Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d Hebron

Transcripción

1 Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d Hebron Institut d Investigació Sanitària de l Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) Introducció a la metabolòmica. Proteòmica i Metabolòmica: Tècniques disponibles, planificació i disseny d'experiments 25 de Març de 2014 RICARDO GONZALO

2 CONTENIDO: Introducción a la metabolómica. PrincipalesTécnicas utilizadas. Diseño de experimentos Análisi de dades de metabolómica

3 METABOLOMICA. Definiciones Definición Estudio de los procesos químicos de los metabolitos Estudio sistemático de la única huella química que los procesos celulares dejan atrás Cualquier molécula intermediaria o producida durante el metabolismo Metaboloma Representa la colección de metabolitos de una célula, de un tejido, de un órgano o de un organismo, los cuales son los productos finales de los procesos celulares.

4 METABOLOMICA. Definiciones Genómica Proteómica Metabolómica Nos explican lo que ha pasado después de un estímulo, mutación,... Explica lo que está pasando después de un estímulo, mutación,... Seria muy interesante poder integrar estos tres tipos de datos para saber lo que está pasando en un organismo

5 METABOLOMICA. Adquisición de datos Técnicas de separación: Cromatografía de gases (GC) Cromatografía líquida (UPLC) Técnicas de detección: Espectrometría de masas (MS) Resonancia magnética nuclear (NMR) Combinación de técnicas: GC-MS H/UPLC-MS

6 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación Sirve 1 para separar diferentes componentes de una muestra Es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. Sólido, líquido o gas Sólido = partículas empaquetadas líquido o gas Alta pureza Inerte químicamente

7 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación Cromatografía de gases Fase movil: gas inerte. Fase estacionaria: columna Permite la separación de mezclas órganicas complejas Suele requerir derivatización química (sólamente los compuestos químicos volátiles pueden ser analizados sin derivatización)

8 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación Cromatografía líquida. HPLC/UPLC Permite la separación de mezclas muy complejas Menor resolución cromatográfica Pueden ser analizados un amplio rango de metabolitos (analitos poco volátiles) UPLC permite trabajar a P mucho mayores y así reducir tiempo y costes

9 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación Cromatografía líquida. HPLC/UPLC

10 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección GC H/UPLC Separan, identifican y cuantifican compuestos... qué pasa si hay muestras que coeluyen...? ESPECTROMETRÍA DE MASAS Permite identificar, cuantificar y elucidad la estructura de manera casi inequívoca cualquier sustancia pura Necesita que las sustancias estén previamente separadas (espectros generados son complejos)

11 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección ESPECTROMETRÍA DE MASAS Muestra es ionizada (=destruída) Cada compuesto se ioniza y fragmenta de una determinada y única manera (relación masa/carga) pierde algunos electrones y se fragmenta dando diferentes iones Iones son acelerados por un campo magnético hacia un detector Detector

12 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-Qtof MS-Tiempo de vuelo (Qtof) Un ión con determinada relación masa/carga es analizado en el tiempo Los iones son acelerados bajo un campo eléctromagnético de fuerza conocida La velocidad del ión dependerá de su relación masa/carga Se mide el tiempo que tarda el ión en llegar al detector

13 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ MS-QQQ 1 Sistema fluídico y de adquisición de muestras Acquity. 4 líneas de solvente, el usuario tiene de escoger 2. Flujo de 0.01 a 2.00 ml/min Presión máxima psi Capacidad para procesar 96 muestras Detector masas Txevo TQ Fuente en Zspray. Capacidad de ser ESI/APCI/ESCi Dos cuadrupolos analizadores de alta resolución. Celda de colisión T-Wave Rango de masas: m/z

14 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ

15 METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección Resonancia magnética nuclear No se basa en la separación de los analitos. La muestra se suele poder recuperar 1 Detecta todos los metabolitos a la vez. No es selectiva Principales ventajas es la alta reproducibilidad y facilidad de preparación de las muestras Es menos sensible que MS

16 METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental Diseño experimental: Definición: La estadística que sucede antes del experimento. Técnica estadística que permite identificar y cuantificar las causas de un efecto dentro de un estudio experimental. Beneficios: un buen diseño puede ahorrar tiempo y dinero (evita repeticiones) reduce el tiempo de análisis y la probabilidad de error. buena estimación del error reduce el tiempo experimental al mínimo. permitirá una validación amplia de los resultados (=muestra de una población)

17 METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental Varianza, análisis de clusters y potencia Experimento Validación de los datos Análisis estadístico Análisis preliminar

18 METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental Fases en las que interviene el diseño estadístico: Preadquisición Planificación y discusión del experimento global Estudiar las fuentes de variabilidad Elección de la metodología a utilizar Definir el/los objetivo/s del estudio Obtención del especimen Elegir las muestras a utilizar Determinar el número de muestras Forma de recolección de las muestras Pooles Diseño del ensayo Número y tipo de replicados Gente que va a manipular, kits,... Si hay más de una tanda de adquisición, repartir bien las muestras

19 METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental Número de muestras necesario: Cuánta variabilidad tiene mi sistema de estudio? Fuentes de variabilidad Biológica (la que nos interesa) Técnica (protocolo, operador...) Sistemática (instrumentos, reactivos,...) cuántas muestras necesito? Se debería estimar la magnitud de las tres fuentes de variabilidad Estudio Piloto Qué nivel de significación se necesita? Cambios sutiles requieren elevado número de replicas

20 Diseño del ensayo METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental Principios básicos del diseño experimental: Aleatorización: Asignar de forma aleatoria las muestras a los grupos Réplicas: Aplicar el mismo tratamiento de forma independiente a más de una muestra. El número de replicados dependerá de la precisión del equipo. Tipos: biológicos/técnicos Bloqueo o control local: Muestras pueden no ser homogéneas (hombres/ mujeres), pueden existir diferencias debidas a los bloques. Asignar correctamente el tratamiento entre los bloques.

21 METABOLOMICA. Análisis de datos espectros digitalizados Datos metabolómica lista de medidas sobre metabolitos Se genera una matriz donde las filas corresponden a las muestras y las columnas corresponden a los niveles analizados en los metabolitos. Suelen ser análisis complicados que requieren de personal y equipo especializado

22 METABOLOMICA. Análisis de datos. Tipos de análisis que se pueden hacer: 1. Análisis exploratorio i. Revisión de los resultados ii. Detección de outliers iii. Patrones de agrupación 2. Descubrimiento de biomarcadores i. Identificar metabolitos que son significativamente diferentes entre grupos 3. Clasificación i. Construcción de un modelo para la predicción/clasificación de nuevas muestras

23 METABOLOMICA. Análisis de datos. Aspectos del análisis de datos 1. Normalización de los datos crudos Eliminar la variabilidad sistemática entre las condiciones experimentales que no estén relacionadas con las diferencias biológicas (diluciones, varios operadores, dyes ) Hacer todos los datos comparables 2. Problema del Multi-testing Al realizar muchos test estadísticos (miles) hay que ajustar el p valor para que no aparezcan falsos positivos. 3. Agrupaciones No supervisados Muy interesantes porque permiten echar un vistazo a los datos rápidamente Ej. PCA, Heatmap, dendogramas,.

24 METABOLOMICA. Análisis de datos. PCA (Análisis de componentes principales) Analiza y extrae la variabilidad sistemática en los datos No necesita conocer la naturaleza de las muestras antes de hacer el análisis Nos mostrará cualquier diferencia significativa entre los grupos de muestras (sea o no sea importante para el estudio en sí)

25 METABOLOMICA. Análisis de datos. 4. Clasificación Métodos supervisado (conocemos la naturaleza de las muestras) Muchos métodos estadísticos tradicionales no se pueden utilizar (pocas muestras con miles de datos) Se han desarrollado métodos nuevos, algunos derivados del análisis de datos de microarrays PLS (Partial Least Square) Similar al PCA, pero se utiliza la información sobre que se conoce de las muestras (supervisado) Recomendado cuando se estudian dos grupos Se maximiza la covarianza entre los resultados obtenidos y la información previa conocida de las muestras.