las manchas son más angulares y de color más contrastante en comparación con los síntomas observados en cítricos dulces (figura 2). Sin embargo, los síntomas comúnmente asociados a HLB (moteado asimétrico, amarillamiento y engrosamiento de nervadura) son producto de la interferencia que ocasiona el patógeno sobre el movimiento de nutrientes y distribución a todas las células vivas que se realiza a través de los tejidos del floema, propiciando así el desarrollo de la enfermedad en las partes de la planta que carezcan de esos nutrientes y sustancias (Agrios, 1999). Esta interferencia no es exclusiva de Ca. Liberibacter spp., por ello la detección confirmatoria de la presencia de HLB en las plantas se realiza por métodos moleculares. Figura 2. Síntomas de HLB en Limón Persa y Naranja Dulce.

8 Aunado a esto, recientemente se ha reportado la presencia de dos fitoplasmas asociados a los síntomas del HLB (Texeira et al., 2008; Chen et al., 2009). El fitoplasma reportado en Brasil (Pigeon pea witches'-broom phytoplasma), asociados a plantas con síntomas muy similares a los que ocasiona la presencia de Ca. Liberibacter asiaticus (figura 3), reitera la necesidad de realizar la detección confirmatoria por métodos moleculares. Figura 3. Síntomas del fitoplasma reportado en Brasil en Naranja Dulce. Para mayor referencia, se recomienda contar con la Guía de síntomas del Huanglongbing, elaborada por el OIRSA. DISTRIBUCIÓN IRREGULAR DE LA BACTERIA. En los árboles afectados los síntomas de HLB se presentan solo en algunas ramas. Esto sugiere una distribución irregular o desigual de la bacteria. Texeira et al., (2008) analizaron 822 muestras de hojas de diferentes ramas de un árbol de naranja dulce con síntomas de HLB. Emplearon la técnica de PCR convencional, PCR nested y qpcr, los resultados que obtuvieron son los siguientes: De las 822 muestras de hojas, 111 presentaban moteado característico, 77 con síntomas de deficiencias de Zinc y 634 asintomáticas. Al analizarlas con PCR convencional, 263 resultaron positivas, es decir sólo 31% de las muestras. Las muestras positivas corresponde a las 111 muestras con moteado, 81 asintomáticas y 61 con deficiencias de zinc. Las 569 muestras negativas restantes se analizaron por PCR nested, resultando 34 muestras positivas (el 6%), que corresponde a 30 asintomáticas y 4 con deficiencias de Zinc. Las 535 negativas restantes, eligieron 97 muestras al azar y las analizaron por qpcr resultando 5 positivas que corresponden a muestras asintomáticas. Los resultados demuestran que incluso en un árbol sintomático, algunas ramas todavía poden estar libres de infección o tienen un contenido muy bajo de Ca. Liberibacter (figura 4).

9 Figura 4. Representación de resultados obtenidos de hojas de una rama de un árbol de naranja dulce afectado por HLB. Triángulos rojos: hojas con moteado positivas por PCR convencional. Círculos rojos: hojas con deficiencia de zinc u hojas asintomáticas positivas por PCR convencional. Círculos azules: hojas con deficiencia de zinc u hojas asintomáticas negativos por PCR convencional y PCR nested. Círculos verdes: Hoja positiva por qpcr, (negativa por PCR convencional y PCR nested). Círculos blancos: Hoja negativa por PCR convencional y PCR nested, no evaluadas por qpcr. Anillos verdes: Hojas negativas por PCR convencional, PCR nested y qpcr. Tomado de Texeira et al., (2008). El resultado de las pruebas de qpcr no sólo depende de la sensibilidad de la técnica de PCR, también depende del tipo de hojas que se están seleccionando. Para la detección de HLB de los árboles infectados pero asintomáticos, la qpcr es sin duda más sensible que la PCR convencional, pero el muestreo de las hojas sigue siendo un aspecto clave. TOMA DE MUESTRAS VEGETALES Los métodos de muestreo son esenciales para la detección, identificación y cuantificación de las variantes de Ca. Liberibacter, ya que su distribución en las plantas hospederas puede ser irregular o con un título muy bajo (Li and Levy, 2009). Algunos reportes señalan que en Florida y Brasil los síntomas en plantas son mucho más evidentes durante el otoño, cuando la temperatura no es tan extrema, por ello se recomienda intensificar las inspecciones y realizar la toma de muestras vegetales desde finales de julio hasta marzo. En árboles con síntomas, se colectan de 1 a 4 ramas (de 10 a 15 cm de largo) con hojas o frutos sintomáticos. Se recomienda utilizar la Guía de síntomas de Huanglongbing, elaborada por el OIRSA.

10 En caso de optar por analizar árboles que no presentan síntomas, lo cual no es recomendable en un programa de vigilancia, pero si en un programa de certificación de material propagativo, se colectan 4 ramas con hojas (de 10 a 15 cm de largo). Las ramas no deben ser viejas, pero tampoco deben ser de los brotes recién formados o nuevos (figura 5), es decir, la rama debe ser de color verde oscuro y la corteza debe estar endurecida 7 (figura 6). Las ramas deben tomarse de cuatro puntos diferentes del árbol. Figura 5. A) Hojas de brote nuevo, no maduras. B) Hojas de brotes maduros, hojas bien formadas. A B Figura 6. A) Ramas viejas con corteza café no apta para toma de muestra vegetal. B) Ramas con hojas bien formadas, corteza color verde oscuro. 7 Sampling Protocol for Submission of Huanglongbing (syn= Greening or HLB) Samples to the Southern Gardens Diagnostic Laboratory.

11 Si no hay ramas disponibles, como en el caso de los árboles pequeños de vivero (figura 7), se colectan 4 a 12 hojas completamente expandidas y endurecidas de cada planta. En el caso extremo de no contar con ningún tipo de hojas, se puede utilizar corteza del tallo o raíz. Figura 7. Plantas de vivero con hojas endurecidas o bien formadas. MUESTREO EN UNIDADES DE PRODUCCIÓN DE CÍTRICOS. La exploración periódica y el muestreo de las diferentes unidades de producción de material propagativo son fundamentales para detectar oportunamente al HLB 8. Se ha demostrado que yemas procedentes de ramas asintomáticas pero portadoras de la bacteria son capaces de producir la enfermedad en las nuevas plantas injertadas con tasas de transmisión que van desde 10 a 60% (Coletta et al., 2010). Por ello, se recomienda realizar actividades de revisión visual y diagnóstico molecular a las diferentes unidades de producción, para garantizar la producción de material propagativo de cítricos completamente sano. La cantidad de muestras a colectar por unidad de producción dependerá del Programa de Certificación de cada país. Para mayor referencia, se recomienda conocer la Norma Regional de Sanidad Vegetal Lineamientos de Armonización Normativa de Certificación Fitosanitaria de Material Propagativo de Cítricos, así como el programa de certificación del país de que se trate. ENVÍO DE MUESTRAS VEGETALES. Una vez realizada la toma de muestra, deberá realizar lo siguiente: 1. Colocar las muestras de ramas con hojas (u hojas solamente) en toallas de papel o bien en bolsa de papel (figura 8). 2. Introducir cada muestra en una bolsa de plástico. 3. Colocar sobre la bolsa el número de identificación de la muestra (se sugiere asignar un número consecutivo y garantizar que la etiqueta no se borre) (figura 8). 4. Sacar el aire de la bolsa y cerrarla. 5. Colocar las muestras en hielera (unicel) con refrigerantes para protegerlas de la temperatura y evitar la oxidación de las hojas. 6. Las muestras deberán enviarse preferentemente el mismo día de su colecta, si esto no es posible, es necesario mantenerlas en refrigeración (4 C) para enviarlas el día siguiente. 8 Protocolo de Diagnóstico NAPPO.

12 7. El envío de las muestras deberá acompañarse de una solicitud de diagnóstico (anexo 2) que contenga la siguiente información: Datos del interesado (nombre, domicilio, teléfono, ). Número total de muestras, fecha de muestreo y fecha de envío Identificación de las muestras (Datos de procedencia como Ciudad, Distrito, Provincia, Comunidad y Datos de la muestra como variedad y clave de éstas). Ubicación de la huerta (croquis detallado y/o datos de georeferenciación, según lo establece el Protocolo del Sistema de Información Geográfica para el HLB y su vector del OIRSA ) 8. Notificar el envío de muestras al laboratorio y considerar los días laborales. A B C Figura 8. A) Muestra sintomáticas. B) Muestra sin síntomas característicos. C) Etiquetado de muestra vegetal, en bolsa de papel. Es importante que el envío de las muestras se realice en corto tiempo y sobre todo, es necesario proteger las muestras de la temperatura, de lo contrario las hojas comenzarán a oxidarse (figura 9), imposibilitando la elección de las hojas sintomáticas por parte del personal del laboratorio. Si las hojas llegan oxidadas no es recomendable procesar ese tejido para hacer el diagnóstico, por ello se recomienda que se envíen ramas con hojas (sintomáticas o asintomáticas). De esa forma, si las hojas presentan oxidación es posible utilizar la corteza de las ramas. Figura 9. Muestras vegetales con hojas oxidadas.

13 RECEPCION DE MUESTRAS Al ingresar las muestras al laboratorio, éstas deberán registrarse en una Bitácora de Diagnóstico (se sugiere asignar un folio consecutivo interno). La Bitácora de Diagnóstico se registrará la clave de las muestras y posteriormente los resultados obtenidos. El laboratorio deberá dar prioridad a las muestras vegetales, para evitar que éstas se oxiden. Una vez registradas las muestras, se procederá a realizar la extracción de ADN y la PCR o qpcr para la detección de HLB. METÓDOS DE EXTRACCIÓN DE ADN. Existen diferentes metodologías que nos permiten extraer el ADN de muestras vegetales y/o de insectos. En las publicaciones y/o protocolos de detección de HLB, los métodos de extracción comúnmente usados son: el método de CETAB utilizado para plantas y psílidos (Murray y Thompson 1989). El método reportado por De Barro et al., (1995) para extracción de ADN de psílidos y los métodos basados en kits comerciales como Kit Qiagen DNeasy para Sangre y Tejido y Mini Kit para Plantas Qiagen DNeasy Qiagen. Existe también una gran diversidad de kits comerciales 9 basados en el uso de membranas (columnas) de silicato para purificar rápidamente ADN celular total sin usar extracciones orgánicas ni precipitación con etanol. La elección del método de extracción depende básicamente de los costos y también del tiempo que se destina a esta actividad. Los kits comerciales, ofrecen además de simplificar el procedimiento y obtener ADN con menos inhibidores, un ahorro de tiempo considerable y la reducción del riesgo de contaminación cruzada. EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL A PARTIR DE PSÍLIDOS Previo a la extracción de ADN, se debe eliminar el residuo de alcohol. La muestra de psílidos se coloca en una toalla de papel (sanita) (figura 10) durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Se recomienda que el área esté cerrada y alejada de corrientes de aire para evitar contaminación cruzada entre las muestras. Figura 10. Muestras de Psílidos sobre papel para eliminar el alcohol. 9 AXYPREP MULTISOURCE GENOMIC ADN MINIPREP KIT, AXYPREP BLOOD GENOMIC ADN MINIPREP KIT, SPEEDTOOLS PLANT ADN EXTRACTION KIT, KIT WIZARD. GENOMIC ADN (Promega).

14 Para la extracción de ADN de psílidos se recomienda utilizar los siguientes métodos: Método de extracción empleando Kit Qiagen DNeasy para Sangre y Tejido (Qiagen #69504 ). Método de extracción empleando Kit Axygen para sangre y tejido (AxyPrep Blood Genomic ADN Miniprep Kit) (anexo 3: Procedimiento de Extracción de ADN) EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL A PARTIR DE PLANTAS Para la extracción de ADN de plantas se desprenden de 10 a 12 hojas con síntomas característicos de HLB o bien las hojas que presenten algún síntoma. En caso de no presentar síntomas, entonces se toman las hojas de diferentes partes de la rama (figura 11). Si la muestra comprende varias ramas, tomar hojas de todas las ramas. Figura 11. Selección de hojas, tomadas de diferentes puntos de de la rama. Tomar hojas de las diferentes ramas procurando cubrir la longitud de ésta. Una vez seleccionadas las hojas, se deprende la nervadura central y peciolos, se cortan en trozos pequeños (figura 12). El resto del tejido se puede almacenar a 4 C o bien a -20 C. Si se requiere corroborar el resultado de una muestra, se puede hacer una nueva extracción de ADN del tejido ya picado (ya que son las hojas más representativas). Se recomienda usar una navaja por cada muestra a fin de evitar contaminación entre las muestras. 200 mg de tejido se colocan en un tubo de 1.5 ml, para realizar la extracción de ADN. Figura 12. Hojas seleccionadas para la extracción de ADN. Nervadura y peciolo picado de las hojas seleccionadas.

15 Para la extracción de ADN de plantas se recomienda utilizar los siguientes métodos: Método de Extracción de ADN empleando Mini Kit para Plantas Qiagen DNeasy ( Qiagen DNeasy #69104). Método de Extracción de ADN empleando el AxyPrep Multisource Genomic ADN Miniprep Kit (Cat. AP-MN-MS-GADN- 50) (anexo 3: Procedimiento de Extracción de ADN) PCR CONVENCIONAL y qpcr PARA LA DETECCIÓN DE HLB Como ya se mencionó, la combinación de PCR convencional y PCR cuantitativa (qpcr) son las técnicas más empleadas para el diagnóstico de HLB. La técnica de PCR emplea iniciadores (oligos) específicos que amplifican secuencias de la región 16S del ADN ribosomal de la bacteria e iniciadores basados en genes proteínicos (operon-β) (Jagoueix et al., 1996; Tian et al., 1996; Hocquellet et al., 1999, Teixeira et al., 2005, Li et al., 2006) que permiten detectar a las tres variantes de Ca. Liberibacter. Los iniciadores comúnmente utilizados en PCR convencional son los denominados OI1/OI2c/OA y rpla2/rplj5 desarrollado por Jagoueix et al., (1996) y Hocquellet et al., (1999) respectivamente. Los iniciadores OI1/OI2c/OA amplifican un fragmento de 1160 pares de bases (pb) de las variantes asiática y africana de Ca. Liberibacter. Para diferenciarlas, se requiere realizar la digestión del producto de amplificación con la enzima Xba I. El patrón de restricción para la variante africana es de tres fragmentos (520 pb, 506 pb y 130 pb) y para la variante asiática se obtienen dos fragmentos (640 pb y 520 pb). El par de iniciadores rpla2/rplj5 permiten distinguir ambas variantes, ya que amplifican un fragmento de 703 pb para Ca. Liberibacter asiaticus y 669 pb para Ca. Liberibacter africanus. Se han desarrollado otros ensayos de PCR convencional empleando distintos pares de iniciadores (cuadro 1). Hung et al., 1999 reportaron un ensayo sensible y rápido usando iniciadores desarrollados a partir de secuencias de fragmentos clonados de Ca. Liberibacter asiaticus. Este set de iniciadores fue evaluado en varios cultivares colectados de diversos países de Asia para detectar a la bacteria. Otro set de iniciadores fue publicado por Tatineni et al., (2008). Los iniciadores están dirigidos a la secuencia del gen de la ADN polimerasa de Ca. Liberibacter asiaticus. La especificad del ensayo con los nuevos iniciadores denominados HLB 65/HLB-66 se evaluó analizando ADN de naranja dulce infectadas con Ca. Liberibacter asiaticus, ADN de naranja dulce sanas de diferentes plantaciones que contienen endófitos múltiples, Virus Tristeza de los Cítricos (CTV), Xanthomonas axonopodis pv. citri, cepas diferentes de bacterias de Cítricos, Phytophthora spp. y Mycosphaerella citri. Los iniciadores HLB-65/HLB-66 generan resultados positivos sólo en muestras infectadas con Ca. Liberibacter asiaticus. Cuadro 1. Iniciadores empleados en PCR convencional para detectar HLB. Iniciador Secuencia Fragmento Fuente/autor OI1 GCG CGT ATG CAA TAC GAC CGG CA 1,160 LAS/LAF Jagoueix, et al., (1996) OI2c GCC TCG CGA CTT CGC AAC CCA T rpla2 TAT AAA GGT TGA CCT TTG GAG TTT 703 para LAS Hocquellet et al., (1999) rplj5 ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A 699 para LAF GB1 AAG TCG ACG GAG TAC GCA AGT ACT 1, 027 Teixeira et al., 2005 GB3 CTA TAT TTG CCA TCA TTA AGT TGG LAM Primer 226 CAC CGA AGA TATGGA CAACA 226 Hung et al., Primer 226 GAG GTT CTT GTGGTT TTT CTG LAS HLB-65 TCCTGAGAATTACACACAAAC 1000 Tatineni et al., 2008 HLB- 66 TCTAAGTCTATCCTGTAACCC LAS

16 Actualmente, la qpcr se ha convertido en el método rutinario para la detección de las variantes de Ca. Liberibacter. En comparación con PCR convencional, qpcr ofrece la detección sensible y rápida de las bacterias. La qpcr aumenta la sensibilidad para la detección de Ca. Liberibacter 10 veces más en relación con la PCR anidada y 100 a 1000 veces más con respecto a la PCR convencional (Morgan et al., 2012), por ello es el método aceptado por las entidades regulatorias y no regulatorias para detectar la presencia del patógeno tanto en muestras de cítricos y muestras de psílidos (Hall et al., 2011). El ensayo de qpcr que comúnmente se utiliza emplea los iniciadores y sonda desarrollados por Li et al., (2006), que están dirigidos a la secuencia de la región 16S del ADN ribosomal. También se han reportado otros ensayos de PCR cuantitativa o qpcr (Cuadro 2). Teixeira et al., (2008) desarrollaron otro ensayo de qpcr usando SYBR Green para determinar la distribución de Ca. Liberibacter americanus en hojas de naranja dulce afectadas por HLB. Señalan que la sensibilidad del ensayo en muestras de campo es al menos tan alta como la de técnicas similares publicadas anteriormente para la detección de Ca. Liberibacter Africana, Asiática y /o Americana. Un ensayo más de qpcr fue publicado por Coletta et al., (2010) para monitorear y cuantificar la multiplicación de Ca. Liberibacter en plantas jóvenes de naranja dulce con injertos infectados con CaLas. Con el trabajo que realizaron demostraron que CaLas puede propagarse fácilmente por yemas tomadas de ramas no sintomáticas pero infectadas. Brotes tomados de ramas infectadas, pero asintomáticas fueron injertados sobre lima Rangpur (C. limonia) (limón cravo). El resultado fue la transmisión de la bacteria con una tasa del 10 a 60%. También observaron una relación directa entre la concentración del agente patógeno y la expresión de síntomas. Hojas amarillentas o brotes, son comúnmente el primer síntoma observado de HLB, estos síntomas estuvieron presentes en los árboles con una baja cantidad de bacterias. La tasa de infección por injerto alcanzó el 100% a los 120 días después de la inoculación, lo que demuestra la diseminación de la bacteria por injerto. Sin embargo, todos estos ensayos de qpcr están dirigidos a genes con un bajo número de copias. Recientemente Morgan et al., (2012) publicaron un nuevo ensayo de qpcr para la detección de HLB. Señalan que con la reciente secuenciación del genoma de Ca. Liberibacter se han identificado dos genes únicos hipotéticos situados en una región del genoma de un profago 10 que se designaron como hyvi (YP_ ) y hyvii (HQ263703). Estos genes contienen múltiples secuencias repetidas en tándem 11 de 132 pb para cada repetición de longitud completa. Estas secuencias son ideales para el desarrollo de un método de qpcr en tiempo real. Los genes hyvi/hyvii puede contener hasta un total combinado de quince repeticiones casi idénticas. Esto mejora la sensibilidad del ensayo para la detección de CaLas en las plantas hospederas como en los insectos vectores. Al comparar los nuevos iniciadores y sonda diseñada (designados como LJ900) con el ensayo de qpcr basado en el 16S rdna, se redujo el umbral de detección y se detectó a Ca. Liberibacter en muestras que otros métodos no detectaron. 10 Fago integrado en el cromosoma de la bacteria parasitada, sin provocar, salvo tras inducción, la reproducción de las partículas víricas, se reproduce a la par con el cromosoma de la célula parasitada. 11 Dos o más secuencias idénticas de ADN contiguas.

17 Cuadro 2. Iniciadores y sondas diseñados para la detección por qpcr de Ca. Liberibacter Iniciador/ Gen Candidatus Fuente/autor Sonda liberibacter HLB as TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG ADN Asiaticus Li et al., 2006 HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG ribosomal 16s HLBp 56 FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/3BHQ 1 HLBam GAG CGA GTA CGC AAG TAC TAG ADN Americanus HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG ribosomal 16s HLBp 56 FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/3BHQ 1 f-rpljamf GGACAAGGGGATATTGGATAATGATG b-operon Americanus Teixeira et al., 2008 r-rpljamr ATTAAGAGTTCTAAGCAACCTGACAG f-rpllasf CGCCCGTTTCCGTTGT b-operon Asiaticus r-rpllasr AGCCTCTTTAAGCCCTAAATCAG AS84F TCACCGGCAGTCCCTATAAAAGT 16S radn Asiaticus Coletta et al., As180R GGTTAAGTCCCGCAACGA As111T ACATCTAGGTAAAAACC LJ900f GCCGTTTTAACACAAAAGATGAATATC hyvi / hyvii Asiaticus/Americanus Morgan et al., LJ900r ATAAATCAATTTGTTCTAGTTTACGAC LJ900p ACATCTTTCGTTTGAGTAGCTAGATCATTGA El ensayo de qpcr que comúnmente se utiliza para la detección de HLB emplea los iniciadores y sonda desarrollados por Li et al., (2006) (anexo 4). Sin embargo, es importante disponer de otros ensayos tanto de PCR convencional como de PCR tiempo real, y evaluar la sensibilidad de estos ensayos en las muestras que el laboratorio comúnmente analiza.

18 Anexos Anexo 1. Aspirador Manual para la colecta de Psílidos La colecta de psílidos puede realizarse con ayuda de un aspirador manual que es sencillo de fabricar. Hay dos tipos comunes de aspiradores para colectar insectos (figura 1). Uno de éstos consiste de un frasco pequeño y un tapón de corcho o goma en la parte superior. El tapón tiene dos perforaciones, una para el tubo para aspirar y la otra para el tubo por donde los insectos serán aspirados. El otro sistema es similar pero un poco más simple. Consiste en un cilindro o tubo grueso de cristal o plástico, abierto de manos extremos con un tapón de corcho o goma en cada abertura. Ambos tapones están perforados en el centro. En un extremo está el tubo aspirador y en el otro extremo el tubo recogedor por el que pasaran los insectos al aspirar 12. En ambos sistemas el tubo aspirador, tiene una malla o red delgada, en el extremo dentro del frasco, para que al momento de aspirar el insecto caiga dentro del recipiente e impedirá que los insectos pasen a la boca. Se puede fabricar con materiales simples, se requieren botes o frascos de 50 ml, dos tubos flexibles, malla o red delgada. Se hacen dos perforaciones en la tapa del bote, conviene dejar suficiente separación entre ellos para evitar que la tapa se agriete. En uno de los tubos, deberá pegar la malla. Después se inserte los tubos en los orificios de la tapa y selle perfectamente, para que no haya fugas de aire. El funcionamiento es simple, por uno de los tubos (que se recomienda sea más grueso que el tubo al que se adicionó la malla) se aspira con la boca mientras que con el extremo del otro, se acerca y apunta al insecto que queremos capturar, éste será absorbido con facilidad y con un poco de práctica, graduando la distancia y la presión con la que aspiramos, no ha absorberse demasiada tierra o polvo. 12 Medina G. S Manual de procedimientos para colectar, preservar y montar insectos y otros artrópodos. Universidad de Puerto Rico.

19 Anexo 2. FORMATO DE SOLICITUD DE DIAGNÓSTICO DATOS DE LA(S) MUESTRA(S) TOTAL MUESTRAS DE PSILIDOS: 4 TOTAL DE MUESTRAS VEGETALES: 2 NUMERACIÓN O CLAVE ASIGNADA: 3-6 NUMERACIÓN O CLAVE ASIGNADA: 1-2 PROCEDENCIA: FECHA DE ENVIO: FECHA DE RECEPCION: INTERESADO O TÉCNICO QUE ENVÍA NOMBRE: DIRECCION: TELEFONO Clave o FOLIO Muestra ESTADO/ PROVINCIA CIUDAD/ LOCALIDAD PLANTACION ESPECIE EDAD DE LA PLANTACIÓN SINTOMAS OBSERVADOS VEGETAL PSILIDOS PRODUCTOR LATITUD/ LONGITUD 1 comercial Naranja 5 Moteado x 2 traspatio Limón Persa 6 Sin síntomas x 3 x 4 x 5 x 6 x

20 Extracción de ADN de Psilidos. Anexo 3. Procedimiento de Extracción de ADN Método de extracción empleando Kit Qiagen DNeasy para Sangre y Tejido (Qiagen #69504 ) 1. Precalentar el baño seco a 56 C para usarse posteriormente. 2. Agregar 360 μl de PBS 1X ph 7.2, (Fosfato de Potasio 50mM, NaCl 150 mm). 3. Transferir los psilidos a un tubo de 1.5 ml (máximo 50 psilidos). 4. Cerrar perfectamente el tubo y homogenizar las muestras usando un disruptor de tejidos. 13 Transferir 180 μl de sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 ml, debidamente etiquetado. Se recomienda usar puntas con filtro. 5. Agregue 20 μl de proteinasa K a cada tubo. Agregar 200 μl del amortiguador AL (sin etanol extra) a cada tubo. 6. Agitar por 5-10 segundos con vortex. Centrifugar brevemente de segundos. 7. Incubar a 56 C durante 10 minutos. Retirar las muestras de la incubadora. 8. Agregar 200 μl de Etanol (96-100%) a cada tubo, agitar 5-10 segundos en vortex. 9. Transferir la mezcla, incluyendo cualquier precipitado que se forme, a la columna DNeasy Mini colocada en un tubo de recolección de 2ml. Etiquetar las columnas con las claves respectivas. 10. Centrifugar a 8,000 rpm durante 1 min. Conservar la columna y desechar el precipitado. 11. Colocar la columna en un tubo nuevo de recolección y agregar 500 μl de amortiguador AW Centrifugar durante 1 min. a 8,000 rpm. Conservar la columna DNeasy y desechar el precipitado. 13. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección y agregar 500 μl de amortiguador AW Centrifugar durante 1 min. a 13,000 rpm. Conservar la columna y desechar el precipitado. 15. Centrifugar 2 min. 13,000 rpm para remover completamente el exceso de amortiguador de lavado. Desechar el precipitado y el tubo de recolección. 16. Retirar cuidadosamente la columna para evitar que ésta entre en contacto con el precipitado y colocar la columna en un nuevo tubo etiquetado de 1.5 ml. Agregar μl de amortiguador AE directamente en la membrana del DNeasy. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. 17. Centrifugar durante 1 minuto a > 8,000 rpm para recolectar la elusión de ADN. 18. Repetir la elusión, usando el mismo tubo de recolección que contiene μl de la primera elusión. 19. Almacenar el ADN en hielo y/o a 4 C para su uso inmediato en PCR-RT o almacenar a -20 C para su uso posterior. 13 Existen varios modelos de disruptores, como el Mini-BeadBeater de Biospec Products, MagNa Lyser de Roche. Si no cuenta con un disruptor, puede macerar la muestra de psilidos con morteros pequeños, pero debe trabajar con sumo cuidado para evitar contaminación cruzada. La ventaja del disruptor de tejido es, además del ahorro de tiempo, que se minimizan los riesgos de contaminación, ya que cada muestra permanece en el tubo cerrado.

21 Método de extracción empleando Kit Axygen para sangre y tejido (AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit) 1. Precalentar el Buffer TE a 65 C para usarse posteriormente. 2. Transferir los psilidos en un tubo de 1.5 ml estéril, agregar 350 de PBS 1X ph 7.2, (fosfato de potasio 50mM, NaCl 150 mm), 500 ul de la solución AP1 y 100ul de la solución AP2. Macerar los psilidos en un disruptor de tejidos. 3. Centrifugar 8 min a rpm. 4. Preparar la columna y etiquetar tubos de recolección. 5. Pasar el sobrenadante a la columna (alrededor de 700 ul) 6. Centrifugar 1 min a 8000 rpm. Desechar el sobrenadante. 7. Agregar 700 ul de la solución AW1. Centrifugar 1 min a 8000 rpm. Desechar el sobrenadante. 8. Agregar 700 ul de la solución AW2. Centrifugar 1 min a 8000 rpm. Desechar el sobrenadante. 9. Agregar 300 ul de la solución Aw2. Centrifugar 2 min a rpm. Retirar cuidadosamente la columna para evitar que ésta entre en contacto con el precipitado. Pasarla a un tubo nuevo etiquetado. 10. Agregar 35 ul de TE precalentado a 65ºC, incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugar 1 min a 8000 rpm. 11. Repetir el paso Desechar la columna y almacenar el ADN en hielo y/o a 4 C para su uso inmediato en PCR o bien almacenar a -20 C para su uso posterior.

22 Extracción de ADN total de muestras vegetales Extracción de ADN empleando Mini Kit para Plantas Qiagen DNeasy * Qiagen DNeasy # Desprender las nervaduras centrales y peciolos de las hojas con síntomas o sospechosas, cortarlos en pedacitos, pesar 200 mg de tejido y colocarlo dentro de un tubo de 1.5 ml etiquetado. Utilice una navaja por cada muestra a fin de evitar contaminación entre las muestras. 2. Precalentar la solución AE a 65 C que será utilizado posteriormente. 3. Agregar 800 μl de solución AP1 a cada tubo. Homogenizar el tejido de la planta en disruptor de tejidos. Si no cuenta con un disruptor de tejidos, colocar el tejido en mortero, congelar a -70 C y maceré o bien emplee nitrógeno líquido para congelar y macerar. Pasar el tejido macerado a un tubo de 1.5 ml que contenga la solución de extracción AP1. 4. Incubar el tejido macerado a 65 C durante 10 minutos. 5. Centrifugar la muestra durante 10 segundos 10,000 rpm para retirar el tejido de la capa superior. 6. Agregar 260 μl de la solución amortiguadora AP2 al lisado, agitar brevemente e incubar en hielo por 5 minutos. 7. Centrifugar a 14,000 rpm durante 10 minutos. Transferir el lisado a una columna mini spin de DNeasy QIAshredder (columna de color lila) y centrifugar durante 2 minutos a 14,000 rpm. 8. Agregar a un tubo de 1.5 ml etiquetado 700 μl de la solución amortiguadora AP3. 9. Transferir el sobrenadante al tubo que contiene la solución AP3 y mezclar por inversión. Centrifugar por unos segundos. 10. Transferir 700 μl de la mezcla, a la columna mini spin DNeasy (blanca). Centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto. Desechar el precipitado. 11. Repetir el Paso 11 con el resto de la mezcla. Desechar el precipitado. 12. Agregar 500 μl de la solución amortiguadora AW y centrifugar 8000 rpm durante 1 minuto. Desechar el precipitado. 13. Realizar un segundo lavado, agregar 300 μl de la solución AW a la columna y centrifugar durante 2 minutos a 14,000 rpm. Retirar cuidadosamente la columna para evitar que ésta entre en contacto con el precipitado. 14. Transferir la columna a un tubo nuevo de 1.5 ml y agregar 85 μl de la solución AE precalentada a 65 C sobre la membrana de la columna. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente, centrifugar durante 1 minuto a 8000 rpm para recolectar la elusión del ADN. 15. Repetir el paso El ADN genómico pueden almacenarse a 4 C sólo para un uso inmediato o a -20 C para utilizarse en el futuro.

23 Método de Extracción de DNA empleando el AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Cat. AP-MN-MS-GDNA-50) 1. Desprender las nervaduras centrales y peciolos de las hojas con síntomas o sospechosas, cortarlos en pedacitos, pesar 200 mg de tejido y colocarlo dentro de un tubo de 1.5 ml. 2. Adicione 550µl de PBS y 150ul de Buffer C-L. Homogenizar el tejido en un disruptor de tejidos. Alternativamente, colocar el tejido en mortero, congelar a -70 C y macerar o bien, emplee nitrógeno líquido para congelar y macerar. Pasar el tejido macerado a un tubo de 1.5 ml que contenga 550µl de PBS y 150ul de Buffer C-L y mezclar vigorosamente. 3. Adicione 20µl de Proteinasa K y dé vortex para mezclar 4. Centrifugue brevemente e incube 10 min a 56 C. Retire las muestras de la incubadora y centrifugue brevemente. 5. Adicione 350µl de buffer P-D y dé vortex a máxima velocidad durante 30 segundos. 6. Centrifugue a 13,300 rpm durante 10 minutus. 7. Coloque la columna miniprep en un tubo de 2 ml (incluido en el kit) y transfiera el sobrenadante del paso anterior a la columna. Centrifugue por 1 minuto a 13,300 rpm. 8. Deseche el eluido y adicione 500µl de buffer W1 a la columna. Centrifugue por 1 min a 13,300 rpm. 9. Deseche el eluido y adicione 700µl de buffer W2 a la columna. Centrifugue por 1 min a 13,300 rpm. Deseche el eluido y repita. 10. Deseche el eluido, regrese la columna al tubo de 2 ml y centrifugue 1 min a 13,300 rpm. 11. Transfiera la columna al tubo colector de 1.5ml (incluido en el kit) adicione 100µl del eluyente en el centro de la columna, incube a temperatura ambiente por unos minutos y centrifugue a 8000 rpm por 1 min. Repetir el paso. 12. Retire la columna y almacene el DNA a 4 C para uso próximo o a -20 C para uso a largo plazo.

24 ANEXO 4. PCR convencional y PCR en tiempo real para la detección de HLB Los iniciadores comúnmente utilizados en PCR convencional son los denominados OI1/OI2c/OA, y rpla2/rplj5 desarrollado por Jagoueix, et al., (1996) y Hocquellet et al., (1999) respectivamente. Los iniciadores OI1/OI2c/OA amplifican un fragmento de 1160 pares de bases (pb) de las variantes asiática y africana de Ca. Liberibacter. Para diferenciarlas, se requiere realizar la digestión del producto de amplificación con la enzima Xba I. El patrón de restricción para la variante africana es de tres fragmentos (520 pb, 506 pb y 130 pb) y para la variante asiática se obtienen dos fragmentos (640 pb y 520 pb). El par de iniciadores rpla2/rplj5 permiten distinguir ambas variantes, ya que amplifican un fragmento de 703 pb para Ca. L. asiaticus y 669 pb para Ca. L. africanus. Iniciador Secuencia Fragmento Fuente/autor OI1 GCG CGT ATG CAA TAC GAC CGG CA 1,160 LAS/LAF Jagoueix, et al., (1996) OI2c GCC TCG CGA CTT CGC AAC CCA T rpla2 TAT AAA GGT TGA CCT TTG GAG TTT 703 para LAS Hocquellet et al., (1999) rplj5 ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A 699 para LAF GB1 AAG TCG ACG GAG TAC GCA AGT ACT 1, 027 Teixeira et al., 2005 GB3 CTA TAT TTG CCA TCA TTA AGT TGG LAM El ensayo de PCR tiempo real o qpcr que comúnmente se utiliza para la detección de HLB emplea los iniciadores y sonda desarrollados por Li et al., (2006). Para muestras de plantas, este ensayo utiliza un par de iniciadores y sonda, basado en la enzima citocromo-oxidasa (COX) como control interno positivo. Para muestras de Psílidos, también se emplea una sonda y primers específicos basados en genes de la glicoproteína (WG). Las metodologías empleadas se basan en el protocolo de diagnóstico desarrollado y validado por USDA-APHIS (USDA et al., 2012b). PRIMERS Y SONDAS PARA MUESTRAS DE PLANTAS Nombre del primer Secuencia 5-3 Gen objetivo Primer HLB as TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG Genes 16s de rrna Las Primer HBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG Sonda HLBp FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/BHQ 1 Primer HLB am GAG CGA GTA CGC AAG TAC TAG Genes 16s de rrna Lam Primer HLBr GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG Sonda HLBp FAM/AGA CGG GTG AGT AAC GCG/BHQ 1 Primer COX GTA TGC CAC GTC GCA TTC CAG A COX COX Primer COXr GCC AAA ACT GCT AAG GGC ATT C Sonda COX TET/ATC CAG ATG CTT ACG CTG G/BHQ 2 1. Las mezclas de primers HLBas y HLBam comparten un primer común, HLBr. 2. COX se refiere al gen citocromo oxidasa de las plantas. Especifico para