Identificación molecular de especies de los géneros Ehrlichia y Anaplasma en perros de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, México

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1 Identificación molecular de especies de los géneros Ehrlichia y Anaplasma en perros de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, México Zaida Murrieta Zamora, Luis Tinoco Gracia, Sawako Hori, Gilberto López Valencia, Alma Rossana Tamayo Sosa, Alberto Barreras Serrano RESUMEN Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias Universidad Autónoma de Baja California, México Las erliquiosis y anaplasmosis caninas son enfermedades transmitidas por garrapatas, de las cuales, la erliquiosis monocítica canina producida por E. canis tiene distribución mundial y tiene una alta prevalencia en perros. Actualmente existen reportes en México donde se han identificado especies de Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum, las cuales han infectado humanos con mortalidad variable. El estudio se llevó a cabo en la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, México, donde se realizó PCR anidado de 235 muestras de sangre de perros con propietario, amplificando el gen 16S rrna del género, para las especies E. canis, A. phagocytophilum y A. platys. Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Salud Pública Veterinaria de la UABC en Mexicali, B.C. Los productos fueron amplificados en gel de agarosa al 1.5% por electroforesis y se han enviado a secuenciar, identificándose las especies E. canis (8%), A. platys (7.2%) y A. phagocytophilum (0.8%). Además se encontraron cuatro coinfecciones con E. canis y A. platys (10.7%), una con E. canis y A. phagocytophilum y otra con A. platys y A. phagocytophilum (3.5%) para cada una). Estos resultados confirman la presencia por identificación molecular de estas especies en perros de la ciudad, así como al ser el primer estudio en el Estado de Sonora. INTRODUCCIÓN Las enfermedades transmitidas por garrapatas representan un problema creciente de importancia en salud pública. Patógenos riquetsiales que producen erliquiosis y anaplasmosis son transmitidos por la mordedura de la garrapata R. sanguineus, Ixodes y Amblyomma americanum, y causantes de enfermedades febriles agudas en perros y humanos (Dema, Holman et al. 2005), además de ser consideradas enfermedades infecciosas emergentes en Norteamérica y en todo el mundo (Qurollo et al 2014). Son bacterias pleomórficas intracelulares obligadas del orden Rickettsiales, Familia: Anaplasmataceae, y tienen tropismo hacia células hematopoyéticas, dentro de las cuales, tienen preferencia por células huésped que infecten: monocitos, granulocitos o plaquetas y el curso de la enfermedad se divide en tres fases: aguda, subclínica y crónica (Neer and Harrus 2006).

2 Ehrlichia canis es causante de la erliquiosis monocítica canina (EMC) y humana, Anaplasma platys de la trombocitopenia cíclica canina y A. phagocytophilum causante de la anaplasmosis granulocítica canina y humana, además de haber reportes de coinfecciones entre ellas y otras especies, siendo el impacto clínico de dicha coinfección en la patofisología de la enfermedad en perros, a el deterioro del paciente por inducir una enfermedad más severa (Gaunt et al., 2010). En la República Mexicana se encontró una seroprevalencia de la infección para E. canis de 33.1%, y para Sonora un 61.5%, donde se utilizó ELISA SNAP3Dx (Nuñez-Ochoa, 2003) siendo éste el único estudio en el Estado. En 2016, Movilla et al, realizaron otro estudio de seroprevalencia por el SNAP 4DX - IDEXX Laboratories en el cual, la prevalencia para E. canis fue de 51% y para Anaplasma spp. de 16.4% obtenido de la región del noroeste del país. En otros Estados del noroeste de México como Sinaloa, la seroprevalencia fue de 71.3% (Sosa et al 2013) y en Yucatán de 44,1% (Rodriguez-Vivas et al., 2005). En la ciudad de Mexicali, Baja california, se han realizado diversos estudios donde se obtuvo una seroprevalencia para E. canis de 21.6% (Haro-Alvarez et al., 2007) y de 49.3% por Tinoco et al 2007, además identificándose la garrapata Rhipicephalus sanguineus en 59.6% de la población canina (Tinoco et al 2009). Considerando la importancia zoonótica de estas enfermedades y debido a que no se han hecho estudios anteriormente en San Luis Río Colorado, Sonora; además de encontrarse el vector R. sanguineus, así como las condiciones medio ambientales favorables para la enfermedad, se plantea la necesidad de obtener información para la identificación de éstas especies. Por lo que el objetivo de este trabajo es la identificación molecular de las especies E. canis, A phagocytophilum y A. platys en perros con propietario de la zona urbana y determinar coinfecciones en perros de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, METODOLOGÍA Se incluyó a 235 perros con propietario de la zona urbana del municipio de San Luis Río Colorado, Sonora, México. Las muestras de sangre se obtuvieron y analizaron del banco de sangre del laboratorio de Salud Pública Veterinaria del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California. Las muestras fueron del periodo del 15 de junio 2014 al 15 de junio del 2015 de un trabajo previo para riquetsiosis. Como criterios de inclusión, se incluyeron en el estudio los perros de al menos un mes de edad, de cualquier sexo, pelaje o raza. La presencia de especies de los géneros Ehrlichia y Anaplasma (EA) en perros fue estimada a partir de los resultados obtenidos mediante PCR analizando las

3 muestras sanguíneas con EDTA, amplificando el gen 16S rrna del género, usando los siguientes iniciadores: Para los géneros Ehrlichia y Anaplasma: EHR16SD (5 -GGTACCYACAGAAGAAGT CC) y EHR16SR (5 -TAGCACTCATCGTTTACAGC) 345 pb (Fernandes-Ferreira et al., 2007). Para E. canis: ECC (AGAACGAACGCTGGCGGCAAGC) y ECB (CGTA TTAC CGCGGCTGCTGGCA) 478 pb ECAN5 (5 -CAATTATTTATAGCCTCTGGC TATAGGA) y HE3 (5 -TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT) 401 pb (Kocan et al., 2000, Murphy et al., 1998, Kim et al., 2006, Wen et al., 1997, Breitschwerdt et al., 1998). Para A. platys: ECC (AGAACGAACGCTGGCGGCAAGC), ECB (CGTATTAC CGCGG CTG CTGGCA) 478 pb. EPLAT5 (5 -TTTGTCGTAGCTTGCTATGAT) y EPLAT3 (5 - CTTCTGTGGGTACCGTC) 359 pb (Kim et al., 2006, Mathew et al., 1997). Para A. phagocytophilum EE-1 (5 -TCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGC GGC) y EE-2 (5 - AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG) 1,435pb EE-3 (5 -GTCGAACGGATTATT CTTTATAGCTTGC) EE-4 (5 -CCCTTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC) 928 pb. (Barlough et al., 1996, Kim et al., 2006, Madigan et al., 1995, Yang et al., 2013). Los productos de amplificación de PCR fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5% en solución amortiguadora TAE 1X (Tris acetato, EDTA), conteniendo SafeView Classic, de Applied Biological Materials Inc. Para prevenir la contaminación de las muestras, las preparaciones, la extracción del ADN, la amplificación y detección de productos de PCR se realizaron en diferentes áreas de laboratorio (Chang et al., 2000). Los protocolos en el termociclador para cada par de iniciadores se realizaron de acuerdo a los autores citados. RESULTADOS De las 235 muestras de sangre de perros analizadas, 33 (14%) fueron positivas para los géneros EA, de las cuales 19 (8%) fueron positivas para la infección por E. canis, 18 (7.6%) para A. platys y 2 (0.8%) para A. phagocytophilum. De las 33 muestras que resultaron positivas a los géneros EA se encontraron 4 coinfecciones con E. canis y A. platys (12.1%), una para E. canis y A. phagocytophilum, y otra para A. platys y A. phagocytophilum (3% para ambas). Algunas muestras positivas para las diferentes especies se enviaron a secuenciar al laboratorio Eurofins MWG Operon y al Laboratorio de Ecología y Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Davis, California; y fueron analizadas con el programa BLAST de National Center for Biotechnology Information (NCBI). Ocho muestras fueron analizadas para E. canis, 2 para A. platys y 1 para A. phagocytophilum, dando una similitud entre 97-99%. DISCUSIÓN Este trabajo representa el primer estudio mediante PCR para la identificación de las especies E. canis, A. platys y A. phagocytophilum en muestras sanguíneas de perros del Estado de Sonora. Actualmente, la prevalencia de E. canis por PCR en el Estado de Coahuila y Durango fue 4% en una población de 100 perros sanos infestados con

4 garrapatas (Almazán et al., 2015), la cual es similar a la obtenida en este estudio de 8%. En Costa Rica se encontró una seroprevalencia para E. canis de 32.1% en perros, de los cuales mediante PCR, se encontró solo 3.2% con la bacteria, donde atribuyeron la discrepancia de resultados entre estas técnicas, es que pudiera estar relacionado al estado de infección del perro (Barrantes-González 2016). También en Buenos Aires, Argentina, los resultados fueron similares, de 223 perros, el 6,7% (15/30) fue positivo para E. canis y el 7.2% (16/30) para A. platys (Cicuttin 2016). En Uruguay, 4/191 (4.2%) fue positivo para A. platys, ninguno para E. canis (Carvalho 2017). En Yucatán, México estimaron un 36% por PCR anidado para E.canis en perros, sin embargo este porcentaje se encontró solo en perros de control animal, ya que los perros de casa muestreados no presentaron la infección por lo que en éstos perros se elevó hasta el 45% (Path-Na Henry et al 2015). En este estudio, probablemente, al ser perros con propietario de la zona urbana de San Luis, el porcentaje de infección fue menor, ya que los perros al andar en zonas suburbanas pudieran infestarse de garrapatas más frecuentemente y contraer la enfermedad. Este estudio difiere de las altas prevalencia encontradas en Sudamérica donde hay reportes de hasta 69% en Brasil (Tanikawa et al 2013), 54% en Colombia (Rojas et al 2013), 47% en Costa Rica (Romero et al 2011). En contraste con Estados Unidos, en el área surcentral, la prevalencia para la infección por E. canis es 0.9 %, A. platys de 2.3% y 0% para A. phagocytophilum, siendo E. ewingii el agente más identificado, sin embargo la garrapata Amblyomma americanum en esa zona es abundante (Little et al 2010). En otro reporte en Estados Unidos, Canadá y el Caribe, utilizando el SNAP Multi-Analyte Assay (SNAP M-A) (IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook, Maine, USA), en 6582 sueros de perros entre y 2012, la seroprevalencia en Estados Unidos fue de 1.8% de infección para E. canis, 1.5% para A. platys, 3.4% A. phagocytophilum, siendo E. ewingii el agente más identificado con 3.6%; para Canadá, 3.2% E. canis y 1.8% A. platys, para el Caribe 27.6% y 10.3% respectivamente (Qurollo 2014). Es importante tener en cuenta que las infecciones subclínicas y crónicas no se diagnostican tan fácilmente como infecciones agudas cuando se utiliza la sangre canina para la detección de E. canis. Por lo tanto, idealmente, para realizar PCR se debe considerar utilizar la sangre y los aspirados esplénicos para superar esta limitación (Harrus 2004). Respecto a las coinfecciones, en este estudio, se encontró 18.1% (6/33) de dos patógenos; para un agente 12.2% (4/33), siendo E. canis y A. platys el más común, seguido de E. canis y A. phagocytophilum con 3.5% (1/33); así como A. platys y A. phagocytophilum 3.5% (1/33). No se encontraron coinfecciones con tres agentes. Este porcentaje es similar con el estudio realizado en Estados Unidos donde se reporta 15.4% de coinfección y 13,3% para un agente (Little et al 2010). En el reporte con péptidos específicos (Qurollo et al, 2014) las coinfecciones fueron de 4%, dos patógenos 3.1%, tres patógenos 0.7%, cuatro patógenos 0.1% y cinco patógenos 0.05%. De los cuales, la coinfección más común fue E. ewingii con E. chaffeensis 1.4% y la más baja E. canis y A. platys 0.3%.

5 CONCLUSIONES Se identificaron molecularmente las especies Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum en perros con propietario de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora. Se considera un porcentaje bajo para E. canis ya que es una zona con el clima y condiciones favorables para la bacteria, sin embargo se debe tener en cuenta que algunos perros pueden ser portadores subclínicos y otros con enfermedad crónica y aunque en estudios de laboratorio pudieran ser consistentes con erliquioisis, es necesario complementarlo con otras técnicas diagnósticas. Así mismo es importante considerar un sobre diagnóstico o diagnóstico erróneo de la enfermedad. Aunque no se encontraron prevalencias tan altas como en otras regiones, es importante tomar las medidas preventivas en las mascotas para que en un futuro dichas enfermedades puedan dispersarse en la población canina además de considerar el riesgo zoonótico que implican. También se identificaron coinfecciones entre estas especies por lo que el Médico Veterinario debe considerarlas en aquellos pacientes que pudieran presentar signología más severa o persistente. Se debe tener en cuenta que un diagnóstico fiable debe ser basado en signología clínica, estudios de laboratorio, pruebas serológicas y métodos de detección molecular en los pacientes y no confiarse por un solo método. BIBLIOGRAFÍA ALMAZÁN, C., GONZÁLEZ-ÁLVAREZ, V. H., FERNÁNDEZ DE MERA, I. G., CABEZAS-CRUZ, A., RODRÍGUEZ- MARTÍNEZ, R. & DE LA FUENTE, J Molecular identification and characterization of Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs in Mexico. Ticks and Tick-borne Diseases. BARLOUGH, J. E., MADIGAN, J. E., DEROCK, E. & BIGORNIA, L Nested polymerase chain reaction for detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks (Ixodes pacificus). Vet Parasitol, 63, BREITSCHWERDT, E. B., HEGARTY, B. C. & HANCOCK, S. I Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J Clin Microbiol, 36, CHANG, Y. F., NOVOSOL, V., MCDONOUGH, S. P., CHANG, C. F., JACOBSON, R. H., DIVERS, T., QUIMBY, F. W., SHIN, S. & LEIN, D. H Experimental Infection of Ponies with Borrelia burgdorferi by Exposure to Ixodid Ticks. Vet Pathol, 37, FERNANDES-FERREIRA, R., FIGUEIREDO-CERQUEIRA, A., MÜLLER- PEREIRA, A., MATHEUS-GUIMARÃES, C., GARCIA DE SÁ, A., DA SILVA ABREU, F., LUIZ MASSARD, C. & PEREIRA ALMOSNY, N. R Anaplasma platys Diagnosis in Dogs: Comparison Between Morphological and Molecular Tests. Intern J Appl Res Vet Med, 5, GAUNT, S., BEALL, M., STILLMAN, B., LORENTZEN, L., DINIZ, P., CHANDRASHEKAR, R. & BREITSCHWERDT, E Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findings. Parasit Vectors, 3, 33. HARO-ALVAREZ, P., LÓPEZ-VALENCIA, G., TINOCO-GRACIA, L., RENTERÍA-EVANGELISTA, T. & MEDINA- BASULTO, G Seroprevalence and Traceback of Animals Suspected of Carrying Ehrlichia

6 canis, in Dogs Attended in Veterinary Clinics in Mexicali, Baja California, Mexico Journal of Animal and Veterinary Advances., 6, KIM, C. M., YI, Y. H., YU, D. H., LEE, M. J., CHO, M. R., DESAI, A. R., SHRINGI, S., KLEIN, T. A., KIM, H. C., SONG, J. W., BAEK, L. J., CHONG, S. T., O'GUINN M, L., LEE, J. S., LEE, I. Y., PARK, J. H., FOLEY, J. & CHAE, J. S Tick-borne rickettsial pathogens in ticks and small mammals in Korea. Applied and environmental microbiology, 72, KOCAN, A. A., LEVESQUE, G. C., WHITWORTH, L. C., MURPHY, G. L., EWING, S. A. & BARKER, R. W Naturally occurring Ehrlichia chaffeensis infection in coyotes from Oklahoma. Emerging infectious diseases, 6, MADIGAN, J. E., RICHTER, P. J., JR., KIMSEY, R. B., BARLOUGH, J. E., BAKKEN, J. S. & DUMLER, J. S Transmission and passage in horses of the agent of human granulocytic ehrlichiosis. The Journal of infectious diseases, 172, MATHEW, J. S., EWING, S. A., MURPHY, G. L., KOCAN, K. M., CORSTVET, R. E. & FOX, J. C Characterization of a new isolate of Ehrlichia platys (Order Rickettsiales) using electron microscopy and polymerase chain reaction. Vet Parasitol, 68, MURPHY, G. L., EWING, S. A., WHITWORTH, L. C., FOX, J. C. & KOCAN, A. A A molecular and serologic survey of Ehrlichia canis, E. chaffeensis, and E. ewingii in dogs and ticks from Oklahoma. Veterinary parasitology, 79, NUÑEZ-OCHOA, L Esudio de la seroprevalencia de Ehrlichia canis en México. AMMVEPE, 14, RODRIGUEZ-VIVAS, R., ALBORNOZ, R. & BOLIO, G Ehrlichia canis in dogs in Yucatan, Mexico: seroprevalence, prevalence of infection and associated factors. Vet Parasitol, 127, WEN, B., RIKIHISA, Y., MOTT, J. M., GREENE, R., KIM, H. Y., ZHI, N., COUTO, G. C., UNVER, A. & BARTSCH, R Comparison of nested PCR with immunofluorescent-antibody assay for detection of Ehrlichia canis infection in dogs treated with doxycycline. J Clin Microbiol, 35, YANG, J., LIU, Z., GUAN, G., LIU, Q., LI, Y., CHEN, Z., MA, M., LIU, A., REN, Q., LUO, J. & YIN, H Prevalence of Anaplasma phagocytophilum in ruminants, rodents and ticks in Gansu, northwestern China. J. Med. Microbiol., 62,