Dr. Roque Bru Martinez. Departamento de Agroquímica y Bioquímica. Grupo Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Jornada LC-MS

Transcripción

1 Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas: una herramienta esencial para el análisis estructural y cuantitativo de proteínas y proteomas Dr. Roque Bru Martinez Grupo Proteómica y Genómica Funcional de Plantas Departamento de Agroquímica y Bioquímica

2 Análisis de proteínas y proteomas por LC-MS/MS TIPO DE ESTUDIO Descubrimiento Verificación Validación Monitorización OBJETIVOS Caracterización de desconocidos Cuantificación relativa Cuantificación absoluta de compuestos conocidos RESULTADOS Secuencias peptídicas Modificaciones postraduccionales Perfiles de abundancia Cuantificación péptidos y proteínas Biomarcadores protéicos Complejos, vias y redes protéicas INSTRUMENTOS 3D & L Ion Traps, QToF LIT-Orbitrap, LC-MALDI ToF/ToF Triple Cuadrupolo (QqQ)

3 DECISIONES CRITICAS DURANTE LAS ETAPAS EXPERIMENTALES Preparación de muestras Extracto proteínas totales, extracto fracción subcelular: proteomas Electroforesis: bandas SDS-PAGE, manchas 2DE, fracción FFE, OGE-IEF Digestión proteolítica En gel ó En solución Selección de proteasa Marcaje isotópico estable? Cromatografia Liquida 1D: fase reversa 2D: SCX + fase reversa; TiO 2 + fase reversa On-line, off-line, escala de flujo (nanoflujo vs. Flujo estandar) MS/MS Muestreo aleatorio de precursores (shotgun, data dependent, discovery ) Muestreo de precursores seleccionados (quant-driven targeted, neutral loss) Muestreo de transiciones: cuantificacion de péptidos conocidos (MRM) Interrogación de bases de datos protéicas Listas de péptidos y proteínas Motores de búsqueda: cotejo de espectros MS/MS experimentales y teóricos Base de datos: tamaño, taxonomía Secuenciación de novo: automatica/manual, BLAST Motores de búsqueda: asignación de secuencias peptídicas, ensamblaje de proteínas, integración de datos cuantitativos Análisis funcional: significado biológico

4 DIGESTIÓN PROTEOLÍTICA etapa obligada en análisis LC-MS/MS de proteínas Rango de masas hasta m/z Digestión tríptica Especificidad: K-X, R-X, X P Robusta: soporta condiciones drásticas Péptidos con cargas (+) múltiples Proteasa con especificidad por el sitio de corte Proteina Peptidos RQLVHVVKWASALPGFRNLHVDDQMAVIQYKWMGLMVFAMGWRSFT

5 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance SEPARACIÓN CROMATOGRAFICA DE PEPTIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM RT: LC Time (min) NL: 1.52E8 Base Peak F: + c Full ms [ ] S#: 1707 RT: AV: 1 NL: 2.41E7 F: + c Full ms [ ] MS Scan m/z CID S#: 1708 RT: AV: 1 NL: 5.27E6 T: + c d Full ms [ ] MS/MS Scan m/z

6 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE PEPTIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS: SISTEMA CLASICO COLUMNAS 1D-LC SCX 2nd Pump 2 1 Plug D-LC 75 m ID Waste 1100 Micro Well plate Sampler Micro 2-position/6-port valve 4 5 Waste C18 Pre-Column C18 Analytical Column Nanopump MS detection Intensity x x x x x x Load 25 mm 50 mm 100 mm 200 mm 1000 mm Time [min]

7 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE PEPTIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS: SISTEMA NANO-CHIP

8 Intensidad (u.a.) CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE PEPTIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS: FLUJO ESTANDAR-ULTRA ALTA PRESION 2,5E+03 2,0E+03 1,5E+03 Particulas 1,8 µm 1200 bar 1,0E+03 5,0E+02 0,0E ,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 Tiempo de retención (min)

9 INTERFASE LC-MS Fuente Electrospray: Vaporización e Ionizacion Infusión de la muestra: - Directa - Elución de columna Entrada de iones: - En línea - Ortogonal Resource/images/lcms/ESI.jpg

10 ADQUISICION DE ESPECTROS DE MASAS Y DE MASAS/MASAS (EN TANDEM) Q-TOF

11 Fragmentacion de Peptidos b 2 -H 2 O b 3 - NH 3 a 2 b 2 a 3 b 3 HO NH + 3 R 1 O R 2 O R 3 O R 4 H -- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C -- COOH H H H H H H H y 3 y 2 y 1 y 3 -H 2 O y 2 - NH 3

12 IG/G/I G T V P\V\GR

13 1. Interpretación por cotejo de espectros MS/MS Secuencia -> Espectro teórico Espectro real 2. Interpretación por secuenciaciónde novo

14 ESTRATEGIAS PARA ANALISIS DE PROTEOMAS ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROTEOMA DE BAYAS DE VID DURANTE EL DESARROLLO MEDIANTE MARCAJE ISOTÓPICO ESTABLE itraq ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROTEOMA DE CULTIVOS CELULARES DE VID SIN MARCAJE: LABEL-FREE DETECCION DE PROTEINAS ESPECIOTÍPICAS EN CARNES POR MRM

15 ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROTEOMA DE BAYAS DE VID DURANTE EL DESARROLLO MEDIANTE MARCAJE ISOTÓPICO ESTABLE itraq

16 itraq Péptido Masa isobárica total=145 Grupo masa etiqueta (retiene carga) Grupo reactivo específico del grupo amino (NHS) Péptido + Péptido Péptido Grupo de compensación de masa (neutral loss) isotopic Tags for Relative and Absolute Quantification of peptides Péptido

17 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Reducido/ alquilado Reducido/ alquilado Reducido/ alquilado Reducido/ alquilado Digerido Digerido Digerido Digerido itraq marcaje itraq marcaje itraq marcaje itraq marcaje PRG PRG PRG PRG Mezcla muestras marcadas SCX cromatografía (n fracciones) Cromatografía fase reversa Adquisición de datos nesi-ms/ms

18 tabla de iones fragmento asignados b, y, a Iones reporteros region del espectro masas bajas MS/MS espectro precursor ion TGPNLHGLFGR TGPNLHGLFGR

19 Análisis del proteoma diferencial de exocarpo mediante itraq 15 mm V - 100% 110 g/l 140 g/l Reducido/ alquilado 114 Digerido Digerido Digest Digerido Digerido 31 PRG PRG PRG PRG itraq marcaje Pool muestras marcadas Cromatografía SCX 23 fracciones con la misma área cromatográfica Cromatografía fase reversa nanospray ESI nlc-ms/ms alta resolución 3 réplicas técnicas Cuantificación e identificación de proteínas con Spectrum Mill Anotación de secuencias de proteína y análisis funcional con Blast2GO

20 Número de proteínas identificadas y cuantificadas Al menos 1 péptido R Al menos 2 péptidos R R R R R Combinación de las tres réplicas #Proteinas ident #Proteínas cuant

21 Análisis del proteoma diferencial de pericarpo y pulpa mediante itraq FS 4 mm 7 mm 15 mm V % 110 g/l 140 g/l Reducido/ alquilado Digerido Digerido Digerido Digerido Digerido Digerido t Digerido PRG PRG PRG PRG 28 PRG PRG PRG PRG itraq marcaje Pool muestras marcadas Pool muestras marcadas SCX Cromatografía 21 fracciones SCX Cromatografía 18 fracciones Cromatografía fase reversa nanospray ESI QSTAR ESI-QTOF Cuantificación e identificación de proteínas con ProteinPilot Anotación de secuencias de proteínas y análisis funcional con Blast2GO

22 Número de proteínas identificadas y cuantificadas -Experimento 1 itraq: Etapa de formación de la baya -Experimento 2 itraq: Etapa de maduración 542 proteínas identificadas 1127 proteínas identificadas 524 proteínas cuantificadas 1134 proteínas cuantificadas Filtro p-value< proteínas 630 proteínas Filtro ratio > proteínas 370 proteínas

23 Distribución anotación términos GO transporte electrónico (80) biogénesis de ribosomas (65) Organización de componentes celulares (71) Transporte (157) Proceso metabólico de ácidos monocarboxílicos (100) Proceso biosintético de carbohidratos (64) Regulación de procesos metabólicos (64) Proceso metabólico de coenzimas (96) Proceso catabólico de glucosa (62) Respuesta a estímulo químico (75) Regulación de procesos celulares (135) Proceso metabólico de nucleótidos, nucleósidos y nucleobase (65) Oxidación reducción (134) Proceso metabólico de amino ácidos (99) Generación de metabolitos precursores y energía (99) Proceso biológico Respuesta a estrés (137) Traducción (97) Proceso metabólico de compuestos aromáticos celulares (71) Retículo endoplasmático (31) Ribosoma (84) Parte nuclear (20) Sistema endomembrana (63) Complejo proteasoma (20) Membrana del tilacoide (26) Vesícula citoplásmica unida a membrana (50) Integral a membrana (70) Parte membrana mitocondrial (22) Lumen orgánulos (33) Membrana interna mitocondrial (30) Membrana plasmática (27) Citosol (48) Fotosistema II (22) Componentes celulares

24 Shikimate pathway EPSP CHOSy EPSPS shikimate 3-phosphate chorismate Phenylpropanoids Phe PAL cinnamic acid Monolignols COMT PCBER PCBER PCBER lignins and lignans SK shikimate DD-SDH 3-dehydroshikimate DD-SDH 3-dehydroquinate C4H p-coumaric acid 4CL p-coumaroylcoa CHS chalcones CCR p-coumaraldehyde CAD Flavonoids p-coumaryl alcohol DDSy DHAP DHAPS PEP+E4P CHI F3H flavanones dihydroflavonols flavonols DFR Fase formación maduración de la baya leucoantocyanidin LAR Exocarpo ANS/LDOX flavan-3-ol PACs Mesocarpo antocyanidin ANR Pericarpo UFGT antocyanins itraq DIGE 15mm FS 4mm V100 7mm mm 140

25 ESTUDIO COMPARATIVO DEL PROTEOMA DE CULTIVOS CELULARES DE VID SIN MARCAJE: LABEL-FREE

26 CULTIVOS CELULARES DE VID DE DISTINTAS VARIEDADES Extracto proteico cv Monastrell Extracto proteico cv Gamay Digestión tripsina Digestión tripsina LC-MS Label Free x5 Gamay Monastrell Monastrell Gamay

27 Alineamiento /Filtro carga iones Deteccion precursores Cuantifica intensidad Iones Selección precursores (stat) Análisis Multivariante (perfil abundancia) Monastrell Gamay

28 Motor de Búsqueda Identificacion y filtrado de peptidos Ensamblaje de Peptidos en proteinas Resolution de conflictos Perfil cuantitativo Proteinas Lista final de proteínas cuantificadas

29 Proteínas con abundancia diferencial Identificadas con Mayor en Gamay Mayor en Monastrell Total diferenciales 1 peptido o más péptidos Total Score Mascot>

30 ANÁLISIS DE PROTEINAS POR MRM

31 Transición m/z -> m/z Detección y cuantificación de péptidos por MRM Areas picos Coelución METODO ADQUISICION DE DATOS ANALISIS DE DATOS

32 Intensidad (u.a.) Intensidad (u.a.) ANÁLISIS DE PEPTIDOS DE PROTEÍNAS SELECCIONADAS EN CARNES 3,0E+03 2,5E+03 METODO => MUESTRA 2,0E+03 1,5E+03 1,0E+03 5,0E+02 0,0E+00 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 2,5E+03 2,0E+03 Tiempo de retención (min) METODO => MUESTRA 1,5E+03 1,0E+03 5,0E+02 0,0E ,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 Tiempo de retención (min)

33 Intensidad (u.a.) Intensidad (u.a.) Intensidad (u.a.) Intensidad (u.a.) SELECCIÓN DE PEPTIDOS ESPECIOTIPICOS: ANALISIS BIOINFORMATICO + EVIDENCIA EXPERIMENTAL METODO => MUESTRA 2,0E+04 1,5E+04 1,0E+04 5,0E+03 0,0E+00 1,9 2,1 2,3 2,5 2,7 Tiempo de retención (min) 2,0E+03 1,5E+03 1,0E+03 5,4E+02 4,0E+01 1,2 1,7 2,2 2,7 Tiempo de retención (min) 2,5E+03 1,0E+04 8,0E+03 6,0E+03 4,0E+03 2,0E+03 0,0E+00 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 Tiempo de retención (min) 2,0E+03 1,5E+03 1,0E+03 5,4E+02 4,0E+01 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 Tiempo de retención (min)

34 Gracias por su atención!!