CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES

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1 Células embrionarias pluripotentes CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología Centro Nacional de Biotecnología, CSIC-Pfizer BIOTECNOLOGÍA APLICADA INTRODUCCIÓN El cuerpo humano se compone de una gran variedad de células especializadas en diferentes funciones. Esta especialización determina una divergencia extrema en la apariencia externa y capacidad funcional de cada una de las clases de células que componen un organismo. Por ejemplo, una célula ósea difiere extraordinariamente en su apariencia externa de una neurona y no podría realizar sus funciones especializadas. La composición y diversidad celular de nuestro cuerpo, salvo excepciones, está presente en el momento de nacer y nos acompaña hasta la muerte. Sin embargo, a pesar de su gran heterogeneidad, todas nuestras células descienden de única célula embrionaria: el zigoto. Durante el desarrollo embrionario ocurren dos importantes procesos que conducen a la composición final del recién nacido; por un lado el zigoto se multiplica por división, generando el número de células necesarias para la construcción del organismo, y en paralelo, distintos linajes celulares se diferencian en poblaciones celulares que adoptan las características propias de su identidad. Una vez diferenciadas, las células disponen de un periodo de vida limitado y deben ser reemplazadas por otras nuevas para mantener la función de los tejidos y órganos del individuo. En el embrión temprano existe una po- 57

2 6º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA Células embrionarias pluripotentes blación de células, las células troncales embrionarias, capaz de diferenciarse en cualquier tipo celular del organismo, y por lo tanto, capaz de aportar todos los tipos celulares necesarios para la construcción de los distintos tejidos y órganos. En el individuo ya desarrollado, son las células troncales adultas las que heredan esta capacidad y aportan a cada tejido u órgano un flujo constante de nuevas células, que sustituyen a las envejecidas o dañadas por enfermedad o accidente, regenerando órganos y tejidos. Sin embargo, la capacidad de regeneración es muy variable según el tejido; desde casi nula en el caso del Sistema Nervioso Central, o muy reducida en el caso del páncreas, hasta muy activa en el caso de la piel, el sistema hematopoyético o el hígado. Esta circunstancia determina que la pérdida o deterioro de una población celular concreta durante la vida adulta sea, en muchos casos, insustituible de manera espontánea. La carencia de las funciones realizadas por las células dañadas provoca el sufrimiento de enfermedades crónicas como la diabetes, el Parkinson, la esclerosis múltiple, etc. ó la pérdida de determinadas funciones, como las parálisis sufridas tras una lesión de médula. Una de las soluciones para resolver este tipo de enfermedades sería la disponibilidad de células embrionarias totipotentes, capaces de especializarse en las funciones perdidas durante la vida adulta. Sin embargo, las células troncales embrionarias se encuentran de manera natural en el embrión en estadio de blastocisto, en número muy limitado y en una ventana de tiempo muy restringida. Por esta razón, la posibilidad de usarlas depende de la capacidad de aislar y multiplicar las células troncales embrionarias de manera controlada en el laboratorio. LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS: OBTENCIÓN, CARACTERÍSTICAS Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS EXPERIMENTALES 58 El aislamiento y cultivo de células troncales embrionarias se consiguió por primera vez a partir de blastocistos de ratón en el año 1981 (Figura 1), conociéndose universalmente como células ES (según la denominación inglesa "Embryonic Stem") (1,2). Las células aisladas mostraron características excepcionales; por un lado, se multiplican indefinidamente en cultivos in vitro, y a la vez, si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lu-

3 Células embrionarias pluripotentes gar a las distintas células especializadas del organismo. Las conclusiones derivadas del cultivo y uso de las células ES en el ratón son contundentes. Células ES mantenidas en cultivo por periodos prolongados son capaces de mezclarse con células de un embrión en desarrollo, contribuyendo células sanas y funcionales a todos los tejidos de un animal adulto (Figura 2). A pesar de haber acumulado un número indefinido de divisiones in vitro, las células ES no parecen "envejecer", ya que los animales generados a partir de estas células no presentas síntomas de envejecimiento prematuro. Estas características se relacionan con una alta actividad telomerasa y con la expresión de otros marcadores relacionados con el mantenimiento del estado indiferenciado y proliferante. En 1998 se consiguió por primera vez obtener y propagar in vitro líneas de células pluripotentes aisladas de blastocistos y de Figura 1: Establecimiento de líneas de células troncales embrionarias. Figura 2: Contribución de las células ES a la formación de quimeras de ratón con colonización de la línea germinal. BIOTECNOLOGÍA APLICADA 59

4 6º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA Células embrionarias pluripotentes gónadas fetales humanas (3, 4). Al igual que sus homólogas de ratón, las células pluripotentes embrionarias humanas se multiplican indefinidamente en cultivos artificiales, pero si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lugar a las distintas células especializadas del organismo. Los cultivos de células ES humanas representan por lo tanto una fuente ilimitada de células jóvenes capaces de contribuir a cualquier tejido del organismo adulto (5, 6). En modelos experimentales animales se han producido ya varios ejemplos del potencial terapéutico de las células ES. Se ha descrito, por ejemplo, la diferenciación de células ES de ratón hacia músculo cardíaco y su implantación con éxito en el corazón de un animal adulto (7). En estudios similares, se han observado mejorías de lesiones medulares y enfermedades neurodegenerativas trasplantando, respectivamente, poblaciones de neuroblastos o gliales diferenciadas in vitro a partir de células ES de ratón (8, 9). También se han conseguido derivar células beta-pancreáticas funcionales a partir de células ES, mediante un proceso de diferenciación y purificación. La posterior implantación de estas células en modelos experimentales de diabetes ha eliminado los síntomas de la enfermedad, demostrando la eficacia de la aproximación (10). LIMITACIONES PRESENTES EN LA APLICACIÓN DE LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS EN TERAPIA HUMANA 60 Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qué enfermedades se beneficiarán de la nueva técnica y cuándo será posible su aplicación. En primer lugar, las células ES de ratón forman teratocarcinomas al ser implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema desaparece si se implantan después de su diferenciación total ó parcial in vitro, por lo que cualquier protocolo de transferencia de células ES deberá incluir un paso previo de diferenciación in vitro. Un segundo problema para la aplicación terapéutica de las células ES reside en la dificultad de obtener células diferenciadas a un linaje celular puro. Cuando se estimula su diferenciación, las células ES son capaces de originar cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homogénea, sino que

5 Células embrionarias pluripotentes dan lugar a poblaciones de células en las que se mezclan distintos tipos especializados. Idealmente deberíamos ser capaces de controlar las vías elegidas por las células ES cuando se diferencian (6, 11). Gracias a experimentos en células en cultivo y a modelos animales como el ratón, hoy conocemos genes de diferenciación que controlan estas vías. Por ejemplo, existen genes miogénicos que determinan la diferenciación hacia músculo, neurogénicos que inducen la diferenciación hacia neuronas, genes que determinan los distintos tipos celulares pancreáticos, otros implicados en determinar los diferentes tipos celulares de la hipófisis y un largo etcétera. La activación controlada de genes de diferenciación en las células ES podría producir el tipo celular deseado para cada aplicación. Un ejemplo práctico de esta aplicación es la estimulación de la producción in vitro de células troncales hematopoyéticas a partir de células ES de ratón por la sobreexpresión del factor de transcripción HoxB4 (12). Alternativamente, se pueden exponer los cultivos a factores difusibles capaces de instruir a las células sobre la vía de diferenciación a seguir. Muchos de estos factores de crecimiento tienen ya aplicaciones terapéuticas y su utilización sería fácil y directa. Algunas de estas aproximaciones se han aplicado ya con éxito para dirigir la diferenciación de células ES a determinados linajes in vitro (11). El tercer problema sería que las células implantadas podrían sufrir el mismo tipo de rechazo inmune que se produce en el trasplante de órganos. Antes de su utilización habría que establecer bancos de distintas líneas de celulares compatibles con el sistema inmune de cada uno de los posibles receptores, una tarea abordable con la tecnología disponible en este momento, pero sin duda laboriosa. Una posibilidad en este contexto sería utilizar técnicas de clonación por transferencia nuclear, mediante lo cual se pueden generar líneas de células troncales personalizadas a partir de células somáticas de cada individuo (13). Esta aproximación se ha demostrado viable en animales de experimentación y sería la solución definitiva al problema del rechazo. BIOTECNOLOGÍA APLICADA COMBINACIÓN DE TERAPIA CELULAR Y TERAPIA GÉNICA POR MUTAGÉNESIS DIRIGIDA: UNA VENTAJA TERAPÉUTICA DE LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS? En aquellos casos en que una población celular determinada esté dañada debido a un defecto genético congénito o adquirido, el autotransplan- 61

6 6º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA Células embrionarias pluripotentes 62 te, simple o por clonación, no sería eficaz. Por otro lado, el trasplante de células sanas ajenas plantearía los problemas de rechazo antes mencionados. De nuevo el modelo experimental de ratón ofrece una posible solución idónea a este problema. La tecnología de células ES en el ratón se ha explotado fundamentalmente como una vía para la producción de animales modificados genéticamente (14, 15). La repercusiones de esta aplicación han sido, y serán en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de modelos de ratón que reproducen patologías humanas, como el cáncer, la esclerosis múltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cómo los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el organismo. Gracias a esto, las técnicas de modificación dirigida del genoma del ratón se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustituciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etc. El potencial terapéutico de estas aproximaciones sería extraordinario en el caso de que se pudieran aplicar a la reparación del genoma en células ES humanas. La reparación genética mediante estas técnicas representaría la terapia génica idónea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de añadir material genético de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genéticas se han realizado extensivamente en células ES de ratón, pero se pueden realizar en cualquier línea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no se ha tenido éxito al intentar aplicarlas en células troncales humanas, ya sean adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas técnicas en células troncales, existiría un argumento añadido en favor de la utilización de la clonación terapéutica, ya que se podría realizar la corrección genética en una línea establecida de células somáticas y utilizar sus núcleos como donadores para obtener, primero blastocistos, y luego células troncales corregidas. En un experimento paradigmático, que supera todas las limitaciones previsibles a la aplicación terapéutica de las células ES (16), se han combinado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artículo para sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutación en el gen Rag-2. Mediante biopsia, se obtuvieron núcleos celulares de los ratones adultos inmunodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos genéticamente idénticos al ratón original. Posteriormente, de estos blastocistos se derivaron células ES y se corrigieron por modificación dirigida, reparando el defecto en el gen Rag-2. A con-

7 Células embrionarias pluripotentes tinuación, se utilizó una combinación de diferenciación espontánea, y dirigida por el gen selector HoxB4, para obtener in vitro células troncales hematopoyéticas reparadas. Finalmente, se trasplantaron las células obtenidas en los ratones deficientes en Rag-2, reconstituyendo establemente un sistema inmune completamente sano. BIOTECNOLOGÍA APLICADA CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS En resumen, la disponibilidad de células ES humanas representa un gran avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a su proceso de diferenciación. De manera inmediata, representan un modelo excelente para el estudio de los procesos de generación de diversidad celular en nuestro organismo y para la caracterización de fármacos que puedan dirigirlos. Los resultados de los ensayos terapéuticos realizados en animales modelo permiten pensar en la aplicación a corto/medio plazo de la tecnología de células troncales embrionarias en terapia humana. Una de las perspectivas más prometedoras en este campo es la combinación del uso de Células Troncales Embrionarias con la reparación genómica dirigida, lo que representaría la terapia génica ideal. En cualquier caso, propuesto para la Figura 3: Esquema aplicación de nuevas existen limitaciones técnicas a la aplicación terapéutica de las células troncales embrionarias, que impiden determinar con certeza qué estrategias en terapia celular. enfermedades se van a beneficiar de las nuevas terapias y en qué plazos. La combinación de la tecnología de células troncales embrionarias con la clonación terapéutica permitirá, al menos, eliminar los problemas de rechazo, y además, puede ser esencial para conseguir la reparación genómica dirigida (Figura 3). 63

8 6º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA Células embrionarias pluripotentes BIBLIOGRAFÍA Evans, M. J. & Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, (1981). 2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 78, (1982). 3. Shamblott, M. J. et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95, (1998). 4. Thomson, J. A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, (1998). 5. Jones, J. M. & Thomson, J. A. Human embryonic stem cell technology. Semin Reprod Med 18, (2000). 6. Odorico, J. S., Kaufman, D. S. & Thomson, J. A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells (2001). 7. Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y. & Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest 98, (1996). 8. McDonald, J. W. et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord. Nat Med 5, (1999). 9. Brustle, O. et al. Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants. Science 285, (1999). 10. Soria, B. et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49, (2000). 11. Wobus, A. M., Guan, K. & Pich, U. In vitro differentiation of embryonic stem cells and analysis of cellular phenotypes. Methods Mol Biol 158, (2001). 12. Kyba, M., Perlingeiro, R. C. & Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoidmyeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell 109, (2002). 13. Colman, A. & Kind, A. Therapeutic cloning: concepts and practicalities. Trends Biotechnol 18, (2000). 14. Bedell, M. A., Jenkins, N. A. & Copeland, N. G. Mouse models of human disease. Part I: Techniques and resources for genetic analysis in mice. Genes Dev 11, 1-10 (1997). 15. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends Genet 5, (1989). 16. srideout, W. M., 3rd, Hochedlinger, K., Kyba, M., Daley, G. Q. & Jaenisch, R. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. 109, (2002).