Nuevos desarrollos tecnológicos para el Screening por LCMS
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- Daniel Ferreyra Barbero
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1 Nuevos desarrollos tecnológicos para el Screening por LCMS All Ions y tmrm para una mayor confianza en el screening LC/MS MassHunter Software Jaume C. Morales Especialista de Producto 1 February 20, 2013
2 Agenda Dos enfoques de Screening complementarios Objeto de las nuevas herramientas tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 2 February 20, 2013
3 Agenda Dos enfoques de Screening complementarios Objeto de las nuevas herramientas tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 3 February 20, 2013
4 Dos enfoques de Screening La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques : Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar. Más sensible (*) El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS. Sin capacidad de determinar NO esperados. Sin capacidad de análisis retrospectivo. NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS. El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado). La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución. La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar Menos sensible (*) (*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF 4 February 20, 2013
5 Dos enfoques de Screening Dirigido No dirigido 5 February 20, 2013
6 Dos enfoques de Screening, COMPLEMENTARIOS El barrido o screening nos permite confeccionar un listado de los compuestos que estan presentes por técnicas de IDENTIFICACIÓN. La Cuantificación y confirmación posterior de SÓLO aquellos compuestos que dieron positivo permite obtener unos resultados más sensibles, reproducibles y robustos. Screening Confirmación Cuantificación 6 February 20, 2013
7 Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Screening Los compuestos se identifican por masa exacta Cuantificción February 20, 2013
8 Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF 1290 Infinity UHPLC Agilent 6460B LC/QQQ El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Screening Confirmación Los compuestos se identifican por masa exacta Cuantificción Cuantificación
9 Agenda Dos enfoques de Screening complementarios Objeto de las nuevas herramientas tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 9 February 20, 2013
10 Nuevas herramientas El objetivo del desarrollo de estas nuevas herramientas es dotar de mayor confianza a los resultados. El Screening puede abordarse desde dos enfoques complementarios, Dirigido y NO Dirigido y Agilent ha desarrollado herramientas para ambos. La mayor confianza viene determinada por una mayor capacidad de confirmación de positivos y negativos. 10 February 20, 2013
11 Nuevas herramientas El enfoque Dirigido basa la confirmación en la respuesta relativa de una 2a o 3a MRM que en demasiadas ocasiones la matriz desvirtúa por interferencias. Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : tmrm El enfoque NO Dirigido basa la confirmación en la masa exacta y perfil isotópico pero en muchas ocasiones NO es suficiente pues existen compuetos isobáricos que dan la misma ID. Requiere una herramienta alternativa de mayor confianza en la confirmación : All Ions 11 February 20, 2013
12 Agenda Objeto de las nuevas herramientas Dos enfoques de Screening complementarios tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 12 February 20, 2013
13 Fundamentos del tmrm y aplicaciones Screening Dirigido Mayor confianza en la confirmación 13
14 tmrm Ventajas y funcionamiento Mayor confianza en la confirmación Nuevas funciones en MassHunter para tmrm Ejemplo de aplicación uso del tmrm Comparación con el dmrm Ejemplos con matrices reales 14
15 tmrm Ventajas y funcionamiento Mayor confianza en la confirmación Nuevas funciones en MassHunter para tmrm Ejemplo de aplicación uso del tmrm Comparación con el dmrm Ejemplos con matrices reales 15 February 20, 2013
16 Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting Enfoque de barrido: Barrido de la huella del compuesto Estrategia tmrm: Foco en las características (fragmentos) del compuesto Dos posibles escenarios: - Confirmación de positivos con información adicional (confirmación espectral) Mayor confianza en la confirmación - Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz 16
17 tmrm Scanning tmrm Scan < 50ms Compatible con UHPLC buen perfil cromatográfico + buena cuantificación tmrm Scans Trigger tmrm Acquisition Time (seconds) Situación ideal : 1 Pico de 5 seg de ancho, sin matriz Mayor confianza en la confirmación 17
18 Triggered MRM (tmrm) Analysis MRM Secundarias Triggered Triggered MRM (sobre threshold) Compound Precursor Product Analyte Analyte Analyte Analyte Analyte Analyte Analyte Threshold MRMs Primarias (bajo threshold) Compound Precursor Product Analyte Analyte Mayor confianza en la confirmación 18
19 tmrm Product Ion Spectrum x x > > > > > x x x x > 132 x > x > 147 x > x tmrm Product Ion Spectrum
20 tmrm LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ Pesticides -Test Mix: 253 compounds Method -DB: ~700 compounds -Library: ~250 compounds Veterinary Drugs -Test Mix: 146 compounds -DB: ~1,000 compounds -Library: ~140 compounds tmrm Database LC/MS Application Kits Standards Forensic Toxicology -Test Mix: 139 compounds -DB: ~2,500 compounds LC Column On Site Training -Library: ~130 compounds Mayor confianza en la confirmación 20
21 La Solución Analítica Ideal para compuestos conocidos Mayor confianza en la confirmación tmrm Cuantitativo Coste Efectivo Cualitativo Fast POINT Cycle Time High POINT Throughput Product POINT Ion Spectrum Short POINT Run Time Single POINT Instrument Library POINT Searching Accurate Confirmation Sensitive Page 21
22 Nuevos parámetros de tmrm Funciones de Triggering en MH Acquisition Permiten centrar los tmrm en el centro del pico 25
23 Nuevos parámetros de tmrm También el Optimizer puede usar tmrm para detectar todas las transiciones de un compuesto 32
24 Nuevos parámetros de tmrm Funciones Triggering en MH Qual Fácil navegación de compuesto a compuesto 35
25 tmrm Ventajas y funcionamiento Nuevas funciones en MassHunter para tmrm Ejemplo de aplicación uso del tmrm Comparación con el dmrm Ejemplos con matrices reales 36
26 Comparación de rendimiento del método con tmrm respecto al MRM tradicional Se comparan con un método de más de 120 pesticidas En modo tmrm se determinaron 2 MRM primarias El Triggering actúa por encima de un threshold especificado para cada compuesto Para poder comparar el rendimiento cuantitativo de ambos métodos, el método tradicional de dynamic MRM se programó también con 2 MRM La comparación se hizo en análisis efectuados sobre muestras reales 38
27 Parámetros de método UHPLC method UHPLC column Mobile phase Gradient program Flow rate Injection volume 3 µl MS method Electrospray ionization Triggered MRM: Dynamic MRM: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD 2.1 x 150 mm, C A: 5 mm NH 4 formate + 0.1% formic acid B: 5 mm NH 4 formate + 0.1% formic acid in methanol Min % B Stop time 22 min 0.40 ml/min 2 MRM primarias más 8 MRM adicionales de confirmación 2 MRM por compuesto 39
28 Cromatograma UHPLC-MS/MS a 10ng/mL en extracto de limón 40
29 Counts Muestra real Napropamida en extracto de limón Napropamid: Lemon spike 1 µg/kg.d: +ESI MRM: > 58.1, > x10 4 Ratio = 65.3 (100.9 %) Acquisition Time (min) Cromatograma MRM de las 2 transiciones primarias a 1µg/kg 41
30 Muestra real Espectro tmrm de Napropamida en extracto de limón a diferentes concentraciones x Cpd 85: Napropamid: +ESI MRM: Lemon spike 1 µg/kg.d pg o.c. x Cpd 85: Napropamid: +ESI MRM: Lemon spike 10 µg/kg.d pg o.c. x Cpd 85: Napropamid: +ESI MRM: Lemon spike 100 µg/kg.d Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 300 pg o.c. Espectro tmrm a 1µg/kg, 10µg/kg y 100 µg/kg 42
31 Number of pesticides Validación del método Límites de cuantificación Solvent Lemon extract < to to to 1 >1 Limit of quantitation in µg/kg 43
32 Rendimiento cuantitativo - Oxamyl Curva de calibración dmrm Curva de calibración tmrm 44
33 Calibration slopes Triggered MRM Rendimiento cuantitativo - Comparación y = x Calibration slopes Dynamic MRM Pendientes de la curva de calibración para todos los pesticidas en el método 45
34 C o u n t s C o u n t s Muestras Reales Tebufenpyrad en extracto de gengibre > 117.0, > x10 5 Ratio = 46.9 (209.9 %) Acquisition Time (min) + MRM ( min, 13 scans) ( > * x Lib Match Score= Reference spectrum Mass-to-Charge (m/z) 46
35 Muestras Reales Tebufenpyrad en extracto de gengibre Reference spectrum 47
36 Counts Muestras reales Tebuthiuron en extracto de camamilla > 172.1, > x10 4 Ratio = 40.3 (204.3 %) Reference spectrum Acquisition Time (min) 48
37 Counts Muestras reales Tebuthiuron en extracto de camamilla > 172.1, > x10 4 Ratio = 19.8 (100.6 %) Acquisition Time (min) Reference spectrum 49
38 Muestras reales ejemplos por interferencia de matriz Library match score Pesticide Matrix Target compound Matrix interference Dichlovos Lemon 94.5 % 78.1 % Thifensulfuron-methyl Green Tea 96.6 % 71.5 % Tebufenpyrad Ginger 99.8 % 55.9 % Tebuthiuron Chamomile 97.8 % 58.0 % Imazalil Chamomile 99.8 % 58.1 % Terbutylazin Chamomile 99.6 % 82.1 %
39 Compounds at a glance Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados 51
40 Resumen del tmrm El Triggered MRM epermite confirmación espectral a niveles de LOQ Mismo rendimiento cuantitativo que los métodos MRM tradicionales Integration única con las nuevas triggered MRM databases y librerías La comprobación automática con la librería de espectros permite una eficaz revisión de los resultados y etiquetado de los casos sospechosos. Utilizando una sola transión primaria en tmrm, nos prmite afrontar un método con mayor número de compuestos en multiresiduo. 52
41 Application notes para su información EN EN 54
42 Agenda Objeto de las nuevas herramientas Dos enfoques de Screening complementarios tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 56
43 Fundamentos de All Ions y aplicaciones Screening NO dirigido Mayor confianza en la confirmación 57
44 All Ions MS/MS AIM para mayor confianza en la identificación La mejor solución del mercado para screening en alimentación, medio ambiente y forensica/toxicología Exclusivo de Agilent: Librerías de espectros MS/MS de masa exacta para identificar los fragmentos Coelution score para confirmar que los fragmentos pertenecen al ión precursor Re-procesado de los datos para desconocidos sin re-adquisición Rápida incorporación de desconocidos a la librería de MS/MS para incluir en el screening Rápida creación del método cuantitativo para screening multiresiduos 58
45 All Ions MS/MS Screening Dirigido Superior Conforme a los requisitos de screening SANCO Al menos 2 iones producto Confirmación final con un compuesto referencia Agilent ofrece un flujo de trabajo totalmente desarrollado en All Ions MS/MS para la confirmación del compuesto y la creación del método cuantitativo. Características: Fácil y simple método de Adquisición (Full Scan) Identificación dirigida del compuesto usando las librerías Agilent de espectros MS/MS Confirmación cromatográfica de los iones producto (coelution score) Rápida creación del método Quant. Automáticamente selecciona dos iones producto de alta calidad para cada compuesto, eliminando la tediosa tarea de crearlo manualmente. El usuario dispone de forma rápida y segura de hacer la cuantificación dirigida de sus compuetos 59
46 Flujo de trabajo de All Ions MS/MS Dirigido Adquisición PCDL Qual Quant MassHunter Acquisition m/z, especies iónicas Find by Formula en MS canal baja Ɛ Voltage Alto/bajo de Fragmentor en TOF y Q-TOF Energía de Colisión Alta/Baja en Q-TOF Librería de pesticidas (~ compuestos con espectros) Librería Forensics /Tox (2720 compuestos con espectros) Qual Report Targets Busca EICs de los fragmentos en el canal MS de alta Ɛ Extracción Alinea EIC s de los fragmentos con EIC del ión padre Cualifica y confirma fragmentos Correlaciona fragmentos cualificados con el compuesto Exporta Cuantificación del compuesto encontrado con información adicional de fragmentos Quant Report 60
47 Características de All Ions MS/MS : Facil creación del método de Adq. En el método de MassHunter Acquisition tan sólo hay que especificar dos canales de diferente energía. Un low channel (e.g. sin Collision Energy) y un high channel (e.g. CE = 20). No hay necesidad de entrar parámetros para cada compuesto como en un QQQ. Mucho más fácil y rápido! Al crear un Experiment # nos permite crear canales de baja y alta energía para Frag y CE 61
48 Ejemplo: Trazodone All Ions MS/MS Espectro de baja Energía Espectro de alta Energía 62
49 Características de All Ions MS/MS : Targeted Identification Using Agilent s PCDLs Personal Compound Database and Libraries (PCDLs) contiene espectros MS/MS de masa exacta. All Ions MS/MS utiliza los product ions del espectro para confirmar la identificación de los iones padre Resultado : menor nº de falsos positivos! Aplicación PCD PCDL Forensics / Tox 7360 compuestos Más espectros para compuestos Pesticides 1609 compuestos Más espectros para 500 compuestos Veterinary Drugs ~1000 compuestos Más espectros para ~500 compuestos Metabolomics METLIN rev. B (~50,000 compuestos) METLIN rev. B (Más espectros para ~9000 compuestos) 63
50 Características de All Ions MS/MS : Confirmación Cromatográfica de los Product Ions Solapamiento de los cromatogramas de Baja y Alta Energía Curvas de Coelución Los iones Precursor y Producto coinciden exactamente en sus máximos. 64
51 All Ions MS/MS in Qualitative Analysis rev. B New panel allows easy setup of All Ions MS/MS: Turn on All Ions MS/MS using the current Formula Source PCDL Minimum Coelution score 65
52 New Compound Details View in Qual rev. B New chromatogram and spectrum windows which show data from one compound only. Data belonging to one compound can be overlaid easily and quickly. 66
53 Import and Build Qual/Quan Method from Qual MH Quant MH Qual Compound results Reference pattern library.cef file Adduct pattern Quant method - Accurate mass EICs for quantifier and qualifier - Relative responses - Retention times 67
54 Rapid Quant Method Setup by Importing the.cef File from Qual Precursor ions with different fragmentor voltages are used as qualifiers 68
55 Rapid Quant Method Setup by Importing the.cef File from Qual Quant methods with hundreds of compounds can be set up in minutes! There is no need to type in the compound names they are already in the PCDL. 69
56 Agenda Objeto de las nuevas herramientas Dos enfoques de Screening complementarios tmrm para Screening Dirigido All Ions para Screening NO Dirigido LCMS Application Kits y Librerías 74
57 Simplify Your Startup Method Databases and Libraries LC/MS Application Kits Standards LC Column On Site Training 75
58 The Value of LC/MS Application Kits Save Time Save Money Kit Value Simplicity Method Quality 76
59 Accurate Mass LC/MS Application Kits Untargeted Screening with TOF or QTOF Method Pesticides -Test Mix: 253 compounds -DB: compounds Accurate Mass MS/MS Library LC/MS Application Kits Standards -Library: 700+ compounds Veterinary Drugs -Test Mix: 146 compounds -DB: compounds -Library: 600+ compounds Forensic Toxicology LC Column On Site Training -Test Mix: 139 compounds -DB: compounds -Library: compounds 77
60 tmrm LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ Pesticides -Test Mix: 253 compounds Method -DB: 700+ compounds -Library: 250+ compounds Veterinary Drugs -Test Mix: 146 compounds -DB: 600+ compounds -Library: 100+ compounds tmrm Database LC/MS Application Kits Standards Forensic Toxicology -Test Mix: 139 compounds -DB: compounds LC Column On Site Training -Library: 100+ compounds 78
61 79 February 20, 2013
62 80 February 20, 2013
63 Muchas Gracias por su Atención Mass Spectrometry Technology Products Solutions NEW NEW
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