Introducción y Posibilidades de la Espectrometría de Masas: LC-GC/MS y LC-GC/MS/MS

Transcripción

1 Introducción y Posibilidades de la Espectrometría de Masas: LC-GC/MS y LC-GC/MS/MS Jornada sobre Posibilidades de la Espectrometría de Masas en Laboratorios de Investigación. El poder del análisis comparativo de muestras en Alimentación, Proteómica y Metabolómica. Miguel A. Martínez Inma Alvarez ICTAN PCiTAL-UdL

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4 Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160) ESTUDIOS DE VALORIZACION TECNOLÓGICA ESTUDIOS DE NUTRICION SERVICIOS ANALITICOS (externos e internos) U.S. Técnicas Analíticas, Instrumentales y Microbiológicas (USTA) Laboratorio de espectrometría de masas Laboratorio de cromatografía general Laboratorio de análisis elemental y minerales Laboratorio de caracterización y propiedades físicas Laboratorio de instrumentación preparativa Laboratorio de espectroscopía Área de Microbiología Área de Cultivos Celulares Calidad y Calibraciones Análisis instrumental en matrices alimentarias y muestras biológicas Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160) Servicios del ICTAN

5 Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160) SERVICIOS DE PLANTA PILOTO Instalaciones para el procesamiento de distintos tipos de alimentos Tratamiento de atmósferas controladas, envasado, microinyección, etc. Sistemas de congelación Equipo de altas presiones -20ºC 100ºC 0 a 900 Mpa 1,7 L Primer equipo europeo capacidad en rangos amplios de P., T., V. Nuevas instalaciones frigoríficas 34 cámaras 12 Cabinas de atmósferas controladas 230 m2 útiles Servicios del ICTAN

6 Planta Piloto

7 Se pueden visitar las instalaciones después del coctel Cámaras

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9 Requisitos de las técnicas en un Servicio Análisis Técnica/método Robusto ( reproducible, fiable, independiente del operador) Preciso Baja incertidumbre Instrumental ( automatizable o poco dedicado.) Versátil (aplicable a distintas muestras/matrices) Requiera poca muestra, poca manipulación Rápido Interferencias nulas o controlables Coste razonable

10 Elección del método de análisis : por qué invertir tantos recursos ( ) en MS? Extracto Qué puedo hacer con mi extracto? Separación de los analitos Electroforesis C E Ultracentrifugación (polímeros) Cromatografía Separativa Escasamente identificativa identificación cuantificación E. Vis-UV Absorción Atómica Infrarrojo RMN E. Masas Electroanálisis Métodos Térmicos No separativa Identificativa Herramienta mas versátil & eficaz: ACOPLAMIENTO CROMATOGRAFIA - E. MASAS Separa Identifica Cuantifica Información estructural Masa [cuasi]molecular No necesita siempre una separación perfecta

11 Peso Molecular Requisitos Técnicas Análisis en muestras biológicas de alimentos Requiere técnicas con un muy amplio rango de aplicabilidad. Muy elevada selectividad, especificidad y sensibilidad. Poder cuantificar trazas de compuestos en complejas matrices. 100,000 10, LC/MS- APPI LC/MS-APCI GC/MS LC/MS API-Electrospray El acoplamiento Cromatografía / Espectrometría de Masas (LC/MS y GC/MS) es la técnica que: Ofrece la mejor sensibilidad y versatilidad para el amplísimo rango de compuestos y matrices a analizar en un laboratorio. Permite obtener perfiles masivos de metabolitos y proteínas. Combinado con la Bioinformática está revolucionando las posibilidades de la investigación multidisciplinar no polar Polaridad del analito/ Solubilidad en Agua muy polar

12 Ejemplos de Instrumentación en MS: sq TOF / q-tof QqQ Q-TRAP TRAP LC + Nano LC Solubles GC + GC x GC volatilizables MS GC C E + Analitos iónicos

13 Instrumentos híbridos. Acoplamientos especiales [lc] Orbi-TRAP LC-ICP-MS (AGILENT 2007) Maldi-TOF Maldi-TOF-TOF

14 Instrumentos hibridos TÉCNICAS MULTIDIMENSIONALES [RP]LC-GC-MS Acoplamiento directo de cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y espectrometría de masas ICTAN Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz

15 Interfaz TOTAD (3) ( 1 ) (1) 1 ) 1 ) (2) GC HORNO Interfaz TOTAD: (1) material absorbente o adsorbente; (2) lana de vidrio; (3) tapón calefactado; (EV 1 y EV 2 ) electroválvula 1 y 2; (EPC) controladores de presión electrónicos; (PR) regulador de presión; (FR) regulador de flujo; (ST 1 ) tubo de acero inoxidable, 0,25 mm d.i., para transferir el eluyente del LC a la válvula de seis vías; (SCT) capilar de sílice fundida, 0,32 mm d.i.; (WT) tubo del desecho; (NV) válvula de aguja; (W) desecho. (Villén y col., 1999)

16 0,92 2,12 3,63 Carum carvi AU RPLC GC-MS (S)-carvona Minutos 1,2 ml Transferencia de 0,92 min a 2,12 min (R)-limoneno 1,5 ml Transferencia de 2,12 min a 3,63 min (R)-limoneno (S)-carvona Minutos Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz

17 LC-GC-MS MINIMIZA (O ELIMINA) LA ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA INTEGRA LA PRE-SEPARACIÓN DE MUESTRA EN EL ANÁLISIS PERMITE EL USO DE FASE NORMAL (NP) Y FASE INVERSA (RP) EN LC REDUCE EL USO DE DISOLVENTES DISMINUYE EL TIEMPO TOTAL DE PROPORCIONA BAJOS LÍMITES DE ANÁLISIS DETECCIÓN PERMITE AUTOMATIZAR EL ANÁLISIS COMPLETO

18 Entrada Interfases ESI, APCI, MALDI, Un espectrómetro de masas consta principalmente de combinación de 3 componentes Múltiples diseños sq QqQ ToF ALTO VACíO QToF MaldiToF Trap etc

19 INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas tienen que ser ionizadas. Qjet ion Guide Los iones son guiados al interior TurboV ion Source (ESI) del MS, sin capilar, mediante campos electromagnéticos Gas secante auxiliar aire caliente

20 INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas tienen que ser ionizadas. La muestra es coprecipitada en el seno de una matriz que absorbe la energia del pulso laser y la transfiere a la muestra, que se carga con +1

21 INTERFASES LC API ESI y APCI

22 SOLO LO QUE SE IONIZA PUEDE SER DETECTADO POR EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS

23 ESI Jet Stream Agilent

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25 Información Proporcionada por LC-GC-CE /MS. Ejemplo Drogas de Abuso mediante LCMS-TOF Nota aplicación EN TIC (Total Ion Chromatogram) Información cuantitativa: - Área pico (TIC:no selectiva - EIC:selectiva) Información cualitativa (ID): -Tiempo Retención - Espectro de Masas 4 Int. 1 EIC ( =Ion extraído) m/z m/z Isómeros => igual m/z exacta Se requerirá su separación cromatográfica CROMATOGRAMA SELECTIVO Utilizados para cuantificación T r

26 Intensidad Espectros LC/MS (Ionización a Presión Atmosférica API ) versus GC/MS (Ionización por Impacto Electrónico-EI) 5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 Clenbuterol Espectro LC/MS (API-ESI) TOF MS: to min from TIC [M+H] + = Contribución del Cl(37) de aprox. 2/3 2 átomos Cl m/z Abundance #103730: Clenbuterol (PM = 276Da) m/z--> Espectro GC/MS (EI) Cl N H 2 Cl MS HPLC MS:QTOF O H H N GC C H 3 86 C H 3 C H 3

27 Espectros LC/MS (API-ESI ) : Iones carga múltiple 5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 Clenbuterol TOF MS: to min from TIC [M+H] + = m/z HPLC MS:QTOF m/z Mioglobina TOF MS 6.45 to 6.78min from TIC Adquieren Moléculas múltiples con varios cargas grupos (ejem. nh + ) Espectro de masa de ionizables Cada molécula (ppdes. con n acido/base) cargas origina una señal proteína ESI-TOF El espectro muestra todas las posibilidades La determinación de la Masa Molecular requiere un programa de cálculo o deconvolución. Aminoácidos ( lisina) Péptidos Proteínas M =

28 Espectros LC/GC/MS El espectro de masas (intensidad de señal versus relación masa/carga (m/z)) y el perfil isotópico son la base de la Bioinformática aplicada a estudios de proteómica y metabolómica

29 Cómo Lograr Información Estructural en LC/MS?: MS n Lc-Trap SCAN MS 2 [579] =146 coincide con perdida hexosa [MH+] MS 3 [433] MS 4 [271] [MH+] = 271 coincide con perdida 2 hexosas Fragmentación final estructura tipo flavona

30 Cómo Obtener Información Estructural en LC/MS de Compuestos No Aislados?: LC/MS/MS Sistemas LC/MS/MS (QqQ / Q-TOF / TRAP): se fragmenta en celda de colisión o en la trampa de iones. Muy útil cuando existe coelución de compuestos (p.ej. en matrices complejas) +TOF to min 1.9e e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 0Cl m 1 m 2 m 1 Filtro Masa nº 1 SIM Celda Colisión rompe Cl Filtro Masa nº 2 SCAN MS/MS del ión aislado (m 1 ) en Q1 1.0e Cl Cl Clenbuterol H 2 N Cl OH HN H 3 C + [M+H]+=277 (Clenbuterol totalmente fragmentado. con PERFIL ISOTOPICO) CH 3 CH 3

31 QqQ- MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con Máxima Sensibilidad, Selectividad y Rapidez QqQ 3m Espectro de una fenilurea Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Transición: Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad sin fondo químico

32 MS/MS con masa exacta : Q-TOF. Ideal para Identificación de picos desconocidos y su confirmación estructural. Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión Ion Mirror Octopole 2 Detector DC Quad Ion Pulser Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Tur bo Tubo de Vuelo monitoriza con masa exacta TODOS los fragmentos característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máxima información y seguridad Espectro completo sin fondo químico y con masa exacta

33 Tipos Cuantificación por LC-GC/MS: Se cuantifican múltiples compuestos en 1 análisis con cromatogramas de iones selectivos. - Relativa: proporcional a la intensidad de señal en otra muestra. Utilizada en estudios comparativos. - Absoluta: construcción de curvas de calibrado con patrones a distinta concentración.. Area pico ) x Ácido Clavulánico 5 Levels, 5 Levels Used, 15 Points, 13 Points Used, 0 QCs LLOQ: ULOQ: Range: 0.05 ng/µl 5.0 ng/µl y = E-005 * x E-007 R 2 = A X mta 0.05 ng/µl Clavulanic Acid in Plasma (not determined) C X mta LINEALIDAD 5 ORDENES Concentración (Absoluta o Relativa) x min 5.00 ng/µl ng/µl Abundance vs. Acquisition Time (min) MRM ng/µl 0.25 ng/µl 0.05 ng/µl (LLOQ)

34 Posibilidades de la Espectrometría de Masas: Detección Universal de cualquier Compuesto Ionizado Con Herramientas de Deconvolución Cromatográfica (MFE) y Análisis Estadístico Multivariante (MPP) adecuadas: Permite obtener un perfil de centenares/miles de compuestos. Caracterizar los compuestos a comparar por su tiempo retención y: LC/MS: por su masa exacta (3-4decimales). GC/MS: por su espectro de EI deconvolucionado (o su masa exacta). 5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 +TOF MS: to min lowhigh03.d Agilent Clenbuterol C 12 H 18 Cl 2 N 2 O [M+H] + = Correlacionar: Variaciones en la concentración de metabolitos/peptidos. Con distintas propiedades de 2 o más grupos de muestras comparadas (organismo, órgano, tejido, célula, fluido, ).

35 Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su Acoplamiento con HPLC o GC en Alimentación Identificar y Cuantificar compuestos presentes en un alimento, incluyendo trazas de contaminantes. Realizar cribados masivos de centenares/miles de compuestos. Correlacionar cambios en la composición de alimentos con sus propiedades: Autentificar muestras, detectar fraudes. Evaluar el impacto de un tratamiento en la composición / conservación de un alimento. Evaluar el impacto de la composición de un alimento (p. ej. alimento funcional) en el metaboloma. Evaluar el impacto de una dieta o alimento en las rutas metabólicas de un organismo....

36 Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su Acoplamiento con HPLC en Metabolómica Identificar y cuantificar metabolitos a muy bajo nivel. Comparar la concentración de los metabolitos presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores. Evaluar el impacto en el metaboloma de factores exógenos (dieta/ fármaco/ entorno/ ) o endógenos (p.e. enfermedad), a través del descubrimiento de las rutas metabólicas alteradas, o del seguimiento de los metabolitos involucrados en rutas concretas....

37 Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su Acoplamiento con HPLC en Proteómica Identificar las proteínas presentes en una muestra. Requiere de motores de búsqueda que identifiquen en bases de datos, a que proteínas pertenecen las m/z de los espectros de MS/MS (MS) de los mapas péptidicos. Comparar los niveles de expresión de las proteínas presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores. Requiere motores de búsqueda que admitan esta opción (p.e. SpectrumMill) Cuantificar péptidos y proteínas a muy bajo nivel de concentración Determinar con gran precisión el peso molecular de un proteína Determinar el peso y secuencia de aminoácidos de un péptido Detectar PTM s en proteínas (por búsquedas en modo homología o por secuenciación de péptidos con MS/MS) Estudiar interacciones no covalentes- entre biomoléculas: complejos proteína-proteína, proteína-fármaco, proteínas-metal, enzimainhibidor,,.....

38 DISEÑO EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DE MUESTRAS Pesada conservación ANÁLISIS = USTA La selección adecuada de la muestra: Tiempo de exposición al tratamiento Recolección y conservación de la muestra etc. 1. Si no está (perdida en filtrado, extracción) no podremos analizarlo 2. Si está por debajo del limite de detección, no podremos detectarlo 3. Si está en concentración muy inferior a interferentes puede que no lo veamos 4. Si no sabemos lo que buscamos pueden darse las tres anteriores El equipo más preciso no podrá aportar precisión si no cuidamos la preparación de la muestra La Muestra

39 SÓLO LO QUE SE IONIZA ES DETECTADO POR EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS La Muestra

40 Alimentos Fluidos biológicos Tejidos Cultivos celulares Compatibilizar la matriz con el análisis Todos los pasos previos de preparación de muestra sesgan los resultados Distintas técnicas aportan información complementaria: LC-MS, GC-MS Consideraciones prácticas: Tipos de Muestra Utilización de controles: alícuotas de todas y cada una de las muestras analizadas Utilización de blancos: todos los reactivos de preparación de muestra aplicados sobre una matriz blanca sin muestra Utilización de patrones internos En estudio con muestras de orina, corregir la dilución de las muestras La Muestra

41 Muchas Gracias Dra. Inma Alvarez D. Miguel A. Martínez (J.U.)